UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
academiejaar 2010 - 2011
PREVALENTIE VAN YERSINIA ENTEROCOLITICA
EN YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS
BIJ DE BELGISCHE VLEESVARKENS
door
Gerty VANANTWERPEN
Promotor: Prof. Dr. L. De Zutter
Medepromotor: Dierenarts I. Van Damme
Onderzoek in het kader van de Masterproef
De auteur en de promotor geven de toelating deze literatuurstudie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen hiervan te
kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met
betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht
betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor(en). De auteur en de promotor(en) zijn niet
verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
VOORWOORD
Bij deze gelegenheid wil ik Prof. Dr. Lieven De Zutter bedanken voor de toewijding die hij de
afgelopen drie jaar getoond heeft. Hij stond telkens klaar met verbeteringen, aanpassingen en
vernieuwende inzichten. Hij was altijd bereikbaar als ik hulp nodig had en vond het niet erg als ik na
een lange werkdag 's avonds nog bij hem kwam aankloppen.
Dan wil ik ook mijn welgemeende dank betuigen aan dierenarts Inge Van Damme. Ze heeft me steeds
met raad en daad bijgestaan bij alle mogelijke problemen in het labo en daarbuiten. Inge, je hebt me
meer geleerd dan labotechnieken, kolonies herkennen en PCR's tot een goed einde brengen. Bedankt
ook voor het gezelschap in de wekelijkse, nachtelijke uurtjes op maandag op weg naar het slachthuis.
Het is fijn te weten dat ik op je kan rekenen.
Ook mijn ouders, Marc Vanantwerpen en Gudrun Lagae, mogen niet vergeten worden. Jullie stonden
elke maandagochtend met mij op, of het nu 3u of 4u was. Papa, bedankt om me te helpen met het
bewerken en herwerken van de foto's en met het helpen oplossen van allerhande
computerproblemen.
Tot slot wil ik ook nog mijn vrienden, Nicky Van Der Vekens en Jorien De Loor, bedanken voor hun
begrip toen ik weinig tijd voor hen kon vrijmaken.
INHOUDSOPGAVE
Samenvatting ........................................................................................................................................ 1
1. Inleiding......................................................................................................................................... 2
1.1. Het genus Yersinia ............................................................................................................. 2
1.1.1. Yersinia pestis ............................................................................................................... 2
1.1.2. Yersinia pseudotuberculosis ....................................................................................... 3
1.1.3. Yersinia enterocolitica .................................................................................................. 4
1.1.4. Overige Yersiniae ......................................................................................................... 7
1.2. Humane Yersiniose ............................................................................................................ 7
1.3 Yersinia enterocolitica bij het varken ............................................................................ 9
2. Eigen onderzoek ....................................................................................................................... 12
2.1. Materiaal en methoden .................................................................................................... 12
2.1.1. Bereiding en interpretatie van de media ................................................................. 12
2.1.2. Methoden ..................................................................................................................... 14
2.1.2.1. Proefopzet ............................................................................................................ 14
2.1.2.2. Staalname ............................................................................................................ 14
2.1.2.3. Bereiding van de homogenaten ........................................................................ 16
2.1.2.4. Directe uitplating ................................................................................................. 17
2.1.2.5. Aanrijking in ITC .................................................................................................. 18
2.1.2.6. Koude aanrijking in PMB ................................................................................... 18
2.1.2.7. Aflezen van CIN-platen ...................................................................................... 18
2.1.2.8. Biochemische bevestiging ................................................................................. 18
2.1.2.9. DNA-extractie ...................................................................................................... 19
2.1.2.10. Polymerase Chain Reaction .............................................................................. 19
2.2. Resultaten........................................................................................................................... 21
2.2.1. Vergelijking van methoden ........................................................................................ 24
2.2.3. Prevalentie ................................................................................................................... 24
2.2.3. Telling ........................................................................................................................... 26
3. Discussie .................................................................................................................................... 29
4. Literatuurlijst ............................................................................................................................. 34
Bijlagen ................................................................................................................................................. 38
Bijlage I: enquête per slachthuis .................................................................................................. 38
Bijlage II: enquête per varken ....................................................................................................... 45
SAMENVATTING
Humaanpathogene Yersinia enterocolitica en Yersinia pseudotuberculosis veroorzaken intestinale
infecties bij mensen, voornamelijk bij jonge kinderen. Varkens zijn het hoofdreservoir van pathogene
Y. enterocolitica en infecties bij de mens worden vaak opgelopen door consumptie van
gecontamineerd varkensvlees.
Het doel van dit onderzoek was de contaminatie bepalen van varkenskarkassen met enteropathogene
Yersinia spp. in België. Hiervoor werden 180 vleesvarkens, afkomstig van 106 bedrijven, onderzocht
op het voorkomen van Y. enterocolitica en Y. pseudotuberculosis. Van elk varken werden zes stalen
genomen: de tonsillen, de darminhoud en swabs van het bekkenkanaal, het kapvlak, de borst en de
kauwspieren. Elk staal werd onderzocht volgens vijf verschillende methoden: (1) directe uitplating op
CIN-platen, (2) 2 dagen aanrijking in ITC met uitplating op CIN-platen, (3) 2 dagen aanrijking in ITC,
gevolgd door KOH-behandeling en uitplating op CIN-platen, (4) 7 dagen en (5) 14 dagen koude
aanrijking in PMB met uitplating op CIN-platen.
Uit het onderzoek bleek dat Y. enterocolitica bioserotype 4/O:3 geïsoleerd werd uit de tonsillen van
103 varkens (57,2%) en uit de darminhoud van 36 varkens (20,0%). Ook hadden 76 varkens (42,2%)
minstens één karkasswab waar Y. enterocolitica gedetecteerd werd. Vaak waren het de kauwspieren
(59/180) die positief testten, gevolgd door de borst (31/180). Het kapvlak en het bekkenkanaal waren
respectievelijk bij 17 en 15 varkens positief. Er waren 6 varkens (3,3%) waar Y. pseudotuberculosis
gedetecteerd werd. De beste methode om de stalen te onderzoeken was de 14 dagen koude
aanrijking.
Er is een groot aantal varkens drager van humaanpathogene Yersinia spp. in de tonsillen en in de
darmen op het moment van slachten. Daarenboven is een groot deel van de varkenskarkassen
gecontamineerd met humaanpathogene Y. enterocolitica op één of meerdere onderzochte
karkasplaatsen.
2
1. Inleiding
1.1. Het genus Yersinia
Het genus Yersinia behoort tot de familie van de Enterobacteriaceae en werd pas in 1944 als een
apart genus beschouwd op voorstel van Van Loghem. De naam van het genus verwijst naar de
Franse bacterioloog Alexandre Yersin. Hij beschreef als eerste de micro-organismen die de plaag
veroorzaakten (Brubaker, 1986; Bottone, 1999; Nesbakken, 2000; Carter en Wise, 2003).
Deze Gram-negatieve bacillen zijn oxidase negatief, facultatief anaëroob, catalase positief en vormen
geen sporen. Ze fermenteren glucose zonder vorming van gas maar met de productie van zuren. Ze
zijn kleiner dan de andere leden van de familie, met 0,5-0,8 µm in diameter en 1-3 µm in lengte
(Brubaker, 1986; Bottone, 1999; Wanger, 2007). Alle species behalve Yersinia pestis zijn dankzij
flagellen beweeglijk bij 22-30°C. Hun optimale groeitemperatuur ligt tussen 25-28°C, maar ze kunnen
vermenigvuldigen bij 4-43°C. Alle Yersinia-species bezitten weinig variatie in de keten van de
lipopolysacchariden, maar een grote variatie van O-antigenen (Carter en Wise, 2003; Wanger, 2007).
Het genus is onderverdeeld in zeventien species. Hiervan zijn er drie humaanpathogeen: Y. pestis, Y.
pseudotuberculosis en Y. enterocolitica (Anonymous, 2007a; Wanger, 2007). Deze drie species zijn
facultatief intracellulair en dringen voornamelijk macrofagen en fibroblasten binnen (Carter en Wise,
2003). Alle pathogene Yersinia bezitten een essentieel virulentieplasmide (plasmide voor Yersinia-
virulentie: pYV) van 70-75 kb. Het plasmide is verantwoordelijk voor de productie van het V
(immunogeen proteïne) - W (niet-beschermend lipoproteïne) - antigeen en de Yersinia outer
membrane proteïnen (de Yops). De genen die aan de basis liggen voor deze proteïnen komen dankzij
andere regulerende genen pas tot expressie bij een lage concentratie van Ca2+
en bij 37°C, en dus
niet bij 25°C (Brubaker, 1986; Bottone, 1997; Carter en Wise, 2003). Bij Y. pestis, Y.
pseudotuberculosis en Y. enterocolitica biotype 1B ligt op het chromosoom een hoog-pathogeniciteits-
eiland (HPI), dat het gen van het Yersiniabactine herbergt. Deze proteïne is een siderofoor die ijzer
levert aan de bacterie en leidt tot ergere infecties (Anonymous, 2007a; Wanger, 2007). Het pYV kan
verloren gaan in de loop van een te lange isolatieprocedure, bij cultuur op een magnesiumoxalaatagar
bij 37°C en bij een te lange bewaring bij frigotemperatuur (Nesbakken, 2000).
1.1.1. Yersinia pestis
Yersinia pestis is het primair agens van de zwarte dood en veroorzaakte rond 1350 het overlijden van
25% van de Europese bevolking (Brubaker, 1986). De laatste uitbraak in Europa was in 1720
(Anonymous, 2006). Vandaag komt Y. pestis niet meer in de Europese Unie voor (Anonymous, 2007a;
Anonymous, 2010). In de Verenigde Staten echter werden tussen 1910 en 1951 nog 523 klinische
gevallen gemeld, met een mortaliteit van 65% (Carter en Wise, 2003). Wereldwijd komen er jaarlijks
nog 3000 humane gevallen voor, waarvan 12-15 in de Verenigde Staten, vooral in New-Mexico en
Arizona (Wanger, 2007).
Het species werd in 1894 voor het eerst geïsoleerd door Alexandre Yersin, maar behoorde tot in 1944
tot het genus Pasteurella en wordt onderverdeeld in één serotype en drie biotypes, aangezien het O-
antigeen ontbreekt. Het bezit drie plasmiden (6, 45, 65 MDa) (Brubaker, 1986; Nesbakken, 2000;
Carter en Wise, 2003; Wanger, 2007). Op het kleinste plasmide liggen genen voor een lytisch
3
bacteriocine, een pesticine, een coagulase en enzymes met fibrinolytische activiteiten. Het grootste
plasmide herbergt de genetische code voor een exotoxine dat voornamelijk letaal is voor ratten en
muizen. Het plasmide van 45 MDa is het pYV (Brubaker, 1986; Bottone, 1997; Carter en Wise, 2003).
Het natuurlijk reservoir van de plaag wordt gevormd door wilde knaagdieren, vooral ratten en
eekhoorns, waarbij de overdracht via vlooien gebeurt en dus niet voedselgebonden is (Brubaker,
1986; Anonymous, 2007a; Wanger, 2007). Y. pestis overleeft en vermenigvuldigt in de maag en de
proventriculus van de vlo, waarbij de proventriculus geblokkeerd wordt. Hierdoor is de vlo
genoodzaakt zijn gastheer meerdere malen te bijten waarbij de kans op een bacteriële overdracht
vergroot wordt (Wanger, 2007). Accidenteel kunnen gedomesticeerde en wilde zoogdieren alsook
mensen geïnfecteerd worden na een vlooienbeet. De bacteriën vermenigvuldigen bij zoogdieren in de
regionale lymfeknopen in de buurt van de bijtwonde. Veel bacteriën worden in deze lymfeknopen
gedood door de neutrofielen (Carter en Wise, 2003). Na een incubatieperiode van 2-8 dagen
verschijnt bij de mens het klinisch beeld van de builenpest. Dit wordt veroorzaakt door de zwelling en
de abcedatie van de lymfeknopen, waarbij er sterfte kan optreden binnen 2-4 dagen. De
pneumonische vorm kan evolueren uit de builenpest of ontstaan door inhalatie van de micro-
organismen (Wanger, 2007). Deze vorm is zeer besmettelijk. De algemene symptomen zijn hoge
koorts en lethargie (Carter en Wise, 2003).
De diagnose kan gesteld worden door de detectie van de bacterie uit een aspiraat van een opgezette
lymfeknoop, uit het sputum, van een keelswab of uit het bloed van de patiënt. Er moet rekening
gehouden worden met de intermitterende aanwezigheid in het bloed. Bij directe microscopie van het
aspiraat, van weefsels of van een bloeduitstrijkje kunnen verschillende kleuringen gebruikt worden,
zoals de Giemsa-kleuring en methyleen-blauw waardoor de bipolair gekleurde bacteriën opvallen. Er
kan ook een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of een polymerase chain reaction (PCR)
gebruikt worden, hoewel de eerste commercieel niet voorhanden is. Isolatieprocedures via
cultuurmethodes worden niet vaak gebruikt omdat deze tijdrovend zijn (Wanger, 2007).
1.1.2. Yersinia pseudotuberculosis
Deze enteropathogeen is wijdverspreid in Europa. De meeste infecties worden in NO-Europa
vastgesteld (Anonymous, 2007a). Sinds 1998 heeft Finland jaarlijks grote uitbraken, ontstaan door
consumptie van zelfgekweekte groenten zoals ijsbergsla en wortels (Anonymous, 2006). De
belangrijkste humane infectiebronnen zijn rauwe groenten, fruit, water en direct contact met besmette
dieren (Anonymous, 2007b). De natuurlijke gastheren bestaan uit knaagdieren, konijnen en wilde
vogels, zoals merels en spreeuwen (Carter en Wise, 2003; Wanger, 2007).
