UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Ana Lj. Petrovi ć
Histopatološke promene bubrega kod pacova soja Wistar tretiranih pesticidom Fastac 10 EC
Master rad
Niš, 2014.
UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Histopatološke promene bubrega kod pacova soja Wistar tretiranih pesticidom Fastac 10 EC
Master rad
Kandidat: Mentor: Ana Lj. Petrović 64 doc. dr Ljubiša B. Đorđević
Niš, April, 2014
UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
Histopathological changes in the kidney in Wistar rats treated with pesticides Fastac 10 EC
Master thesis
Candidate Mentor Ana Lj.Petrović 64 doc. dr Ljubiša B. Đorđević
Niš, April, 2014.
Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Ljubiši Đorđeviću
na razumevanju i nesebičnoj pomoći, koju mi je pružio prilikom izrade ovog
master rada.
Zahvaljujem se asistentici Mileni Aleksić na pomoći u realizaciji
eksperimentalnog dela rada. Takođe veliku zahvalnost dugujem Tanji, Vesni
i Vladi, zaposlenima u Vivarijumu Medicinskog fakulteta u Nišu, koji su
pomogli u radu sa eksperimentalnim životinjama.
Najveću zahvalnost dugujem svojoj majci koja mi je pružila veliku i
neizmernu ljubav, podršku i razumevanje tokom studiranja. Kao i svim
prijateljima koji su bili uz mene sve ovo vreme.
Ovaj rad, kao i sve što sam postigla, dugujem osobi koja je čvrsto
verovala u mene svih ovih godina. Osobi koja je bila moja snaga i uzor i u
čiju čast ću i na dalje da sledim svoje ideale, a znam da bi danas bio
ponosan na mene da je tu sa nama!
Hvala ti, tata!
Sažetak
Cilj ovog rada bio je ispitivanje uticaja date koncentracije pesticida Fastac 10 EC
na bubreg kod pacova soja Wistar. Fastac je insekticid sa kontaktnim i digestivnim
delovanjem, čija je aktivna materija alfa-cipermetrin. Životinje su pesticidom tretirane
oralno, putem sonde, u koncentraciji 1,2 µl/dnevno u periodu 7 i 14 dana u konstantnim
uslovima. U tretmanu od 7 i 14 dana došlo je do povećanja telesne mase životinja. Kod
tretiranih životinja u periodu od 7 i 14 dana izlaganje Fastac-u dovodi do smanjenja mase
bubrega. Histološki na bubregu posle 7 dana nastaju prvi znaci toksičnog delovanja, koji
se ogledaju u promeni izgleda bubrežnih kanalića. Posle 14 dana tretmana na bubregu se
uočavaju drastične histološke promene, koje se ogledaju u degenerativnim promenama
glomerula i bubrežnih tubula. Istraživanje je pokazalo da su priroda i intenzitet toksičnih
simptoma proizvedenih delovanjem pesticida Fastac 10 EC vremenski zavisni.
Ključne reči: Fastac 10 EC; alfa-cipermetrin; bubreg; Wistar pacovi;
Abstract
The aim of this study was to investigate the influence of given concentrations of
pesticides Fastac 10 EC of the kidney in Wistar rats. Fastac is an insecticide with contact
and digestive action, whose active ingredient is alpha - cypermehrin. The animals were
orally treated with the pesticide, by gavage, at a concentration of 1,2 µl/day over 7 and 14
days in constant conditions. In the treatment of 7 and 14 days, there was an increase in
body weight of the animal. In the treated animals over a period of 7 and 14 days,
exposure of Fastac leads to a reduction in mass of the kidney. Histologicaly, on the
kidney after 7 days occured the first signs of toxic effects, which are reflected in changes
in appereance of renal tubules. After 14 days of treatment in the kidney is observed
drastic histological changes, which are reflected in degenerative changes in glomerul and
renal tubules. Research has shown that the nature and intensity of the toxic symptoms
produced by the action of the pesticides FASTAC 10 EC, weather dependent.
Keywords: Fastac 10 EC; alpha-cypermethrin; kidney; Wistar rats
Sadržaj 1.Uvod ........................................................................................................................... 1 1.1. Toksičnost pesticida .............................................................................................. 1 1.2. FASTAC................................................................................................................ 3 1.2.1. Hemijski sastav ............................................................................................... 4 1.2.2. Delovanje i upotreba ....................................................................................... 5 1.2.2.1.Delovanje................................................................................................ 5 1.2.2.2.Upotreba...........................................................................................................6 1.2.3.Dosadašnja istraživanja FASTAC-a................................................................ 6 1.3. Bubreg- građa i funkcija....................................................................................... 7 1.4. Nefrotoksičnost................................................................................................... 10
2. Cilj rada .................................................................................................................11
3. Materijal i metode .......................................................................................... 12 3.1. Materijal ............................................................................................................... 12 3.2. Metode............................................................................................................................. 12 3.2.1. Tretiranje životinja u konstantnim eksperimentalnim uslovima......................... 12 3.2.2. Priprema tkiva................................................................................................. 13 3.2.2.3. Fiksacija tkiva-funkcija.......................................................................... 14 3.2.2.4. Kalupljenje tkiva.................................................................................... 14 3.2.2.5. Sečenje tkiva.......................................................................................... 15 3.2.2.6. Bojenje................................................................................................... 16 3.2.2.6.1. Hematoksilin- eozin (H&E) metoda.......................................... 16
4. Rezultati i diskusija ....................................................................................... 18 4.1. Ispitivanje uticaja date koncentracije pesticida na bubreg pacova u periodu od 7 dana............................................................................................. 19 4.2. Ispitivanje uticaja date koncentracije pesticida na bubreg pacova u periodu od 14 dana............................................................................................22
5. Zaključak ............................................................................................................ 24
6. Literatura ............................................................................................................ 25
1
1. Uvod
Delovanje otrova na žive organizme proučava toksikologija. Toksikologija (od
grčkih reči toksikon i logos) je nauka o nepovoljnim uticajima hemikalija na žive
organizme. Ona proučava simptome, mehanizme, lečenje i otkrivanje biološkog trovanja
— posebno trovanja ljudi. Glavni kriterijum toksičnosti hemikalije je doza, tj. stepen
izlaganja supstanci (Amdur et al.,1993).
