Download - Cross Linking the Cornea

l a b o r a t o r y s c i e n c e

Stress-strain measurements of human and porcinecorneas after riboflavin–ultraviolet-A-inducedcross-linking

Gregor Wollensak, MD, Eberhard Spoerl, PhD, Theo Seiler, MD

Purpose: To evaluate the biomechanical effect of combined riboflavin–ultravioletA (UVA) treatment on porcine and human corneas.

Setting: Department of Ophthalmology, Technical University of Dresden,Dresden, Germany.

Methods: Corneal strips from 5 human enucleated eyes and 20 porcine cadavercorneas were treated with the photosensitizer riboflavin and irradiated with 2 dou-ble UVA diodes (370 nm, irradiance � 3 mW/cm2) for 30 minutes. After cross-linking, static stress-strain measurements of the treated and untreated corneaswere performed using a microcomputer-controlled biomaterial tester with a pre-stress of 5 � 103 Pa.

Results: There was a significant increase in corneal rigidity after cross-linking,indicated by a rise in stress in treated porcine corneas (by 71.9%) and humancorneas (by 328.9%) and in Young’s modulus by the factor 1.8 in porcine corneasand 4.5 in human corneas. The mean central corneal thickness was 850 �m � 70(SD) in porcine corneas and 550 � 40 �m in human corneas.

Conclusions: Riboflavin�UVA-induced collagen cross-linking led to an increasein mechanical rigidity in porcine corneas and an even greater increase in humancorneas. As collagen cross-linking is maximal in the anterior 300 �m of the cor-nea, the greater stiffening effect in human corneas can be explained by the rela-tively larger portion of the cornea being cross-linked in the overall thinner humancornea.

J Cataract Refract Surg 2003; 29:1780–1785 © 2003 ASCRS and ESCRS

The biomechanical properties of the cornea are pri-marily determined by the collagen fibers compris-

ing 15 000 km and the degree of interfibrillar linkage.1

Therefore, collagen cross-linking induced by combined

riboflavin–ultraviolet A (UVA) treatment has been usedsuccessfully to mechanically stabilize the cornea in ker-atoconus (thereby stopping the progression of keratec-tasia2) and in corneal melting processes.3 No adverseeffects have been observed clinically.2

However, biomechanical experimental measure-ments of the effect of combined riboflavin–UVAtreatment on human corneas have not been done.4,5

This study measured the biomechanical effect of ribofla-vin–UVA-induced collagen cross-linking in humancorneas and compared it to the effect in cross-linkedporcine corneas having comparable biomechanicalproperties.6,7

Accepted for publication March 17, 2003.

From the Department of Ophthalmology, Technical University ofDresden (Wollnesak, Spoerl), Dresden, Germany, and the Departmentof Ophthalmology, University of Zurich (Seiler), Zurich, Switzerland.

None of the authors has a financial interest in any product mentioned.

Reprint requests to Priv.-Doz. Dr. med. Gregor Wollensak, UniversityEye Clinic Dresden, Fetscherstrasse 74, D-01307 Dresden, Germany.E-mail: [email protected].

© 2003 ASCRS and ESCRS 0886-3350/03/$–see front matterPublished by Elsevier Inc. doi:10.1016/S0886-3350(03)00407-3

Materials and MethodsSpecimen Preparation

Five freshly enucleated human eyes with intact and clearcorneas that had been removed because of endophthalmitis (1patient), choroidal melanoma (3 patients), and a nonhealingretinal detachment (1 patient) were used within 1 to 2 hoursof enucleation. Before treatment, the corneal epithelium wascompletely scraped using a blunt hockey knife. The 12 o’clockposition was marked with a nylon thread for orientation of thesuperior–inferior cut. The corneoscleral ring was then re-moved. With a self-constructed triple-blade scalpel, the cor-nea was cut into 2 equal strips of 4.0 mm width, 550 �mcentral corneal thickness, and 14.0 mm length including1.0 mm sclera on both ends. Human cadaver eyes had beenmeasured but were not included in the study as the variancesin the stress-strain measurements were too great because ofdifferent postmortem times and degrees of autolysis.

Twenty fresh porcine cadaver eyes with intact epitheliaand clear corneas were retrieved from the local slaughterhousewithin 2 to 5 hours post-mortem. The eyes were deepithelial-ized mechanically, and the corneoscleral ring was removedusing a scissors. With a self-constructed double-blade scalpel,1 corneal strip of 5.0 mm width, 850 �m central cornealthickness, and 14.0 mm length including 1.0 mm sclera onboth ends was cut in a superior–inferior fashion from the12 o’clock position of the cornea, which was easily identifiedby its oval shape. Because of the natural thickness of the por-cine cornea, only 1 corneal strip with clearly cut perpendicularedges could be prepared properly from each eye. There wereshear artifacts in the deeper layers otherwise. Ten corneas weretreated with riboflavin–UVA irradiation, and 10 were used asuntreated controls.

PachymetryUsing ultrasound pachymetry (Pachette, Technomed),

the central corneal thickness was determined in the humanand porcine eyes.

TreatmentStarting 5 minutes before the treatment, 0.1% riboflavin

(vitamin B2) photosensitizer solution (10 mg riboflavin-5-phosphate in 10 mL 20% dextran-T-500) was dropped on thetreated strips and 20% dextran solution on the control stripsat 5-minute intervals. Ultraviolet A irradiation (370 nm) wasapplied using 2 double UVA diodes (Roithner Lasertechnik)with an irradiance of 3 mW/cm2 at a distance of 1.0 cm fromthe cornea for 30 minutes (Figure 1). This is equal to a dose of5.4 J/cm2. The parameters of exposure were chosen accordingto the treatment procedure used in keratoconus patients.2

Three 1.3 V accumulators were used as a power generator.Before treatment, the desired irradiance of 3 mW/cm2 wascontrolled with a calibrated UVA meter (LaserMate-Q, Laser

2000) at a distance of 1.0 cm and, if necessary, regulated witha potentiometer.

Static Stress-Strain MeasurementsThe human and porcine corneal strips were clamped hor-

izontally at a distance of 8.0 mm between the jaws of a com-mercially available microcomputer-controlled biomaterialtester (Minimat, Rheometric Scientific GmbH (Figure 2). Toinclude the physiological stress range, a prestress of 5 � 103 Pa(1 Pa � 1 N/m2) was used, which required a force of 10 mNin human corneas and 20 mN in porcine corneas because ofthe different thicknesses. The strain was then increased lin-early with a velocity of 1.5 mm min–1, and the stress wasmeasured up to 2 �105 Pa.4,5 The stress-strain values werefitted by an exponential function � � A exp (B � ε) using theSPSS-calculation program (SPSS GmbH Software, Munich).Young’s modulus (E) was calculated for 4%, 6%, and 8%strain as the gradient of the stress-strain graph (E � d�/dε �A � B exp (B � ε).

Figure 1. (Wollensak) Irradiation of riboflavin-treated human cor-neal strip using 2 double-UVA diodes (irradiance 3 mW/cm2 , expo-sure time 30 min) at 1.0 cm distance.

Figure 2. (Wollensak) Human corneal strip between the clamps ofthe stress-strain biomaterial tester (Minimat).

LABORATORY SCIENCE: STRESS-STRAIN MEASUREMENTS AFTER COLLAGEN CROSS-LINKING

J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 2003 1781

Statistical EvaluationThe stress data necessary for a strain of 4%, 6%, and 8%

in treated and untreated corneas (separately for human andporcine eyes) and in human and porcine corneas were com-pared using the Student t test.

ResultsStress-Strain Curves

The stress-strain curves showed the typical expo-nential increase of a bioviscoelastic solid (Figure 3).

In porcine corneas, the stress using 6% strain was98.5 � 29.77 � 103 Pa in the treated corneas and57.3 � 17.3 � 103 Pa in the untreated corneas, corre-sponding to a 71.9% increase (Table 1). The differencewas statistically significant (P � .014).

In human corneas, the stress using 6% strain was227.3 � 95.7 � 103 Pa in the treated corneas and53.0 � 11.5 � 103 Pa in the untreated corneas, corre-

sponding to a 328.9% increase (Table 1). The differencewas statistically significant (P � .012).

In untreated corneas in porcine and human eyes, thedifference in the stress-strain values was not statisticallysignificant (P � .87). In treated corneas in porcine andhuman eyes, the difference was statistically significant (P� .01). The increased biomechanical stiffness was alsoreflected in the different bending behaviors (Figure 4).

Young’s ModulusTo calculate Young’s modulus, the stress-strain

values were fitted with an exponential function � � Aexp (B � ε). The first derivation of this function in adefinite strain is Young’s modulus E � d�/dε � A � Bexp (B � ε).

In porcine corneas at 6% strain, Young’s moduluswas 1.5 � 106 Pa in the untreated eyes and 2.7 � 106 Pain the treated eyes (increase factor 1.8). In human cor-

Figure 3. (Wollensak) Top: Stress-strain mea-surements of human corneas (n � 5) treated withriboflavin–UVA (irradiance � 3 mW/cm2). Bottom:Stress-strain measurements of porcine corneas(n � 20) treated with riboflavin–UVA (irradiance �

3 mW/cm2).


J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 20031782

neas at 6% strain, Young’s modulus was 1.3 � 106 Pa inthe untreated eyes and 5.9 � 106 Pa in the treated eyes(increase factor 4.5).

PachymetryThe mean central corneal thickness was 850 �

70 �m in porcine eyes and 550 � 40 �m in human eyes.

DiscussionWe found a significant increase in biomechanical

rigidity by a factor of 4.5 in human corneas, as indicatedby Young’s modulus, following riboflavin–UVA-in-duced collagen cross-linking. The increase in biome-chanical stiffness in porcine eyes was also significant, butonly by a factor of 1.8.

The increase in biomechanical stiffness in the hu-man corneas was surprisingly high. From previous mea-

surements of porcine eyes, using slightly differenttreatment conditions (ie, treatment time [45 minutes],UVA irradiation source [mercury lamp with 365 nmUV filter], UVA irradiance [2 mW/cm2 ]), we expectedan increase in the range of a factor of 2, as found inporcine eyes in the present study.4

From other experiments on the diameter of cornealcollagen fibers,8 resistance to enzymatic digestion,9 andkeratocyte loss after riboflavin–UVA treatment,9,10 weknow that the cross-linking and cytotoxic effects are signif-icantly higher in the anterior portion of the cornea. Thisis caused by the significant increase in UVA absorptionby riboflavin, leading to a rapid reduction of UVA irra-diance and collagen cross-linking across the cornea.11

Given the uneven distribution of collagen cross-linking, with the maximum cross-linking effect in theanterior 300 �m of the corneal stroma, the treatedcorneas can be regarded as 2-layer structures. Theanterior portion amounts to 35% cross-linking volumein the porcine cornea (300 �m/850 �m) and to 54%cross-linking volume in the human cornea (300 �m/550 �m), resulting in higher rigidity of the total corneain human eyes, as reflected in the stress-strain measure-ments (Figures 3 and 5). In normal eyes, the more rigidanterior stroma also accounts for maintenance of thecorneal curvature.12,13

The anterior localization of the main cross-linkingeffect has the advantage of allowing us to achieve a rela-tively high increase in corneal rigidity in human eyesbecause of the relatively small thickness of the humancornea and to spare the endothelium and the lens fromcytotoxic damage provided the corneal stroma is nor-mally thick.

To avoid additional cross-linking inhomogeneities inthe horizontal dimensions, the irradiation was performedover the entire length of the corneal strips using 2 double

Figure 4. (Wollensak) Treated (below) and untreated (above) por-cine corneal strips with preservation of the corneal curvature in thetreated cornea due to the increase in bending stiffness by collagencross-linking.

Table 1. Stress values for 4%, 6%, and 8% strain and calculated Young’s modulus in brackets.

Type of Cornea Stress at 4% (103 Pa) Stress at 6% (103 Pa) Stress at 8% (103 Pa)

Porcine

Untreated 33.7 � 9.3 (E � 0.8 � 106 Pa) 57.3 � 17.3 (E � 1.5 � 106 Pa) 86.5 � 29.9 (E � 2.6 � 106 Pa)

Treated 55.8 � 17.6 (E � 1.4 � 106 Pa) 98.5 � 29.7 (E � 2.7 � 106 Pa) 151.8 � 44.7 (E � 5.3 � 106 Pa)

Human

Untreated 34.3 � 5.5 (E � 0.8 � 106 Pa) 53.0 � 11.5 (E � 1.3 � 106 Pa) 79.3 � 21.2 (E � 2.2 � 106 Pa)

Treated 135.7 � 61.4 (E � 3.0 � 106 Pa) 227.3 � 95.7 (E � 5.9 � 106 Pa) 344.7 � 141.9 (E � 11.8 � 106 Pa)



UVA diodes, whereas in clinical applications, we irradi-ate only the central cornea using 1 double UVA diode.2

The rise in biomechanical rigidity after collagencross-linking in human and porcine corneas is probablycaused by an increase in the collagen fiber diameter dueto intrafibril cross-links.8

Other cross-linking methods that have been testedsuccessfully in vitro have a biomechanical effect on thecornea comparable to riboflavin–UVA treatment butcannot be used clinically because of the development ofcorneal haze and scarring, as after glutaraldehyde treat-ment (W.J. Dupps, ARVO abstract 147, 2002),14 orapplication problems and prolonged treatment time, aswith glyceraldehyde (F.J. Tessier, ARVO abstract 3234,2002).14

In keratoconus, a 50% decrease in the stress neces-sary for a defined strain has been found.15 Accordingly,we have used the cross-linking treatment mainly in pro-gressive keratoconus and less frequently in corneal melt-ing processes. Further applications lie in the field ofrefractive surgery and are being explored in conditionssuch as after iatrogenic laser in situ keratomileusis(LASIK) induced keratectasia16,17 or for preventivetreatment before LASIK for high myopia to avoid orreduce possible postoperative myopic regression or ker-atectasia. Collagen cross-linking might also help to

avoid so-called central islands in broad-beam laser sur-gery (W.J. Dupps, ARVO abstract 147, 2002), oftencaused by differential corneal hydration,18 which ismarkedly reduced after cross-linking (E. Spoerl, ARVOabstract 2339, 1997).

In conclusion, the present study showed a strongerincrease in the biomechanical rigidity of the human cor-nea after riboflavin–UVA treatment than in the porcinecornea because of the relatively larger portion of cross-linking in the thinner human cornea. Practical applica-tions of the new method are for progressive keratoconus,corneal-melting processes, and LASIK in high myopia.

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12. Muller LJ, Pels E, Vrensen GFJM. The specific architec-ture of the anterior stroma accounts for maintenance

Figure 5. (Wollensak) Two-layer model of cross-linked cornea withthe anterior cross-linked and posterior non-cross-linked cornealstroma. In porcine corneas, the relative portion of the cross-linkedcornea (t1/t) is less than in human corneas due to the greater cornealthickness in pig eyes (850 �m versus 550 �m), resulting in less rigidityfor the total porcine cornea (as indicated by a lower �total) (� � totalstress of the cornea, �1 � partial stress of the cross-linked cornealayer, �2 � partial stress of the noncross-linked cornea layer, t � totalthickness of the cornea, t1 � partial thickness of the cross-linkedcornea layer, t2 � partial thickness of the noncross-linked cornealayer; � � �1 � t1/t � �2 � t2/t).



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Keratocytecytotoxicity ofriboflavin/UVA-treatment in vitro

G Wollensak1, E Spoerl1, F Reber2 and T Seiler3

Abstract

Purpose Collagen crosslinking using

ultraviolet- A (UVA) -irradiation combined

with the photosensitizer riboflavin is a new

technique for treating progressive

keratoconus. It has been shown to increase

effectively the biomechanical strength of the

cornea and to stop or even reverse the

progression of keratoconus. As part of a safety

evaluation, the present study was undertaken

to investigate in vitro the possible cytotoxic

effect of combined riboflavin/UVA-treatment

on corneal keratocytes and to compare it to

UVA-irradiation alone.

Methods Cell cultures established from

porcine keratocytes were treated with 0.025%

riboflavin solution and various UVA (370 nm)-

irradiances ranging from 0.4 to 1.0 mW/cm2

and with UVA alone between 2 and 9 mW/cm2

for 30 min. The cell cultures were evaluated for

cell death 24 h after irradiation using trypan-

blue and Yopro-fluorescence staining.

Results An abrupt cytotoxic irradiance level

was found at 0.5 mW/cm2 for keratocytes after

UVA-irradiation combined with the

photosensitizer riboflavin, which is 10-fold

lower than the cytotoxic irradiance of 5 mW/

cm2 after UVA-irradiation alone.

Conclusions A cytotoxic effect of combined

riboflavin/UVA-treatment on keratocytes is to

be expected at 0.5 mW/cm2, which is reached in

the clinical setting in human corneas down to

a depth of 300mm using the standard surface

UVA-irradiance of 3 mW/cm2.