Ook dit species werd tot 1944 tot het genus Pasteurella gerekend, en vertoont zeer sterke
gelijkenissen met Y. pestis (Wanger, 2007). Er zijn 15 serotypes bekend, waarvan het serotype O:1
het meest voorkomt bij humane en dierlijke infecties in Europa (meer dan 90% van de infecties),
gevolgd door serotype O:3 (Nesbakken, 2000; Carter en Wise, 2003; Anonymous, 2007a; Wanger,
2007). Beide serotypes bezitten het HPI. Alle stammen zijn echter potentieel pathogeen. Naast de
virulentiegenen gelegen op het pYV, bestaan er ook chromosomale virulentiegenen, zoals inv en ail,
die coderen voor de outer membrane proteïnen invasine en adherence invasion locus. Beiden staan
4
ze in voor de celadhesie en de celinvasie. Invasine bindt met de integrinereceptoren van de ileocecale
epitheelcellen. Hierdoor is orale transmissie van de micro-organismen mogelijk. Na orale opname en
aanhechting aan het epitheel van het ileum bereikt Y. pseudotuberculosis via de M-cellen de
mesenteriale lymfeknopen en de Peyerse platen waarin de bacteriën vermenigvuldigen (Bottone,
1997; Carter en Wise, 2003; Anonymous, 2007a).
Het species veroorzaakt minder ernstige systemische symptomen in vergelijking met Y. pestis, maar
zorgt wel voor gastro-intestinale aandoeningen bij mensen en wilde en gedomesticeerde vogels en
zoogdieren. Verder geeft de infectie aanleiding tot caseuze abcessen bij knaagdieren, katten en
kalkoenen, epididymo-orchitis bij de ram, abortus bij de geit en occasioneel ziekte bij varkens en
runderen. Y. pseudotuberculosis veroorzaakt vooral ziekte bij kinderen en jongvolwassenen. De
aandoening is vaak zelflimiterend. Soms wordt er mesenteriale lymphadenitis en septicemie
veroorzaakt, deze laatste vooral bij immuno-incompetente personen. De mogelijke complicaties op
langere termijn zijn erythema nodosum, het syndroom van Reiter en nefritis (Carter en Wise, 2003;
Wanger, 2007).
Isolatie is moeilijk aangezien er geen selectief medium bestaat dat voor alle stammen gebruikt kan
worden. Directe uitplating op conventionele enterische media is betrouwbaar voor mono-bacteriële
stalen. Voor andere stalen wordt een koude aanrijking gedurende twee weken aangeraden in
phosphate-buffered saline met 0,5% pepton, 1% mannitol en 0,15% galzout (PMB). De cefsulodine-
irgasan-novobiocine-agar (CIN) is de meest gebruikte selectieve plaat, hoewel sommige stammen hier
niet op groeien. Beter is om zowel een CIN als een MacConkey te gebruiken (Anonymous, 2007a).
1.1.3. Yersinia enterocolitica
Dit species werd voor de eerste maal beschreven in 1934 door McIver en Pike onder de naam
Flavobacterium pseudomallei. De bacteriën werden in 1939 geassocieerd met humane infecties en
kregen dankzij Schleifstein en Coleman in 1943 een nieuwe naam, Bacterium enterocoliticum
(Bottone, 1997; Bottone, 1999; Jungersen et al., 2006; Acha en Szyfres, 2007; Anonymous, 2007a).
Pas in 1964 werd door Frederiksen de definitieve naam toegewezen dankzij meerdere gevallen van
gastro-intestinale aandoeningen, en werd het lid van de familie van de Enterobacteriaceae (Bottone,
1997; Wanger, 2007). Het micro-organisme is ubiquitair in Europa (Anonymous, 2007a).
Deze micro-organismen zijn pleomorf: hun vorm varieert van kleine coccobacillen met afgeronde
uiteindes tot verlengde bacillen. Bij 22-25°C bezitten ze peritrich geplaatste flagellen, terwijl ze bij 35-
37°C aflagellair en dus onbeweeglijk zijn. Sommige stammen van serotype O:3 zijn bij beide
temperaturen onbeweeglijk (Bottone, 1999; Nesbakken, 2000). Y. enterocolitica vormt een zeer
heterogene groep die, op basis van biochemische eigenschappen, onderverdeeld is in zes biotypes
(Tabel 1) en gebaseerd op de somatische O-antigenen, in meer dan 70 serotypes (Wauters et al.,
1987; Anonymous, 2007a; Wanger, 2007; de Boer et al., 2008). Y. enterocolitica bezit zowel
pathogene als apathogene biotypes. Elk biotype heeft zijn eigen geografische spreiding (Tabel 2)
(Bottone, 1997; Anonymous, 2007a). Biotype 4 serotype O:3 en biotype 2 serotype O:9 zijn de
belangrijkste zoönotische pathogenen van het genus Yersinia in Europa (Anonymous, 2010). Enkel
het biotype is een betrouwbare indicator voor de pathogeniteit. Eén serotype kan tot meer dan één
5
Tabel 1. Schema voor biotypering (naar Wauters et al., 1987)
a + : positief, - : negatief, (+) : meestal weinig uitgesproken of vertraagd, V: variabel
biotype behoren, en kan dus zowel virulent als avirulent zijn (Anonymous, 2007a). Het serotype O:9
interfereert bij serologische reacties ter detectie van Brucella-species (Carter en Wise, 2003;
Jungersen et al., 2006; Acha en Szyfres, 2007). Hun bijna identieke O-antigenen staan onder leiding
van het perosamine synthetase gen (per) (Jacobsen et al., 2005). Het onderscheid tussen beide
species kan gemaakt worden op basis van de flagellaire antigenen, die Brucella niet bezit (Acha en
Szyfres, 2007). Ook Vibrio, Salmonella, Proteus en Escherichia coli kunnen kruisreacties met serotype
O:9 veroorzaken (Nesbakken, 2000).
test
biotype
1A 1B 2 3 4 5
Lipase (Tween-esterase) +a + - - - -
Hydrolyse van esculine + - - - - -
Salicine (zuurproductie) + - - - - -
Pyrazinamidase + - - - - -
Indolproductie + + (+) - - -
Xylose (zuurproductie) + + + + - V
Trehalose (zuurproductie) + + + + + -
Nitraatreductie + + + + + -
β-D-glucosidase + - - - - -
Voges-Proskauer + + + + + (+)
Proline peptidase V - - - - -
Enkel biotype 1A is niet humaanpathogeen en bezit dus ook geen pYV, terwijl biotype 1B als enige
biotype het HPI heeft (Brubaker, 1986; Carter en Wise, 2003; Anonymous, 2007a). De
humaanpathogene Y. enterocolitica bezitten het pYV en de chromosomale virulentiegenen inv en ail
(Bottone, 1997; Carter en Wise, 2003). De meeste stammen produceren het hitte-stabiel enterotoxine
Yst dat maximaal geproduceerd wordt onder 30°C en waarvan het gen yst op het chromosoom
gelegen is (Bottone, 1997; Carter en Wise, 2003).
Het aantal diersoorten waarbij Y. enterocolitica kan voorkomen is zeer groot. De bacteriën worden
hoofdzakelijk teruggevonden bij varkens, maar ook bij hazen, honden, konijnen, paarden, schapen,
geiten, runderen en verscheidene vogelsoorten. Katten kunnen zelfs een belangrijke vector zijn op
varkensbedrijven. Knaagdieren werden reeds aangeduid als reservoir voor serotypes O:8 en O:21 in
Japan. Het niet-pathogene biotype 1A wordt vaak aangetroffen in de omgeving, zoals in het water en
in de bodem (Nesbakken, 2000; Carter en Wise, 2003; Acha en Szyfres, 2007). De hoofdbron van
6
Tabel 2. Serotypes en distributie van de verschillende biotypes van Y. enterocolitica (Bottone, 1999; Anonymous,
2007a)
besmetting bij de mens is de consumptie van rauw of onvoldoende gekookt varkensvlees, gevolgd
door rundvlees, melk en afgeleide producten (Anonymous, 2006). Hoewel de bacteriën de
pasteurisatie van melk niet overleven, kan het zijn dat de melk besmet blijft indien er een zware
originele besmetting was (Acha en Szyfres, 2007).
biotype serotypes distributie
1A O:5, O:6,30, O:7,8, O:18 wereldwijd
omgeving, varkens, water, feces
1B O:8, O:21, O:13, O:7, en andere
vooral in Noord-Amerika en Japan, zeer zelden in Europa
leeft in de omgeving
2 O:9, O:5,27
frequent in Europa, belangrijkste biotype in het Verenigd Koninkrijk
varkens en runderen zijn dragers, weinig in de omgeving
3 O:3, O:5,27 zeer zelden in Europa
komt voor bij chinchilla’s en varkens
4 O:3 belangrijkste biotype in de meeste Europese landen
varkens en runderen zijn dragers, weinig in de omgeving
5 O:3, O:2,3, O:1,2,3 zeer zelden in Europa
komt voor bij hazen
De kiem hecht zich vast aan de mucuslaag van de gastro-intestinale epitheelcellen, penetreert deze
laag en hecht zich vast aan de microvilli van het darmepitheel. Deze aanhechting vindt voornamelijk
plaats in de ileocecale regio dankzij een groot, fibrillair outer membrane proteïne, YadA, waarvan de
genetische code gelegen is op het pYV. Zowel inv, ail en yadA zijn nodig om de infectie op te starten
en ontbreken bij biotype 1A. De bacteriën dringen binnen in de M-cellen waardoor ze toegang krijgen
tot de Peyerse platen en zo gastro-intestinale symptomen veroorzaken (Bottone, 1997; Bottone,
1999).
De symptomen zijn afhankelijk van de leeftijd en conditie van de gastheer en van de serogroep van Y.
enterocolitica. Jonge kinderen worden het frequentst geïnfecteerd. Vier tot zeven dagen na de
blootstelling ontstaat een enteritis of enterocolitis. Hierdoor krijgen ze, naast koorts, een waterige
diarree die vaak ook bloederig is en één tot drie weken kan duren. Oudere kinderen en volwassenen
kunnen een groter scala aan symptomen vertonen. Zij krijgen pijn in het rechterabdomen dat verward
kan worden met appendicitis. Deze pijn wordt veroorzaakt door een mesenteriale lymphadenitis of een
terminale ileitits. Vervolgens kan, vooral bij immunosuppressie, een septicemie optreden. Als gevolg
van deze septicemie ontstaan er (1) focale abcessen in de lever, de nieren, de milt en de longen, (2)
cutane aandoeningen zoals cellulitis, pyomyositis en pustules, (3) pneumonie, (4) meningitis, (5)
panophthalmie, (6) endocarditis en (7) osteomyelitis. Postinfectieus kan er reactieve artritis van één of
7
meerdere gewrichten, myocarditis, glomerulonephritis of erythema nodosum ontstaan. Het erythema
nodosum komt voornamelijk voor bij personen ouder dan 40, 1-2 weken na de enteritis. Personen die
de infectie overwonnen hebben kunnen nog meerdere maanden drager blijven (Bottone, 1997;
Anonymous, 2006; Acha en Szyfres, 2007; Wanger, 2007).
Voor de detectie van Y. enterocolitica worden verschillende methoden beschreven. De methoden die
in dit onderzoek gebruikt werden, zullen later beschreven worden. Enkel de methode van de
International Organization for Standardization (ISO), beschreven in ISO 10273:2003, zal hier van
naderbij bekeken worden. De ISO-methode is ontworpen voor de detectie in levensmiddelen en omvat
twee isolatieprocedures die parallel uitgevoerd worden voor een optimale detectie (de Boer et al.,
2008). Bij de eerste procedure worden de stalen aangerijkt in peptone, sorbitol en galzouten (PSB)
gedurende 2-3 dagen bij 22-25°C met beweging of gedurende 5 dagen zonder roeren. Daarna wordt
PSB na een KOH-behandeling overgebracht op een CIN-agar en geïncubeerd gedurende 24 h bij
30°C. Bij de tweede procedure worden de stalen aangerijkt in een irgasan-ticarcilline-
kaliumchloraatmedium (ITC) gedurende 48 h bij 24°C. Daarna wordt ITC overgeënt op een
Salmonella/Shigella-agar met deoxycholaat en calciumchloride (SSDC-agar) en geïncubeerd
gedurende 48 u bij 30°C. Dan worden er vijf karakteristieke kolonies afgenomen en uitgeplaat op een
algemene voedingsbodem, die 24 h bij 30°C geïncubeerd wordt. De verdachte kolonies worden
overgezet op een Kligler Iron Agar (KIA) en geënt in een Urea Broth volgens Christiansen (Ur).
Daarna worden nog biochemische testen uitgevoerd om het biotype te bepalen (Tabel 1)
(Anonymous, 2003).
1.1.4. Overige Yersiniae
De resterende species zijn niet humaanpathogeen (Anonymous, 2007a). Ze zijn echter toch belangrijk
omdat ze soms foutief aanzien worden voor pathogene species (Carter en Wise, 2003). Y. intermedia,
Y. frederiksenii en Y. kristensenii zijn saprofieten en behoren tot de normale flora van
ongecontamineerd stromend water. Y. ruckeri is pathogeen voor vissen (Carter en Wise, 2003). Y.
aldovae is te vinden in waterbronnen en Y. rohdei werd ontdekt in humane en caniene feces en
oppervlaktewateren (Bottone, 1997). Resterend zijn er nog Y. mollaretii, Y. bercovieri en Y. aleksiciae
(Anonymous, 2007a). Deze laatste werd vroeger tot Y. kristensenii gerekend, aangezien ze
fenotypisch identiek zijn (Wanger, 2007).