1.1. Toksičnost pesticida
Dejstvo otrova na organizam predstavlja interakciju otrova sa hemijskom i
morfološkom građom organizma na molekularnom, ćelijskom, tkivnom i organskom
nivou. Otrov je bilo koja supstanca koja uneta u organizam u određenoj količini i pod
određenim uslovima izaziva strukturne ili funkcionalne poremećaje organizma i
eventualno smrt.
Ispitivanja na životinjama obuhvataju četiri osnovna testa toksičnosti koji se
međusobno razlikuju prvenstveno po trajanju:
(1) test akutne toksičnosti- dovoljna je jedna jedina doza uneta odjednom ili kao
podeljena u periodu od najviše 24h.
(2) test subakutne toksičnosti - ponovljena ekspozicija supstanci bar jednom dnevno u
toku nekoliko, 14 ili 28 dana.
(3) test subhronične toksičnosti. nastavljanje ogleda u trajanju od 30 do 90 dana.
(4) testom hronične toksičnosti- svakodnevno unošenje supstanci u hrani (ili na neki
drugi način) u toku više meseci jedne, dve ili više godina.
Toksičnost je prvenstveno određena hemijskim sastavom pesticida. Pod
pesticidima podrazumevamo proizvode hemijskog ili biološkog porekla, koji su
namenjeni zaštiti ekonomski značajnih biljaka i životinja od korova, bolesti, štetnih
insekata, grinja i drugih štetnih organizama. Većina pesticida (među njima i
organohlorni) poseduju izrazitu sposobnost koncentrovanja i ispoljavaju aktivno biološko
dejstvo na toplokrvne životinje (Stajkovac i saradnici, 2009).
2
U odnosu na štetne organizme, pesticidi se dele na tri osnovne grupe:
• herbicidi – namenjeni za suzbijanje zeljastih i drvenastih korova, algi, mahovina,
lišajeva i parazitnih cvetnica,
• fungicidi – namenjeni za suzbijanje gljiva prouzrokovača biljnih bolesti
• insekticidi – namenjeni za suzbijanje štetnih insekata,
a kasnije su se razvile i podgrupe:
• rodenticidi –suzbijanje glodara
• akaricidi - suzbijanje grinja
• nematocidi - suzbijanje valjkastih crva
• moluskocidi - suzbijanje mekušaca: puževa
• algicidi – suzbijanje algi
• antihelmintici - suzbijanje glista
• arboricidi - uništavanje drvenastih korova
• atraktanti - sredstva koja privlače štetne insekte
• defolijanti - izazivanje prevremenog opadanja lišća
• desikanti - izazivanje uvenuća i sušenja biljaka
• fumiganti – sredstva koja deluju gasnom fazom
• hemosterilizanti – utiču na sterilitet imaga
• repelenti – sredstva koja odbijaju štetne organizme od gajene biljke
• regulatori rasta biljaka
(http://www.agromarket.rs/srb/38/39/Zastita-bilja/Vise-o-Pesticidima)
3
1.2. FASTAC
FASTAC ( u prevodu od engleske reči fast- brz, i tac- dodir ili dovoljno je samo
da se ostvari kontakt i da insekt padne sa biljke) je insekticid sa kontaktnim i digestivnim
delovanjem(http://www.agro.basf.rs/agroportal/rs/media/migrated/basf_bro_ure_2013/fl
ajeri_2013/Fastac_2013.pdf). Ovo je značajna osobina kada se želi brzo sprečavanje
oštećenja od insekata. Zbog izuzetne stabilnosti i otpornosti na spiranje kišom, Fastac 10-
EC ostvaruje dugo insekticidno dejstvo. Zbog toga je Fastac 10 EC registrovan u velikom
broju zemalja za suzbijanje širokog spektra štetočina koje sišu i grickaju useve. Fastac je
visoko efikasan insekticid širokog spektra sa veoma brzim delovanjem u vrlo niskim
dozama ( http://www.stovet.rs/vocarstvo/pesticidi/insekticidi/?prod_id=100000300565).
Razlozi i prednosti upotrebe Fastac-a:
• Fastac 10 EC je efikasan protiv većine ekonomski značajnih štetočina
• Suzbija sve razvojne stadijume insekata
• Uspešan protiv insekata rezistentnih na druge insekticide
• Ispoljava repelentno i “anti-feeding” delovanje
• Upotrebljava se u velikom broju raznovrsnih useva
• Ne ispoljava fitotoksičnost u preporučenim dozama
• Duže deluje nego klasični insekticidi
• Visoko otporan na spiranje kišom
• Niske doze umanjuju zagađenost okoline
• Neznatno opasan za vrste koje nisu objekat tretiranja
(http://www.agro.basf.rs/agroportal/rs/media/migrated/basf_bro_ure_2012/Jabuka_katalog2.pdf )
4
1.2.1. Hemijski sastav
Fastac 10 EC je formulisan u obliku tečnog koncentrata za emulziju (EC) koja
sadrži 100 g/l aktivne materije alfa-cipermetrina (Slika 1). Sadržaj aktivne materije:
100g/l +/- 10% alfa- cipermetrina (tehnička čistoća minimum 90%). Ovo jedinjenje se
smatra najaktivnijim piretroidom.