Eye advance online publication, 23 January 2004;

doi:10.1038/sj.eye.6700751

Keywords: keratocytes; UVA; riboflavin;

necrosis; cell culture; crosslinking

Introduction

We have recently developed a new method for

the treatment of keratoconus by inducing

collagen crosslinking in the cornea using

ultraviolet A (UVA) and the photosensitizer

riboflavin. Collagen crosslinking leads to an

increase in intra- and interfibrillar covalent

bonds by photosensitized oxidation and causes

a biomechanical stabilization of the cornea. In a

prospective clinical pilot study including 22

patients with moderate or advanced progressive

keratoconus and with a follow-up time of up to

4 years, the progression of keratoconus could

thus be stopped in all treated eyes. Regression

with a reduction of the maximal keratometry

readings by 2 diopters was achieved in 70% of

patients.1

In stress–strain measurements of the human,2

porcine,2,3 and rabbit4 cornea, a significant

increase of mechanical rigidity was found. An

increased resistance to collagenases could be

demonstrated.5 Besides keratoconus and

corneal ulcers, the new treatment can be used in

corneal melting processes6 and in the field of

refractive surgery to reduce the risk for

iatrogenic keratectasia after LASIK (laser

assisted in situ keratomileusis).7

The impact of various treatment modalities

like corneal abrasion, PRK (photorefractive

keratectomacy),8 LASIK,8,9 and epithelial

injury10–12 on keratocytes has gained

considerable interest in recent years having a

possible influence on scarring or corneal

thinning.10 Therefore, as part of a

comprehensive safety evaluation, we have

undertaken the following experimental study to

assess the possible damage to corneal

keratocytes after combined riboflavin/UVA-

treatment and to compare it to the effect of

UVA-irradiation alone.

Material and methods

Materials

All primary cultures and serial passaging were

carried out in growth media consisting of

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)

Received: 3 February 2003Accepted in revised form:22 October 2003

1Department ofOphthalmology TechnicalUniversity of DresdenDresden, Germany

2Department of AnatomyTechnical University ofDresden Dresden, Germany

3Institut fur Refraktive undOphthalmo-Chirurgie(IROC) ZurichSwitzerland

Correspondence:G WollensakWildentensteig 4Berlin D-14195, GermanyTel: þ49 351 458 3763Fax: þ 49 351 458 4335E-mail: [email protected]

Eye (2004), 1–5& 2004 Nature Publishing Group All rights reserved 0950-222X/04 $25.00

www.nature.com/eyeL

AB

OR

AT

OR

YS

TU

DY

supplemented with 10% foetal calf serum (FCS, from

Sigma, Deisenhofen, FRG), phenol red, and antibiotics

(penicillin–streptomycin). Trypan-blue solution13

(Biochrome AG, Berlin, FRG) and Yopro (Molecular

probes, Eugene, OR, USA)-fluorescent stain were used

for the viability assay.14

Explant culture conditions

Explant cultures13 were established from porcine eyes,

which were obtained from a local slaughterhouse within

3–5 h postmortem. The epithelium was removed

mechanically using a blunt hockey knife. Pieces 6� 6 mm

of mid-stromal lamellae were dissected by a pair of

scissors, and transferred into a 25 cm2 cell culture flask

(Nunc, Wiesbaden, FRG). The flask was filled with 2 ml

DMEM plus 10% foetal calf serum and placed into an

incubator gassed with carbon dioxide 6% at 371C. Cell

outgrowth from the stromal explants started after 10–12

days, and confluence with about 2.5� 106 cells per flask

was reached after 21 days. The media were exchanged

every week. The confluent stock cultures were passaged

every 3 weeks with a split ratio of 1 : 3. For dissociation

and detachment, the cultures were treated with 0.05%

trypsin–EDTA solution. The free cells were centrifuged at

230 g, transferred into new culture flasks and

resuspended. The cell growth was evaluated regularly

using an inverted phase-contrast microscope at

� 100 magnification (Zeiss Axiovert L5). Before the

irradiation, 5� 104 cells were plated per well in

eight-well tissue plates, where they reached confluence

after 8–10 days. After another week, the UVA-irradiation

was performed.

Treatment groups

The cells were exposed to three different treatments:

1. Riboflavin alone: The cells were exposed to 25, 50, 100,

and 500 mM riboflavin solution.

2. Riboflavin plus UVA: The cells were exposed to

0.025% (¼ 500 mM) riboflavin solution plus

UVA-irradiances ranging from 0.4 to 1 mW/cm2

(Table 1).

3. UVA alone: The cells were exposed to UVA-

irradiances ranging from 2 to 9 mW/cm2 (Table 1).

Except for the varying UVA-irradiances, the other

parameters like riboflavin concentration or the UVA-

wavelength of 370 nm were kept identical to the clinical

treatment in the second treatment group.

Irradiation procedure

A riboflavin concentration as close as possible to the

conditions of the clinical treatment of human corneas

was chosen and calculated as follows. In humans, 0.1%

riboflavin solution is applied. Using the so-called

diffusion equation and the diffusion coefficient

(D¼ 6.5� 10�7 cm2/s) of the related dye fluorescein, we

calculated the average riboflavin concentration over

30 min in the stroma as 0.024% riboflavin solution.

Therefore, we used 0.025% riboflavin solution (¼ 500 mM)

by adding 57ml of 0.2% riboflavin stock solution to 400ml

colourless culture medium without phenol red. No

riboflavin was added to the cultures with UVA-treatment

alone. The riboflavin solution for the UVA-irradiation

was added to the wells 5 min before the irradiation and

was replaced by the cell medium after the irradiation.

To avoid UVA-absorption by riboflavin solution

overlying the monolayer of keratocytes attached to the

floor of the wells, we irradiated the wells from

underneath fixating the UVA-double diode (370 nm)

1 cm under the respective wells (Figure 1) with

the help of a stand. The UVA-absorption by the 100mm

thin floor of the wells made of borsilicone was

measured to be only 2% and was negligible. Before the

treatment, the required UVA-irradiances ranging

from 0.4 to 9 mW/cm2 were controlled with

a UVA-meter (LaserMate-Q, LASER 2000,

Wessling, Germany) at a 1 cm distance and if

necessary regulated with a potentiometer in series. The

irradiation itself lasted 30 min, which is conform to the

clinical setting. Five wells were tested for each

irradiance level. The irradiation doses (J/cm2) were

calculated from the UVA-irradiances (mW/cm2) by

multiplying the value with the irradiation time in

seconds (¼ 30� 60).

Table 1 Cytotoxicity for porcine keratocytes after combinedriboflavin/UVA-treatment and after UVA alone

Irradiance level (mW/cm2) RiboflavinþUVA UVA

9 þ8 þ7 þ6 þ5 þ4.5 �4 �3 �2 �0.8 þ0.7 þ0.6 þ0.55 þ0.5 þ0.45 �0.4 �

(þ ) Necrosis, (�) no cell damage.

Keratocyte cytotoxicityG Wollensak et al

2

Eye

Supravital staining

To determine possible cell damage after treatment, 100ml

of 0.25% trypan-blue solution dissolved in colourless

culture medium was applied per well for 15 min

followed by twofold rinsing with culture medium. After

microscopic evaluation of the trypan-blue staining,13 the

cells were subsequently stained with Yopro adding 1 ml

per well followed by one rinse with culture medium.14

For trypan blue (Figures 2 and 3), cultures were

examined in an inverse microscope (Leica DMIR) at

100–400-fold magnification using differential interference

contrast and for Yopro (Figure 4) using fluorescence at

488 nm (N2.1 filter). Photos were taken with a digital

camera attached to the microscope (Nikon coolpix 950).

Only the nuclei of damaged cells were labelled with the

stains.

Results

Cellular characteristics

Before confluence, the scattered cells appeared dendritic,

whereas they assumed a spindle-shaped appearance

when confluence was reached (Figure 2). About 10% of

the cells contained some brown-coloured,

autofluorescent granules as is typical for lipofuscein

deposits. After cytotoxic doses, the damaged cell nuclei

stained positively with trypan blue (Figure 3) and the

green-fluorescent Yopro (Figure 4). The cell damage

detected by the two stains was always observed in the

same cells and at the same irradiance level. In addition,

dead cells became more globular in shape and about

5–10% of the damaged dead cells lost adhesion floating

off the bottom of the wells. The area of the damaged cells

Figure 3 Peripherial sector of the circular treatment area(riboflavin plus 0.5 mW/cm2 UVA) with trypan-blue-positivekeratocytes and loss of cells (trypan blue, � 400).

Figure 4 Peripherial sector of the circular treatment area(5 mW/cm2 UVA) with Yopro-stained keratocyte nuclei (Yopro,� 400).

Figure 2 Representative morphology of the cultured porcinekeratocytes at confluence (phase-contrast, � 100).

Figure 1 Irradiation procedure with double UVA-diode underthe wells of the culture plate.


3

Eye

was shaped like a circle quasi like an imprint of the UVA-

beam with surviving cells only in the nonirradiated

periphery (Figures 3 and 4).

Cytotoxicity

The cytotoxic irradiance level was found to be 10-fold

lower at 0.5 mW/cm2. (¼ 0.9 J/cm2) for keratocytes after

riboflavin combined with UVA-irradiation compared to

5 mW/cm2 (¼ 9 J/cm2) for cells with UVA-irradiation

alone (Table 1). The cytotoxic effect occurred in a

threshold-like manner with a sharp and abrupt

transition from damaging to nontoxic irradiance levels.

There was no variability in the five different wells per

irradiance level and always all cells irradiated with the

toxic dose were damaged. There was no cytotoxicity

for the cells treated with riboflavin alone without

UVA-irradiation.

Discussion

The present study has shown an abrupt threshold-like

cytotoxic irradiance level of combined riboflavin/UVA-

treatment at 0. 5 mW/cm2. Using the standard surface

irradiance of 3 mW/cm2 and the absorption coefficient

of 53 cm�1, it can be calculated according to the

Lambert–Beer equation Idepth¼ Isurfacee(�dm) that in human

corneas the cytotoxic keratocyte UVA-irradiance of

0.5 mW/cm2 is reached down to a stromal depth of

300 mm.4,15 These data fit well to our in vivo results in

riboflavin/UVA-treated rabbit corneas, where we found

exactly the same cytotoxic irradiance of 0.5 mW/cm2

with a keratocyte loss down to a depth of 300mm after

3 mW/cm2 surface irradiance.16

UV-induced damage of keratocytes has also been

reported by others and depends on the ultraviolet

wavelength and dose. While ultraviolet C (UVC)

(100–290 nm) is completely absorbed at the corneal

surface and 80% of ultraviolet B (UVB) (290–315 nm) in

the corneal epithelium, 25–34% of UVA (315–400 nm) is

absorbed in the stroma.17 Accordingly, massive

keratocyte damage was observed especially in the

anterior portion of the rabbit cornea following exposure

to UVA-irradiation at 350 nm.18,19

In the present in vitro study, the cytotoxic irradiance

level after combined riboflavin/UVA-treatment was

about 10-fold lower than that after treatment with UVA

alone because the cytotoxic effect, which is due to the

oxidant effect of UVA-light, is multiplied by the

photosensitizer riboflavin due to increased UVA-

absorption. Concurrent with this observation,

UVA-absorption was shown by us to be increased to

95%4 in the cornea after riboflavin treatment compared to

25–35% without riboflavin.17

Riboflavin (vitamin B2) alone produced no cell damage

as is also known from other experiments20 and is not

surprising because riboflavin is also present in the retina,

liver, and heart, being an essential element in normal

nutrition.21

In terms of the clinical problems of keratocyte loss,

only long-term imbalances of the keratocyte

reconstitution bear a risk for corneal thinning.8,10

However, this is not to be expected because the

keratocyte loss can be repaired rapidly by

repopulation from migrating keratocytes of the

adjacent cornea.8,22 Loss of keratocytes has been

observed already in other corneal procedures without

having dramatic consequences. So after PRK,8

LASIK,8,9 or epithelial injury10–12 keratocyte apoptosis

of variable degree was described. However,

treatment-related keratocyte apoptosis might be

an issue because of the presumptive role of

keratocyte apoptosis in the pathogenesis of

keratoconus.8

The state of the keratocytes was assessed 24 h

following UVA-irradiation because then there is the

maximum degree of cell damage as has been shown

previously.16 To determine possible cell death, we first

conducted trypan-blue staining followed by Yopro

staining.14 Both stains are positive in the nuclei of

damaged cells without interfering with cell viability,

whereas undamaged endothelial cells are impervious to

these dyes. The DNA-intercalant dye Yopro is also

able to detect minor damage like in apoptotic cells

due to its relatively low molecular weight (MW 629

vs 961).14 Yet, as the threshold for both Yopro and

trypan blue was congruent, and at the same dose

level, the cellular damage in the present in vitro

experiment is obviously mainly due to necrosis because

otherwise the Yopro stain should have been positive

already at lower irradiance levels than the one found by

trypan blue.

In conclusion, we have shown that combined

riboflavin/UVA-treatment leads to a 10-fold lower

threshold for keratocyte cytotoxicity at 0.5 mW/cm2

compared to 5 mW/cm2 after UVA-irradiation alone.

Using riboflavin/UVA in human corneas,

keratocyte damage can be expected down to a

depth of 300mm using 3 mW/cm2 surface irradiance.

Although no corneal thinning or scarring due to

keratocyte loss has been observed so far in a

4-year-clinical trial,1 a long-term study including

confocal in vivo microscopy in humans after

riboflavin/UVA-treatment is currently underway to

evaluate the depth of the keratocyte loss, the

repopulation process, and to exclude reliably the

development of treatment-related stromal scarring,

haze, or thinning in humans.


4

Eye

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5

Eye

Basic Investigations

Keratocyte Apoptosis After CornealCollagen Cross-linking UsingRiboflavin/UVA TreatmentGregor Wollensak, MD, Eberhard Spoerl, PhD, Michaela Wilsch, PhD, and

Theo Seiler MD, PhD

AbstractPurpose:Combined riboflavin/UVA treatment inducing col-lagen cross-links in the cornea has been shown toincrease the biomechanical rigidity of the corneaand has been used successfully in the treatment ofprogressive keratoconus. The current study wasundertaken to investigate the possible cytotoxic ef-fect of combined riboflavin/UVA treatment on cor-neal keratocytes in vivo.

Methods:Thirty-four New Zealand white rabbits were treatedwith 0.1% riboflavin solution and surface UVA ir-radiances ranging from 0.75 to 4 mW/cm2 (1.35–7.2 J/cm2) for 30 minutes. The animals were eutha-nized either 4 (n = 6) or 24 (n = 28) hours postop-eratively. Four additional control eyes underwentepithelial debridement alone. The corneas of theenucleated eyes were evaluated in routine histo-logic sections. In addition, the TUNEL techniqueand transmission electron microscopy were usedfor the detection of keratocyte apoptosis.

Results:In the control eyes with corneal epithelial debride-ment only, apoptotic keratocytes were found in theanterior 50 µm of the corneal stroma 4 hours post-operatively. However, riboflavin/UVA-induced ap-optosis was only visible in the rabbit eyes enucle-ated 24 hours postoperatively. In these eyes, wefound apoptosis of keratocytes down to a variablestromal depth depending on the applied UVA irra-diance. A cytotoxic UVA irradiance for keratocytesin the range of 0.5–0.7 mW/cm2 could be deduced.

Conclusions:Riboflavin/UVA treatment leads to a dose-dependent keratocyte damage that can be expectedin human corneas down to a depth of 300 µm usinga surface UVA dose of 5.4 J/cm2. Future studiesshould be done to examine the keratocyte repopu-lation and exclude possible adverse sequelae ofkeratocyte loss like stromal scarring or thinning.

Key Words: UVA radiation, cross-linking, kerato-cytes, riboflavin, cornea, apoptosis

(Cornea 2004;23:43–49)

Collagen cross-linking in the cornea using

UVA and the photosensitizer ribofla-

vin was developed by us recently for biome-

chanically strengthening the cornea. In a

prospective clinical pilot study including

22 patients with progressive keratoconus

and a follow-up of up to 4 years, the pro-

gression of keratoconus could be stopped in

all treated eyes. Even regression with a re-

duction of the maximal keratometry readings

by 2 diopters was achieved in 70% of pa-

tients. Corneal and lens transparency as well

as endothelial cell density remained un-

changed.1 In stress-strain measurements of

human, rabbit, and porcine cornea,2–4 we

could show a significantly increased biome-

chanical rigidity. After exposure to collage-

nases that play a role in both keratoconus and

corneal ulceration, a significant delay in en-

zymatically induced tissue dissolution by 8

days was found in cross-linked corneas indi-

cating an increased resistance to enzymatic

digestion.5 Other applications of the new

cross-linking method lie in the treatment of

corneal melting processes6 and in the field of

refractive surgery like prevention of postop-

erative keratectasia after LASIK for high

myopes or regression of the refractive ef-

fect.7

As part of an extensive safety evalua-

tion of the new treatment, we have under-

taken the following experimental study to

assess the possible damage to the kerato-

cytes after combined riboflavin/UVA treat-

ment.

Received for publicationFebruary 6, 2003; revisionreceived July 9, 2003; acceptedAugust 15, 2003.