1.2. Humane Yersiniose
Yersiniose is in Europa de derde meest frequente zoönose, voorafgegaan door infecties met
Campylobacter en Salmonella. Onder de benaming humane yersiniose vallen alle infecties bij de
mens met de verschillende Yersinia-species, dus zowel de infecties met Y. pestis, Y.
pseudotuberculosis als met Y. enterocolitica. Aangezien Y. pestis niet meer in Europa voorkomt en Y.
pseudotuberculosis een zeer lage Europese prevalentie heeft, is het vooral Y. enterocolitica die
humane yersiniose veroorzaakt. Sinds 2001 is er een licht dalende trend op te merken in het aantal
gemelde gevallen (Fig. 1). In 2008 werden er 8346 gevallen van yersiniose in Europa gerapporteerd,
waarvan er 273 gemeld werden door België. Van die 8346 gevallen waren er 91,9% afkomstig van Y.
8
Fig. 1: Aantal gerapporteerde gevallen van humane yersiniose in Europa en België van 2001-2008
(Anonymous, 2006; Anonymous, 2007b; Anonymous, 2007c; Anonymous, 2009; Anonymous, 2010)
enterocolitica en maar 1,8% het gevolg van Y. pseudotuberculosis. Er werd geen informatie verstrekt
over de resterende 6,3%. Gebaseerd op het aantal gerapporteerde gevallen waren er in 2008 in
Europa 1,8 gevallen op 100000 inwoners. In Litouwen en Finland lag de incidentie respectievelijk op
15,9 en 11,5 gevallen op 100000 inwoners. Zes lidstaten van de Europese Unie lieten in 2008 22
voedseluitbraken ten gevolge van yersiniose optekenen. Enkel Finland en Frankrijk lieten deze
uitbraken verifiëren. In deze twee landen waren 53 personen betrokken waarvan er 11
gehospitaliseerd werden. De bron in Finland waren wortelen die gecontamineerd waren met Y.
pseudotuberculosis en 50 mensen besmetten (Anonymous, 2010).
Jonge kinderen tussen 1 en 4 jaar oud worden het vaakst geïnfecteerd, namelijk 25-32% van alle
infecties met Yersinia-species komen in deze leeftijdsgroep voor (Fig. 2). Deze kinderen krijgen 4-7
dagen na blootstelling een vaak bloederige diarree, die 1-3 weken kan aanhouden. Ongeveer een
kwart van de infecties verschijnen bij oudere kinderen van 5-14 jaar. De symptomen zijn gelijk met die
bij de volwassenen: pijn gesitueerd in het rechterabdomen, koorts, eventueel huiduitslag,
gewrichtspijn en septicemie (Anonymous, 2006).
0
200
400
600
800
1000
1200
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
aan
tal g
era
pp
ort
eerd
e g
ev
allen
jaartal
Europa (x10)
België
trendlijn Europa
9
Fig. 2: Yersiniose bij de verschillende leeftijdsgroepen in Europa (naar Anonymous, 2007c)
1.3 Yersinia enterocolitica bij het varken
Y. enterocolitica is dus een voedselgebonden pathogeen en varkensvlees wordt aanvaard als de
belangrijkste infectiebron. Dit gegeven kan aangetoond worden door het aantal gevallen van humane
yersiniose in België en het voorkomen van de consumptie van rauw varkensvlees te vergelijken met
de zeer lage incidentie van yersiniose in de moslimlanden, waar nauwelijks varkensvlees
geconsumeerd wordt. Dankzij de eigenschap om te vermenigvuldigen van -2 tot 42°C kan Y.
enterocolitica eventueel groeien in producten met een bewaartemperatuur van rond het vriespunt
(Nesbakken, 2000; Anonymous, 2007a).
De bacteriën worden bij varkens vooral teruggevonden in de mondholte, hoofdzakelijk op de tong en
in de tonsillen, gevolgd door de ingewanden en de feces (Nesbakken, 2000). De prevalentie van Y.
enterocolitica in Europa is zeer variërend (Fig. 3). Bij onderzoek van de tonsillen fluctueert de
prevalentie van 7,5% in Tsjechië tot 89% in Estland (Simonova et al., 2008; Martinez et al., 2009). Bij
onderzoek van de mest was dit 3,3% in Nederland en 16% in de regio van München (de Boer et al.,
2008; Fredriksson-Ahomaa et al., 2009).
Als de varkensbedrijven van naderbij bekeken worden, varieert het voorkomen van Y. enterocolitica
afhankelijk van het soort bedrijf. Uit een Noorse studie (Skjerve et al., 1998) die het voorkomen van
antistoffen tegen Y. enterocolitica O:3 onderzocht, blijkt dat 53,1% van de gesloten varkensbedrijven
besmet is, terwijl bij de vleesvarkensbedrijven 86,0% positief bevonden is. Op de
vermeerderingsbedrijven wordt Y. enterocolitica teruggevonden op 56,1% van de bedrijven, wat
overeenkomt met het voorkomen op de gesloten varkensbedrijven. Uit een andere studie (Virtanen et
al., 2011) blijkt dat er geen verschil bestaat in prevalentie tussen gesloten bedrijven en
vleesvarkensbedrijven.
0
2
4
6
8
10
12
14
0-4 5-14 15-24 25-44 45-64 ≥65
aan
tal g
eva
llen
pe
r 1
00
00
0 in
wo
ne
rs
leeftijdsgroep
10
Fig. 3: De prevalentie van Y. enterocolitica in Europa op basis van onderzocht
tonsillair weefsel bij vleesvarkens (Bonardi et al., 2003; Nesbakken et
al., 2003; Fredriksson-Ahomaa et al., 2007; Kechagia et al., 2007; de
Boer et al., 2008; Simonova et al., 2008 ; Laukkanen et al., 2009;
Martinez et al., 2009; Fredriksson-Ahomaa et al., 2010; Fondrevez et
al., 2010; Martinez et al., 2010; Van Damme et al., 2010; Martinez et
al., 2011)
Binnen deze bedrijven loopt de prevalentie van Y. enterocolitica bij de varkens ook uiteen. Op de
gesloten bedrijven en de vermeerderingsbedrijven bezitten respectievelijk 35,0% en 37,3% van de
varkens antistoffen, terwijl dit op de vleesvarkensbedrijven 66,0% is. Hieruit blijkt dat gesloten
bedrijven en vermeerderingsbedrijven een beschermende factor vormen ter preventie van de infectie
met Y. enterocolitica (Skjerve et al., 1998). Nowak et al. (2006) toonde aan dat op de organische
vleesvarkensbedrijven (voeder geproduceerd op het bedrijf zelf en geen antimicrobiële additieven in
het voeder) de prevalentie lager ligt dan op de conventionele vleesvarkensbedrijven. Dit werd ook
beweerd door Virtanen et al. (2011), die de organische bedrijven als een beschermende factor
beschouwde, maar dit wijdde aan de oudere slachtleeftijd van de varkens. De
binnenbedrijfsprevalentie van Y. enterocolitica varieert dus afhankelijk van het soort bedrijf (Nowak et
al., 2006).
11
De dynamiek van de infectie binnen een bedrijf is nog niet helemaal duidelijk. Een Amerikaanse studie
(Bowman et al., 2007), bij 2349 levende varkens van diverse leeftijden, toonde een significant verschil
aan in infectiestatus tussen de productiestadia. Enkel de feces en de oropharynx werden via isolatie
onderzocht. Twee van de 500 onderzochte, zogende biggen (0,4%) hadden pathogene Y.
enterocolitica. Amper 0,6% van de biggen uit de biggenbatterij waren positief, terwijl 5,2% van de
mestvarkens de bacterie in zich hadden, waarbij de prevalentie het hoogst was bij de oudere
vleesvarkens. Uit een Duitse studie (Gürtler et al., 2005) die enkel de feces onderzocht van 600
varkens en deze varkens opvolgde gedurende hun productie, bleek dat er geen besmetting
plaatsvond bij de zogende biggen en in de biggenbatterijen. Pas bij de vleesvarkens van 14 weken
oud, werd 2,8% van de varkens positief bevonden. Later, op 20 weken leeftijd, was 19,6% reeds
gecontamineerd. Naarmate de varkens ouder worden, neemt het aandeel van besmette dieren dus
toe.
Bij experimentele infecties vertonen alle varkens een seroconversie op dag 19 post infection (p. i.),
terwijl de feces van alle varkens bij isolatie positief zijn van dag 5 tot dag 21 p. i.. Op dag 49 p. i. is de
fecale uitscheiding gedaald tot 10% van de varkens en wordt er geen Y. enterocolitica meer
uitgescheiden 68 dagen p. i. (Nielsen et al., 1996).
Het onderzoek naar de natuurlijke en experimentele infecties kan ertoe leiden dat de methode en het
soort weefsel dat gebruikt wordt voor onderzoek, varieert naargelang de leeftijd van het varken. Via
bacteriële isolatie uit de tonsillen kunnen varkens van 85 dagen oud tot slachtleeftijd (6 maand)
bemonsterd worden. De isolatie uit de feces is betrouwbaar vanaf een leeftijd van 85 tot 135 dagen.
Dit betekent dat tijdens het slachten beter de tonsillen verzameld worden dan de feces. Serologisch
kunnen de varkens onderzocht worden van zodra ze 100 dagen oud zijn tot slachtleeftijd (Nesbakken
et al., 2006).
Er werd reeds beperkt onderzoek verricht op de varkensbedrijven om de risicofactoren en de
beschermende factoren voor infectie op te sporen. Als risicofactor kunnen strobedding in de hokken
van de slachtvarkens, dagelijkse aanwezigheid van katten in de stallen en het vervoer van varkens
naar het slachthuis met eigen transportmiddelen aangehaald worden (Skjerve et al., 1998). Een
verhoogde fecale uitscheiding van de bacteriën wordt bekomen bij varkens met een hogere
gezondheidsstatus, meer neuscontact en het gebruik van tetracyclines (Virtanen et al., 2011). Het
manueel voederen van slachtvarkens en onderdrukventilatie daarentegen worden opgevat als
beschermende factoren (Skjerve et al., 1998).
12
Tabel 3. Bereiding en interpretatie van de media nodig ter detectie van Y. enterocolitica en Y. pseudotuberculosis
2. Eigen onderzoek
Het beschreven onderzoek kadert in een project om de prevalentie van Y. enterocolitica en Y. pseudotuberculosis bij de vleesvarkens in België te bepalen,
aangezien in België hieromtrent geen gegevens beschikbaar zijn. Dit project loopt over een periode van één jaar, waaraan in het kader van deze Masterproef
zes maand meegewerkt is. Naast de bepaling van de prevalentie werden de gegevens ook gebruikt om de detectiemethodes te vergelijken en om de
risicofactoren op contaminatie in het slachthuis nader te bekijken. Voor dit laatste moeten de resultaten van de volledige studie afgewacht worden omdat er nu
te weinig gegevens beschikbaar zijn.
2.1. Materiaal en methoden
2.1.1. Bereiding en interpretatie van de media
medium bestanddelen voor 1 l bereiding a, b,c
interpretatie en opmerkingen
Phosphate-Buffered Saline met
0,5% pepton, 1% mannitol en
0,15% galzout (PMB)
5 g Tryptone (Lab M Limited,
Lancashire, Verenigd
Koninkrijk)
10 g D-mannitol (Sigma)
8,23 g Disodium Hydrogen
Phosphate (Merck, Overijse,
België)
1,2 g Sodium Dihydrogen
Phosphate Monohydrate
(Merck)
1,5 g Bile Salts (Oxoid,
Basingstoke, Verenigd
Koninkrijk)
5 g NaCl
1 l gedeïoniseerd water
Oplossen, pH aanpassen naar 7,6,
gedeelte overbrengen naar proefbuizen (20
ml per buisje), autoklaveren,
1 maand houdbaar bij 4°C
13
a autoklaveren: sterilisatie bij 121°C gedurende 15 min
b ureum autoklaveren: sterilisatie bij 115°C gedurende 20 min
c pH: (± 0,2) bij 25°C
medium bestanddelen voor 1 l bereiding a, b,c
interpretatie en opmerkingen
Irgasan-Ticarcilline-
Kaliumchloraatmedium (ITC)
62 g ITC Broth (Sigma,
Steinheim, Duitsland)
970 ml gedeïoniseerd water
1 g KClO3
Oplossen, autoklaveren, pH aanpassen
naar 6,9, verdeling: 45 ml per buis en
90 ml per fles, net voor gebruik 45 μl
ticarcilline (1 mg/ml) (Sigma) aan de
buizen en 90 μl ticarcilline (1 mg/ml)
aan de flesjes toevoegen
1 maand houdbaar bij 4°C
Yersinia Cin Schiemann Agar
(CIN)
aangekocht bij Bio-Rad (Eke, België)
Plate Count Agar (PCA) 20,5 g Plate Count Agar (Bio-
Rad, Marnes-La-Coquette,
Frankrijk)
1 l gedeïoniseerd water
Oplossen, koken, autoklaveren,
verdeling: 60 petriplaten, eindpH 7,0
1 maand houdbaar bij 4°C
fijne, niet-gepigmenteerde culturen zijn
verdacht
Kligler Iron Agar (KIA) 55 g Kligler Iron Agar (Oxoid)
1 l gedeïoniseerd water
Oplossen, koken, pH aanpassen naar
7,4, verdeling: 7,5 ml per buisje,
autoklaveren, schuin houden tot ze
afgekoeld zijn
1 maand houdbaar bij 4°C
tongverkleuring wijst op
lactosefermentatie
geel: +
rood: -
stompverkleuring wijst op
glucosefermentatie
geel: +
rood: -
zwartverkleuring wijst op H2S-vorming
gasvorming wijst op de aanwezigheid van
gasvormende bacteriën
Urea Broth volgens Christiansen
(Ur)
9 g Urea Broth Base (Oxoid)
950 ml gedeïoniseerd water
50 ml Supplement Urea (40%)
(Oxoid)
Oplossen, autoklaveren, afkoelen, pH
aanpassen naar 6,8, supplement
toevoegen, verdeling: 2 ml per buisje
1 maand houdbaar bij 4°C
geel: -
roze: +
Trypton Soya Broth (TSB) 30 g T. C. S. (Bio-Rad)
1 l gedeïoniseerd water
Oplossen, pH aanpassen naar 7,3,
verdeling: 5 ml per buisje, autoklaveren
1 maand houdbaar bij 4°C
14
2.1.2. Methoden
2.1.2.1. Proefopzet
Er werd een selectie gemaakt uit alle Belgische varkensslachthuizen. De voorwaarde was dat ze meer
dan 100000 varkens per jaar slachten. De selectie bestond uit 22 slachthuizen. De computer koos hier
ad random tien slachthuizen uit. Op deze manier kon de prevalentie van Y. enterocolitica en Y.