Piretroidi su klasa organskih molekula, sintetskih analoga prirodnog piretrina,
molekula izolovanog iz cveta biljke buhač (Chrysanthemum coccineum) koji uspeva na
prostorima bivše Jugoslavije, u Dalmaciji i na Crnogorskom primorju
(http://duochem.rs/insekticidi.html). U cvetu ove biljke nalaze se dve vrste piretrina koji
su poznati kao piretrin 1 i piretrin 2 kao i cinerin 1 i cinerin 2. Piretrini su kontaktni
otrovi koji deluju preko površine tela parazita. Kada prodru preko kutikule ili hitina
vezuju se za ćelije nervnog sistema, oštećuju ih i nastaje paraliza parazita
(http://vettehpet.wordpress.com/2012/03/19/ektoantiparazitici-najvazniji-predstavnici/).
U ljudskom organizmu piretrini se slabo apsorbiraju u probavnom i disajnom
traktu, tako što se brzo i dobro apsorbiraju iz probavnog trakta, dok je apsorpcija kroz
kožu sporija. Brzo se metabolizuju reakcijama hidrolize i oksidacije i ne nakupljaju se
znatnije u tkivima. Izlučuju se uglavnom urinom (Macan J., et al, 2006).
Piretroidi su sintetska jedinjenja koja su sintetisana na bazi piretrina, ali su znatno
efikasniji zato što im je otpornost prema svetlu veća pa se teško razlažu, a dejstvo im se
produžava (http://vettehpet.wordpress.com/2012/03/19/ektoantiparazitici-najvazniji-
predstavnici/). Piretroidi su takođe kontaktni otrovi sa brzim paralitičkim dejstvom, kome
prethodi povećana mišićna razdražljivost i konvulzije parazita. Paralitički efekat piretrina
brzo nastaje, ali postoji mogućnost da se neki insekti posle dejstva mogu oporaviti.
(http://www.vet.bg.ac.rs/~farmakologija/Predavanja%20i%20vezbe/Predavanja/Predavanja%20Prof.%20
Trailovic%20TOKS/Trovanja%20piretroidima.pdf ).
Aktivna materija alfa-cipermetrin je lipofilna, što znači da ostvaruje neposredni
kontakt za voštanim materijama kutikule biljaka, kao i regulatorom rasta biljaka.
(http://www.agrosava.com/proizvodi/insekticidi/Fastac/detaljnije-o proizvodu.html).
5
Slika 1. Strukturna formula alfa- cipermetrina
(http://sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/structure/24.jpg)
1.2.2. Delovanje i upotreba
1.2.2.1. Delovanje
Fastac 10 EC ima izraženo dejstvo na odrasle insekte i larve, ali poseduje i
značajno delovanje na jaja sa tankom opnom. Fastac 10 EC u višim koncentracijama
deluje repelentno (odbijajuće) na štetočine, a u manjim količinama izaziva "anti -
feeding" efekat, odnosno insekti smanjuju ishranu. Pošto je aktivna supstanca
FASTAC-a piretroid, on deluje tako da blokira transport Na jona kroz membranu
nervnih ćelija pa je onemogućen prenos nervnih impulsa (deluju na permabilnost
nervnih membrana). Što dovodi do nekordinisanih pokreta pri čemu nastaje paraliza,
a nakon toga dolazi do uginuća. Vrlo je otrovan za insekte, a takođe uništava sintezu
ATP-a kod vodenih organizama. Dok je za toplokrvne životinje slabo otrovan.
6
1.2.2.2. Upotreba
Fastac EC 10 ima upotrebu u zasadu jabuke, za suzbijanje jabukinog smotavca
(Cydia/Laspeyresia/Carpocapsa pomonella), u koncentraciji 0,015-0,018%, odnosno
1,5-1,8 ml u 10 l vode. U zasadu kruške za suzbijanje obične kruškine buve (Psylla
piri ), u koncentraciji 0,018-0,02% , odnosno 1,8-2 ml u 10 l vode. U zasadu breskve,
za suzbijanje breskvinog smotavca (Cydia/Laspeyresia/molesta), u koncentraciji
0,012-0,015%, odnosno 1,2-1,5 ml u 10 l vode. U usevu kupusa, za suzbijanje
kupusovog moljca (Plutella maculipennis), u količini 0,08-0,12 l/ha, odnosno 0,8-1,2
ml na 100 m². Na ukrasnom bilju: u staklarama, za suzbijanje bele mušice leptiraste
vaši (Trialeurodes vaporarium), u koncentraciji 0,02-0,025%, odnosno 2-2,5 ml na
100 m². U polju, za suzbijanje tripsa (Thrips sp.) u koncentraciji 0,012-0,018%,
odnosno 1,2-1,8 ml na 100 m².
1.2.3. Dosadašnja istraživanja FASTAC-a
FASTAC kao insekticid, ima izraženo dejstvo na odrasle insekte i larve, ali
poseduje i značajno delovanje na jaja sa tankom opnom. Spektar delovanja FASTAC-a
određuje njegova aktivnost prema mastima insekata. Iz ovih razloga ciljni insekti su
gusenice Lepidoptera i larve Diptera, prema kojima on ima prednost u odnosu na druge
insekticide (http://www.agrosava.com/proizvodi/insekticidi/Fastac/detaljnije-o-proizvodu.html).
Studija je pokazala da je priroda i intenzitet toksičnih simptoma, proizvedenih od
cipermetrina, da su dozno i vremeski zavisna. Ispitivanja na životinjama su pokazala da:
akutna izloženost utiče na aktivnost centralnog nervnog sistema, dolazi do povećanja
telesne mase životinja. Manja doza dovodi do smanjenja relativne težine bubrega u
obimu, dok kod veće doze dolazi do blagog krvarenja, sakupljanja glomerula i nekroze
bubrežnih tubula. Nema podataka o dugoročnoj toksičnosti, reproduktivne toksičnosti,
kancerogenosti (Grewal K.K. et.al, 2010)
7
1.3. Bubreg- građa i funkcija
Bubrezi ( lat: ren; gr: νεφρό, nephro ) su parni organi, koji predstavljaju centralni
deo urinarnog sistema. Smešteni su u retroperitonealnom prostoru na zadnjem zidu
abdomena, i nalaze se sa obe strane kičmenog stuba (u visini 12. grudnog i 1. i 2.
slabinskog pršljena). Desni bubreg, potisnut jetrom, postavljen je malo niže u odnosu na
levi. Bubreg je spreda pokriven parijetalnim peritoneumom, a osim toga sa svih strana ga
okružuju tri omotača: bubrežna fascija (koja oblaže i nadbubrežnu žlezdu), masna čahura
(capsula adiposa) i fibrozna čahura (capsula fibrosa) (Stefanović i saradnici,2004) .