From the Department ofOphthalmology, TechnicalUniversity of Dresden, Dresden,Germany (Drs. Wollensak andSpoerl); Max-Planck-Institute forCell Biology and Genetics,Dresden, Germany (Dr. Wilsch);and the Department ofOphthalmology, University ofZurich, Zurich, Switzerland (Dr.Seiler).

Reprints: Gregor Wollensak,MD, Wildentensteig 4, D-14195Berlin, Germany (e-mail:[email protected]).

Copyright © 2003 byLippincott Williams & Wilkins

43CORNEAVolume 23, Number 1

January 2004

MATERIAL AND METHODS

Study DesignThirty-eight eyes of 38 female New

Zealand white rabbits weighing 2–2.5 kgwere used. Thirty-four eyes of 34 rabbitswere treated with central epithelial abrasion,riboflavin, and varying UVA irradiances (seebelow). Four control eyes in 4 rabbits weretreated with corneal abrasion alone. The ani-mals were divided into 2 subsets dependingon the postoperative time interval of either 4or 24 hours, respectively:1. Six rabbits were irradiated with a surface

UVA irradiance ranging from 0.75 to 4mW/cm2 (0.75, 1.5, 3, and 4 mW/cm2)(Table 1). These animals were all eutha-nized 4 hours postoperatively. Two ad-ditional rabbits underwent corneal epithe-lial debridement alone and were eutha-nized 4 hours postoperatively as well(n = 8).

2. Twenty-eight rabbits treated with ribofla-vin and irradiated with a surface UVA irra-diance ranging from 0.75 to 4 mW/cm2

(0.75, 1.5, 1.88, 2.25, 2.62, 3, and 4mW/cm2) (Table 1) were euthanized 24hours postoperatively. Two additional rab-bits underwent corneal epithelial debride-ment alone and were euthanized 24 hourspostoperatively as well (n = 30).

Cross-linking TreatmentGeneral anesthesia was performed with

a subcutaneous injection of a mixture of di-azepam and atropine (1 mg). For premedica-tion, 1.5 mL ketamine hydrochloride 10% (35

mg/kg) and 0.5 mL xylazine hydrochloride(5 mg/kg) were used. In each rabbit, only theright eye was exposed to UV radiant energy.A lid speculum was placed. After removal ofthe central 5-mm portion of the epitheliumusing a blunt crescent knife, riboflavin (vita-min B2) photosensitizer solution containing0.1% riboflavin-5-phosphate and 20% dex-tran T-500 was dropped onto the cornea 5minutes before the irradiation to achievegood corneal penetration of the solution andevery 5 minutes during the irradiation. Theeyes were irradiated with UVA (370 nm) for30 minutes using a double UVA diode (Roith-ner Lasertechnik, Vienna, Austria) at a dis-tance of 1 cm from the cornea. Three 1.3-Vaccumulators were used as a power genera-tor. Before the treatment, the desired sur-face irradiance in the range from 0.75 to 4mW/cm2 (Table 1) was controlled with acalibrated UVA meter (LaserMate-Q, LASER2000, Wessling, Germany) at a 1-cm distanceand if necessary regulated with a potentiom-eter. The animals were euthanized 4 or 24hours postoperatively with general anes-thesia using an overdose of intravenous so-dium phenobarbital. All animal procedureswere approved by the ethics committee andconformed to the ARVO Resolution on theUse of Animals in Ophthalmic and Vision Re-search.

Tissue PreparationThe rabbit eyes enucleated 4 or 24

hours postoperatively were bisected. Onehalf was fixed in 4% neutral-buffered formalinfor light microscopy and the other half was

TABLE 1. Depth of Keratocyte Loss in Relation to UVA Irradiance

Group nSurface UVA Irradiance

(mW/cm2)Depth of Keratocyte Loss

(µm)Calculated Cytotoxic UVA-

Irradiance (mW/cm2)

1 3 4 350 0.632 6 3 300 0.613 5 2.62 260 0.664 3 2.25 200 0.775 3 1.88 170 0.766 5 1.5 130 0.757 3 0.75 80 0.49

44 CORNEAVolume 23, Number 1

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Wollensak et al

© 2003 Lippincott Williams & Wilkins

immersed in 2% glutaraldehyde for transmis-

sion electron microscopy (TEM). For light mi-

croscopy, 4-µm thin paraffin sections were

stained with hematoxylin-eosin and periodic

acid–Schiff (PAS). The specimens were evalu-

ated using a Zeiss light microscope (Ax-

ioskop) at 40- to 1000- fold magnification.

The depth of the damaged zone with loss of

keratocytes, and few remaining apoptotic

keratocytes was measured using a special

morphometry reticule

For transmission electron microscopy,

small pieces of the central cornea were post-

fixed in 4% osmium tetroxide, dehydrated,

and embedded in Epon resin. After observa-

tion of the semithin sections stained with to-

luidine blue, 50–70-nm ultrathin sections

were prepared, mounted on copper grids,

contrasted with uranyl acetate and lead ci-

trate, and assessed using the Morgagni 268D

electron microscope (Philips) at 3500–

34,000× magnification.

TUNEL AssayTo detect apoptosis with DNA strand

breaks in situ, terminal deoxynucleotidyl

transferase (TdT) mediated dUTP-biotin nick

end labeling (TUNEL) was performed essen-

tially as described previously.8 In brief, after

the quenching of endogenous peroxidase,

sections were incubated with TdT buffer (30

mN Tris, 140 mmol/L sodium cacodylate, 1

mmol/L cobalt chloride) at pH 7.2 and incu-

bated with 0.3 u/mL TdT (Sigma, München,

Germany) and biotinylated-dUTP (1:200;

Boehringer, Mannheim, Germany) in TdTbuffer for 60 minutes at 37°C. Labeled nucleiwere detected with Vectastain ABC (VectorLabs, Burlingame, CA) and peroxidase activ-ity was visualized by 3-amino-9-ethyl-carbazole (AEC) to yield a reddish brown re-action product. The sections were lightlycounterstained with hematoxylin. As a posi-tive control, tissue sections of follicular hy-perplasia of the appendix were used andgave the expected positive staining oftingible bodies in the germinal centers.

Calculation of Cytotoxic UVAIrradiances and Doses

The cytotoxic UVA irradiance was de-termined by correlating the depth of thekeratocyte loss with the corresponding UVAirradiances reached at the specific stromaldepth that were calculated according to theequation Idepth = I surface · e(−dµ) (Lambert-Beerlaw) using the absorption coefficient µ of 53cm−1 that was found by us in earlier UVAtransmission measurements following ribofla-vin treatment (Table 1).4,9 Irradiation doses(J/cm2) were calculated from the UVA irradi-ances (mW/cm2) by multiplying the valuewith the irradiation time in seconds (30 ×60).

RESULTSLight Microscopy and TUNEL Assay

In the 6 cross-linked corneas, all eutha-nized 4 hours postoperatively and the 4 con-trol eyes with corneal abrasion alone, eutha-nized 4 or 24 hours postoperatively, onlyscattered apoptotic keratocytes were presentdown to a depth of 50 µm in the anteriorstroma as shown by light microscopy in theTUNEL-stained sections and on transmissionelectron microscopy.

In the 28 cross-linked corneas, all eu-thanized 24 hours postoperatively, a massiveloss of keratocytes with an almost acellularzone and some remaining apoptotic, TUNEL-positive, or completely destroyed necroticcells were observed in variable depths of thecorneal stroma correlating with an increasingsurface UVA irradiance (Figs. 1, 2A–C, 3A;Table 1). All these changes were only presentin the treated area with a sharp transitionzone toward the normal-appearing adjacenttissue without treatment (Fig. 2C). Some re-generating thinned epithelium was presentover the edges of the lesion as some epithe-lial migration had already taken place in thedeepithelialized treatment zone within 24hours (Fig. 2C).

Transmission Electron MicroscopyIrradiated apoptotic keratocytes re-

vealed apoptotic changes like formation of


January 2004

Keratocyte Apoptosis After Corneal Collagen Cross-linking

apoptotic bodies, chromatin condensation,and cell shrinkage (Figs. 3B,C).

CytotoxicityThe cytotoxicity level for keratocytes

was calculated for the various stromal depthsaccording to the Lambert-Beer law (seeabove) and found to be in the range of 0.49–0.77 mW/cm2 irradiance corresponding toUVA doses of 0.86–1.39 J/cm2 (Table 1).

DISCUSSION

The current study has shown signifi-cant keratocyte damage after combinedriboflavin/UVA cross-linking treatment corre-lating closely with the level of UVA irradiance(Figs. 1 and 2; Table 1). Using the Lambert-Beer law and the absorption coefficient of 53cm−1 for the UVA irradiation in riboflavin-treated cornea,4,9 we were able to deduce acytotoxic irradiance threshold for kerato-cytes in the range of 0.5–0.7 mW/cm2 fromthe depth of the keratocyte loss and the cor-responding irradiance levels.

In the eyes of the irradiated animals thathad been euthanized 4 hours postoperativelyand in the deepithelialized control eyes, kera-tocyte apoptosis was located only in the an-terior 50 µm, whereas in the irradiated ani-

mals euthanized 24 hours postoperatively,

extended and deep keratocyte loss and apo-

ptosis was found. Obviously, in the cases eu-

thanized 4 hours postoperatively, keratocyte

apoptosis was of the immediate type10,11 and

only due to epithelial scraping, as has been

described by others after corneal deepitheli-

alization.12,13 Accordingly, in the eyes

enucleated 24 hours postoperatively, a more

delayed type of apoptosis was found that was

due to UVA.10,11 Riboflavin by itself is not

cytotoxic, but as a photosensitizer, it in-

creases the absorption of UVA, which in-

duces the cellular damage.14

Similar UVA-induced keratocyte dam-

age has been reported after UVA irradiation

without a photosensitizing agent. Using pig-

mented rabbits, Pitts et al15 found a corneal

damage threshold at the surface UVA dose

(365 nm) of 42.5 J/cm2. Our relatively low

cytotoxic UVA surface dose in the range of

1.35–7.2 J/cm2 can be explained by the mul-

tiplying effect on the UVA absorption by ri-

boflavin.14 UVB-induced keratocyte loss can

be found already at lower dose levels becauseof the shorter wavelength of UVB with a cor-respondingly higher energy content.

Histologically, keratocyte damage wasobserved, especially in the anterior one-fourth of the albino rabbit cornea after expo-

FIGURE 1. Scheme illustrates the depth of keratocyte loss depending on surface UVA irradiance.


January 2004

Wollensak et al


FIGURE 2. Light micrograph (A) and schematic diagram (B) of keratocyte loss and apoptosis downto 100 µm 24 hours after irradiation with surface UVA irradiance of 0.75 mW/cm2 (hematoxylin andeosin, �200). Light micrograph (C) and schematic diagram (D) of keratocyte loss and apoptosisdown to 170 µm 24 hours after irradiation with surface UVA irradiance of 1.88 mW/cm2 (hema-toxylin and eosin, �200). Light micrograph (E) and schematic diagram (F) of transition from theirradiated area with a total keratocyte loss across the entire stroma 24 hours after irradiation withsurface UVA irradiance of 4 mW/cm2 (hematoxylin and eosin, �200) to the adjacent normal cornea.Thinned healing epithelium migrating from the right side.


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sure to 290–350 nm UVB irradiation over 15minutes.16 After UVB irradiation of 0.12J/cm2 at 280 nm and 0.47 J/cm2 at 310 nm,other authors have reported extended UV-induced keratocyte apoptosis through the en-

tire thickness of the cornea 24 hours after thetreatment.17,18

The clinical importance of massivekeratocyte loss is not quite clear because thekeratocyte loss can usually be repaired by re-population from migrating keratocytes of theadjacent cornea.12,19 In other treatment mo-dalities like corneal abrasion,20–22 PRK,12,19

LASIK,12,19,23 and epikeratophakia24 or dis-eases like keratoconus25 and herpes,26 kera-tocyte loss of variable extension has been re-ported in recent years having a possible in-fluence on scarring, haze,27 or cornealthinning.20,25 However, in our clinical study,we have not observed any change in trans-parency or corneal thickness after the cross-linking treatment.1 Application of the apo-ptosis inhibitor zinc chloride is not helpful28

because then the wanted cross-linking effectwould also be weakened.14

In conclusion, we have shown thatcombined riboflavin/UVA cross-linking treat-ment leads to a dose-dependent keratocyteapoptosis at 0.86–1.39 J/cm2 and can be ex-pected in human corneas of 500-µm thick-ness down to a depth of 300 µm using theusual 3 mW/cm2 surface irradiance (5.4J/cm2 surface dose). A clinical long-termstudy using confocal in vivo microscopy29 af-ter riboflavin/UVA treatment is currently un-derway to evaluate the depth of the kerato-cyte loss and the repopulation process and toexclude the development of treatment-related stromal scarring, haze, and thinningin humans.

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FIGURE 3. A: TUNEL-positive apoptotic kerato-cytes (arrowheads) in the posterior half of thecornea 24 hours after irradiation with surfaceUVA irradiance of 4 mW/cm2 (oil immersion,�1000). B: Apoptotic cell bodies, chromatincondensation, and cell shrinkage in the centralkeratocyte 24 hours after irradiation surface UVAirradiance of 4 mW/cm2 (TEM, uranyl acetateand lead citrate, �3500). The frame delineatesthe portion that is shown magnified in C. C:Higher magnification of the apoptotic keratocyteillustrates apoptotic cell bodies (TEM, uranyl ac-etate and lead citrate, �34,000).


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Wollensak et al


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January 2004


Endothelial cell damage after riboflavin–ultraviolet-A treatment in the rabbitGregor Wollensak, MD, Eberhard Spoerl, PhD, Michaela Wilsch, PhD, Theo Seiler, MD, PhD

Purpose: To evaluate the possible cytotoxic effect of combined riboflavin–ultravi-olet-A (UVA) treatment on the corneal endothelium.

Setting: Department of Ophthalmology, Technical University of Dresden,Dresden, Germany.

Methods: The right eyes of 34 New Zealand White rabbits were treated with ribo-flavin and various endothelial UVA doses ranging from 0.16 to 0.9 J/cm2 (0.09 to0.5 mW/cm2, 370 nm) and postoperative enucleation times of 4 hours and 24hours. The endothelial cells were evaluated in histological sections. The terminaldeoxynulceotidyl transferase deoxy-UTP-nick-end labeling (TUNEL) technique andtransmission electron microscopy were used to detect apoptosis.

Results: There was no endothelial damage in the 6 rabbit eyes enucleated at4 hours. In those enucleated at 24 hours, there was significant necrosis and apo-ptosis of endothelial cells in the corneas treated with an endothelial dose of�0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2), which is about twice the endothelial UVA dose usedin the treatment of keratoconus patients.

Conclusions: In rabbit corneas with a corneal thickness less than 400 �m, theendothelial UVA dose reached a cytotoxic level of �0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2)using the standard surface UVA dose of 5.4 J/cm2 (3 mW/cm2). Pachymetryshould be routinely performed before riboflavin–UVA treatment; in thinner cor-neas, irradiation should not be done because of the cytotoxic risk to theendothelium.

J Cataract Refract Surg 2003; 29:1786–1790 © 2003 ASCRS and ESCRS

Collagen cross-linking in the cornea using combinedriboflavin–ultraviolet-A (UVA) treatment leads to

a significant increase in mechanical stiffness, as shown instress-strain measurements1–3 and increased resistanceto collagenases.4 The treatment’s main clinical use is inprogressive keratoconus,5 corneal ulcers,6 and before la-ser in situ keratomileusis in eyes with high myopia to

reduce the risk for postoperative myopic regression oriatrogenic keratectasia.

Preservation of the endothelium is crucial for everytreatment involving the cornea; 400 to 800 endothelialcells/mm2 is the minimum endothelial cell count for aclear cornea.7 However, the risk involved in the newmethod of cross-linking is unknown and a major con-cern that must be clarified before the technique can beapplied on a larger scale. In this experimental study, weevaluated the cytotoxic damage to the corneal endothe-lium after riboflavin–UVA treatment.

Materials and Methods

Rabbit EyesIn the experiments, 36 right eyes of 36 female New

Zealand White rabbits weighing 2.0 to 2.5 kg were used.

Accepted for publication February 13, 2003.

From the Department of Ophthalmology, Technical University ofDresden (Wollensak, Spoerl), and Max-Planck-Institute for Cell Biologyand Genetics (Wilsch), Dresden, Germany, and the Department of Oph-thalmology, University of Zurich (Seiler), Zurich, Switzerland.

None of the authors has a financial interest in any product mentioned.

Reprint requests to Priv.-Doz. Dr. med. Gregor Wollensak, UniversityEye Clinic Dresden, Fetscherstrasse 74, D-01307 Dresden, Germany.E-mail: [email protected].

© 2003 ASCRS and ESCRS 0886-3350/03/$–see front matterPublished by Elsevier Inc. doi:10.1016/S0886-3350(03)00343-2

The animals were divided into 2 groups: 7 rabbits killed4 hours postoperatively and 29 rabbits killed 24 hourspostoperatively.