pseudotuberculosis in België onderzocht worden. De gekozen slachthuizen werden op voorhand
allemaal eens bezocht en er werd een enquête ingevuld (bijlage I). Hierbij werd de organisatie van de
infrastructuur, het slachtritme, de verschillende stadia van het slacht- en het evisceratieproces, de
reiniging en de desinfectie van de gebruikte messen en apparatuur bekeken. Het is de bedoeling elk
slachthuis vier maal te bezoeken. In het kader van deze masterproef werd elk slachthuis twee keer
bezocht. Door het stoppen van de werkzaamheden van één van de uitgekozen slachthuizen tijdens
deze proef, werden uiteindelijk twee keer negen slachthuizen bezocht. Tijdens elk slachthuisbezoek
werd tijdens de staalnames opnieuw een enquête ingevuld, waarbij het klopnummer van de
bemonsterde varkenskarkassen werd genoteerd en gelet werd op de reiniging en desinfectie van de
messen bij het verwijderen van de buikorganen en de hartslag en op het aansnijden van de darmen
(bijlage II).
2.1.2.2. Staalname
Alle bemonsteringen gebeurden telkens op een maandagochtend. De staalnames werden aangevat
binnen 15 min na de aanvang van de evisceratie van het eerste varken en telkens werd om het
kwartier een varken bemonsterd. Van telkens tien varkens werden de volgende zes stalen genomen:
het rectum (D), de tonsillen (T) en vier karkasswabs (K1 tot K4), namelijk ter hoogte van het
bekkenkanaal (K1), het kapvlak (K2), de borst (K3) en de kauwspieren (K4) (Fig. 4). Er werden 106
loten bemonsterd. Het aantal bemonsterde varkens per lot varieerde van 1 tot 6.
Aan het begin van de evisceratie, net na het opensnijden van de buikholte, worden de buikorganen uit
het karkas verwijderd. Op dit moment werd dit maagdarmpakket opgevangen en bijgehouden in een
grote, genummerde plastiekzak. Wanneer de tijd er zich toe leende, tussen de andere staalnames
door, werd de zak geopend en het rectum opgezocht. Op de plaats waar het colon in het rectum
overgaat, werden twee koordjes vastgemaakt om het rectum af te binden, waarna tussen de touwtjes
een incisie gemaakt werd. Het rectum werd overgebracht in een nieuwe, kleinere plastiekzak.
De tonsillen (tonsilla veli palatini) werden op steriele wijze zo volledig mogelijk uit de hartslag, uit de
kop of uit beiden verwijderd. De plaats waar de tonsillen teruggevonden werden, was afhankelijk van
de manier waarop het slachthuispersoneel de hartslag uitsneed (Fig. 5a en Fig. 5b). Het tonsillair
weefsel werd in een steriel zakje overgebracht.
Aan elke steriele cellulosespons (3MTM
Sponge-Stick SSL100, 3M, Diegem, België) werd net voor de
bemonstering 20 ml PMB toegevoegd. De swab werd doorheen zijn steriele zakje enkele keren
leeggedrukt en losgelaten zodat de PMB in voldoende mate door de swab opgenomen werd en de
swab voldoende bevochtigd werd. Er werd bemonsterd na het klieven van het karkas, zodat per
varken afwisselend de linker- of de rechterkarkashelft bemonsterd kon worden.
15
Fig. 4: Bemonsteringsplaatsen op het karkas
De onderzochte oppervlakte per bemonsteringsplaats was steeds ± 100 cm² groot. De eerste plaats
die afgeswabt werd, was het bekkenkanaal ter hoogte van de passage met de anusboor. Deze plaats
werd gekozen om fecale verontreiniging te detecteren. Het tweede staal werd genomen tussen de
sacraalwervels en de dorsale huid (het kapvlak) om bacteriële overdracht via de kapmachine te
ontdekken. Vervolgens werd met een derde swab de huid net achter de voorpoot (de borst) en de
borstspieren bemonsterd. Ook op deze plaats kan fecale verontreiniging voorkomen. De laatste swab
werd genomen van de kauwspieren waarbij er op gelet werd de tonsillaire regio te vermijden om
kruiscontaminatie tijdens de staalname te voorkomen. Deze plaats werd gekozen om de invloed van
het opensnijden en de manipulatie aan de kop te bekijken. Soms werd er geswabt wanneer het karkas
voor dit onderzoek even van de slachtlijn gehaald werd, in andere slachthuizen werden de stalen
16
Fig. 5a: De tonsilla veli palatini ter hoogte van de
hartslag: (A) er zijn geen tonsillen meer
aanwezig, (B) nog één tonsil aanwezig of
(C) beide tonsillen aanwezig
genomen terwijl het varken de slachtlijn bleef volgen. De steel van de swabs werd afgebroken zodat
de genummerde zakjes gesloten en getransporteerd konden worden.
Na tien varkens bemonsterd te hebben, werden alle stalen gekoeld getransporteerd naar het
laboratorium van de Vakgroep Veterinaire Volksgezondheid en Voedselveiligheid van de Faculteit
Diergeneeskunde van de Universiteit Gent, om daar verder onderzocht te worden.
2.1.2.3. Bereiding van de homogenaten
De stalen werden bij aankomst in het labo onmiddellijk verder verwerkt tot homogenaten, die als basis
dienden voor de verschillende analysen (Fig. 6).
Het zakje van de tonsillen werd steriel opengeknipt, waarna de tonsil op steriele wijze van zijn
omgevende weefsel ontdaan werd en in kleine stukjes werd verdeeld. Daarna werd een hoeveelheid
van 11 g tonsillair weefsel in een steriele stomacherzak afgewogen en aangevuld met 99 ml PMB. De
zak werd overgebracht in een Colworth Stomacher 400 (Seward, West Sussex, Verenigd Koninkrijk)
en gedurende 2 min gehomogeniseerd. Het rectum werd uit de transportzak gehaald en het uiteinde
waar nog een koordje aan bevestigd was, werd 2 s in de ethanol ondergedompeld. Nadat de ethanol
verdampt was, werd net naast het koordje een dwarse incisie gemaakt. Vervolgens werd de mest naar
deze nieuwe opening gemasseerd en werd 11 g darminhoud naar buiten geduwd en in een steriele
filterzak overgebracht. Indien dit niet lukte, werd met een propje watte dat bevochtigd was met
ethanol, de darmwand over zijn volledige lengte gesteriliseerd. Daarna kon hier een longitudinale
incisie gemaakt worden waardoor de darmmucosa zichtbaar werd. De darminhoud kon dan van deze
darmmucosa afgelepeld worden. In de filterzak werd de darminhoud aangelengd met PMB tot een
verhouding 1/10 ontstond. De zak werd overgebracht in de stomacher en gedurende 2 min
gehomogeniseerd. De verdere verwerking van de karkasswabs bestond uit het stomacheren van de
zakjes. Op deze manier werden alle stalen verwerkt tot homogenaten die gebruikt werden voor de
directe uitplating, de aanrijking in ITC en de koude aanrijking.
Fig. 5b: De tonsilla veli palatini zijn nog
aanwezig in de kop
17
Fig. 6: Gevolgde methode ter detectie en bevestiging van Y. enterocolitica en Y. pseudotuberculosis
2.1.2.4. Directe uitplating
Er werd tweemaal 0,5 ml van alle homogenaten (T, D, K1-K4) drooggespateld op een CIN-plaat en de
T- en D-homogenaten werden ook met de spiraalenter (Eddie Jet, IUL Instruments, Barcelona,
Spanje) op een CIN-plaat uitgeënt. Alle platen werden geïncubeerd bij 30°C gedurende 24 h. Tien ml
van zowel T- als D-homogenaten werden overgebracht in flesjes met 90 ml ITC, waarna dit flesje
geschud werd en geïncubeerd werd bij 25°C gedurende 48 h. Vijf ml PMB die uit de swab gedrukt
werd, werd overgebracht in een proefbuis met 45 ml ITC, die na het schudden met een vortex 48 h bij
25°C geïncubeerd werd. Er werd nog 11 ml steriele PMB aan de swab toegevoegd, waardoor de swab
bijna volledig ondergedompeld was in PMB. Alle homogenaten met PMB werden geïncubeerd bij 4°C
(frigotemperatuur).
T + PMB
D + PMB
K1-K4 + PMB
T, D: 90 ml ITC
K1-K4: 45 ml ITC
2 X (0,5 ml op CIN)
T, D: 10 ml
K1-K4: 5 ml
48 h bij 25°C
0,5 ml in
4,5 ml KOH
(0,5%)
7 d bij 4°C
7 d bij 4°C
0,5 ml in 4,5 ml
KOH (0,25%)
T, K1-K4: 10 μl op CIN
D: 100 μl op CIN
100 μl op CIN 100 μl op CIN 100 μl op CIN
24 h bij 30°C 24 h bij
30°C 24 h bij 30°C 24 h bij
30°C
24 h bij
30°C
verdachte kolonies uitplaten op PCA
enten op Ur, KIA en TSB
DNA-extractie
multiplex PCR
24 h bij 30°C
24 h bij 30°C
urease +
glucose +
lactose –
H2S –
gas –
18
2.1.2.5. Aanrijking in ITC
Na twee dagen incubatie bij 25°C in ITC werden de flesjes en proefbuizen nog eens geschud met een
vortex. Van de ITC (T en K1-K4) werd telkens met een öse 10 μl geënt op een CIN-plaat. Honderd μl
ITC, dat afkomstig was van de darminhoud, werd eveneens uitgestreken op een CIN-agar. Er werd
ook een alkalibehandeling voor het uitplaten uitgevoerd. Daartoe werd 0,5 ml ITC overgebracht in
proefbuizen met 4,5 ml KOH-oplossing (0,5% KOH in 0,5% NaCl) en met een vortex geschud. Na een
contacttijd van 20 s werd 100 μl van het homogenaat op een CIN-plaat geënt. Alle CIN-agars werden
gedurende 24 h bij 30°C geïncubeerd.
2.1.2.6. Koude aanrijking in PMB
Na één week bij 4°C geïncubeerd te zijn, werd van elk zakje (T, D en K1-K4) met PMB 100 μl
uitgeplaat op een CIN-agar. Deze platen werden dan 24 h bij 30°C geïncubeerd. De zakjes met PMB
werden terug in de frigo geplaatst om verder bij 4°C te incuberen.
Veertien dagen na de staalname, werden de PMB-oplossingen (T, D en K1-K4) voor de derde keer
geënt. Hiervoor werd 0,5 ml PMB samengebracht met 4,5 ml KOH-oplossing (0,25% KOH in 0,75%
NaCl) en met een vortex geschud. Na 20 s werd 100 μl overgebracht op een CIN-plaat en
uitgestreken. De CIN-platen werden 24 h bij 30°C geïncubeerd.
2.1.2.7. Aflezen van CIN-platen
Alle CIN-platen werden na één dag incubatie zowel macroscopisch als onder een stereomicroscoop
met Henry-belichting (Olympus, Aartselaar, België) bekeken. Bij aanwezigheid van verdachte kolonies
werd minstens één kolonie afgenomen en overgezet op een PCA-plaat. Dit konden zowel kolonies zijn
met het typisch uitzicht van Y. enterocolitica of Y. pseudotuberculosis, als kolonies die morfologische
gelijkenissen vertoonden met deze bacteriën. De PCA-platen werden 24 h bij 30°C geïncubeerd. De
CIN-platen werden 24 h later nogmaals bekeken, om de trager groeiende Y. pseudotuberculosis niet
te missen.