Građa bubrega:
Ako se bubreg raseče od vrha do dna, makroskopski se mogu uočiti dve
karakteristične zone: spoljašnja zona ili kora (cortex renis) i unutrašnja zona ili
srž (medulla renis). Kora bubrega sastoji se od parenhima između renalnih piramida i
kapsule (bubrežni labirint), kao i dela parenhima koji prodire između piramida
(Bertinijeve kolumne) gradeći bubrežne stubove (Teofilovski—Parapid & Maliković,
1997).
Mikroskopski posmatrano, svaki bubreg sadrži oko million sopstvenih jedinica-
nefrona. Nefron (nephron) predstavlja osnovnu morfološku i funkcionalnu jedinicu
bubrega. Osnovni delovi nefrona su bubrežno telašce (corpusculum renale) i bubrežni
kanalić (tubulus renalis). Unutar telašca se nalazi mreža arterijskih kapilara (rete
mirabile), označena kao glomerul, i dvolisna vezivna kapsula, čiji listovi ograničavaju
prostor u kome se filtrira primarna mokraća (Stefanović i saradnici.,2004). Bubrežni
kanalići se sastoje od izuvijanog proksimalnog dela i izuvijanog, distalnog dela. Ova dva
dela su povezana tankim kanalom, tzv. Henle-ovom petljom (Štajn & Žikić,1990).
8
Slika 2. Nefron - histološki preparat: 1. Glomerul, 2. Proksimalni tubul, 3. Distalni tubul ( http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/63/Histology-kidney.jpg)
Funkcija bubrega:
Bubrezi imaju čitav dijapazon po život značajnih uloga i utiču na rad svih ostalih
organa i organizma u celini. Osnovna funkcija ovih organa je formiranje
konačne mokraće, ali pored toga oni imaju višestruku ulogu u održavanju homeostaze u
organizmu. To podrazumeva:
• regulaciju ravnoteže vode i elektrolita,
• regulaciju osmolarnosti telesnih tečnosti i koncentracije elektrolita,
• regulaciju acido-bazne ravnoteže,
• izlučivanje otpadnih produkata metabolizma i štetnih hemikalija,
• regulaciju arterijskog pritiska,
• sekreciju različitih hormona,
• sintezu glukoze i sl.
Mehanizam stvaranja mokraće obuhvata tri fundamentalna procesa: glomerularnu
filtraciju, tubularnu reapsorpciju i tubularnu sekreciju (Petrović, 1991) . Obavljajući ovu
primarnu ulogu, bubrezi takođe vrše i druge funkcije. Oni veoma precizno podešavaju
izlučivanje vode i elektrolita prema njihovom unosu, održavajući na taj način stalnost
unutrašnje sredine.
9
Oni imaju glavnu ulogu u izlučivanju otpadnih produkata metabolizma (urea,
keratin, mokraćna kiselina, bilirubin), raznih toksina, lekova i dodataka hrani.
Regulacijom izlučivanja vode i Na imaju presudnu ulogu u dugoročnoj regulaciji
arterijskog pritiska. Zajedno sa plućima i puferima telesnih tečnosti, bubrezi učestvuju u
regulaciji acido-bazne ravnoteže, jer mogu da odstrane iz organizma
razne kiseline (sumpornu, fosfornu i dr). Pošto sintetišu i sekretuju oko 90% ukupnog
eritropoetina, oni direktno utiču i na stvaranje, tj. broj crvenih krvnih zrnaca. Tokom
prolongiranog gladovanja bubrezi u procesu glikoneogeneze, od različitih prekursora,
stvaraju glikozu (Gauyton & Hall, 2003) .
10
1.4. Nefrotoksičnost
Nefrotoksičnost je jedan od najčešćih problema sa bubrezima i nastaje kada je telo
izloženo na lek ili toksin koji izaziva oštećenje bubrega. Bubreg je organ koji služi kao
kanal za eliminisanje otrova. Većina otrova, unetih u toksičnim dozama, mogu izazvati
bubrežne povrede, lezije čija posledica može biti pojava nefrita i promene u mokraći.
Tako npr. kod akutnih trovanja živom bubreg će brzo biti oštećen. Kao posledica
toksičnog delovanja žive već posle dan- dva može da dođe do potpune anurije i velike
albuminurije. U izvesnim slučajevima, kao kod saturnizma, do jasnih ozleđenja bubrega i
do bubrežne insuficijencije i eventualnog nefrita može doći tek posle dužeg vremena
(Mokranjac M., 2001).
Hemijski indukovana nefrotoksičnost varira u zavisnosti od veličine i trajanja
izloženosti: npr. jetra tipično pretrpi štetu od velikih akutnih doza, a bubrezi su ranjivi
tokom proširenog izlaganja niskim dozama. Postoje nekoliko fizioloških razloga koji
predisponiraju bubrege za hemijsku toksičnost: npr. jak izraz ksenobiotičkih transportera
u luminalnoj membrani čine bubrege veoma osetljive na nefrotoksikante od njega, što
znači da lokalna koncentracija otrova može ozbiljno prevazići svoje nivoe u cirkualciji
krvi. Ksenobiotik uzrokovan bubrežnom povredom često čini njeno prisustvo poznato
preko promena u količini ili kvalitetu urina: simptomi mogu uključivati hiperprodukciju u
razblaženom urinu (poliurija), izlučivanje urina u malim količinama (anurija) ili prolaz
umazane krvi urina (hematurija). Promene u sastavu urina koje ukazuju na renalna
oštećenja uključuju izgled glukoze (glukozurija) ili krvnih proteina u urinu (proteinurija).