In the first group, 2 rabbits were irradiated with an endo-thelial UVA dose of 0.65 J/cm2 (irradiance 0.36 mW/cm2);1 with 0.9 J/cm2 (0.5 mW/cm2); 2 with 0.33 J/cm2

(0.18 mW/cm2), which was equivalent to the endothelialUVA intensity used in humans; and 1 with 0.16 J/cm2 (0.09mW/cm2) (Table 1). These animals (n � 6) were killed 4hours postoperatively. One additional rabbit received a cor-neal abrasion only and was also killed at 4 hours.

In the second group, 28 rabbits treated with riboflavinand irradiated with an endothelial UVA dose ranging from0.16 to 0.9 J/cm2 (irradiance 0.09 to 0.5 mW/cm2) (ie, sur-face epithelial doses of 1.35, 2.7, 3.4, 4.0, 4.7, 5.4, and7.2 J/cm2 [irradiance 0.75, 1.5, 1.88, 2.25, 2.62, 3.0, and4.0 mW/cm2]) (Table 1) were killed 24 hours postoperatively.One additional rabbit received a corneal abrasion only andwas also killed at 24 hours.

Treatment ProcedureGeneral anesthesia was induced with a subcutaneous in-

jection of a mixture of diazepam (1 ampule Faustan�) andatropine (1⁄2 ampule, 1 mg). For premedication, 1.5 mL ket-amine hydrochloride 10% (Rompun�) (35 mg/kg) and0.5 mL xylazine hydrochloride (5 mg/kg) were used. Therabbits were placed on the left side with the left eye closed; theright eye was held open with a lid holder (Figure 1). Thecentral 5.0 mm portion of the epithelium was removed with ablunt hockey knife; 5 minutes before the irradiation, a ribo-flavin photosensitizer solution containing 0.1% riboflavin-5-phosphate and 20% dextranT-500 was placed on the corneato achieve good corneal penetration of the solution; this wasrepeated every 5 minutes during the irradiation. The eyes wereexposed to a surface UVA (370 nm) irradiance rangingfrom 0.75 to 4.0 mW/cm2 (Table 1) for 30 minutes usinga double UVA diode (Roithner Lasertechnik) 1.0 cm from thecornea (Figure 1). The respective endothelial UVA irradiances

between 0.09 and 0.50 mW/cm2 were calculated according tothe equation Idepth � I surface � e(�d�), where depth (d) was400 �m and the UVA-absorption coefficient (�) was53 cm�1, determined in earlier UVA-transmission measure-ments following riboflavin treatment.2 Before treatment, thedesired irradiance was controlled with a calibrated UVA meter(LaserMate-Q, Laser 2000) at 1.0 cm and, if necessary, regu-lated with a potentiometer.

In the animals killed after 4 hours, anesthesia was main-tained with supplemental injections. The other animals werekilled under general anesthesia with an overdose of sodiumphenobarbital 24 hours postoperatively. All animal proce-dures were approved by the ethics committee and conformedto the ARVO Statement for Use of Animals in Ophthalmicand Vision Research.

Tissue PreparationAfter enucleation, the rabbit eyes were bisected and

fixed in neutral buffered 4% formalin for light microscopy

Figure 1. (Wollensak) Irradiation procedure showing a double UVAdiode 1.0 cm from the riboflavin-treated rabbit cornea.

Table 1. Treatment groups, surface epithelial and endothelial UVA irradiance, and endothelial cytotoxicity in rabbits (only animals with 24hours post-mortem).

GroupNumber

of Animals

Surface EpithelialUVA Irradiance

(mW/cm2)

EndothelialUVA Irradiance

(mW/cm2)EndothelialCytotoxicity

1 3 4.0 0.50 � 0.07 ��

2 6 3.0 0.36 � 0.04 ��

3 5 2.62 0.32 � 0.04 0

4 3 2.25 0.27 � 0.03 0

5 3 1.88 0.23 � 0.03 0

6 5 1.5 0.18 � 0.02 0

7 3 0.75 0.09 � 0.01 0

LABORATORY SCIENCE: ENDOTHELIAL CELL DAMAGE AFTER CROSS-LINKING


and 2% glutaraldehyde for transmission electron microscopy(TEM).

For light microscopy, 4 �m paraffin sections were stainedwith hematoxylin and eosin. The specimens were analyzedusing a Zeiss light microscope (Axiomat) at �20 to �1000magnification.

For electron microscopy, small pieces of central corneawere postfixed in 4% osmium tetroxide, dehydrated, and em-bedded in Epon resin. Semithin sections were stained withtoluidine blue. Ultrathin sections of 50 to 70 nm were con-trasted with uranyl acetate and lead citrate and assessed usingthe Morgagni 268D electron microscope (Philips) at �2800magnification.

TUNEL AssayTerminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxy-

UTP-nick-end labeling for detecting apoptosis was per-formed essentially as described by Ihling et al.8 Briefly, afterthe endogenous peroxidase was quenched, sections were incu-bated with TdT buffer (30 mN TRIS, 140 mM sodium ca-codylate, 1 mM cobalt chloride) at pH 7.2 and incubated with0.3 eu/mL TdT (Sigma) and biotinylated-dUTP (1:200;Boehringer) in TdT buffer for 60 minutes at 37°C. Labelednuclei were detected with Vectastain ABC (Vector Labs),and peroxidase activity was visualized by 3-amino-9-ethyl-carbazole to yield a reddish-brown reaction product. Thesections were lightly counterstained with hematoxylin. Asa positive control, tissue sections of follicular hyperplasia ofthe appendix were used. Negative control slides were alsoincluded.

PachymetryThe central corneal thickness of the rabbit corneas was

determined preoperatively using an ultrasound pachymeter(Pachette, Technomed).

ResultsHistology

In the 6 treated animals killed at 4 hours and the2 cases with corneal epithelial debridement alone, nei-ther TUNEL-positive endothelial cells nor loss of endo-thelium was observed.

In the animals killed at 24 hours, significant endo-thelial cell necrosis with complete loss of endothelialcells (Figure 2) and a few remaining apoptotic endo-thelial cells were observed in the treatment area in theeyes that had an endothelial UVA dose of 0.9 J/cm2

(0.5 mW/cm2) and of 0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2),which was twice as high as the therapeutic endo-thelial dose in humans of 0.32 J/cm2 (0.18 mW/cm2)(Table 1).

In the animals exposed to an endothelial UVA doseof 0.16 to 0.58 J/cm2 (0.09 to 0.32 mW/cm2), the en-dothelial cells were intact.

TUNNEL Assay and TEMUsing the TUNEL-straining, the few remaining

endothelial cells in the 2 groups (0.9 J/cm2 and0.65 J/cm2) were TUNEL-positive, showing brownnuclear staining (Figure 3).

On TEM, apoptotic endothelial cells showed typi-cal features of apoptosis-like chromatin condensation,formation of apoptotic bodies, and cell shrinkage(Figure 4).

Figure 2. (Wollensak) Complete endothelial cell loss in the treat-ment zone with sharp demarcation toward untreated area (arrow)(endothelial UVA dose of 0.9 J/cm2).

Figure 3. (Wollensak) TUNEL-positive apoptotic endothelial cell(arrow) (endothelial UVA dose of 0.65 J/cm2, original magnification�100, oil immersion).



Pachymetry

The mean central corneal thickness was 400 �m �20 (SD).

DiscussionThis study showed a specific threshold-like cyto-

toxic effect of combined riboflavin–UVA treatment oncorneal endothelium starting at an endothelial UVAdose of 0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2). Using the absorp-tion coefficient of 53 cm�1, which we found in earlierUVA-transmission measurements following riboflavintreatment,2 it can be calculated that in human corneasthinner than 400 �m, the cytotoxic endothelial UVAirradiance of 0.36 mW/cm2 is reached using the stan-dard surface irradiance of 3.0 mW/cm2.

Fortunately, the cytotoxic threshold is not reachedin normal corneas with an average corneal thicknessof 540 �m or in most keratoconus patients (410 to470 �m).9 However, in corneal ulcers and advancedkeratoconus, the corneal thinning may be beyond thislimit. In such cases, riboflavin–UVA treatment shouldbe avoided and alternative methods such as amniontransplantation for ulcers or keratoplasty for keratoco-nus considered. Alternatively, in thinner corneas with atleast 350 �m corneal thickness, a reduced surface UVAdose of 3.6 J/cm2 (2 mW/cm2), which is the lowest doseto produce a significant mechanical stiffening effect1

and increase resistance to enzymatic digestion,4 mightbe tried cautiously; the endothelial UVA dose wouldthen be only 0.54 J/cm2 (0.3 mW/cm2). In addition, in

keratoconus patients with extreme thinning in a smallarea only, the treatment might be used because the en-dothelial cell loss in a small circumscribed area might becompensated for by the migration of adjacent undam-aged endothelial cells.

The observed cytotoxic effect on the endotheliumappeared to be due to the combined effect of UVA andthe photosensitizer riboflavin, which increases UVA ab-sorption in the cornea to 95%2 compared to 32% with-out riboflavin.10 From in vivo irradiation experiments inanimal eyes, it is known that UVA irradiation (320 to400 nm) alone can induce endothelial cell damage onlyafter a relatively high surface UVA dose of 42.5 J/cm2

(5.4 J/cm2 in our experiment).11,12 In addition, in cellculture experiments with combined riboflavin/lighttreatment, a significant cytotoxic effect on bovine cor-neal endothelial cells was observed after application of aminimum riboflavin solution of 50 �M and 2 hours ofwhite-light irradiation; riboflavin or white light aloneproduced no damage in the cells.7 Endothelial damagewas also reported in cases with solar keratitis13 with asurface ultraviolet-B (UVB) dose between 0.12 and0.56 J/cm2.14 In rabbit corneas exposed to 310 nm UVBwith 0.47 J/cm2, TUNEL-positive endothelial cells werefound 24 hours later.15 The extensive damage after ex-posure to UVB is explained by the shorter UVB wave-length, with a correspondingly higher energy content.

In the animals killed at 4 hours, no apoptotic endo-thelial cells were observed, whereas maximum cytotoxicdamage was found at 24 hours, as described after UVAirradiation; this so-called delayed type of apoptosis15–18

is in contrast to the immediate type of apoptosis ob-served in keratocytes after epithelial scraping.19,20

In conclusion, this study demonstrated that com-bined riboflavin–UVA treatment should be safe for theendothelium as long as the dose is less than the endo-thelial cytotoxic dose of 0.65 J/cm2. In human corneas,the endothelial cytotoxic UVA dose is only reached incorneas thinner than 400 �m. Therefore, pachymetrymeasurements should be performed routinely before ri-boflavin/UVA treatment to identify unsuitable cases.

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Figure 4. (Wollensak) Apoptotic endothelial cell with apoptoticbodies and chromatin condensation (TEM, original magnification�2800) (endothelial UVA dose of 0.65 J/cm2).



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Zusammenfassung

Hintergrund: Eine mechanische Stabilisie-rung der Hornhaut beim Keratokonus könn-te das Fortschreiten dieser Erkrankung ver-zögern. Die an der Hornhaut von enukleier-ten Schweineaugen optimierten Vernet-zungsmethoden zur Erhöhung der Festigkeitwurden im Langzeitversuch am Kaninchen-modell auf Beständigkeit und biologischeVerträglichkeit getestet.Methode: Von 28 Kaninchen wurde dasrechte Auge behandelt, das linke Auge dien-te jeweils als Kontrolle. Nach der mechani-schen Entfernung des Epithels wurden 19Augen mit Riboflavin-Dextranlösung ge-tropft und anschließend mit UV-Strahlung(365 nm, Bestrahlungsstärke 2 mW/cm2) für45 min exponiert. Auf 9 Augen wirkte ein Ge-misch aus Methocel und 0,075% Glutaralde-hyd für 20 min ein. Die Reaktion der Horn-haut wurde mit der Spaltlampenphotogra-phie dokumentiert. Nach 1 Monat wurden 20Tiere und nach 3 Monaten 8 Tiere getötet,die Augen enukleiert und von Streifen (Brei-te 5 mm, Länge 8 mm) der Hornhäute derSpannungs-Dehnungszusammenhang ge-messen.Ergebnisse: Vier Wochen nach der Vernet-zung konnte eine signifikant höhere Festig-keit in den mit Riboflavin+UV behandeltenHornhäuten nachgewiesen werden. Die ver-netzten und unvernetzten Hornhäute unter-schieden sich bei einer Dehnung von 6% inder Spannung um den Faktor 1,61±0,75(p=0,041). Nach 12 Wochen lag diese Festig-keitszunahme noch bei 1,3±0,48 (p=0,07).Es kam zu keiner sichtbaren Entzündungsre-aktion oder Beeinträchtigung der Transpa-renz. Die mit Glutaraldehyd behandeltenHornhäute wiesen zwar auch eine Zunahmeder Festigkeit auf (Faktor 1,3±0,66), aber der

Die Funktion von kollagenhaltigenStrukturen besteht meist in der Auf-rechterhaltung einer bestimmten Formoder Stabilität, wobei hauptsächlichder Vernetzungsgrad, der unter physio-logischen Bedingungen enzymatischgesteuert wird, die mechanischen Ei-genschaften bestimmt. Verstärkt tretenVernetzungen beim Altersprozess [5, 6]oder auch bei Diabetes [9, 14] auf. Die-se können aber auch gezielt erzeugtwerden, um in vitro kollagene Bioma-terialien [10, 13] und Implantate [2, 7]zu stabilisieren. Dieses Verfahren hatsich z.B. bei Epikeratoplasik [18], Herz-klappen- [8] und Meniskusersatz [19]sowie bei der Gewebevergrößerungmit kollagenen Biomaterialien [16] be-währt. Erste in vivo Vernetzungen sindin der Augenheilkunde bisher nur beider Photovernetzung von fibrinogen-haltigen Klebern im Tiermodell be-kannt [4].

Der Ophthalmologe 3•2000 203

Hornhaut: KurzmitteilungOphthalmologe2000 · 97:203–206 © Springer-Verlag 2000

Eberhard Spörl1 · Jana Schreiber1 · Kerstin Hellmund1 · Theo Seiler1 · Peter Knuschke2

1Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde, Universitätsklinikum TU Dresden2Klinik für Dermatologie, Universitätsklinikum TU Dresden

Untersuchungen zur Verfestigung der Hornhautam Kaninchen* **

*Teile dieser Originalarbeit sind auf der 97.Tagung der Deutschen OphthalmologischenGesellschaft vorgetragen worden**Gefördert durch die Brunenbusch-Stein-Stiftung

Dr. rer. nat. habil. E. SpörlKlinik und Poliklinik für Augenheilkunde,Universitätsklinikum TU, Fetscherstr. 74,01307 Dresden

Effekt war statistisch nicht signifikant(p=0,319), sodass ein Langzeittest dieserMethode nicht gerechtfertigt war.Schlussfolgerungen: Die Kombination vonRiboflavin+UV-Strahlung ist geeignet zurErzeugung von mindestens temporären Ver-netzungen in der Hornhaut bei Kaninchenohne klinische Zeichen für Nebenwirkungenwie Trübung oder Entzündung.

Schlüsselwörter

Vernetzung · Cornea · Keratokonus · Riboflavin · Ultraviolette Strahlung

Beim Keratokonus kommt es infolgeder abnehmenden Festigkeit [1] zu ei-nem Hervorwölben der Hornhaut, waserhebliche funktionelle Konsequenzenhat. Eine künstliche in-vivo Vernetzungder Hornhaut mit gesicherter Verfe-stigung ergäbe eine sinnvolle Präven-tion von Keratektasien. Nachdem in-vitro Untersuchungen an enukleiertenSchweineaugen eine Zunahme der Fe-stigkeit nach Bestrahlung bzw. Behand-lung mit Glutaraldehyd zeigte [17],sollenbeide Vernetzungstechniken am Tiermo-dell überprüft werden mit dem Ziel derEinschätzung der Biokompatibilität undder Dauer des Vernetzungseffektes.