2.1.2.8. Biochemische bevestiging
Indien de groei op de PCA-plaat de aanwezigheid van Y. enterocolitica of Y. pseudotuberculosis liet
vermoeden, werd van elke detectiemethode één PCA-cultuur geënt op TSB, Ur en KIA. Bij lichte
morfologische afwijkingen werd de cultuur ook geënt. Hiervoor werd met een gesteriliseerde entnaald
een deel van de cultuur op PCA afgenomen en een klein entpuntje werd geplaatst net boven het
vloeistofoppervlak van de schuingehouden TSB- en Ur-buisjes. Met diezelfde entnaald werd daarna
over de tong van de KIA gestreken en daarna tot op de bodem doorgestoken. Zowel de TSB, de Ur
als de KIA werden 24 h bij 30°C geïncubeerd. Enkel indien de Kligler Iron Test en de Ureum Test
lieten blijken dat de stammen positief waren voor urease en glucose, negatief voor lactose en H2S en
er geen gasvorming optrad, werden lysaten van de culturen gemaakt.
19
2.1.2.9. DNA-extractie
Er werd 100 μl aangerijkte TSB overgebracht in een 1,5 ml epje (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) en
gecentrifugeerd gedurende 2 min bij 12000 tpm. Hierna werd het supernatans verwijderd en 50 μl
PrepMan® Ultra (Applied Biosystems, Foster City, Verenigde Staten) toegevoegd waarmee de pellet
gesuspendeerd werd. Alle epjes werden gemengd met een vortex waarna ze gedurende 10 min in
een heat-block (Grant, Cambridge, Verenigd Koninkrijk) werden geplaatst bij 100°C. Na 2 min
afkoeling op kamertemperatuur werden de epjes terug 2 min gecentrifugeerd aan 12000 tpm. Er werd
30 μl supernatans overgebracht in een nieuw 1,5 ml Eppendorf-epje en ingevroren bij -20°C.
2.1.2.10. Polymerase Chain Reaction
Elk staal werd gebruikt in twee multiplex PCR reacties om het serotype en de virulentiefactoren op te
sporen. Hiertoe werden de epjes ontdooid en werd er telkens 2,5 μl toegevoegd aan 22,5 μl PCR-mix
in 0,2 ml Eppendorf-epjes. Voor één staal bestaat de PCR-mix uit 1x PCR-buffer (Promega, Leiden,
Nederland), 200 μM dNTP Mix (Invitrogen, Carlsbad, Verenigde Staten), 1,5 mM MgCl2 (Promega),
0,5 mM per primer (Invitrogen, Paisley, Verenigd Koninkrijk), 1 U Taq DNA polymerase (Promega).
Deze mix werd dan aangevuld tot 22,5 μl met water.
Aan de eerste multiplex PCR (PCR 1) werden nog twee controles toegevoegd: een positieve controle
met DNA van een O:3 referentiestam en een negatieve controle zonder DNA. Bij de tweede multiplex
PCR (PCR 2) werden drie controles gebruikt: twee positieve controles met DNA van een O:3 en een
O:9 referentiestam, en een blanco. Het DNA gebruikt voor de positieve controles, is meer
geconcentreerd dan het DNA van de lysaten. Er werd hierdoor 0,5 μl aan 22,5 μl PCR-mix
toegevoegd.
Al deze epjes werden in de iCycler® (Bio-Rad) geplaatst om de PCR amplificatie uit te voeren. De
amplificatie volgde verschillende stappen. Bij de eerste stap werd het DNA gedenatureerd bij 94°C
gedurende 4 min. Daarop volgden 30 cycli van 3 stappen: denaturatie bij 94°C gedurende 30 s,
aanhechting van de primer bij 55°C gedurende 30 s en primerextensie bij 72°C gedurende 1 min. De
derde stap is een finale extensie bij 72°C gedurende 7 min. Bij PCR 1 werden de genen ail, yst en virF
geamplificeerd om aan te tonen dat het om een pathogene Y. enterocolitica gaat en om het
virulentieplasmide op te sporen. Bij de PCR 2 werden per en rfbC vermenigvuldigd om het serotype te
bepalen. Deze twee genen staan in voor de detectie van respectievelijk serotype O:9 en serotype O:3
(Weynants et al., 1996; Jacobsen et al., 2005). Indien het staal verdacht was van Y.
pseudotuberculosis, werd een derde PCR (PCR 3) uitgevoerd om het gen inv te detecteren De
aanhechting van de primer gebeurde dan bij 58°C. Het geamplificeerde product mocht geen gelijkenis
vertonen met het inv van Y. enterocolitica (Tabel 4) (Nakajima et al., 1992).
20
Tabel 4. Sequentie van de gebruikte primers en de grootte van het geamplificeerde product
Tabel 5. Bestanddelen en bereiding van een 1,5% agarosegel voor 20 stalen
a De bestanddelen voor TBE zijn voor de bereiding van 1 l TBE (10x)
primer oligonucleotidesequentie (5’-3’) grootte van het geamplificeerde
product (bp) referentie
ail-a TGG TTA TGC GCA AAG CCA TGT 356 Harnett et al., 1996
ail-b TGG AAG TGG GTT GAA TTG CA
yst-a GTC TTC ATT TGG AGG ATT CGG C 134 Harnett et al., 1996
yst-b AAT CAC TAC TGA CTT CGG CTG G
virF-a GCT TTT GCT TGC CTT TAG CTC G 231 Harnett et al., 1996
virF-b AGA ATA CGT CGT CGC TTA TCC
per-a TGT GCT GAA GCT TTT GGA TCT 181 Jacobsen et al., 2005
per-b GAG GCC GAT ACA CCT TGAT T
rfbC-a CGC ATC TGG GAC ACT AAT TCG 253 Weynants et al., 1996
rfbC-b CCA CGA ATT CCA TCA AAA CCA CC
inv-a TAA GGG TAC TAT CGC GGC GGA 295 Nakajima et al., 1992
inv-b CGT GAA ATT AAC CGT CAC ACT
Na de amplificatie werd 10 μl van de stalen geladen in een 1,5% agarosegel (Tabel 5). Aan het begin
van elke rij werd 7 μl van een 100 bp DNA ladder (Invitrogen) geplaatst. De controles werden op het
einde geladen. Daarna werd gedurende 1 h de electroforese (120 V) voltooid. De gel werd dan
overgebracht in een bad met ethidium-bromide (Sigma) waardoor de DNA-bandjes gedurende 30 min
konden kleuren. Toen werd de gel uit het bad genomen en onder UV-licht geplaatst. Zo konden de
DNA-banden gevisualiseerd worden en werd een foto genomen.
eindproduct bestanddelena bereiding
Tris-H3BO3-EDTA (TBE) (10x)
108 g Tris (USB
Corporation, Cleveland,
Verenigde Staten)
55 g boorzuur (Sigma)
40 ml 0,5M EDTA (Sigma)
960 ml gedeïoniseerd water
Oplossen, autoklaveren, voor gebruik verdunnen met 9 l gedeïoniseerd water (1x)
1,5% agarosegel 1,35 g agarose (Invitrogen)
90 ml TBE (1x)
Mengen, opwarmen tot alles opgelost is, gel gieten
21
Fig. 7a: Morfologie van kolonies gevonden op de CIN-platen. De drie bovenste foto’s zijn kolonies van Y.
enterocolitica, de drie onderste foto’s bleken na PCR geen Y. enterocolitica te zijn
2.2. Resultaten
De selectie van verdachte kolonies gebeurde op basis van de morfologie van de kolonies op de CIN-
platen. De morfologie van Y. enterocolitica na 24 h incubatie is meestal zeer typisch en gemakkelijk
herkenbaar (Fig. 7a) indien er zich geen interfererende kolonies in de omgeving bevinden (Fig. 7b).
De verdachte kolonies zijn klein met een rood centrum en een witte rand met een directe overgang, ze
zijn microscopisch fijn gekorreld en niet-iriserend. Na nogmaals 24 h bewaring bij kamertemperatuur
verandert de morfologie (Fig. 7c). De morfologie van Y. pseudotuberculosis was minder duidelijk. De
kolonies op de CIN-platen zijn nog kleiner en volledig wit (Fig. 8). Door de CIN-platen 24 h na
incubatie op kamertemperatuur te bewaren, zijn de kolonies beter waarneembaar.
22
Fig. 7b: Morfologie van Y. enterocolitica bij
aanwezigheid van interfererende kolonies
Fig. 7c: Morfologie van Y. enterocolitica na 48 h
Fig. 8: Morfologie van Y. pseudotuberculosis na 24 h
Bij de eerste bevestiging werd de morfologie van de kolonies op de PCA-platen gebruikt. De
streepentingen moeten een fijne, rechtlijnige structuur hebben, zonder woekeringen van
snelgroeiende bacteriën. De cultuur mag niet gepigmenteerd zijn.
De tweede bevestiging steunde op de kleuromslagen van KIA en Ur (Fig. 9). De roze kleurverandering
bij Ur wijst op de aanwezigheid van urease en is indicatief voor Yersinia-species behalve voor Y.
pestis (Brubaker, 1986). Bij KIA worden verschillende biochemische eigenschappen onderzocht:
lactosefermentatie, glucosefermentatie, H2S-vorming en gasvorming. De lactosefermentatie vindt
plaats in de tong van de KIA. Een rode tong duidt op de afwezigheid van deze lactosefermentatie. De
stomp van de KIA is de plaats voor glucosefermentatie. De kleuromslag van rood naar geel wijst op de
capaciteit van de bacteriën om glucose te fermenteren. Y. enterocolitica en Y. pseudotuberculosis
kunnen geen lactose fermenteren, maar wel glucose. Daarenboven vormen ze geen H2S of gas.
23
Fig. 10: Een PCR 1 van 9 stalen. Stammen a, b, d, e, f, g en h zijn Y. enterocolitica met pYV. Stam c is Y.
enterocolitica zonder pYV. Stam i is geen pathogene Y. enterocolitica.
Fig. 9: De gewenste kleuromslagen van KIA en Ur. Van links naar rechts: niet-geënte en geënte KIA, niet-
geënte en geënte Ur.
De derde en laatste bevestiging gebeurde aan de hand van PCR 1, PCR 2 en eventueel PCR 3. De
PCR 1 werd gebruikt voor de detectie van de chromosomale virulentiegenen ail en yst en van het gen
virF dat op het virulentieplasmide ligt (Fig. 10). Via de PCR 2 wordt het serotype bepaald door het
opsporen van per en rfbC, die respectievelijk instaan voor serotype O:9 en serotype O:3. De PCR 3
werd enkel gebruikt wanneer de stam verdacht was voor Y. pseudotuberculosis, zodat het
speciespecifieke gen inv opgespoord werd.
2072 bp
1500 bp
1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
lad
der
a
b
c
d
e
f g
h
i O:3
O:9
bla
nco
356 bp ail 231 bp vir F 134 bp yst
24
Tabel6. Het aantal varkens met Y. enterocolitica en de vergelijking van de gebruikte methodes.
2.2.1. Vergelijking van methoden
Er werd gebruik gemaakt van vijf verschillende methoden om Y. enterocolitica en Y.
pseudotuberculosis op te sporen.
Geen enkele methode was in staat om alle Y. enterocolitica positieve stalen op te sporen (Tabel 6).
Met de methode PMB + KOH + CIN werd 93,5% van de positieve stalen (201/215) gedetecteerd. Het
percentage positieve stalen bekomen met de andere vier methoden was significant lager: direct CIN:
54%, ITC + CIN: 48,8%, ITC + KOH +CIN: 59,5% en PMB + CIN: 53,0%. Deze percentages waren
onderling niet significant verschillend. Het aantal positief bevonden stalen was echter afhankelijk van
het type staal. Met deze vier methoden werden ongeveer 2/3 van de positieve tonsillen gedetecteerd,
terwijl het aantal gevonden positieven bij darminhoud ongeveer 1/2 was en bij karkas 1/3 of minder,
met uitzondering voor PMB + CIN.
Het aantal positieve stalen bekomen met de direct CIN voor tonsillen en karkas was hoger dan na
aanrijking in ITC. De methoden waarbij KOH gebruikt wordt (ITC + KOH + CIN en PMB + KOH + CIN)
vertoonden steeds een hogere detectiegraad dan dezelfde methoden zonder KOH (ITC + CIN en PMB
+ CIN). Dit komt doordat de storende, begeleidende flora gedood wordt door de KOH. Y. enterocolitica
krijgt dus meer kans om uit te groeien en gedetecteerd te worden.
Slechts uit een beperkt aantal stalen kon Y. pseudotuberculosis geïsoleerd worden. Bij één varken
waren de tonsillen positief met direct CIN, ITC + KOH + CIN, PMB + CIN en PMB + KOH + CIN . De
tonsillen van 3 andere varkens werden positief bevonden met PMB + CIN en PMB + KOH + CIN. De
darminhoud was één keer positief en dit werd ontdekt met de methode PMB + KOH + CIN. Ook de
kauwspieren werden eenmalig positief bevonden met deze methode.
2.2.3. Prevalentie
Er werden 180 vleesvarkens bemonsterd, verdeeld over 106 loten. Een varken werd als positief
beschouwd indien bij één van de zes stalen Y. enterocolitica of Y. pseudotuberculosis gedetecteerd
werd. Er waren 126 varkens (70,0%) positief voor Y. enterocolitica, terwijl er bij zes varkens (3,3%) Y.
methode
staal direct CIN ITC + CIN
ITC +
KOH + CIN PMB + CIN
PMB +
KOH + CIN totaal
tonsillen 79 70 79 79 99 103
darminhoud 13 15 17 19 31 36
karkas 24 20 32 16 71 76
25
Tabel 7. Het aantal positieve varkens, de prevalentie van de afzonderlijke stalen
en het aantal stalen waarbij telbare kolonies gevonden zijn
a BI: betrouwbaarheidsinterval
pseudotuberculosis teruggevonden werd. Bij vijf varkens werden beide species gedetecteerd: drie
keer in een verschillend staal (Y. enterocolitica in de tonsillen, in het bekkenkanaal of op het kapvlak
en de kauwspieren en Y. pseudotuberculosis in de darminhoud of in de tonsillen) en twee keer in
hetzelfde staal (eenmaal in de tonsillen en eenmaal op de kauwspieren). Alle geteste Y. enterocolitica
isolaten behoorden tot het bioserotype 4/O:3.