Nivoi specificnih proteina kao što je albumin (albuminurija) koji je korisni pokazatelji
nefrotoksičnosti u kliničkom okruženju. Ksenobiotička trovanja doprinose oko jedne
polovine akutnih i horničnih bubrežnih neuspeha, dok izmedju 10% i 15% intenzivne
nege prijemno se uključuju akutnom bubrežnom insuficijencijom. Pošto su se stope
mortaliteta za akutne bubrežne insuficijencije jedva pomerile za proteklih 50 godina,
potrebe za osnovnim i kliničkim istraživanjima u ovoj oblasti su i dalji visoki. Bubrežni
kapacitet treba da eliminiše te strane hemikalije kao i metabolički otpadne proizvode
(npr. urea, amonijak i mokraćna kiselina) je takođe od ključnog značaja za telesno
zdravlje (Burcham, 2013).
11
2. Cilj rada
Cilj ovog rada bio je da se:
• Ispita uticaj date koncentracije tečnog koncentrata emulzije Fastac-a od 1,2 µl
doze 0,4 ml u periodu od 7 dana na bubreg pacova.
• Ispitivanje uticaja date koncentracije tečnog koncentrata emulzije Fastac-a od 1,2
µl doze 0,4 ml u periodu od 14 dana na bubreg pacova.
• Utvrde efekti na histološku strukturu bubrega kod tretiranih životinja.
12
3. MATERIJAL I METODE 3.1. Materijal U eksperimentima korišćeni su sledeći materijali:
1. Eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar, težine oko 380- 490g
2. Pesticid FASTAC 10- EC (BASF Agro B.V., Switzerland)
3. Organ pacova- bubreg
Metode
- Tretiranje životinja u konstantnim eksperimentalnim uslovima
- Žrtvovanje životinja
- Priprema tkiva:
� Fiksacija tkiva
� Kalupljenje tkiva
� Sečenje tkiva
� Bojenje tkiva
3.2.1. Tretiranje životinja u konstantnim eksperimentalnim uslovima
Eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar , težine od 380 do 490g, tretirane
su u dva vremenska perioda. Prvo tretiranje je trajalo 7 dana, u kome su životinje
tretirane FASTAC-om u koncentraciji 1,2 µl koji je razblažen u 10ml destilovane vode.
Ukupno je bilo 5 životinja od kojih su 3 tretirane pesticidom, jedna destilovanom vodom
i jedna ne tretirana praćena kao kontrola. Drugo tretiranje je trajalo 14 dana, u kome je
nastavljeno tretiranje životinja FASTAC-om sa koncentracijom od 1,2 µl razblaženog u
10ml destilovane vode. Pesticid je apliciran oralno preko sonde. Životinje su dozirane sa
po 0,4 ml rastvora određene koncentracije svakog dana u isto vreme. Eksperimentalne
životinje čuvane su na temperaturi od 22-23 C, sa slobodnim režimom ishrane i režimom
13
dana od 12:12h svetlost/tama. Nakon tertiranja životinje su žrtvovane, davanjem veće
doze anestezije.
3.2.2. Priprema tkiva
� Priprema parafinskih uzoraka:
• Uzorak: što svežiji
• Fiksacija: čuva (fiksira) strukturnu organizaziju
• Dehidratacija: zamena vode u tkivu alkoholom
• Prosvetljavanje: zamena alkohola ksilolom
• Kalupljenje: zamena ksilola medijumom za kalupljenje
• Sečenje i bojenje
Ciljevi preparacije:
• Održati uzorak u stanju koje je što približnije nativnom (prirodnom).
• Očuvati što više karakteristika uzorka.
Priprema tkiva:
Hemijska fiksacija Etanol ili aceton ksilol parafin MIKROTOM - Formaldehid -Serija rastvora rastuće
- Paraformaldehid koncentracije: 70%, 95%, - Metanol 100% - Buenov fiksativ
Slika 3. Priprema tkiva
14
3.2.2.3. Fiksacija tkiva-funkcija
Funkcija fiksacije tkiva je održavanje odgovarajućeg odnosa između ćelija, takođe
je ključna za prezervaciju tkivne strukture i sprečavanje ćelijske autolize od strane
enzima, ćelijske razgradnje, degradacije tkiva i degeneracije proteina. Fiksacija tkiva
može biti:
Fizička: Hemijska:
- Toplota-mikropropagacija - Potapanje u fiksativ
- Mikrotalasi-glikosal - Perfuzija
- Zamrzavanje
3.2.2.4. Kalupljenje tkiva
Dovođenje tkiva u dovoljno čvrsto stanje kako bi moglo da se seče–kalupljenjem
u parafin ili plastične smole. Nakon fiksacije, tkivo se ispira vodom. Zatim se vrši
dehidratacija odnosno uklanjanje vode iz tkiva kroz seriju alkohola rastuće koncentracije.
Nakon toga se vrsi prosvetljavanje tkiva, potapanjem u rastvarač za sredstvo za
kalupljenje (ksilol). Zatim se vrši impregnacija parafinom i na kraju kalupljenje u
rastopljen parafin na 58 ˚C.
Slika 4. Kalupljenje tkiva
15
3.2.2.5. Sečenje tkiva
Sečenje tkiva omogućuje se pomoću mikrotoma (Slika 5). Mikrotom je aparat koji
služi za sečenje ekstremno malih preseka tkiva (≥ 5 mm). U stanju je da načini
izvanredno tanke komade tkiva tako da se mogu preparirati za mikroskopsko ispitivanje.