Material und Methoden

Hornhautexposition mit Riboflavin

Insgesamt 28 Kaninchen (weiße Neu-seeländer) wurden entsprechend den“Principles of laboratory animals care”unter Anästhesie (1,5 ml Velonarkon®

und 0,5 ml Rompun®) monokular be-handelt, wobei jeweils das Partneraugeals Kontrolle diente. Nach der mechani-schen Entfernung des Epithels derHornhaut unter dem OP-Mikroskopwirkte bei 19 Kaninchen eine 0,11%ige

Hornhaut: Kurzmitteilung

E. Spörl · J. Schreiber · K. Hellmund · T. Seiler · P. Knuschke

Cross-linking effects in the cornea of rabbits

Summary

Background: The mechanical stabilization ofthe cornea in keratoconus may delay pro-gression of this disease.The cross-linkingtechniques optimized in corneas of enucle-ated porcine eyes were investigated under in vivo conditions in rabbits to estimate thebiocompatibility and duration of the stiffen-ing effect.Methods: Twenty-eight rabbits were treatedmonocularly, the fellow eye serving as con-trol.The epithelium was mechanically re-moved and 19 eyes were treated with ribo-flavin plus ultraviolet irradiation (365 nm,2 mW/cm2) for 45 min and 9 eyes with0.075% glutaraldehyde for 20 min. Aftertreatment, the eyelids were sutured for 3days.The healing process was controlled byslit-lamp examination and photographicallydocumented. After 1 month, 20 animals andafter 3 months 8 animals were sacrificed, theeyes enucleated, and the stress-strain rela-tion of the corneas measured and comparedto the fellow eye.Results: The epithelium was closed after 4-5days.The transparency of the corneas re-mained clear during follow-up, and therewere no signs of inflammatory reaction.Stress for a strain of 6% was higher in thetreated corneas by a factor of 1.3±0.66(P=0.319) in the glutaraldehyde group andby a factor of 1.6±0.75 (P=0.0408) in the ri-boflavin group at 1 month, and by 1.3±0.48(P=0.07) at 3 months after treatment.Conclusions: The cross-linking technique us-ing riboflavin plus UV irradiation is suitablefor at least temporarily stiffening the corneain vivo and seems to be a promising methodfor conservative treatment of keratectasia.

Key words

Cross-links · Cornea · Keratoconus · Riboflavin · Ultraviolet radiation

Riboflavinlösung (10,95 mg Riboflavin-5-phosphat in 10 ml 20%iger Dextranlö-sung) für 5 min auf die Hornhaut ein.Die sich anschließende UV-Bestrahlungerfolgte bei einer Wellenlänge von365 nm, die mittels einer Quecksilber-dampflampe (HQE-40, EMI, Ilmenau)und einem Interferenzfilter für 365 nmmit 25 nm Halbwertsbreite erzeugt wur-de. Deren Applikation mit einem Quarz-lichtleiter ergab eine kreisförmige Flä-che von 7 mm Durchmesser auf derHornhaut (Abb. 1). Die so erzeugte Be-strahlungsstärke von 2 mW/cm2 (ge-messen mit dem UV-LeistungsmesserLASER-MATE,Fa.Coherent,dessen Sen-sorempfindlichkeit für 365 nm mit ei-nem von der Physikalisch-TechnischenBundesanstalt kalibrierten Thermopileüberprüft wurde) wirkte für die Dauervon 45 min auf die Hornhaut ein, wobeialle 5 Minuten ein Tropfen Riboflavinlö-sung auf die Hornhaut getropft wurde,um ein Austrocknen zu vermeiden. An-schließend wurde ein Antibiotikum(Ofloxacin, Floxal® Augensalbe, Dr.Mann Pharma) zur antibiotischen Ab-schirmung aufgetragen und das Lid miteiner U-Naht für 3 Tage vernäht.

In Vorversuchen an Schweineaugenwurde der Einfluss der Riboflavinkon-zentration und der Bestrahlungszeit aufdie Festigkeitszunahme getestet, wobeidas Ergebnis unabhängig war von derRiboflavinkonzentration im Bereich von0,015% bis 0,15%, während Bestrah-lungszeiten größer als 30 min einen si-gnifikanten Effekt bewirkten. Um mög-lichst viel Bestrahlungsenergie in derHornhaut zu absorbieren (etwa 90%)

und damit die tiefer liegenden Gewebezu schützen sowie eine gleichmäßigeVernetzung der Hornhaut zu erreichen,wurde die Konzentration von 0,11% ge-wählt (Abb. 2).

Hornhautexposition mit Glutaraldehyd

Bei der zweiten Technik (Abb.3) kam einGemisch aus Methocel und 0,075%Glutaraldehyd bei 9 Kaninchen zur An-wendung, das für die Dauer von 20 minauf die Hornhaut einwirkte. Das Metho-cel diente dabei nur zur Erhöhung derViskosität des Gemisches. Um nur denzentralen Teil der Hornhaut zu vernet-zen und ein Auslaufen des Gemischesauf den Limbus zu verhindern, diente

Der Ophthalmologe 3•2000204

Ophthalmologe2000 · 97:203–206 © Springer-Verlag 2000

Abb. 1 m Behandlung mit Riboflavin und UV-Bestrahlung, wobei die UV-Strahlung über eine flexible Quarzfaser lokal begrenzt appliziert wird

Abb. 2 m Transmission der Hornhaut für 365 nm in Abhängigkeit von der Riboflavin-konzentration

ein aufgelegter Silikonring (Ø 7 mm ) alsBegrenzung. In Vorversuchen konnte dieDichtheit dieses Ringes mit einem Me-thocel-Fluoreszeingemisch nachgewie-sen werden.

Nach der Applikation wurde dasGlutaraldehyd entfernt, die Hornhautmit physiologischer Kochsalzlösung ge-spült und die Nachbehandlung wie inder UV-Gruppe durchgeführt.

Eine Untersuchung der Hornhauterfolgte mit der Handspaltlampe am 3.,5. und 6. Tag sowie an der Spaltlampemit photographischer Dokumentationam 4. Tag, nach 1 und 3 Monaten.

Nach 1 bzw. 3 Monaten wurden dieKaninchen getötet, die Augen enukleiertund aus den Hornhäuten vertikale Strei-fen 5x8 mm geschnitten. Die Dicke derHornhautstreifen wurde mit einem Ultra-schallpachymeter gemessen. Nach einer5minütigen Vordehnung der Streifen miteiner Spannung von 104 N/m2,was einemintraokularen Druck von etwa 9 mm Hgentspricht, wurden die Spannungs-Deh-nungsexperimente mit einem kommerzi-ellen Materialtester (MINIMAT, PolymerLaboratories) mit einer Dehnungsge-schwindigkeit von 1,5 mm/min und bis zueiner Spannung von 5·105 N/m2 (50-fachesdes physiologischen intraokularenDruckes) durchgeführt.

Um die mechanischen Eigenschaf-ten der behandelten und unbehandeltenHornhaut zu vergleichen, wurden dieSpannungen, die für eine Dehnung vone=6% notwendig waren, ausgewertet.Das Verhältnis von s (behandelt)/s(un-behandelt) diente als Maß für die Verfe-stigungszunahme.

Die statistische Analyse basiert aufdem WILCOXON-Rangtest, wobei p-Werte kleiner als 0,05 als statistisch si-gnifikant galten.

Ergebnisse

Epithelschluß und Hornhauttransparenz

In der Gruppe der UV-bestrahlten Ka-ninchen war das Epithel nach dem 4.Taggeschlossen. Bei den mit Glutaraldehydbehandelten Hornhäuten konnte einEpithelschluss erst nach dem 5. Tag be-obachtet werden, wobei sich eine gerin-ge subepitheliale Trübung zeigte, diesich aber wieder auflöste. Die Transpa-renz der Hornhaut war durch beide Be-handlungsverfahren nach 4 Wochen

nicht verändert. Die Daten wurden pho-tographisch dokumentiert.

Biomechanische Charakterisierung

Bei den Hornhäuten, die mit Glutaralde-hyd vernetzt wurden, konnte zwar nach4 Wochen eine Zunahme der Festigkeitum den Faktor 1,3±0,66 nachgewiesenwerden. Dieser Effekt war statistischnicht signifikant (p=0,319). Aus diesemGrund wurden die Versuche mit 12 Wo-chen Nachbeobachtungszeit nichtdurchgeführt.Nach Riboflavin+UV kames initial zu einer signifikanten Verfesti-gung, was die s(behandelt)/s(unbehan-delt)-Werte (Tabelle 1) zeigen. Nach 1Monat war das Verhältnis 1,61±0,75(p=0,041) und nach 3 Monaten 1,3±0,48(p=0,07).

Diskussion

Der Keratokonus und andere Formender Keratektasie sind progressive Er-krankungen, die wahrscheinlich auf ei-ner Abnahme der Festigkeit der Horn-haut basieren [1]. Die morphologischenund biochemischen Ursachen sind nichtbekannt, obwohl Veränderungen derProteoglycane gefunden wurden [3, 20].Auch eine erhöhte Menge an proteolyti-schen Enzymen und weniger Protease-hemmer wurden in Keratokonushorn-häuten nachgewiesen [21]. Dabei istnoch nicht klar, ob dies die primäre Ur-sache des Keratokonus ist oder eine se-kundäre Reaktion.Andere morphologi-sche Veränderungen wie Einrisse derBowman’schen Membran und eine Ver-dünnung des Stromas werden als sekun-däre Effekte während des Prozesses derEktasie erklärt.

Um eine Erhöhung der Festigkeit zuerreichen, wurden die in den in vitro-Untersuchungen aussichtsreichsten Me-thoden Riboflavin+UV Strahlung bzw.

Glutaraldehyd angewendet. Das Haupt-ergebnis dieser Untersuchungen ist einetemporäre Festigkeitszunahme von et-wa 50% nach Riboflavin+UV Behand-lung ohne sichtbare Komplikationen wieTrübung, Entzündung oder Katarakt.

Bereits nach dem Herausschneidender Hornhautstreifen konnte man schonmakroskopisch einen Unterschied zwi-schen der behandelten und unbehandel-ten Hornhaut feststellen, wie Abb. 4a-czeigt. Während die unbehandeltenHornhautstreifen gerade herunterhin-gen mit zahlreichen Falten, behielten diebehandelten Streifen eine Restkrüm-mung, was nur mit einer Zunahme derScherspannung zu erklären ist. Somitändert sich mit der Vernetzung auch dasBiegeverhalten. Die einzelnen Kollagen-lamellen sind durch die Vernetzung stär-ker miteinander verbunden, damit kannein Auseinandergleiten der Lamellen,was auch bei der Entstehung einer Ke-ratektasie diskutiert wird [12], verhin-dert werden.

Glutaraldehyd brachte bei den kur-zen Behandlungszeiten keinen signifi-kanten Effekt, da es nur eine oberfläch-liche Hornhautschicht von etwa 200 µm

Der Ophthalmologe 3•2000 205

Tabelle 1Festigkeitszunahme bei der Behandlung mit Riboflavin+UV-Bestrahlung und bei Glutaraldehyd

Behandlungsverfahren Zahl Nachbeobachtung Festigkeitszunahme p-Wert (Monate) (bei 6% Dehnung) (WILCOXON)

Glutaraldehyd 0,075%/20 min 9 1 1,3±0,66 0,313Riboflavin+UV 45 min 11 1 1,61±0,75 0,041Riboflavin+UV 45 min 8 3 1,3±0,48 0,07

Abb. 3 m Applikation einer 0,075%igenGlutaraldehydlösung, wobei ein Silikonringeine Vernetzung der Hornhautperipherie verhindert

Hornhaut: Kurzmitteilung

vernetzt. Dies konnte an Schweinehorn-häuten in-vitro fluoreszenzmikrosko-pisch nachgewiesen werden.Aus diesemGrund erwies sich Glutaraldehyd für diein-vivo Vernetzung von Keratokonus-hornhäuten als nicht geeignet [17]. Im-plantate könnten aufgrund der erhöhtenEinwirkungzeit möglicherweise erfolg-versprechend mit Glutaraldehyd vorbe-handelt werden [7, 8, 16, 19].Andererseitsist zu erwarten,daß mit längerer Einwir-kungszeit die Nebenwirkungen auf dasHornhautendothel größer werden.

Um eventuelle Veränderungen desHornhautendothels, der Linse oder derRetina durch die UV-Strahlung ein-schätzen zu können,wurde die Strahlen-belastung aus Transmissionsmessungenabgeschätzt.

Abbildung 2 zeigt die Transmissionder Schweinehornhaut bei unterschiedli-chen Riboflavinkonzentrationen.Aus derHornhautdicke, der verwendeten Ribo-flavinkonzentration von 0,11% und derBestrahlungsstärke von 2 mW/cm2 ergibtsich eine Strahlenbelastung des Endo-thels von 100 µW/cm2.Aus der Transmis-sionsmessung der unbehandelten Horn-haut und der maximal (für UV-exponier-te Arbeitsplätze) zulässigen Bestrah-lungsstärke von 1 mW/cm2 [15] könnenam Endothel etwa 500 µW/cm2 wirksamwerden.

Damit beträgt die Strahlenbelastungdes Endothels bei der UV-Vernetzungnur etwa 20% der zulässigen Grenze, so-daß auch keine Gefahr für Linse oder Re-tina besteht.Vergleicht man die applizier-te Bestrahlungsdosis von 5,4 J/cm2 mitdem Grenzwert der Bestrahlungsdosisvon 42,5 J/cm2 für die Hornhaut bei365 nm [11], so dürften keine Schädigun-gen zu erwarten sein. Der biomikrosko-pische Nachweis der Unschädlichkeit für

Endothelzellen muss aber noch erbrachtwerden.

Aufgrund der vorliegenden Ergeb-nisse scheint die Vernetzung mit Ribofla-vin und UV-Strahlung eine geeignete Me-thode zur sicheren Verfestigung derHornhaut zu sein. Infolge von Um- undAbbauprozessen der Kollagene und Pro-teoglykane besteht mit der Zeit die Mög-lichkeit der Abnahme der Festigkeit. Essind weitere Untersuchungen notwendig,um zu entscheiden, ob eine Wiederho-lung der Riboflavin und UV-Expositionerforderlich ist.

Fazit für die Praxis

Experimentelle Untersuchungen an Kaninchenaugen haben gezeigt, daß mittels Exposition der Hornhaut mit Ribo-flavin in Kombination mit UV-Bestrahlungeine mechanische Stabilisierung der Horn-haut bewirkt werden kann.Weitere Unter-suchungen müssen noch zeigen, ob dieseMethoden zur Stabilisierung der Hornhautbei Keratokonus oder zur Vorbehandlungvon Spenderhornhäuten geeignet sind.

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Nachtrag bei der Korrektur. Die Technik derUV-Vernetzung wurde erheblich vereinfachtdurch den Ersatz der Quecksilberdampf-lampe, des Interferenzfilters und der Quarz-faser durch zwei UV-Leuchtdioden (370 nm,750 mW), (Roithner Lasertechnik, Wien).

Der Ophthalmologe 3•2000206

Abb. 4a–c m Demonstration des Biegeverhaltens der Hornhaut.(a) mit Glutaraldehyd behandelt, (b) mit Riboflavin und UV-Strahlung behandelt und (c) unbehandelt

a b c

Eberhard Spörl1 · Michael Huhle1 · Michael Kasper2 · Theo Seiler1

1 Augenklinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Carl-Gustav-Carus, Technische Universität Dresden2 Institut für Anatomie, Universitätsklinikum Carl-Gustav-Carus, Technische Universität Dresden

Erhöhung der Festigkeit derHornhaut durch Vernetzung* **

Zusammenfassung

Hintergrund: Die biomechanische Festigkeitder Hornhaut soll durch künstliche Querver-netzung der Kollagenfibrillen (Strahlenver-netzung, chemische Vernetzung) erhöhtwerden, um eine evtl. konservative Therapiedes Keratokonus zu prüfen.Methode: Von enukleierten Schweineaugenwurde das Epithel entfernt. Je 10 Augen in8 Testgruppen wurden mit UV-Strahlung(l = 254 nm), einer 0,5 %igen Riboflavinlö-sung und UV-Strahlung (365 nm), blauemLicht (436 nm) und Sonnenlicht sowie mitchemischen Vernetzern ± Glutaraldehyd(1 % und 0,1 %, 10 min) und Karnovsky-Lösung (0,1 %, 10 min) ± behandelt. AlsStandard dienten jeweils Kontrollgruppenmit 10 unbehandelten Hornhäuten. Aus je-der Hornhaut wurde ein zentraler Streifenvon 5 mm Breite und 9 mm Länge geschnit-ten und die Spannungs-Dehnungs-Kurvengemessen.Ergebnisse: Bei UV-Bestrahlung von mit Ri-boflavin vorbehandelten Hornhäuten nimmtdie Dehnbarkeit signifikant ab (p < 0,05).Auch die mit Glutaraldehyd oder Karnovsky-Lösung behandelten Hornhäute zeigen einesignifikante Zunahme der Festigkeit(p < 0,05).Schluûfolgerung: UV-Strahlen und Ribofla-vin sowie niedrigkonzentriertes Glutaralde-hyd oder Karnovsky-Lösung führen zu einerVerfestigung der Hornhaut wahrscheinlichaufgrund von Vernetzungen der Kollageneoder der Proteoglykane. Weitere Untersu-chungen sind jedoch bezüglich der Optimie-rung der Dosis-Wirkungs-Beziehung und derIn-vivo-Bedingungen erforderlich.

Schlüsselwörter

Hornhaut · Kollagen · Keratokonus · Proteo-glykane · Vernetzung

Um die Form der Hornhaut zu verän-dern, z. B. beim Astigmatismus, bei derMyopie und bei der Hyperopie, stehendem Augenarzt zahlreiche Therapiever-fahren zur Verfügung. ¾ndern sichaber die Hornhautform und -dicke, wiez. B. beim Keratokonus, so bleibt als ein-zige kurative Therapie die Keratopla-stik. Das Krankheitsbild des Keratoko-nus ist klar umschrieben. BiochemischeUntersuchungen zur Ursache des Kera-tokonus legen Veränderungen der Pro-teoglykane nahe [22, 23]. Biomechani-sche Untersuchungen weisen eine gerin-gere Festigkeit der Hornhaut mit Kera-tokonus nach [2, 14].