Er waren 103 varkens in de tonsillen (57,2%) positief. Bij 36 varkens (20,0%) werden de pathogenen
in de darminhoud teruggevonden (Tabel 7). Er waren 28 varkens die zowel in de tonsillen als in de
darminhoud positief waren voor Y. enterocolitica. In totaal waren 76 karkassen (42,2%) op één of
meer plaatsen gecontamineerd met Y. enterocolitica. Ter hoogte van het bekkenkanaal en het kapvlak
waren respectievelijk 15 (8,3%) en 17 (9,4%) varkens positief, terwijl dit ter hoogte van de
kauwspieren al 59 varkens (32,8%) waren. De prevalentie op de borst ligt hier tussenin, met 17,2%
(31 varkens). Het verschil tussen de prevalenties van het bekkenkanaal, het kapvlak en de borst was
echter niet significant. Het aantal positieve kauwspieren was evenwel significant hoger dan bij de drie
andere plaatsen.
staal aantal prevalentie
(%) 95% BI
a aantal
telbaar
tonsillen 103 57,2 50,0-64,8 78
darminhoud 36 20,0 14,2-25,9 12
karkas:
bekkenkanaal 15 8,3 4,3-12,4 6
kapvlak 17 9,4 5,2-13,7 3
borst 31 17,2 11,7-22,8 1
kauwspieren 59 32,8 25,9-39,7 17
totaal karkas 76 42,2 35,0-49,5 24
26
Tabel 8. Aantal varkens met minstens twee stalen gecontamineerd met Y. enterocolitica
De meeste karkassen die gecontamineerd waren, werden ook positief bevonden in de tonsillen.
Daarentegen was bij minder dan de helft van de positieve karkassen de darminhoud positief (Tabel 8).
Er werden vier karkassen gevonden waarbij alle karkasswabs positief waren. Bij twee daarvan waren
zowel de tonsillen als de darminhoud ook positief. Bij de andere twee karkassen werd Y. enterocolitica
enkel gedetecteerd in de tonsillen en niet in de darminhoud. Van de 59 varkens waarvan de
kauwspieren positief bevonden werden, waren er 27 karkassen die ook gecontamineerd waren op een
andere plaats van het karkas.
In totaal waren er 23 varkens die Y. enterocolitica negatief waren in de tonsillen, maar waar de
pathogenen wel in een ander staal gevonden werden (Tabel 8). Van deze 23 varkens waren er 8 die
positief waren in de darminhoud en 13 ter hoogte van de kauwspieren. Bovendien werden twee
varkens positief bevonden in het bekkenkanaal, drie in het kapvlak en vijf op de borst. Er zijn dus
varkens positief enkel ter hoogte van het karkas.
aantal positieven (noemer)
tonsillen darminhoud bekkenkanaal kapvlak borst kauwspieren
aanta
l positie
ven
(te
ller)
tonsillen 28/36 13/15 14/17 26/31 46/59
darminhoud 28/103 7/15 5/17 11/31 21/59
bekkenkanaal 13/103 7/36 8/17 8/31 11/59
kapvlak 14/103 5/36 8/15 7/31 12/59
borst 26/103 11/36 8/15 7/17 18/59
kauwspieren 46/103 21/36 11/15 12/17 18/31
Y. pseudotuberculosis heeft in België een veel lagere prevalentie dan Y. enterocolitica. Van de 180
bemonsterde slachtvarkens waren er 6 (3,3%) besmet met Y. pseudotuberculosis. De tonsillen waren
het meest frequent (2,2%) geïnfecteerd, gevolgd door de darminhoud en de kauwspieren, waarbij
telkens één varken positief was. Bij het bekkenkanaal, het kapvlak en de borst is geen enkele keer Y.
pseudotuberculosis gevonden.
Er dient opgemerkt te worden dat bij de detectie van Y. pseudotuberculosis steeds maar één staal per
varken deze bacterie droeg. Dit waren de tonsillen, de darminhoud of de kauwspieren. De besmette
tonsillen waren steeds afkomstig van varkens uit verschillende loten.
2.2.3. Telling
De tonsillen en de darminhoud zijn het zwaarst gecontamineerd. Van 12 tonsillen kon het aantal Y.
enterocolitica niet geteld worden, wegens de massale aanwezigheid van begeleidende flora op de
CIN-plaat. In deze gevallen waren evenwel minstens 2,00 log10 kolonievormende eenheden (kve)/g
27
Fig. 11. De contaminatiegraad van het tonsillair weefsel met Y. enterocolitica via direct CIN
onderzocht weefsel aanwezig. Het gemiddeld aantal Y. enterocolitica in tonsillen waarbij het aantal
kon geteld worden, bedroeg 3,82 log10 kve per g met een maximum van 5,73 log10 kve/g. Het
overgrote deel van de positieve tonsillen bevatten 3,50 tot 4,99 log10 kve/g (Fig. 11). De darminhoud
van 12 varkens was positief na directe uitplating. Het gemiddeld aantal Y. enterocolitica in deze
monsters bedroeg 3,03 log10 kve/g met een maximum van 6,11 log10 kve/g. Er waren 17 swabs van de
kauwspieren die reeds positief waren via directe uitplating (Tabel 7). Ze hadden gemiddeld 1,69 log10
kve/swab en het maximum lag op 2,75 log10 kve/swab. Het contaminatieniveau van de andere
positieve plaatsen op de karkassen was aanzienlijk lager. Er waren 6 varkens met een telbaar aantal
kve in het bekkenkanaal. Gemiddeld telde het bekkenkanaal 1,45 log10 kve/swab, het maximum lag op
2,20 log10 kve/swab. Van de drie swabs van het kapvlak met een telbaar aantal kve, waren er twee
met 1,30 log10 kve/swab en één met 2,15 log10 kve/swab. Bij de enige swab van de borst die positief
was met direct CIN werd 1,30 log10 kve/swab geteld.
Het aantal kauwspieren met telbare kve was duidelijk hoger bij tonsillen die ook telbare kve bezaten
(Fig. 12). Er waren 14 kauwspieren positief met directe uitplating waarbij de bijbehorende tonsillen ook
positief waren via direct CIN. Er waren slechts drie kauwspieren positief via directe uitplating maar
waarbij de tonsillen negatief waren via direct CIN. Het aantal kauwspieren negatief op directe
uitplating hield geen verband met de uitslag van de tonsillen op direct CIN.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
aan
tal to
nsille
n
Log10 telbare kve/g
28
Fig. 12. De vergelijking van de tonsillen en de kauwspieren met een telbaar aantal CFU’s
positieve tonsillen
79 tonsillen positief met
directe uitplating
positieve kauwspieren
14 kauwspieren positief met directe uitplating
22 kauwspieren negatief met directe uitplating
25 tonsillen negatief met
directe uitplating
positieve kauwspieren
3 kauwspieren positief met directe uitplating
20 kauwspieren negatief met directe uitplating
29
3. Discussie
Dit onderzoek had 3 doelstellingen, namelijk de studie naar de invloed van de gebruikte methode op
de isolatie van humaanpathogene Yersinia, kwantificatie van de aanwezige Yersinia en de prevalentie
van deze pathogeen bij varkens en contaminatie van de bijhorende karkassen. Bij iedere staalname
werd ook een enquête ingevuld waarbij de gebruikte slachthygiëne werd genoteerd. Deze resultaten
van de enquêtes werden in deze studie niet in aanmerking genomen, daar een zinvolle
risicofactorstudie alleen mogelijk is, wanneer een veel grotere dataset beschikbaar is.
Het aantal positieve monsters was afhankelijk de gebruikte methode isolatiemethode en het type staal.
De isolatiemethode PMB + KOH + CIN leverde significant meer positieve stalen op dan de 4 andere
methoden. Tussen deze laatste methoden werden geen significant verschillen waargenomen. Ook
werd er een zeker effect van het type staal waargenomen. Verschillende factoren kunnen aan de
basis liggen voor deze verschillen, zoals het aangerijkt volume staal, uitgroei van de begeleidende
bacteriële flora tijdens aanrijking en op selectief medium. In de eerste plaats werden verschillende
volumes van de genomen stalen met de verschillende methoden onderzocht. Voor tonsillen en
darminhoud bedroeg de theoretische detectielimiet met direct CIN, met ITC + CIN en ITC + KOH +
CIN en met PMB + CIN en PMB + KOH + CIN respectievelijk 10kve/g, 1kve/g en 0,1kve/g, terwijl deze
voor de karkasswabs respectievelijk 20kve/100cm2, 4kve/100cm
2 en 1,4kve/100cm
2 bedroeg. In de
gevallen waar het staal zeer lage aantallen Yersinia bevatte, is het dan ook niet uitgesloten dat het
onderzochte substaal (hoeveelheid staal bij direct CIN<ITC<PMB) geen Yersinia bevatte en aldus
resulteerde in een negatieve resultaat. Indien dit het geval zou zijn, zou men verwachten dat de direct
CIN het laagste aantal positieve stalen opleverde, maar dit was niet steeds het geval (ITC + CIN gaf
een lagere prevalentie weer bij de tonsillen en het karkas en PMB + CIN gaf ook een lagere
prevalentie bij het karkas). Om het effect van de onderzochte hoeveelheid staal uit te schakelen zou
een vergelijking gemaakt moeten worden waarbij dezelfde hoeveelheid staal aan de beide
aanrijkingsmedia wordt toegevoegd. In de tweede plaats kan de uitgroei van begeleidende bacteriële
flora de uitgroei van Yersinia tijdens de aanrijking negatief beïnvloeden. Tot slot kan een massale
uitgroei van begeleidende flora op de CIN-platen de aflezing van de selectiefplaat beïnvloeden. In dit
geval is het mogelijk dat de aanwezige Yersinia overgroeid worden en dan ook niet meer terug te
vinden zijn. Dit was zeker bij een aantal stalen het geval. Door de aanrijking ITC en PMB te
behandelen met KOH werd een hoger aantal positieve stalen bekomen. Immers bij een kortstondige
alkalische omgeving worden een groot deel van de begeleidende flora afgedood, maar overleven
Yersinia vrij goed. Dit heeft als gevolg dat na een dergelijke behandeling veel minder begeleidende
kolonies aanwezig zijn op het CIN medium, wat de detectie van Yersinia kolonies vergemakkelijkt.
30
Tabel 10. Vergelijking van prevalenties (in %) uit studies die dezelfde detectiemethoden bij de tonsillen gebruiken
(Martinez et al., 2009; Martinez et al., 2011)
Studies waarbij dezelfde isolatiemethoden werden gebruikt, leverden gelijkaardige resultaten op
(Tabel 10). De aanrijking in ITC gevolgd door de uitplating op CIN leverde steeds het laagste aantal
positieven op. Indien er koude aanrijking toegepast werd, steeg de prevalentie, maar niet alle
gecontamineerde stalen werden via koude aanrijking ontdekt. Er dient opgemerkt te worden dat koude
aanrijking na 14 dagen steeds meer besmette stalen detecteerde dan na 7 dagen, maar sommige
stalen die positief waren na 7 dagen, werden niet meer als zodanig herkend op 14 dagen.
Van de 180 bemonsterde vleesvarkens zijn er 103 (57,2%) die in de tonsillen Y. enterocolitica
bezitten. Deze prevalentie ligt ver boven de prevalentie van Nederland, Tsjechië, Griekenland, Italië
en Frankrijk, maar onder die van Spanje, Estland, Noorwegen en Zwitserland (Tabel 11). De
prevalentie is naast de geografische distributie en de verschillen in productieproces ook afhankelijk
van het aantal vleesvarkens dat in het onderzoek opgenomen is en van de gebruikte methoden, zoals
eerder vermeld. De studies die dezelfde cultuurmethoden gebruikten als in deze studie, kunnen het
best vergeleken worden. Het gaat hier om het onderzoek van Laukkanen et al. (2009), Martinez et al.
(2009), Martinez et al. (2011) en Martinez et al. (2010). Binnen deze studies varieerde de prevalentie
van Y. enterocolitica in de tonsillen tussen 32% in Italië en 93% in Spanje. De verschillen die uit deze
studies blijken, berusten waarschijnlijk vooral op het verschil in vleesvarkenproductie dat varieert van
land tot land.