Koristi se za pripremu uzoraka u mikroskopiji koji se posmatraju na klasičnom
transmisionom svetlosnom, konfokalnom ili elektronskom mikroskopu. Mikrotom se
upotrebljava za sečenje različitih preparata tkiva ukalupljenih u parafinski medijum.
Slika 5. Mikrotom (http://www.leicabiosystems.com/uploads/pics/RM2125_RTS_0061_grip_02.jpg)
16
3.2.2.6. Bojenje
Bojenje je uglavnom zasnovano na specificnom vezivanju boja, upotrebi
obeleženih antitela i aktivnosti enzima. Po završetku bojenja, preseci se sprovode
kroz alkohole rastuće koncentracije i ksilol, montiraju u nekom od medijuma za
montiranje, pokriju pokrovnim staklom i tako nastaje trajni preparat.
3.2.6.1. Hematoksilin- eozin (H&E) metoda
Ova metoda predstavlja jedno od najčešćih histoloških bojenja. Bazofilne
strukture (jedra) boji plavo, crno ili sivo, a acidofilne strukture (citoplazma) u roze ili
crvenu boju. Sam hematoksilin nije boja. On se oksidiše u hematein koji boji jedra (Slika
6). Eozin je kisela boja i boji citoplazmu ćelija (Slika 7).
Slika 6. Harisov hematoksilin
Slika 7. Eozin
17
Način rada:
Za analizu, životinjama su uzeti organi: jetra, slezina, bubreg i kostna srž. Za
fiksaciju korišćen je 4% formalin u kome tkivo stoji nekoliko dana (najmanje tri dana).
Nakon toga vrši se kalupljanje tkiva sledećim redosledom: prvo ide dehidratacija tkiva
serijom alkohola, zatim natapanje i izbeljivanje tkiva posrednim sredstvima kao što je
ksilol. Nakon toga vrši se prožimanje i kalupljenje tkiva parafinom u termostatu. Kada se
kalupljenje završi, vrši se pravljenje preseka ukalupljenog tkiva koje se vrši pomoću
mikrotoma, tako da preseci budu debljine 4-5 mikrona. Napravljeni preparati se zatim
boje odgovarjućim bojenjima, a jedno od osnovnih i rutinskih je H - E bojenje Harisovim
hematoksilinom i eozin bojom.
Ovu metodu bojenja radili smo na sledeći način:
Preparati koji su prethodno bili u ksilolu, zbog uklanjanje parafina, dovode se do
rehidratacije (od etanola opadajućih koncentracija do destilovane vode). Tako da se
ispiraju prvo 100% alkoholom, pa 96% alkoholom i na kraju destilovanom vodom.
Nakon serije ispiranja, preparati se boje hematoksilinom i tako stoje 10 minuta. Nakon
isteka vremena vrši se ispiranje tkiva destilovanom vodom, pa tekućom vodom 5 minuta,
pa opet destilovanom vodom. Zatim se vrši bojenje eozinom, i tako stoje 2 minuta.
Nakon isteka vremena vrši se dehidratacija i prosvetljavanje. Ispire se destilovanom
vodom, zatim 96% alkoholom i na kraju 100% alkoholom. Kada se ispiranje završi,
preparati se suše 15-20 minuta. Kada se preparati osuše, vrši se montiranje kanada
balzamom, nakon čega sledi mikroskopiranje.
18
4. Rezultati i diskusija
Ispitivanjem uticaja date koncentracije od 1,2µl pesticida Fastac na bubreg
pacova u periodu od 7 i 14 dana došlo je do sledećih zapažanja. Pre početka
eksperimenta izmerena je telesna masa pacova (Tabela 1), isto tako i na kraju
eksperimenta nakon tretmana od 7 i 14 dana, pri čemu je izmerena masa bubrega i
preračunat somatski indeks (Si) (Tabela 2). Poređenje ovih vrednosti ukazuje na
smanjenje bubrega u obe eksperimentalne grupe u odnosu na kontrolu.
Fastac 10 EC u dozi od 1,2µl/dnevno u periodu od 7 dana proizvodi blage do
umerene toksične simptome i promene u ponašanju životinja. U odnosu na kontrolu i
grupu tretiranoj česmenskom vodom životinje tretirane Fastac-om pokazale su
promenu, koja je bila odlikovana većim unosom hrane, a samim tim i blagim
povećanjem telesne mase (Tabela 2). U tretmanu od 14 dana, životinje izložene
Fastac 10 EC u dozi od 1,2µl/dnevno pokazuju efekte toksičnosti, koja se odlikuje
dijareom, hematurijom, većim unosom hrane, a samim tim i povećanjem telesne
težine (Tabela 2). U svim eksperimentalnim grupama sve životinje su preživele.
Telasna masa pacova (g)
Kontrola Česmenska voda Pesticid Fastac
7 dana 440 460 460
14 dana 430 490 470
Tabela 1. Prikaz apsolutne telesne mase životinja pre eksperimenta.
19
Tabela 2. Prikaz mase životinja, mase bubrega i somatskog indeksa (Si) na kraju eksperimenta.
4.1. Ispitivanje uticaja date koncentracije pesticida na bubreg pacova u periodu
od 7 dana
Na histološkim preparatima bubrega kod kontrolne grupe (Slika 4.1. i Slika
4.2.) kao i grupe životinja tretiranih česmenskom vodom (Slika 4.3. do Slike 4.6.)
zapaža se normalna morfološka i histološka građa organa, koja se ogleda u jasno
izdiferenciranom kortikalno medularnom regionu. Glomeruli su normalnog izgleda, a
tubularni delovi su sa normalno očuvanim i funkcionalnim epitelom.