Die molekulare Erklärung diesesFestigkeitsverlusts ist noch unbefriedi-gend: So werden eine Verringerung derVernetzungen innerhalb der Kollagen-matrix, eine Reduzierung der Kontakt-stellen zwischen benachbarten Proteo-glykanen der Grundsubstanz oder aucheine erhöhte Aktivität proteolytischerEnzyme diskutiert [23]. Neue elektro-nenmikroskopische und Röntgenstrahl-streumessungen konnten im vorderenStoma beim Keratokonus das Fehlenvon solchen Lamellen nachweisen, diebenachbarte Fibrillenlagen durchkreu-zen und miteinander verbinden [4, 16].

Gelänge es, eine biologisch verträg-liche Methode zu entwickeln, die Horn-hautfestigkeit zu stabilisieren bzw. zuerhöhen, so könnte dies ein Ansatz füreine konservative Therapie des Kerato-konus darstellen.

Aus Polymerchemie und Bioche-mie ist bekannt, daû mit energiereicherStrahlung (Infrarot-, Ultraviolett- undRöntgenstrahlung) oder mit bestimm-ten chemischen Verbindungen Poly-mere vernetzt werden können. Milne u.Zika [12] fanden eine Erhöhung der Vis-kosität einer Kollagenlösung nach UV-Bestrahlung. Die Vernetzung von Bin-degewebe nimmt mit dem Alter zu und

tritt verstärkt beim Diabetes auf. DieVernetzung wird auch gezielt zur Erhö-hung der Stabilität von kollagenen Bio-materialien für Bioprothesen, wie z. B.Herzklappen, Blutgefäûe und Duraer-satz, genutzt. In der Augenheilkundewurde über die erste Anwendung derkünstlichen Vernetzung bei der Herstel-lung von kollagenen Biomaterialien fürdie synthetische Epikeratoplastik be-richtet.

In unseren Untersuchungen prüf-ten wir die Wirkung von chemischenVernetzern und von UV-Strahlung un-terschiedlicher Wellenlänge bezüglichder Veränderung der biomechanischenEigenschaften der Hornhaut.

Material und Methode

Als Untersuchungsobjekte dientenSchweineaugen, die 15±30 min postmor-tal im Schlachthof enukleiert und in derKühlbox bei + 10 �C transportiert undgelagert wurden. Die Messungen an derHornhaut erfolgten innerhalb von 8 hpostmortal, um evtl. autolytische Ver-änderungen so gering wie möglich zuhalten. Die intakten Bulbi wurden in ei-ner 20 %igen Dextranlösung (DextranT 500, Pharmacia Biotech, Freiburg) ge-lagert, um die Hornhaut auf eine Dickevon 0,8 mm zu dehydrieren. Die Dickeder Hornhaut wurde ultraschallpachy-metrisch bestimmt (Pachette, Techno-med, Baesweiler).

902 Der Ophthalmologe 12´97

Ophthalmologe1997 ´ 94:902±906 � Springer-Verlag 1997 Hornhaut

* Vortrag gehalten auf der 94. Tagung derDeutschen Ophthalmologischen Gesellschaft** Unterstützt von der Brunenbusch-Stein-Stiftung, Stuttgart

Prof. Dr. Dr. T. SeilerAugenklinik und Poliklinik, UniversitätsklinikumCarl-Gustav-Carus, Technische UniversitätDresden, Fetscherstraûe 74, D-01307 Dresden

Zwei Vernetzungsmethoden kamenzur Anwendung:

· Vernetzung mit UV-Strahlung· Vernetzung mit chemischen Vernet-

zern.

Dabei wurden immer gleichzeitig2 Gruppen zu je 10 intakten Augen un-tersucht. Bei der einen Gruppe (Test-gruppe) wurde die Vernetzungswirkunggetestet. Die andere Gruppe diente alsKontrollgruppe.

Vernetzung mit UV-Strahlung

· UV-Strahlung von 254 nm: Nach derEntfernung des Epithels schloû sicheine UV-Bestrahlung der Augen in ei-ner feuchten Kammer durch eineQuarzscheibe mit einer Wellenlängevon 254 nm für 20 min an. Die Entfer-nung des Epithels ist wichtig, da es dieUV-Strahlung unterhalb von 290 nmfast vollständig absorbiert. EineQuecksilberlampe (HNU 6, EMI, Il-menau) diente als Lichtquelle mit ei-ner Intensität von 90 W/m2 durch dieQuarzscheibe.

· Riboflavin und UV-Strahlung(365 nm), blaues Licht (436 nm) undSonnenlicht: Eine Lösung von Ribo-flavin (0,5 %, B2-Inject, Jenapharm,Jena) und 20 % Dextran wirkten für60 min auf die Hornhaut der intaktenAugen der Test- und der Kontroll-gruppe ein. Anschlieûend wurde jeeine Testgruppe mit Licht der Wellen-länge 365 nm (45 min, ohne Epithel),436 nm (45 min, ohne Epithel) undeine Testgruppe mit Sonnenlicht für2 h in der gleichen Anordnung wiebei 254 nm bestrahlt. Eine Xenon-lampe (XBO 50, EMI, Ilmenau) und

Interferenzfilter von 365 und 436 nmlieferten eine Intensität von 20 W/m2

durch die Quarzscheibe. Die Sonnen-lichtbestrahlung wurde an einem son-nigen Tag (abgeschätzte Intensität85 W/m2) durchgeführt. Die mit Ri-boflavin behandelten Kontrollgrup-pen wurden dem gleichen Zeitablaufunterworfen, blieben jedoch jeweilsim Dunklen.

Um zu prüfen, ob Riboflavin allein ei-nen Effekt bewirkt, wurde eine Test-gruppe mit Riboflavin behandelt abernicht bestrahlt. Die dazugehörige Kon-trollgruppe lagerte nur in 20 % Dextran.

Vernetzung mit chemischenVernetzern

Das Einwirken der Substanzen, die inTabelle 1 angegeben sind, konnte mitHilfe einer Augenhalterung realisiertwerden, die es ermöglichte, daû nur dieHornhaut in die Flüssigkeit eintauchte.

Nach der UV- bzw. chemischen Be-handlung lagerten alle Augen (die Test-gruppe und die Kontrollgruppe) für45 min wieder in einer feuchten Kam-mer in einem dunklen Raum.

Aus jeder Hornhaut wurde ein zen-traler Streifen von 5 mm Breite und9 mm Länge herausgeschnitten und dieDicke mit einem Ultraschallpachymeter(Pachette, Technomed, Baesweiler) an3 Stellen bestimmt. In einem Span-nungs-Dehnungs-Meûgerät (MINI-MAT, Rheometric Scientific GmbH,Bensheim) wurden die Hornhautstrei-fen mit einer Spannung von 5 � 103 N/m2 für 5 min vorgedehnt, anschlieûenderfolgte die Spannungs-Dehnungs-Mes-sung im Spannungsbereich von5 � 103±2 � 105 N/m2 bei einer Deforma-

Der Ophthalmologe 12´97 903

E. Spörl · M. Huhle · M. Kasper · Th. Seiler

Artificial stiffening of the cornea byinduction of intrastromal cross-links

Summary

Purpose: To increase the stability of the cor-nea by artificial cross-linking (radiation orchemical agents) and to investigate a futuretherapy for keratoconus.Materials and methods: The epithelium ofenucleated porcine eyes was removed. Teneyes in each of eight test groups were treatedwith UV light (l = 254 nm), 0.5 % riboflavinand UV light (365 nm), blue light (436 nm)and sunlight, and the chemical agents glu-taraldehyde (1 % and 0.1 %, 10 min) andKarnovsky's solution (0.1 %, 10 min). Stripsof 5 mm in width and 9 mm in length werecut from each cornea and the stress-strainbehaviour of the strips was measured. Forcomparison, eight groups of ten untreatedcorneas each were measured by the samemethod.Results: Compared to untreated corneas ri-boflavin and UV irradiation as well as gluta-raldehyde and Karnovsky's solution treat-ment resulted in significantly increased stiff-ness of the cornea (p < 0.05).Conclusions: The biomechanical behaviourof the cornea can be altered by low-concen-tration glutaraldehyde, Karnovsky's solution,and by riboflavin and UV irradiation, whichoffers potential conservative treatment ofkeratoconus. To optimize this effect furtherinvestigation is necessary regarding thedose-effect relation and the in-vivo condi-tions.

Key words

Collagen · Cornea · Cross-linking · Keratoco-nus · Proteoglycans

Ophthalmologe1997 ´ 94:902±906 � Springer-Verlag 1997

Tabelle 1Behandlung der Hornhäute zur Erzeugung von Vernetzungen

Gruppe n UV-Bestrahlung Chemische Behandlung

1 10 254 nm, 20 min Keine2 10 365 nm, 45 min Riboflavin 0,5 %, 45 min3 10 436 nm, 45 min Riboflavin 0,5 %, 45 min4 10 Sonnenlicht, 120 min Riboflavin 0,5 %, 45 min5 10 Keine Riboflavin 0,5 %, 45 min6 10 Keine Glutaraldehyd 1 %, 10 min7 10 Keine Glutaraldehyd 0,1 %, 10 min8 10 Keine Karnovsky-Lösung 0,1 %, 10 min9 80 Keine Keine

tionsgeschwindigkeit von 1,5 mm/min[19].

Die Mittelwerte der Spannung derTestgruppe wurden mit denen der dazu-gehörigen Kontrollgruppe bei Dehnun-gen von 4, 6 und 8 % verglichen. ZurPrüfung der statistischen Signifikanzdiente der Mann-Whitney-Test ausdem Statistikprogramm SPSS 4.01 fürDOS 1993 (SPSS GmbH Software, Mün-chen). Unterschiede zwischen der Be-handlungsgruppe und der Kontroll-gruppe wurden ab p < 0,05 als stati-stisch signifikant betrachtet.

Anhand der Fluoreszenz der che-misch erzeugten Vernetzungen konntedie Eindringtiefe von Glutaraldehyd indas Hornhautgewebe qualitativ be-stimmt werden [13]. Drei Hornhäuteder Behandlungsgruppen 6±8 und derKontrollgruppe wurden in flüssigemStickstoff gefroren. Gefrierschnitte von5±8 mm Dicke vom Hornhautzentrumwurden mit einem Fluoreszenzmikro-skop (PH-2, Olympus, Hamburg) beieinem Anregungsspektrum von450±490 nm und bei einem Fluores-zenzspektrum von 515±565 nm unter-sucht.

Ergebnisse

In Abb. 1 sind die Spannungs-Deh-nungs-Kurven der Testgruppen, bei de-nen die Strahlungsvernetzung ange-wendet wurde, dargestellt. Zum Ver-gleich ist die Mittelwertkurve aller Kon-trollgruppen ebenfalls eingezeichnet.

Die Veränderung durch UV-Bestrah-lung mit 254 nm bei einer Bestrahlungs-zeit von 20 min ist nicht signifikant. Einsignifikanter Unterschied trat in allenFällen der UV-Bestrahlung nach einerVorbehandlung mit Riboflavin auf (Ta-belle 2). In Abb. 2 sind die Spannungs-Dehnungs-Kurven für die chemischenVernetzer, die einen signifikanten Un-terschied hervorriefen, dargestellt.Abb. 3 zeigt die fluoreszenzmikroskopi-schen Aufnahmen einer unbehandeltenund einer mit 0,1 % Glutaraldehyd be-handelten Hornhaut. Die Transparenzder Hornhaut blieb in allen Testgruppenerhalten.

Diskussion

Die Stabilität des Bindegewebes, natür-lich auch der Hornhaut, wird normaler-weise durch die enzymatische Vernet-zung der Kollagenfibrillen gewährlei-stet. Des weiteren kommen auch nicht-enzymatische Vernetzungen vor,insbesondere die nichtenzymatischeGlykosilierung. Darunter versteht mandie chemische Reaktion zwischen Glu-kose bzw. deren Metaboliten und pri-mären Aminogruppen von Proteinen[5, 17, 19, 24, 25].

Die nichtenzymatische Vernetzungdes Kollagens nimmt mit dem Alterschwach zu [1, 3, 10]. Besonders starknimmt sie bei Diabetikern zu, und aucheine Erhöhung der Festigkeit des Kolla-gens konnte nachgewiesen werden [8,13, 17]. Dabei kommt es zu Veränderun-gen der physikochemischen Eigen-schaften wie Löslichkeit, thermische Ei-genschaften, mechanische Festigkeit,Viskosität, Versteifung, Verdickungund Resistenz gegenüber Kollagenasen[9, 11, 17, 19]. Kent et al. [8] fanden eineErhöhung der mechanischen Festigkeitund eine Verringerung der Löslichkeitam Bindegewebe von Rattenschwänzennach Inkubation in Glukose [2].

Die Vernetzung mit UV-Strahlungvon 254 nm wurde zwar an einer zirku-lierenden Kollagenlösung nachgewie-sen [12], aber aufgrund der geringenEindringtiefe von nur einigen Mikro-metern in der Hornhaut ist die Wirkunggering. Gröûere Wellenlängen werden


Hornhaut

Abb. 1~ Einfluû von UV-Strahlung und Riboflavin auf das Spannungs-Dehnungs-Verhalten der Hornhaut(Gruppe 1±4 und 9). Die Behandlung mit UV-Licht (254 nm) allein führte nicht und mit Riboflavin/436 nmnur zu einer schwach signifikanten Verfestigung der behandelten Hornhäute. Riboflavin/Sonnenlichtund Riboflavin/365 nm dagegen zeigten einen hochsignifikanten Effekt

Abb. 2~ Einfluû von Glutaraldehyd und Karnovsky-Lösung auf das Spannungs-Dehnungs-Verhaltender Hornhaut (Gruppe 6±9). Trotz der hohen Standardabweichung ist die Zunahme der Festigkeit für alle

Behandlungen statistisch signifikant, trotz der kleinen Gruppengröûe (n = 10)

nur über einen Photosensibilisatorwirksam, wobei es sehr wichtig ist, daûdie Wellenlänge von diesem absorbiertwird, aber auch genügend tief in dieHornhaut eindringt. Riboflavin ist solchein nicht-toxischer, wasserlöslicherPhotosensibilisator, der auch leicht indas Stroma eindringt. So riefen Wellen-längen von 365 und 436 nm statistischsignifikante Unterschiede hervor. Sogarbei der Testgruppe von Riboflavin und2 h Sonnenbestrahlung trat ein stati-stisch signifikanter Unterschied auf.Riboflavin ohne Lichtbestrahlung(Gruppe 5) verursachte keine biome-chanischen Veränderungen im Ver-gleich zur Kontrollgruppe, die nur in20 % Dextran lagerte.

Die Bestrahlungsdauer spielt einenentscheidenden Faktor bei der Vernet-zung. Die Vernetzungsreaktion beginntnicht unmittelbar mit dem Bestrah-lungsbeginn, sondern benötigt eineStartphase. Einige Untersucher berich-ten, daû bei der Photoreaktion mit Ri-boflavin Sauerstoffradikale entstehen,deren Vernetzungswirkung am Glaskör-perkollagen in vitro nachgewiesen wer-den konnte [7].

Bei den chemischen Vernetzernzeigte Glutaraldehyd die gröûte Wir-kung, auch nach einer Verringerungder Konzentration von ursprünglich1 % für 10 min auf 0,1 % für 10 min. Umdas Penetrationsvermögen von Gluta-raldehyd zu verbessern, wurde zusätz-

lich ein Gemisch von Glutaraldehydund Formaldehyd + Phosphatpuffer(Karnovsky-Lösung) verwendet.

Ungeklärt bleibt dabei, ob sich dieVernetzungen intra- oder interfibrillärbilden. Interfibrilläre Verbindungenkann man sich zwar bei Sehnen vorstel-len, in denen die Kollagenfibrillen mit-einander verwoben sind. Im Hornhaut-stroma jedoch liegen die Kollagenfibril-len parallel mit einem relativ konstantenAbstand von 20±40 nm, der mit Proteo-glykanen ausgefüllt ist, und es ist nichtklar, wie bei den verschiedenen Vernet-zungstechniken interfibrilläre Verbin-dungen zwischen den Kollagenmolekü-len entstehen können. Aber auch die Co-

reproteine der Proteoglykane können inder Vernetzungskette beteiligt sein.Nach unseren Kenntnissen liegen in derLiteratur keine Hinweise über Protein-vernetzungen im lebenden Gewebe au-ûer zwischen Kollagenmolekülen vor.Quellungsexperimente an vernetztenHornhäuten können weitere Erkennt-nisse über diesen Prozeû liefern [6].