In onze studie werd enkel Y. enterocolitica bioserotype 4/O:3 geïsoleerd. Wanneer het bioserotype in
de andere studies bepaald werd, bleek dit bioserotype het meest voorkomend. Enkel in het Verenigd
Koninkrijk en Mexico werden andere biotypes gedetecteerd, respectievelijk biotype 2 en biotype 1.
methode Italië, Spanje
en België Estland Letland St.-Petersburg dit onderzoek
ITC (2 d, 25°C) + CIN (1
d, 30°C) 35 58 56 19 39
PMB (7 d, 4°C) + CIN (1
d, 30°C) 36 74 - 26 44
PMB (14 d, 4°C) + KOH +
CIN (1 d, 30°C) 37 75 57 30 55
totaal koude aanrijking 45 88 57 33 56
totaal alle methoden 50 89 64 34 57
31
Tabel 11. De prevalentie van Y. enterocolitica in de tonsillen van vleesvarkens in andere landen in de
meest recente studies
: dezelfde methode als in dit onderzoek
prevalentie meest
frequente bioserotype
land of
streek
aantal getest
referentie
7,5% O:3 Tsjechië 439 Simonova et al., 2008
9,3% 4/O:3 Nederland 140 de Boer et al., 2008
15% - Griekenland 455 Kechagia et al., 2007
19,8% - Frankrijk 900 Fondrevez et al., 2010
32% 4/O:3 Italië 428 Martinez et al., 2011
35% 4/O:3 ZW-Finland 350 Laukkanen et al., 2009
37,4% 4/O:3 België 139 Van Damme et al., 2010
44% 2/O:9 O-Verenigd Koninkrijk
630 Martinez et al., 2010
61,6% 4/O:3 Beieren 164 Fredriksson-Ahomaa et al., 2010
89% 64% 34%
4/O:3 4/O:3 4/O:3
Estland Letland
St-Petersburg
151 109 197
Martinez et al., 2009
75% O:3 NO-
Noorwegen 24 Nesbakken et al., 2003
88% 4/O:3 Zwitserland 212 Fredriksson-Ahomaa et al., 2007
93% 4/O:3 Spanje 200 Martinez et al., 2011
35,5% - Midwesten
V.S. 252 Boyapalle et al., 2001
22% 1/O:3 en 1/O:9 Mexico 100 Hernandez-Andrade et al., 2009
Bij 36 (20%) varkens is Y. enterocolitica gedetecteerd in de darminhoud. Deze prevalentie is de
hoogste tot nog toe gevonden in Europa (Tabel 12). De prevalentie in de Verenigde Staten ligt veel
hoger (31,3%). Er is echter slechts één studie die dezelfde methode gebruikt als in dit onderzoek.
Laukkanen et al. (2009) toonde toen een prevalentie aan van 8% voor het ZW van Finland.
Het percentage positieve tonsillen is veel hoger dan darminhoud. Dit is in overeenstemming met de
resultaten bekomen door Nesbakken et al. (2003). Evenwel werden 8 varkens gevonden waarvan de
tonsillen negatief waren, maar de darminhoud positief. Met uitzondering van één geval was het
contaminatieniveau van deze stalen laag (<10kve/g). Mogelijks werd tijdens het uitslachten de
darminhoud (rectuminhoud) gecontamineerd. Een aantal tonsillen bevatten een laag aantal Y.
enterocolitica. Ook hier rijst de vraag of deze tonsillen reeds besmet waren voor het slachten of tijdens
het slachten werden gecontamineerd. Verder onderzoek is nodig om hieromtrent uitsluitsel te kunnen
geven.
32
Tabel 12. De prevalentie van Y. enterocolitica in de darminhoud van vleesvarkens in andere
landen in de meest recente studies
Positieve tonsillen en een positieve darminhoud kunnen fungeren als bron voor contaminatie van
karkassen tijdens het slachten. Immers, tijdens de evisceratie kan een fecale contaminatie van het
karkas plaatsvinden. Dit kan leiden tot een besmetting van het betrokken karkas of via
kruiscontaminatie van volgende karkassen. Ook in dit onderzoek werd in een aantal gevallen een
contaminatie van het bekkenkanaal vastgesteld. In de meeste gevallen was echter het aantal
aanwezige Y. enterocolitica laag. Er mag aangenomen worden dat deze plaats op het karkas
gecontamineerd werd tijdens het lossnijden van de anus en het rectum. Maatregelen om de
contaminatie bij het lossnijden van de anus en het rectum, zoals gebruik van een anusboor en het
plaatsen van de anus in een plastiekzak na lossnijden, reduceerde de contaminatie van het karkas
(Andersen, 1988; Laukkanen et al., 2010). In geen enkel bemonsterd slachthuis tijdens dit onderzoek
werd de anus in een plastiekzak verpakt. In alle onderzochte slachthuizen werd de tong uit de kop
gesneden tijdens de evisceratie. De meest gecontamineerde bemonsteringsplaats op de karkassen in
dit onderzoek was de kauwspieren. Deze plaats bevatte tevens het hoogste aantal Y. enterocolitica.
Van 46 karkassen waarvan de kauwspieren positief werden bevonden, waren ook de tonsillen positief.
Evenwel waren bij 13 karkassen de kauwspieren positief, niettegenstaande de tonsillen negatief
werden bevonden. Dit duidt erop dat de kauwspieren ook via kruiscontaminatie kunnen
gecontamineerd worden door het slachtpersoneel en/of door de keurders. Immers tijdens het
uitsnijden van de hartslag komt het slachthuispersoneel in contact met de tonsillen en kauwspieren.
Ook de veterinaire keurders die de kauwspieren manipuleren terwijl de tonsillen eventueel nog
aanwezig zijn, kunnen de bacteriën verspreiden. Bovendien bleek uit de bekomen resultaten dat
wanneer de tonsillen volledig of gedeeltelijk in de kop bleven na verwijdering van de tong uit de kop
dat de kauwspieren in een hoger percentage gecontamineerd waren, dan wanneer de tonsillen samen
met de tong uit de kop verwijderd werden.
prevalentie meest
frequente bioserotype
land of
streek
aantal getest
referentie
3,3% 4/O:3 Nederland 150 de Boer et al., 2008
4% 4/O:3 Italië 150 Bonardi et al., 2003
7,4% O:3 Tsjechië 175 Simonova et al., 2008
8% 4/O:3 ZW-Finland 358 Laukkanen et al., 2009
10,2% - Verenigd Koninkijk
2107 Milnes et al., 2008
12,5% O:3 NO-
Noorwegen 24 Nesbakken et al., 2003
8-12,5% 4/O:3 Z-Duitsland 50-64 Bucher et al., 2008
31,3% - Midwesten
V.S. 255 Boyapalle et al., 2001
: dezelfde methode als in dit onderzoek
33
Tabel 13. De prevalentie van Y. pseudotuberculosis in de darminhoud van
vleesvarkens in andere landen in de meest recente studies
Bovendien duiden de bekomen resultaten erop dat positieve tonsillen fungeren als bron voor de
contaminatie van het kapvlak. Contaminatie van deze plaats is evenwel alleen mogelijk via
kruiscontaminatie. Door contact met besmette tonsillen kunnen de messen van de kapmachine
gecontamineerd worden en vervolgens aanleiding geven tot contaminatie van de volgende karkassen
tijdens het halveren. De prevalentie van de borst bedroeg 17,2%. De contaminatiegraad was echter
zeer laag. In hoeverre het hier ging over een fecale contaminatie of een contaminatie uitgaande vanuit
de tonsillen kan niet uitgemaakt worden. Laukkanen et al. (2010) toonde aan dat de
karkascontaminatie slechts voor een deel van fecale oorsprong is. De rol van de tonsillen in de
contaminatie van varkenskarkassen werd tot op heden niet bekend. Onderzoek kan hieromtrent
uitsluitsel geven.
Er zijn nog maar weinig onderzoeken uitgevoerd naar de prevalentie van Y. pseudotuberculosis bij
vleesvarkens (Tabel 13). Ons onderzoek toont aan dat 2,2% van de tonsillen en 0,6% van de
darminhouden besmet zijn met Y. pseudotuberculosis. De besmette tonsillen zijn steeds afkomstig
van varkens uit verschillende loten. Martinez et al. (2010) vond in Italië slechts 1% van de
varkensdarminhouden positief, terwijl in het Verenigd Koninkrijk de prevalentie 18% bedroeg. Het
karkas met gecontamineerde kauwspieren is afkomstig van hetzelfde lot waarbij besmette tonsillen
werden gevonden.
prevalentie land of
streek
aantal getest
referentie
1% Italië 428 Martinez et al., 2011
18% O-Verenigd Koninkrijk
630 Martinez et al., 2010
34
4. Literatuurlijst
Acha P., Szyfres B. (2007). Enterocolitic yersiniosis. In: Acha P., Szyfres B. (Editors) Zoonoses and
Communicable Diseases Common to Man and Animals. 2nd
edition, Pan American Health
Organization, Washington, p. 81-86.
Andersen K. (1988). Contamination of freshly slaughtered pig carcasses with human pathogenic
Yersinia enterocolitica. International Journal of Food Microbiology 7,193-202.
Anonymous (2003). Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for the
detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica, ISO 10273:2003.
Anonymous (2006). The community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses and
Zoonotic Agents in the European Union in 2004, The EFSA Journal (2005), 310.
Anonymous (2007a). Scientific Opinion of the Panel on BIOHAZ on “a request from EFSA on
monitoring and identification of human enteropathogenic Yersinia spp”, The EFSA Journal (2007),
595, 1-30.
Anonymous (2007b). The community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic
Agents, Antimicrobial Resistance and Foodborne Outbreaks in the European Union in 2005, The
EFSA Journal (2006), 94.
Anonymous (2007c). The community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic
Agents, Antimicrobial Resistance and Foodborne Outbreaks in the European Union in 2006, The
EFSA Journal (2007), 130.
Anonymous (2009). The community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses and
Zoonotic Agents in the European Union in 2007, The EFSA Journal (2009), 223.
Anonymous (2010). The community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses and
Zoonotic Agents and food-borne outbreaks in the European Union in 2008, The EFSA Journal
(2010), 8.
Bonardi S., Brindani F., Pizzin G., Lucidi L., D’Incau M., Liebana E., Morabito S. (2003). Detection of
Salmonella spp., Yersinia enterocolitica and verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 in pigs
at slaughter in Italy. International Journal of Food Microbiology 85, 101-110.
Bottone E. J. (1997). Yersinia enterocolitica: The Charisma Continues. Clinical Microbiology Reviews
10, 257-276.
Bottone E.J. (1999). Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates. Microbes and
Infection 1, 323-333.
Bowman A. S., Glendening C., Wittum T. E., Lejeune J. T., Stich R. W., Funk J. A. (2007). Prevalence
of Yersinia enterocolitica in Different Phases of Production on Swine Farms. Journal of Food
Protection 70, 11-16.
Boyapalle S., Wesley I. V., Hurd H. S., Reddy P. G. (2001). Comparison of Culture, Multiplex, and 5’
Nuclease Polymerase Chain Reaction Assays for the Rapid Detection of Yersinia enterocolitica in
Swine and Pork Products. Journal of Food Protection 64, 1352-1361.
Brubaker R.R. (1986). Yersinia. In: Gyles C.L. and Thoen C.O. (Editors) Pathogenesis of Bacterial
Infections in Animals, Iowa State University Press, Ames, p. 154-159.
35
Bucher M., Meyer C., Grötzbach B., Wacheck S., Stolle A., Fredriksson-Ahomaa M. (2008).
Epidemiological Data on Pathogenic Yersinia enterocolitica in Southern Germany During 2000–
2006. Foodborne Pathogens and Disease 5, 273-280.
Carter G.R., Wise D.J. (2003). Enterobacteriaceae II: Salmonella en Yersinia. In: Carter G.R., Wise
D.J. (Editors) Essentials of Veterinary Bacteriology and Mycology, 6th edition, Blackwell Publishing,
Oxford, p. 137-142.
de Boer E., Zwartkruis-Nahuis J.T.M., Lesuis R. (2008). Prevalentie humaanpathogene Yersinia
enterocolitica bij varkens. Tijdschrift voor Diergeneeskunde 133, 938-941.
Fondrevez M., Labbé A., Houard E., Fravalo P., Madec F., Denis M. (2010). A simplified method for
detecting pathogenic Yersinia enterocolitica in slaughtered pig tonsils. Journal of Microbiological
Methods 83, 244-249.
Fredriksson-Ahomaa M., Gerhardt M., Stolle A. (2009). High bacterial contamination of pig tonsils at
slaughter. Meat Science 83, 334-336.
Fredriksson-Ahomaa M., Meyer C., Bonke R., Stüber E., Wacheck S. (2010). Characterization of
Yersinia enterocolitica 4/O:3 isolates from tonsils of Bavarian slaughter pigs. Letters in Applied
Microbiology 50, 412-418.
Fredriksson-Ahomaa M., Stolle A., Stephan R. (2007). Prevalence of pathogenic Yersinia
enterocolitica in pigs slaughtered at a Swiss abattoir. International Journal of Food Microbiology
119, 207-212.
Gürtler M., Alter T., Kasimir S., Linnebur M., Fehlhaber K. (2005). Prevalence of Yersinia enterocolitica
in Fattening Pigs. Journal of Food Protection 68, 850-854.
Harnett N., Lin Y. P., Krishnan C. (1996). Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica using the
multiplex polymerase chain reaction. Epidemiological Infections 117, 59-67.
Hernandez-Andrade L., Elizalde-Castaneda P., Urrutia R.M., Moles-Cervantes L.P., Diaz-Aparicio E.
(2009). Presence of Zoonotic Interest Bacteria in Slaughter Pigs. Journal of Animal and Veterinary
Advances 8, 2447-2452.
Jacobsen N.R., Bogdanovich T., Skurnik M., Lübeck P.S., Ahrens P., Hoorfar J. (2005). A real-time
PCR assay for the specific identification of serotype O:9 of Yersinia enterocolitica. Journal of
Microbiological Methods 63, 151-156.
Jungersen G., Sørensen V., Giese S. B., Stack J. A., Riber U. (2006). Differentiation between
serological responses to Brucella suis and Yersinia enterocolitica serotype O:9 after natural or
experimental infection in pigs. Epidemiology and Infections 134, 347-357.