Slika 4.1. Glomeruli 20x HE Slika 4.2. Presek bubrežnih kanalića
20x HE
Posle 7 dana Posle 14 dana Telesna masa
pacova ( gr)
Masa bubrega (gr)
Si (%) Telesna masa
pacova (gr)
Masa bubrega ( gr)
Si (%)
Kontrola 460 2.08 0.50 490 2.47 0.50 Česmenska
voda 480 2.44 0.50 520 2.51 0.49 Pesticid Fastac 510 2.57 0.45 580 2.69 0.46
20
Slika 4.3. Presek dela bubrežnih Slika 4.4. Glomeruli u bubrežnom parenhimu kanalića 20x HE 20x HE
Slika 4.5. Izgled bubrežnih Slika 4.6. Glomeruli 40x HE kanalića 40x HE
Analiza preparata bubrega tretiranih životinja Fastac-om u periodu od 7 dana
(Slika 4.7. do Slika 4.11.) pokazuje da u oblasti glomerula postoje infiltrati tečnosti,
bubrežni tubuli izgledaju dilatirano. Jedra epitelnih tubularnih ćelija su uvećana i
hiperhromna, što ukazuje na njihovu pojačanu metaboličku aktivnost. Po periferiji,
između tubula, zapažaju se infiltrati makrofagnih ćelija što ukazuje na povečanu
imunološku aktivnost i inflamatorni proces.
21
Slika 4.7. Infiltracija u oblasti Slika 4.8. Infiltracija makrofaga u glomerula 20x HE oblasti bubrežnih kanalića 40x HE
Slika 4.9. Izgled glomerula 40x HE Slika 4.10. Oblast dilatiranih bubrežnih
kanalića 40x HE
Slika 4.11. Bubrežni kanalići 20x HE
22
4.2. Ispitivanje uticaja date koncentracije pesticida na bubreg pacova u periodu
od 14 dana
Histološki preparati bubrega kod životinja tretiranih Fastac-om tokom 14 dana
(Slika 4.12. do Slika 4.17.) ukazuju na izraženu nefrotoksičnost ovog pesticida.
Kortikalni region bubrega je jako istanjen. Na glmerulima se zapažaju degenerativne
promene. U medularnom delu se zapažaju polja sa obilnim fibroznim tkivom, koje
zamenjuje oštećene tubule. U samim tubulima i njihovom epitelu evidentni su
nekrotični procesi.
Slika 4.12. Degenerativna promena Slika 4.13. Fokalna polja nekroze na glomerulu (desno gore) 20x HE bubrega 10x HE
Slika 4.14. Oštećenje glomerula Slika 4.15. Izgled nekrotičnog polja 40x HE (gore na slici) 20x HE
23
Slika 4.16. Hemoragija na mestu oštećenog Slika 4.17. Deo bubrežnih kanalića
glomerula (gore desno) 40x HE sa vezikularnim promenama i gotovo
otsutnim epitelom 40x HE
Poređenje histoloških nalaza svih eksperimentalnih grupa ukazuje na
progresivne degenerativne promene koje su posledica izlaganja Fastac-u. U
fiziološkom smislu to je i očekivano, tako da kod životinja tretiranih 7 dana
infiltracije u oblasti glomerula i dilatiranost tubula ukazuju na veću mobilizaciju
bubrega u cilju što brže eliminacije ksenobiotika. Kod produženog izlaganja od 14
dana došlo je do dodatnog aktiviranja svih kapaciteta organizma i na biohemijskom
nivou u svim ćelijskim elementima. Izlučujući pesticid i njegovi metaboliti izazvali su
jak oksidativni stres, koji je uticao na aktivnost lizozoma, čijim prskanjem su
izazvane nekrotične pojave u oblasti bubrežnih tubula. Ovo je i razlog pojavi
hematurije kod tretiranih životinja. Nekrozom se gube funkcionalni bubrežni elementi
koje fokalno zamenjuje fibrozno tkivo, a što sve zajedno za posledicu ima smanjenje
mase bubrega.
24
5. Zaklju čak
Na osnovu iznetih rezultata ispitivanja uticaja Fastac-a na bubreg pacova mogu se izvesti sledeći zaključci:
� U tretmanu od 7 i 14 dana došlo je do povećanja telesne mase životinja.
� Kod tretiranih životinja u periodu od 7 i 14 dana izlaganje Fastac-u dovodi do smanjenja mase bubrega.
� Histološki na bubregu posle 7 dana nastaju prvi znaci toksičnog delovanja, koji se ogledaju u promeni izgleda bubrežnih kanalića.
� Posle 14 dana tretmana na bubregu se uočavaju drastične histološke promene, koje se ogledaju u degenerativnim promenama glomerula i bubrežnih tubula.
� Istraživanje je pokazalo da su priroda i intenzitet toksičnih simptoma proizvedenih delovanjem pesticida Fastac 10 EC vremenski zavisni.
25
6. Literatura
1. Amdur MO, Doull J, Klaassen, CD. (1993): Cassarett and Doull's Toxicology:
The Basic Science of Poisons. New York: McGraw-Hill, Inc. Lewis M. Gash
MDD
2. Burcham C. Philip (2013): An introduction toxicology- School of Medicine and
Pharmacology The University of Western Australia, 176-185.
3. Grewal K K, Sandhu G S, Kaur R, Brar R S, Sandhu H S. Toxic impacts of
cypermethrin on behavior and histology of certain tissues of albino rats. Toxicol
Int 2010;17:94-8
4. Gauyton, AC., Hall, E.J., (2003). Medicinska fiziologija, Beograd: Savremena
Administracija
5. http://www.agromarket.rs/srb/38/39/Zastita-bilja/Vise-o-Pesticidima
6. http://www.agro.basf.rs/agroportal/rs/media/migrated/basf_bro_ure_2013/flajeri_
2013/Fastac_2013.pdf
7. http://www.agrosava.com/proizvodi/insekticidi/Fastac/detaljnije-o proizvodu.html
8. http://www.agro.basf.rs/agroportal/rs/media/migrated/basf_bro_ure_2012/Jabuka
_katal og2.pdf
9. http://duochem.rs/insekticidi.html
10. http://www.stovet.rs/vocarstvo/pesticidi/insekticidi/?prod_id=1000003005654..