In geringen Konzentrationen wirdGlutaraldehyd bereits zur Stabilisierungvon Implantaten, z. B. Herzklappen [15],des Meniskus [21] und bei der Stimm-bandbehandlung [18], eingesetzt. VonKollagen, welches mit geringen Konzen-trationen von Glutaraldehyd vernetztwurde, ist bekannt, daû es widerstands-fähiger gegenüber Kollagenasen ist.Das so vernetzte Kollagen soll gut tole-riert werden, da es keine Entzündungs-und keine Fremdkörperreaktion verur-sacht. Eine kurze Glutaraldehydfixie-rung erhält zahlreiche Enzymaktivitä-ten und weitgehend auch die immuno-logische Charakteristik der Proteine[18]. Daneben macht sie das Kollagen-molekül weniger angreifbar für Kolla-genasen. Diesen Effekt nutzten wir kli-nisch in einigen Fällen von einschmel-zenden Hornhautulzera, bei denen diekonventionelle Therapie versagt hatte.So konnten wir den Einschmelzungs-prozeû in allen Fällen durch die Appli-kation von Karnovsky-Lösung (0,1 %,10 min) stoppen.

Perspektiven

Diese In-vitro-Experimente sollen nurals erster Schritt in Richtung auf einekonservative Behandlung der Keratek-

Der Ophthalmologe 12´97 905

Abb. 3~ Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einer unbehandelten (links) und einer mitKarnovsky-Lösung 10 min behandelten (rechts) Hornhaut, um die Tiefenverteilung der Vernetzungenqualitativ zu zeigen (1 cm = 60 mm). Offensichtlich wird bei der Behandlung nur die vordere Hälftedes Stromas erreicht

Tabelle 2Signifikanzwerte zur Charakterisierung der Zunahme der Festigkeitder behandelten Hornhäute im Vergleich zur entsprechenden unbe-handelten Kontrollgruppe

Gruppe Behandlung p -Wert bei

e = 4 % 6 % 8 %

1 UV (254 nm, 20 min) 0,390 0,796 0,5792 Riboflavin, 365 nm, 45 min 0,0001 0,0001 0,00033 Riboflavin, 436 nm, 45 min 0,0288 0,0433 0,07534 Riboflavin, Sonne, 120 min 0,0001 0,0005 ±5 Riboflavin 0,3932 0,8534 0,79596 Glutaraldehyd 1 % 0,0016 0,0016 0,01647 Glutaraldehyd 0,1 % 0,0302 0,0412 0,04618 Karnovsky-Lösung 0,1 % 0,0185 0,0185 0,0147

tasie verstanden werden. Es ist noch un-klar, wie lang die Vernetzungen und diedadurch erhöhte Festigkeit in lebendenGeweben bestehen bleiben. Erste Beob-achtungen an lebenden Kaninchenau-gen, die zentral auf der Hornhaut mit0,1 % Karnovsky-Lösung behandeltwurden, zeigten nur eine leichte subepi-theliale Trübung, die nach 3 Wochenverschwand. Durch die Vernetzungender Kollagenfibrillen wird die mechani-sche Stabilität erhöht, jedoch nicht dieAnordnung der Fibrillen und damit dieTransparenz verändert.

Die Kombination von Riboflavinund Lichtenergie sowie Karnovsky-Lö-sung sind die beiden aussichtsreichstenMethoden für die Erhöhung der Festig-keit der Hornhaut. Eine biologische Te-stung muû in weiteren Tierexperimen-ten erfolgen.


In biomechanischen Untersuchungen weisenAugen mit einem Keratokonus eine gerin-gere Festigkeit der Kornea auf, die molekula-ren Grundlagen dieses Phänomens sind nochnicht zufriedenstellend bekannt. Ursächlichdiskutiert werden eine Verringerung der Ver-netzung innerhalb der Kollagenmatrix, eineReduktion der Kontaktstellen zwischen be-nachbarten Proteoglykanen der Grundsub-stanz oder auch eine erhöhte Aktivität pro-teolytischer Enzyme.

Neue elektronenmikroskopische undRöntgenstrahlenstreumessungen zeigten imvorderen Hornhautstroma von Keratokonus-patienten das Fehlen von Lamellen, die be-nachbarte Fibrillenlagen durchkreuzen undmiteinander verbinden.

Durch UV-Strahlung und Riboflavin so-wie niedrigdosiertes Glutaraldehyd oder Kar-novsky-Lösung wird eine Verfestigung derKornea erreicht, wahrscheinlich aufgrundvon Vernetzung der Kollagene oder der Pro-teoglykane. Eine Erhöhung der biomechani-schen Festigkeit der Hornhaut könnte einekonservative Therapie des Keratokonus er-möglichen, weitere Untersuchungen sind je-doch noch erforderlich.

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Hornhaut

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Originalien

| Der Ophthalmologe 1•200344

Zusammenfassung

Hintergrund. Ziel dieser Studie war derNachweis, ob sich die Hornhaut bei Kerato-konuspatienten mittels photochemischer Ri-boflavin/UVA-Kollagenvernetzung verfesti-gen lässt, um so die progressive Hornhautek-tasie zu stoppen.Patienten und Methode. Wir behandelten16 Augen von 15 Patienten mit gesicherterProgression und überwiegend moderatemKeratokonus. Nach Epithelabrasio wurde Ri-boflavinlösung auf die Hornhaut appliziertund mit UVA aus 1 cm Abstand für 30 minbestrahlt. Nachkontrollen, die Visus, Horn-hauttopographie und Messung der Endo-thelzelldichte einschlossen, erfolgten im1. Jahr alle 3 Monate, danach alle 6 Monate,wobei der Nachbeobachtungszeitraum zwi-schen 1 und 3 Jahren lag.Ergebnisse. Eine Progression der Keratekta-sie konnte bei allen Patienten gestoppt wer-den. Bestkorrigierter Visus und der maximaleKeratometerwert besserten sich gering in ca.50% der Fälle. Bei allen Patienten blieben dieHornhauttransparenz und die Endothelzell-dichte stabil.Schlussfolgerungen. Unsere Ergebnisse zei-gen, dass möglicherweise die Quervernet-zung des Kollagens eine geeignete konser-vative Behandlungsmöglichkeit ist, um dasFortschreiten des Keratokonus aufzuhalten.Weitere Studien sind geplant, um Spätkom-plikationen auszuschließen und den Lang-zeiteffekt dieser Methode zu sichern.

Schlüsselwörter

Keratokonus · Hornhaut · Vernetzung · Riboflavin · UV

Der Keratokonus ist eine zumeist bila-teral auftretende Hornhautdegenerationmit kegelförmiger Hervorwölbung derverdünnten Kornea. Der Begriff „Kera-tokonus“ wurde durch von Ammon ausDresden bereits Anfang des 19. Jahr-hunderts geprägt. Die Inzidenz beträgt1/2000 in der Gesamtbevölkerung. Typi-scherweise beginnt der Keratokonus inder Pubertät und schreitet dann bei ca.21% aller Keratokonuspatienten so weitvoran, dass eine Keratoplastik wegenVernarbung oder irregulärem Astigma-tismus durchgeführt werden muss [10,16]. Deswegen ist der Keratokonus auchinsgesamt gesehen mit bis zu 16% eineder häufigsten Indikationen zur Kerato-plastik [7].

Vor der Keratoplastik werden vorallem harte Kontaktlinsen zur Behand-lung eingesetzt. Seltener angewandteVerfahren sind Epikeratoplastik und in-trakorneale Ringe [4, 10, 13]. Allen die-sen Verfahren ist jedoch gemeinsam,dass sie nur die refraktiven Folgen desKeratokonus behandeln, jedoch nichtdie Ursache der Hornhautverdünnungund daher das Fortschreiten des Kerato-konus nicht aufhalten können bzw. so-gar zum Teil beschleunigen.

Basierend auf umfangreichen tier-experimentellen Untersuchungen [14,15], bei denen es uns gelang, mittels pho-tochemischer Vernetzung die Hornhautsignifikant zu verfestigen (Abb. 1, 2, 3),verfolgten wir in der vorliegenden pro-spektiven Studie einen ganz anderenAnsatz, bei dem es Ziel ist, durch Erhö-hung der Kollagenquervernetzung inder Hornhaut die Erkrankung an ihrerWurzel zu packen und ein Fortschreitendes Keratokonus zu verhindern.

Patienten und Methode

Nach Zustimmung der Ethikkommissi-on des Universitätsklinikums zum Stu-diendesign (EK 310499) wurden 15 Pati-enten (16 Augen) in die prospektive kli-nische Studie eingeschlossen. Das mitt-lere Alter der 6 weiblichen und 9 männ-lichen Patienten betrug 32,18±10,86Jahre (13–51 Jahre). Es wurden bevor-zugt Patienten mit moderatem Kerato-konus behandelt, d. h., die Keratometer-werte lagen bei den meisten zwischen48 und 56 dpt (Tabelle 1). Bei allen Pa-tienten lag anamnestisch eine deutlicheProgression des Keratokonus in denletzten 2 Jahren vor, weshalb die Pati-enten zum Teil auch von weit entferntüberwiesen wurden. Dabei war bei ca.der Hälfte der Patienten die Progressi-on durch Hornhauttopographieaufnah-men gesichert.

Die Patienten wurden vor der Be-handlung über den experimentellenCharakter der Behandlung und über dieregelmäßigen Kontrolluntersuchungenaufgeklärt.Aus Vorsichtsgründen wurdebevorzugt nur ein Auge behandelt, nurim ersten Fall alle beiden Augen, da we-gen Leber- Optikusatrophie beidseitigeErblindung bestand. Bei 2 Patienten lageine Trisomie 21, bei 1 Fall eine Neuro-

OriginalienOphthalmologe 2003 · 100 : 44–49DOI 10.1007/s00347-002-0700-3

G.Wollensak1 · E. Spörl1 · T. Seiler2

1 Universitäts-Augenklinik Dresden · 2 Universitäts-Augenklinik, Zürich

Behandlung von Keratokonusdurch Kollagenvernetzung

© Springer-Verlag 2003

Teile des Beitrags wurden auf der 99.Tagungder Deutschen Ophthalmologischen Gesellschaft präsentiert.

Priv.-Doz. Dr. G.WollensakUniversitäts-Augenklinik Dresden,Fetscherstraße 74, 01307 DresdenE-Mail: [email protected]

Der Ophthalmologe 1•2003 | 45

G.Wollensak · E. Spörl · T. Seiler

Treatment of keratoconus by collagencross linking

Abstract

Background. We were able to show a signi-ficant increase in corneal stiffness of rabbitand porcine eyes after combined ribofla-vin/UVA-induced collagen cross-linking. Inthis study, we tried to treat keratoconus pa-tients with this method to stop the progres-sion of corneal ectasia.Patients and methods. We treated 16 eyesof 15 patients with progressive keratoconusand mostly moderate keratectasia (48–56dpt). After removal of the epithelium(7 mm ∅), riboflavin solution was appliedon the cornea, which was irradiated withUVA (370 nm, 3 mW/cm2) at a distance of1 cm for 30 min. Post-operative follow-upcontrols were conducted every 3 months inthe first year and then every 6 months, al-ways including visual acuity testing, cornealtopography and measurements of endothe-lial cell density.The follow-up time was be-tween 1 and 3 years.Results. Progression of keratectasia wasstopped in all patients. Best corrected visualacuity and the maximal keratometry valuesimproved slightly in about 50% of the cases.In all patients corneal transparency, the de-gree of keratectasia registered by corneal to-pography and the density of endothelialcells remained unchanged within the follow-up time. No negative side-effects were ob-served.Conclusions. Our results show that collagencross linking might be a useful conservativetreatment modality to stop the progression ofkeratoconus.By this means the need for kera-toplasty might be significantly reduced.Giventhe simplicity of the technique and minimalcosts of the treatment it might also be wellsuited for developing countries.Further stud-ies are envisaged to exclude long-term sideeffects and to evaluate the long term durabili-ty of the mechanical stiffness effect.

Keywords

Keratoconus · Cornea · Cross linking · UV · Riboflavin

dermitis vor.Augenbohren war bei Fall 1anamnestisch bekannt.

Folgende Parameter wurden vor derBehandlung im 1.postoperativen Jahr alle3 Monate, danach zumeist nur noch alle6 Monate erhoben: der beste korrigierteVisus, Keratometerwerte, Hornhautto-pographie mit dem Videokeratoskop (C-Scan,Technomed),Augeninnendruck,Hornhautfoto,Spaltlampen- und Fundus-untersuchung sowie zentrale Endothel-zelldichte mit dem Endothelmikroskop(EM-1200, Tomey), wobei die Endothel-zelldichte mit der Fixed-frame-Methodebestimmt wurde und jeweils ca. 90–100Zellen pro Messung erfasst wurden. EinePachymetrie (Pachette,Technomed) wur-de bei den letzten 4 Patienten (Patient13–16) durchgeführt.Dabei wurden Wertezwischen 460–540 µm gemessen.

Behandlungsprocedere. Die Behandlungerfolgte in lokaler Tropfanästhesie mitProxymetacainhydrochlorid-AT 0,5%.Im Zentrum der Hornhaut wurde auf ei-ner Fläche von 7 mm Durchmesser eineEpithelabrasio durchgeführt. Diese istnotwendig, weil sonst die Epithelschichtdas Eindringen von Riboflavin ins Horn-hautstroma verhindert. Als Photosensi-bilisator wurde eine 0,1%ige Riboflavin-lösung (10,95 mg Riboflavin-5-phosphatin 10 ml 20%iger Dextran-T-500-Lö-sung) auf die Hornhaut getropft und mit

ultraviolettem UVA-Licht der Wellenlän-ge von 370 nm und der Bestrahlungsin-tensität von 3 mW/cm2 mit einem Ab-stand von 1 cm für 30 min bestrahlt(Abb.4).Als UVA-Strahlungsquelle dien-ten zwei UV-Leuchtdioden mit einerStrahldivergenz von 10 (Roithner Laser-technik, Wien), bei denen ein Potentio-meter zur Spannungsregelung in Reihegeschaltet wird. Als Spannungsversor-gung dienten drei 1,3-V-Akkus. Vor derBehandlung wurde die Bestrahlungsin-tensität von 3 mW/cm2 mit dem UV-Messgerät LaserMate-Q (LASER 2000,Wessling,BRD) in 1 cm Abstand kontrol-liert. Bei Abweichungen der Bestrah-lungsstärke wurde die Spannung derLeuchtdiode mittels Potentiometer aufdie Sollbestrahlungsintensität geregelt.Während der Bestrahlung wurden imIntervall von 5 min 1–2 Tropfen Ribofla-vin auf die Hornhaut getropft. Nach Ab-schluss der Behandlung wurde antibioti-sche Augensalbe appliziert.

Um die UV-Dosis für die menschli-che Linse abschätzen zu können, wurdenin einem Vorversuch bei 10 frisch enu-kleierten,mit Riboflavin vorbehandeltenSchweineaugen mit einem UV-Extinkti-onsmessgerät (Perkin Elmer) die kornea-le UV-Transmission bei 370 nm gemes-sen [14] und betrug somit 7% der pri-mären Bestrahlungsintensität, d. h., dieverwendete Bestrahlungsintensität wur-

Ophthalmologe 2003 · 100 : 44–49DOI 10.1007/s00347-002-0700-3

Abb. 1 � Prinzip der photo-chemischen Vernetzung von

Kollagen mit Riboflavin alsPhotosensibilisator

Originalien


de von 3 mW/cm2 durch die korneale Ab-sorption bei einer Hornhautdicke von500 µm auf 0,21 mW/cm2 (=0,378 Ws/cm2

bei 30 min Bestrahlungszeit) in derNähe der Linse und auf 10 µW/cm2

(=0,018 mWs/cm2 bei 30 min Bestrah-lungszeit) vor der Netzhaut reduziert.

Ergebnisse

Die maximale Nachkontrollzeit lag bei3,5 Jahren, die mittlere Nachkontrollzeitbei 23,2±9,4 Monaten. Mit dem Wilco-xon-Test für Paardifferenzen findet sicheine signifikante Verbesserung für denVisus um 1,3 Linien (p<0,01) und fürden maximalen Keratometerwert um1,38 dpt (p<0,01). Leichte Verbesserungdes Visus fanden sich in ca. 68% und desKeratometerwertes (Abb. 5) in ca. 50%der Fälle, wobei die restlichen Fälle kon-stant gegenüber dem präoperativen Be-fund blieben.

Nebenwirkungen wie Endothelzell-schäden oder Kataraktbildung wurdenbei keinem der Patienten festgestellt. Eskam zu keiner Zunahme der Trübungder Hornhaut, bei 2 Patienten (Patient 1und 2) wurde sie sogar deutlich besser(s. Tabelle 1).