Kechagia N., Nicolaou C., Ioannidou V., Kourti E., Ioannidis A., Legakis N. J., Chatzipanagiotou S.
(2007). Detection of chromosomal and plasmid -encoded virulence determinants in Yersinia
enterocolitica and other Yersinia spp. isolated from food animals in Greece. International Journal of
Food Microbiology 118, 326-331.
Laukkanen R., Martinez P. O., Siekkinen K., Ranta J., Maijala R., Korkeala H. (2009). Contamination
of Carcasses with Human Pathogenic Yersinia enterocolitica 4/O:3 Originates from Pigs Infected
on Farms. Foodborne Pathogens and Disease 6, 681-688.
36
Laukkanen R., Ranta J., Dong X., Hakkinen M., Martinez P. O., Lunden J., Johansson T., Korkeala H.
(2010). Reduction of Enteropathogenic Yersinia in the Pig Slaughterhouse by using Bagging of the
Rectum. Journal of Food Protection 73, 2161-2168.
Martinez P. O., Fredriksson-Ahomaa M., Pallotti A., Rosmini R., Houf K., Korkeala H. (2011). Variation
in the Prevalence of Enteropathogenic Yersinia in Slaughter Pigs from Belgium, Italy, and Spain.
Foodborne pathogens and disease 8, 445-40.
Martinez P. O., Fredriksson-Ahomaa M., Sokolova Y., Roasto M., Berzins A., Korkeala H. (2009).
Prevalence of Enteropathogenic Yersinia in Estonian, Latvian, and Russian (Leningrad Region)
Pigs. Foodborne Pathogens and Disease 6,719-724.
Martinez P. O., Mylona S., Drake I., Fredriksson-Ahomaa M., Korkeala H.,. Corry J. E.L (2010). Wide
variety of bioserotypes of enteropathogenic Yersinia in tonsils of English pigs at slaughter.
International Journal of Food Microbiology 139, 64-69.
Milnes A. S., Stewart I., Clifton-Hadley F. A., Davies R. H., Newell D. G., Sayers A. R., Cheasty T.,
Cassar C., Ridley A., Cook A. J. C., Evans S. J., Teale C. J., Smith R. P., MCNally A., Toszeghy
M., Futter R., Kay A., Paiba G. A. (2008). Intestinal carriage of verocytotoxigenic Escherichia coli
O157, Salmonella, thermophilic Campylobacter and Yersinia enterocolitica, in cattle, sheep and
pigs at slaughter in Great Britain during 2003. Epidemiological Infections 136, 739-751.
Nakajima H., Inoue M., Mori T., Itoh K., Arakawa E., Watanabe H. (1992). Detection and Identification
of Yersinia pseudotuberculosis and Pathogenic Yersinia enterocolitica by an Improved Polymerase
Chain Reaction Method. Journal of Clinical Microbiology 30, 2484-2486.
Nesbakken T. (2000). Yersinia species. In: Lund B. M., Baird-Parker T. C., Gould G. W. (Editors) The
Microbiological Safety and Quality of Food, Aspen Publishers, Gaithersburg, p. 1363-1393.
Nesbakken T., Eckner K., Høidal H. K., Røtterud O. (2003). Occurrence of Yersinia enterocolitica and
Campylobacter spp. in slaughter pigs and consequences for meat inspection, slaughtering, and
dressing procedures. International Journal of Food Microbiology 80, 231-240.
Nesbakken T., Iversen T., Eckner K., Lium B. (2006). Testing of pathogenic Yersinia enterocolitica in
pig herds based on the natural dynamic of infection. International Journal of Food Microbiology
111, 99-104.
Nielsen B., Heisel C., Wingstrand A. (1996). Time course of the serological response to Yersinia
enterocolitica O:3 in experimentally infected pigs. Veterinary Microbiology 48, 293-303.
Nowak B., von Mueffling T., Caspari K., Hartung J. (2006). Validation of a method for the detection of
virulent Yersinia enterocolitica and their distribution in slaughter pigs from conventional and
alternative housing systems. Veterinary Microbiology 117, 219-228.
Simonova J., Borilova G. Steinhauserova I. (2008). Occurrence of pathogenic strains of Yersinia
enterocolitica in pigs and their antimicrobial resistance. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy
52, 39-43.
Skjerve E., Lium B., Nielsen B., Nesbakken T. (1998). Control of Yersinia enterocolitica in pigs at herd
level. International Journal of Food Microbiology 45, 195-203.
37
Van Damme I., Habib I., De Zutter L. (2010). Yersinia enterocolitica in slaughter pig tonsils:
Enumeration and detection by enrichment versus direct plating culture. Food Microbiology 27, 158-
161.
Virtanen S. E., Salonen L. K., Laukkanen R., Hakkinen M., Korkeala H. (2011). Factors related to the
prevalence of pathogenic Yersinia enterocolitica on pig farms. Epidemiology and Infection (in druk).
Wanger A. (2007). Yersinia. In: Murray P., Baron E., Jorgensen J., Landry M., Phaller M. (Editors)
Manual of Clinical Microbiology, 9th edition, vol. 1, ASM Press, Washington, p.688-697.
Wauters G., Kandolo K., Janssens M. (1987). Revised Biogrouping Scheme of Yersinia enterocolitica.
Contributions to microbiology and immunology 9, 14-21.
Weynants V., Jadot V., Denoel P., Tibor A., Letesson J.-J. (1996). Detection of Yersinia enterocolitica
Serogroup O:3 by a PCR Method. Journal of Clinical Microbiology 34, 1224-1227.
38
Bijlagen
Bijlage I: enquête per slachthuis
Slachtritme: ___ varkens/uur
Beneveling in wachtruimte □ Ja □ Nee
Verdoving: CO2 / elektrisch
Keling:
□ Liggend / hangend
□ Hol mes □ Ja □ Nee
Voorspoelen vóór broeien □ Ja □ Nee
Broeien
□ Broeibak / Stoomtunnel
□ Temperatuur broeiwater: ____ °C
Ontharen □ Ja □ Nee
Drogen vóór schroeien □ Ja □ Nee
Schroeien □ Ja □ Nee
Poetsen □ Ja □ Nee
Naschroeien □ Ja □ Nee
Tijd tussen keling en begin evisceratie: ____________ (geschat / gemeten)
Losmaken rectum/anus
□ fase: __________________
□ mechanisch / manueel
□ blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
__________________________
□ Persoon die anus losmaakt opent ook de buikholte □ Ja □ Nee
□ regelmatig reiniging mes/anusboor? □ Ja □ Nee
Methode: __________________ Frequentie: ______________
□ regelmatig desinfectie mes/anusboor? □ Ja □ Nee
Methode: __________________ Frequentie: ______________
□ gebruik van water (naspoelen) □ Ja □ Nee Frequentie: ______________
Openen borstholte:
Opensnijden borstbeen
□ door persoon die de buikholte opent
□ door dezelfde persoon die hartslag verwijdert (1e fase / 2
e fase / nvt)
□ Anders: ____________
Opensnijden keelholte
□ door persoon die de buikholte opent
□ door dezelfde persoon die hartslag verwijdert (1e fase / 2
e fase / nvt)
□ Anders: ____________
Naam slachthuis: ___
Volgnummer: ___
Adres: ___
___
Contactpersoon: ___
Tel.: ___
E-mail: ___
Datum/tijdstip: ___
39
Openen diafragma
□ door persoon die de buikholte opent
□ door dezelfde persoon die hartslag verwijdert (1e fase / 2
e fase / nvt)
□ Anders: ____________
Evisceratie:
□ 1 persoon voor losmaken anus + 1 persoon opening buikholte + 1 persoon uitnemen darmen
□ 1 persoon voor losmaken anus+opening buikholte + 1 persoon uitnemen darmen
□ 1 persoon opent buikholte + 1 persoon voor losmaken anus+uitnemen darmen
□ Anders:
_____________________________________________________________________
Verwijdering hartslag
□ aantal betrokken personen: ____
□ 1 fase / 2 fasen
Persoon 1e fase
- Reiniging mes: □ Ja □ Nee
Methode: _____________________
Frequentie: _____________________
- Desinfectie mes: □ Ja □ Nee
Methode: _____________________
Frequentie: _____________________
- Bijkomende functies:
___________________________________
Persoon 2e fase
- Reiniging mes: □ Ja □ Nee
Methode: _____________________
Frequentie: _____________________
- Desinfectie mes: □ Ja □ Nee
Methode: _____________________
Frequentie: _____________________
Bijkomende functies:
_____________________________________
Tonsillen:
□ Worden samen met hartslag verwijderd
□ Blijven aanwezig in de kop
□ Combinatie (deel blijft in de kop/deel wordt verwijderd)
□ Variabel / afhankelijk van slachter tot slachter
- Worden de tonsillen regelmatig aangesneden? □ Ja □ Nee
- Waar en door wie worden de tonsillen verwijderd?
Tonsillen aan de hartslag: _______________________________________________
Door: personeel slachthuis / dierenarts
Reiniging/desinfectie mes: □ Ja □ Nee □ NVT (alle stalen genomen vóór verwijdering
tonsillen)
Tonsillen nog in de kop: _________________________________________________
Door: personeel slachthuis / dierenarts
Reiniging/desinfectie mes: □ Ja □ Nee □ NVT (alle stalen genomen vóór verwijdering
tonsillen)
40
Klieven:
□ mechanisch (machine) / manueel
□ aantal: ___
□ contact zaag – mondholte: □ Ja □ Nee
□ splitten kop: □ Ja □ Nee □ Soms (afhankelijk van klant)
Afzetten kopgewricht □ Ja □ Nee
□ Plaats: ___
□ Automatisch / Manueel
□ Tang / Mes
□ Reiniging en desinfectie: □ Ja □ Nee
Keuring
□ Totaal aantal keurders: ___
o Organen: _____
o Karkas: _____
□ Aansnijden mandibulaire lymfeknopen □ Ja □ Nee
□ Manipulatie kop: □ Ja □ Nee
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee
Methode: _____________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee
Methode: _____________________ Frequentie: ______________
Totaal aantal personen vanaf evisceratie tot staalname karkasswabs: _____
Slachtvolgorde: rekening gehouden met Salmonella status bedrijven? □ Ja □ Nee
Diersoorten geslacht: □ enkel varken
□ varken + rund
Regelmatig fokdieren geslacht? □ Ja □ Nee
Fokdieren tussen vleesvarkens of op aparte dagen?
_______________________________________________
41
o Functies fase 1: ______________________________________________
______________________________________________
Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
Aantal personen parallel bezig: ___________________________________________________
o Functies fase 2: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 3: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 4: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 5: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 6: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
42
o Functies fase 7: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 8: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 9: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 10: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 11: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 12: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
43
o Functies fase 13: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 14: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 15: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 16: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 17: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________ Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
o Functies fase 18: ______________________________________________
______________________________________________
□ Blote handen / handschoenen / veiligheidshandschoenen / geen contact handen-karkas
□ Reiniging mes: □ Ja □ Nee Methode: _________________ Frequentie: ______________
□ Desinfectie mes: □ Ja □ Nee Methode: ___________Frequentie: ______________
□ Aantal personen parallel bezig: _________________________________________________
44
Aantal studenten nodig voor staalname: ___
___
Merken varkens: ___
___
Staalname tonsillen: ___
___
Staalname rectuminhoud:
___
Staalname diafragma:
___
Staalname karkasswabs:
___.
Plaats staalname karkassen:
□ Voor / na veterinaire keuring
□ Voor / na verwijderen tonsillen
□ Voor / na opkuis karkas
o Buikvet verwijderd □ Ja □ Nee
o Nieren ontkapseld □ Ja □ Nee
o Afzetten kopgewricht □ Ja □ Nee
o Diafragma verwijderd □ Ja □ Nee
o Huid weggesneden binnenzijde ham □ Ja □ Nee
o Andere: _____________________
Info lotgegevens:
___
Tijdstip eerste keling op maandag: ___
45
Bijlage II: enquête per varken
Voor verwijdering MD pakket:
- Reiniging mes? □ Ja □ Nee
- Desinfectie mes? □ Ja □ Nee
Voor verwijdering hartslag:
- Reiniging mes? □ Ja □ Nee
- Desinfectie mes? □ Ja □ Nee
Tonsillen:
□ Werden samen met hartslag verwijderd
□ Waren nog aanwezig in de kop
□ Combinatie
Werden de tonsillen aangesneden? □ Ja □ Nee
Werd de kop gekliefd? □ Ja □ Nee
Veterinaire keuring:
- Manipulatie kop □ Ja □ Nee
- Aansnijden mand. lkn.? □ Ja □ Nee
Werden de darmen aangesneden? □ Ja □ Nee
Karkasswabs genomen aan linker / rechter zijde van het karkas
Geslacht: M / V
Eventuele opmerkingen (evt. afkeuring, problemen slachtlijn, pauze, ...):
_________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________
Lot-afhankelijke factoren:
□ Lotgrootte ________
□ Aankomst varkens in slachthuis: ____u____
□ Hoeveelste lot per dag is het bemonsterde lot? _______
□ Hoeveelste varken binnen dit lot geslacht? 1/3 2/3 3/3
Tijdstip laboanalyse: ____u____ (tijdstip begin analyse)
Onderzochte hoeveelheid Tonsillen: _______g
Rectuminhoud: _______g
Buitentemperatuur: _________
Tijd transport slachthuis-labo: _______
Volgnummer bemonsterd karkas: _________
Tijdstip staalname: ____u____
Klopnummer: _________