11. http://www.vet.bg.ac.rs/~farmakologija/Predavanja%20i%20vezbe/Predavanja/Pr
edavanja%20Prof.%20Trailovic%20TOKS/Trovanja%20piretroidima.pdf
12. http://vettehpet.wordpress.com/2012/03/19/ektoantiparazitici-najvazniji-
predstavnici/
13. Mokranjac ST. M. (2001): Toksikološka hemija, Beograd.
14. Macan J, et al. HEALTH EFFECTS OF PYRETRINS AND PYRETROIDS Arh
Hig Rada Toksikol 2006;57:237-243
15. Petrović, V.M., (1991): Uporedna fiziologija 1.deo. Zavod za udžbenike i
nastavna sredstva, Beograd.
16. Petrović, V.M., (1995): Uporedna fiziologija 2.deo. Zavod za udžbenike i
nastavna sredstva, Beograd.
26
17. Stefanović N., Antić S., Vasović Lj., Čukuranović R., Pavlović S., Arsić S.
(2004): Anatomija čoveka za studente farmacije. Medicinski fakultet, Niš.
18. Stajkovac, J., Amidžić, B., Biočanin, J.: 1st International Conference
″ECOLOGICAL SAFETY IN POST-MODERN ENVIRONMENT″ 26-27. Juny
2009. Banja Luka,RS, BiH
19. Teofilovski- Parapid G., Maliković A. (1997). Anatomija čoveka. Farmaceutski
fakultet, Beograd.
20. Štajn A., Žikić R. (1990). Vežbe iz fiziologije životinja. Prirodno–matematićki
fakultet, Kragujevac.
27
Biografija kandidata
Ana Petrović je rođena 4. septembra 1988. godine u Knjaževcu. Osnovnu školu
,,Timočki Partizani“ u Knjaževcu završava 2003. godine sa odličnim uspehom, i iste godine
upisuje Gimnaziju u Knjaževcu, prirodno-matematički smer. Nakon završetka srednje škole,
2007. godine upisuje osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu
Univerziteta u Nišu, Departman za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije
završava 2011. godine sa zvanjem ,,biolog“. Iste godine upisuje master akademske studije na
Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, smer -
Biologija. Master akademske studije završava 2014. godine sa zvanjem ,,master biolog“.
28
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Aна Петровић Ментор, МН: Љубиша Ђорђевић
Наслов рада, НР: Хистопатолошке промене бубрега код пацова соја Wistar третираних пестицидом Fastac 10 EC
Језик публикације, ЈП: српски
Језик извода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2014.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/цитата/табела/слика/графика/прилога)
27 страна; 24 слика; 2 табеле
Научна област, НО: Биологија
Научна дисциплина, НД: Физиологија животиња
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Fastac 10 EC; alfa-cipermetrin; bubreg; Wistar pacovi;
УДК 591.8: [ 599.324.2 + 591.46 + 632.95.02 ]
Чува се, ЧУ: библиотека
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: Циљ овог рада био је испитивање утицаја дате концентрације пестицида Fastac 10 EC на бубрег код пацова соја Wistar. Fastac је инсектицид са контактним и дигестивним делованјем, чија је активна материја алфа-циперметрин. Животиње су пестицидом третиране орално,путем сонде, у концентрацији 1,2 µl/дневно у периоду 7 и 14 дана у константним условима. Код третираних животиња у периоду од 7 и 14 дана излагање Fastac-у доводи до смањења масе бубрега. Хистолошки на бубрегу после 7 дана настају први знаци токсичног деловања, који се огледају у промени изгледа бубрежних каналића. После 14дана третмана на бубрегу се уочавају драстичне хистолошке промене, које се огледају у дегеративним променама гломерула и бубрежних тубула. Истраживање је показало да су природа и интезитет токсичних симптома произведених деловањем пестицида Fastac 10 EC временски зависни.
Датум прихватања теме, ДП: 16.4.2014
Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Др Перица Васиљевић
Члан: Др Јелка Црнобрња-Исаиловић
Члан, ментор: Др Љубиша Ђорђевић
29
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO:
Identification number, INO: Document type, DT: monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: Master thesis
Author, AU: Ana Petrovi ć
Mentor, MN: Ljubiša Đorđević
Title, TI: Histopathological changes in the kidney in Wistar r ats treated with pesticides Fastac 10 EC
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2014
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/a
27 pages ; 24 pictures; 2 tables
Scientific field, SF: Biology
Scientific discipline, SD: physiology of animals Subject/Key words, S/KW: Fastac 10 EC ; alpha - cypermethrin ; kidney ; Wist ar rats
UC 591.8: [ 599.324.2 + 591.46 + 632.95.02 ]
Holding data, HD: library
Note, N:
Abstract, AB : The aim of this study was to investigate the influence of given concentrations of pesticides Fastac 10 EC of the kidney in Wistar rats. Fastac is an insecticide with contact and digestive action, whose active ingredient is alpha - cypermehrin. The animals were orally treated with the pesticide, by gavage, at a concentration of 1.2 ml/day over 7 and 14 days in constant conditions. In the treated animals over a period of 7 and 14 days, exposure of Fastac leads to a reduction in mass of the kidney. Histologicaly, on the kidney after 7 days occured the first signs of toxic effects, which are reflected in changes in appereance of renal tubules. After 14 days of treatment in the kidney is observed drastic histological changes, which are reflected in degenerative changes in glomerul and renal tubules. Research has shown that the nature and intensity of the toxic symptoms produced by the action of the pesticides FASTAC 10 EC, weather dependent.
Accepted by the Scientific Board on, ASB : 16.04.2014.
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President: Dr Perica Vasiljević
Member: Dr Jelka Crnobrnja-Isailović
Member, Mentor: Dr Ljubiša Đorđević