Diskussion

Mit der hier vorgestellten Methode derKollagenvernetzung ist eine Erweite-

rung des therapeutischen Spektrums beiKeratokonus gegeben, und es scheintzum ersten Mal möglich zu sein, dasFortschreiten des Keratokonus zu stop-pen und evtl. in Einzelfällen sogar wie-der etwas rückgängig zu machen. Eskonnte eine signifikante Abnahme derKeratektasie anhand der Keratometer-werte in 50% und eine Zunahme des Vi-sus um eine Visusstufe in 68% statistischnachgewiesen werden. Die zahlreichenbisherigen operativen Verfahren zur Be-handlung des Keratokonus wie therma-le Keratoplastik, intrakorneale Ringe,Epikeratoplastik oder lamelläre Kerato-plastik können nur vorübergehend re-fraktive Sehverbesserungen bringen [4,10, 13], jedoch das Fortschreiten des Ke-ratokonus nicht aufhalten. Auch bei derKontaktlinse ist ein positiver Einflussauf das Fortschreiten des Keratokonusnicht bewiesen [19]. Letztendlich bleibtdaher langfristig nur die Hornhaut-transplantation, wobei hierbei Problemewie sekundäre Katarakt oder Glaukom,irregulärer Astigmatismus, Abstoßungund Keratokonusrezidiv möglich sind.

Schwierigkeit bei der Einschätzungdes Behandlungseffektes

Eine Schwierigkeit bei der Einschätzungdes Behandlungseffektes ist die Tatsache,dass der Keratokonus schon spontanzum Stillstand kommen kann („formefruste“).Daher sind die positiven Verläu-fe unserer Patienten theoretisch auchohne die vorangegangene Vernetzungmöglich.Allerdings war der Keratokonuspraktisch bei allen Patienten anamnes-tisch vor der Behandlung progredientgewesen, in knapp 50% war dies auchdurch Topographie belegt.Außerdem istaus epidemiologischen Studien bekannt,

dass ca. 21% der Keratokonuspatientenlangfristig eine Keratoplastik brauchen[16], während es in unserer Studie beikeinem zu einer Progression des Befun-des kam. Sollten in der Zukunft aller-dings negative Verläufe nach Vernet-zungsbehandlung beobachtet werden,müssten diese aber umso stärker gewer-tet werden, da nicht auszuschließen ist,dass einige Fälle auch ohne Behandlungstabil geblieben wären. In unserer Studiegab es aber bisher keinerlei „therapeuti-sche Ausreißer“. Es bleibt auch abzuwar-ten,ob der Behandlungseffekt auch nochin 5–10 Jahren anhält. Möglicherweisemuss die Behandlung alle paar Jahre we-gen der Umbauvorgänge im Rahmen desKollagenstoffwechsels der Hornhaut wie-derholt werden,da die biologische Halb-wertszeit des kornealen Kollagens ca.2–3Jahre beträgt.

Behandlungsprinzip

Das Prinzip der beschriebenen Behand-lung beruht auf der photochemischenVernetzung der Kollagenfasern derHornhaut und findet z. B. auch in der In-dustrie zur Härtung von Lacken undPlastikwerkstoffen in ähnlicher WeiseAnwendung. Bei der UV-Bestrahlungder Hornhaut werden Kollagen-Cross-links durch die bei der Bestrahlung ent-stehenden Sauerstoffradikale induziert(s.Abb. 1), wobei das Riboflavin als Pho-tosensibilisator wirkt und den Vernet-zungseffekt potenziert. Es kommt dabeizu einer Verhärtung der Hornhaut ähn-lich wie nach Formalin- oder Glutaral-dehydfixation, dessen „Verhärtungsef-fekt“ jedem Pathologen aus der tägli-chen Praxis bestens bekannt ist undauch auf der Erhöhung der Crosslinksim Gewebe beruht. In ähnlicher Weise

Abb. 2 � Deutlicher Versteifungseffekt durchRiboflavin-UVA-Behandlung (oben) behandeltegelbe, (unten) unvernetzte graue Schweine-hornhaut

Abb. 3 � Biomechanischer Ma-terialtester (Minimat) zur Mes-

sung des Spannungsdehnungs-verhaltens von vernetzter

Schweinehornhaut


kommt es auch bei der Blutgerinnungzum Crosslinking von Fibrin und damitzur Bildung eines festen Thrombus.

Der therapeutische Ansatz der Ver-netzung wird im übrigen auch in derMedizin bereits vielfältig bei anderenIndikationen verwendet. So wurde dieKollagenvernetzung mittels Glutaral-dehyd bzw. Formalin bei Bioherzklap-pen, bei injizierbarem Kollagen für dieStimmbänder zur Behandlung der Re-kurrensparese und periurethral bei Harn-inkontinenz und zur Härtung von Fas-zien beim Trommerfellersatz genutzt. Inder Zahnheilkunde werden zahlreiche

Werkstoffe durch Lichtaktivierung aus-gehärtet [8]. In der Ophthalmologiewurden injizierbare Linsenmaterialiendurch photochemische Vernetzung ver-festigt [6] und ein Riboflavin-Fibrino-gen-Gemisch durch Argonlaseraktivie-rung als Bioklebemittel für die nahtloseKeratoplastik getestet [5].

Interessanterweise wurde passendzu unserem neuen Therapieansatz inbiochemischen Untersuchungen bei Ke-ratokonus eine Abnahme der Hydroxy-lysin-Crosslinks gezeigt [3]. Des Weite-ren wurde beim Keratokonus eine Zu-nahme der Kollagenasen, eine Abnahme

von Proteasehemmern [19], eine Zunah-me von Kollagenabbauprodukten in derTränenflüssigkeit [1] und eine Störungdes zwischen den Kollagenfibrillen gele-genen Glycosaminoglycangerüstes [18]festgestellt, alles Faktoren, die zur Re-duktion der mechanischen Kollagenfa-serstabilität führen. In biomechanischenUntersuchungen wurde beim Keratoko-nus eine signifikant reduzierte mecha-nische Festigkeit in Spannungs-Deh-nungs-Experimenten festgestellt [2].Auch konnte bei epidemiologischen Stu-dien gezeigt werden, dass bei Patientenmit Diabetes mellitus, bei denen Kolla-gen-Crosslinks in der Hornhaut durchsog.„advanced glycation end products“vermehrt sind [11], Keratokonus signifi-kant seltener auftritt als in der Normal-bevölkerung [12].

Nebenwirkungen undKomplikationen

Bemerkenswerterweise wurden nachder Behandlung weder Kurz- nochLangzeitnebenwirkungen beobachtet.Insbesondere wurden keine Endothel-zellschäden und keine Katarakt beob-achtet. Wir konnten messen, dass durchdas hohe Absorptionsvermögen von Ri-

Tabelle 1Kontrollparameter prä- und postoperativ

Patient Postoperatives Visus Endothelzellzahl Maximaler K-Wert TransparenzZeitintervall(Monate) Präoperativ Postoperativ Präoperativ Postoperativ Präoperativ Postoperativ Postoperativ

1R 41 – – – +1L 41 – – – +2 29 HBW 1/20 – – +3 27 0,4 0,9 2.300 2275±211(6) 49,69 48,30 =4 27 0,5 0,6 2.400 2413±186(6) 57,94 58,04 =5 25 0,8 1,0 2.200 2257±218(6) 49,36 49,41 =6 25 HBW HBW 1.700 1875±197(3) 49,10 48,20 =7 24 0,8 0,8 – – 50,32 45,90 =8 23 0,6 0,7 2.600 2723±169(5) 50,72 49,04 =9 23 0,3 0,6 2.580 2668±228(5) 56,49 54,52 =

10 21 0,8 0,9 – 2815±208(4) 53,19 51,11 =11 19 0,4 0,7 2.450 2396±196(5) 55,50 52,61 =12 14 0,3 0,5 2.290 2257±258(4) 55,17 54,56 =13 13 0,4 0,3 2.110 2214±151(4) 52,80 – =14 13 0,5 0,8 2.360 2437±217(4) 45,88 45,94 =15 6 0,2 0,3 2.060 2139±273(2) 59,00 57,76 =

Der Wert für den postoperativen Visus und den Keratometerwert sind von der letzten Untersuchung; die Zahl in Klammern bei der postoperativen Endothelzellzahl=Anzahl der postoperativen Endothelzellmessungen.

Abb. 4 � Bestrahlungstechnikmit 2 UV-Dioden über der mitRiboflavin getropften, zentralabradierten Hornhaut bei ei-nem Keratokonuspatienten

Originalien


boflavin für 370 nm die Energie zu 93%im Hornhautstroma absorbiert wirdund das Endothel, die Linse und dieNetzhaut weitestgehend vor UV-Schä-den geschützt sind [14]. So wird z. B. dieSchwellendosis von 70 Ws/cm2 für einenUV-bedingten Linsenschaden bei 370 nmbei einer Bestrahlung von 30 min mit0,378 Ws/cm2 deutlich unterschritten.Bei der therapeutischen Dosis wurdenvon uns jedoch im Tierexperiment beisehr dünnen Hornhäuten (kritische Di-cke: 400 µm) massive Endothelschädenbeobachtet (noch unveröffentlichte Da-ten). Eine Behandlung mit der Bestrah-lungsstärke von 3 mW/cm2 sollte daherbei einer Hornhaut mit einer Dicke we-niger als 400 µm nicht durchgeführt wer-den. Daher führen wir seit 1 Jahr auchimmer vor der Behandlung eine Pachy-metrie durch (Patient 13–15).Glücklicher-weise werden selbst beim fortgeschritte-

nen Keratokonus diese Werte in der Re-gel nicht unterschritten. So fanden Wat-ters und Owen eine durchschnittlicheHornhautdicke von 446±38 µm im Ko-nusbereich bei fortgeschrittenem Kera-tokonus, wobei jedoch insbesondere dieHornhaut im Bereich unter dem Konus-apex noch etwas dünner sein kann [17].

Indikationen der Methode

In erster Linie ist die Methode geeignet,die weitere Progression des Keratokonuszu stoppen.Eine minimale Verbesserungder Keratektasie des Keratokonus ist je-doch zum Teil möglich. Daher behan-deln wir zurzeit in erster Linie moderatfortgeschrittene Stadien des Keratoko-nus, bei denen zum einen eine vorange-gangene Progression anamnestisch vor-lag und zum anderen die Behandlungnoch Sinn macht, da eine Keratoplastik

noch nicht nötig ist. Falls sich die Me-thode langfristig bezüglich Therapieef-fekt und Nebenwirkungen bewährt,wol-len wir später auch sehr frühe Formendes Keratokonus behandeln, bei denender Patient noch geringe Beschwerdenhat. Insgesamt könnte sich dann die Zahlder Keratoplastiken bei Keratokonusdeutlich vermindern, sodass Spender-hornhäute vermehrt für andere Indika-tionen zur Verfügung stehen würden [7].

Andere denkbare Indikationen fürdie Behandlung sind neben dem Kera-tokonus die pelluzidale marginale Rand-degeneration, Keratoglobus, Hornhaut-stablisierung im Rahmen von refrakti-ven Eingriffen und Hornhautulzera. Dadie Behandlung einfach und kosten-günstig ist, wäre sie in Zukunft auch inEntwicklungsländern durchführbar, indenen Kontaktlinsen oder Keratoplastikoftmals nicht zur Verfügung stehen.


Die Induktion von Kollagenquervernetzun-gen durch Behandlung mit Riboflavin undUVA-Licht scheint eine neue Möglichkeit zusein, eine Progression von Keratokonus be-reits im Frühstadium durch Erhöhung derbiomechanischen Festigkeit zu stoppenund damit auch eine Keratoplastik zu ver-meiden. Langzeitstudien müssen nochKlarheit über Dauer des Effektes und mög-liche Langzeitnebenwirkungen bringen.Aufgrund der geringen Kosten und Unkom-pliziertheit der Behandlung ist diese auchgut für Entwicklungsländer geeignet.

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Abb. 5a,b � Hornhauttopographie vor (a) und 22 Monate nach (b) Behandlung mit leichter Verbesserung der Keratometerwerte(50,26 dpt→48,32 dpt)

Springer-Verlag und Die Deutsche Bibliothek koope-rieren in der Langzeitarchivie-rung von Online-Publikationen

Der wissenschaftliche Springer-Verlag und DieDeutsche Bibliothek haben die Volltext-Versionenvon derzeit 430 Springer-Zeitschriften in überzwei Millionen Einzeldateien zur Langzeiterhal-tung auf den Archivserver der Deutschen Biblio-thek überführt. Das 1998 begonnene Pilotprojektmit dem Ziel, die Langzeitarchivierung von On-line-Publikationen sicherzustellen, wurde damitfür den Zeitschriftenbereich zu einem vorläufigenAbschluss gebracht. Somit können Leserinnenund Leser die archivierten Volltext-Daten in denRäumen der Deutschen Bibliothek bequem nut-zen. Darüber hinaus arbeiten der Springer-Verlagund Die Deutsche Bibliothek daran, das Archivie-rungsverfahren auf die elektronisch verfügbarenSpringer-Buchreihen auszudehnen.Bereits im März 2002 hatte der Springer-Verlaggemeinsam mit anderen Verlagen der Arbeits-gruppe “Elektronische Depotbibliothek” mit derDeutschen Bibliothek eine Rahmenvereinbarungüber die Archivierung von Online-Publikationenabgeschlossen. Die Bibliothek strebt an, ihremAuftrag der lückenlosen Archivierung aller deut-schen und deutschsprachigen Publikationen auchim elektronischen Bereich gerecht zu werden.Der Springer-Verlag ist mit seinem Internet-ba-sierten Informationsservice einer der führendeninternationalen Anbieter wissenschaftlicher Onli-ne-Inhalte mit Zugang zu knapp 500 Zeitschrif-ten, 1.600 Büchern, zwei Lernsoftwares und fünfExpertensystemen. Monatlich kann der Springer-Online-Service im Durchschnitt 55 Millionen Zu-griffe verzeichnen. Das inhaltliche Spektrum umfasst elf verschiedene Fachgebiete aus Natur-wissenschaft, Technik, Medizin, Psychologie, Wirt-schaftswissenschaften und Jura.Die Deutsche Bibliothek ist die deutsche Natio-nalbibliothek mit den drei Standorten DeutscheBücherei Leipzig, Deutsche Bibliothek Frankfurtam Main und Deutsches Musikarchiv Berlin. Siehat die Aufgabe, lückenlos alle deutschen unddeutschsprachigen Publikationen ab 1913 zusammeln. Mit inzwischen etwa 12.000 Online-Dissertationen verfügt sie über die weltweitgrößte Sammlung an originär digital veröffent-lichten Hochschulschriften. Die Deutsche Biblio-thek hat im Oktober 2001 eine Anmeldeschnitt-stelle für Online-Publikationen eingerichtet, dieallen Verlagen und verlegenden Stellen die frei-willige Abgabe von Veröffentlichungen zur Archi-vierung ermöglicht.

Weitere Informationen unter: http://link.springer.de und http://www.ddb.de

Henna-Tätowierungen als Ursache für lebenslangeAllergien

Immer mehr Menschen lassen sich mit demalten orientalischen Färbemittel Henna tem-poräre Bilder in die Haut tätowieren. Leiderkönnen diese so genannten Temptoos kon-taktallergische Hautreaktionen auslösen –oft sogar erst, wenn das Hautbild bereitsverblasst ist.

Reines Henna wird von den meisten Menschenvertragen. Dem traditionellen Henna wird jedochhäufig Paraphenylendiamin (PPD) beigemengt,um den Farbton augenscheinlich zu verbessernund eine schnellere Trockenzeit zu erreichen. PPDist ein schwarzer Farbstoff, dessen hohes Sensibi-lisierungspotenzial als Kontaktallergen belegt ist.Als Haarfärbemittel ist es seit Jahrzehnten inDeutschland verboten und lediglich für bestimm-te industrielle Zwecke in einer Konzentration biszu 6 % zugelassen. Das dekorative Bemalen derHaut mit PPD-haltigen Farbstoffgemischenunterliegt der Kosmetikverordnung. Produkte ausNicht-EU-Ländern sind an diese Vorgaben abernicht gebunden und enthalten oft erheblicheMengen an PPD.Bereits einige Tage nach Tätowierung könnenerste Hautreaktionen wie Juckreiz, Rötungen,Knötchen- und Bläschenbildung auftreten. Auchüber Schwellungen von Haut und Schleimhaut(Angioödeme), Beinödeme, Nesselsucht (Urtika-ria) oder Astma bronchiale wurde berichtet. Inder Regel lassen sich die Beschwerden erfolg-reich mit Kortikosteroiden und zusätzlicher Anti-histamingabe behandeln.Zu den Spätreaktionen der Henna-Tätowierun-gen zählt die kontaktallergische Dermatitis. Oftsind die Temptoos bereits vollständig verblasst,wenn der Patient die ersten Beschwerden angibt.Eine einmal erworbene Allergie begleitet den Pa-tienten häufig lebenslang: Beim Tragen vonschwarzer Kleidung etwa können sich juckendeund schuppende Hautveränderungen bilden, teil-weise mit blasigen Streureaktionen an Händenund Füßen. Noch gravierender sind die Auswir-kungen auf das Arbeitsleben: PPD und andereverwandte Stoffe sind in bestimmten Berufenwie Friseur, Drucker, Textilverarbeiter, Schuh- undLederwarenverkäufer, Chemiewerker oder Arbei-ter in der Gummi-, Kunststoff oder Papierindu-strie schwer zu meiden.

Quelle: Informationsdienst Wissenschaft

Fachnachrichten


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Riboflavin/Ultraviolet-A–induced CollagenCrosslinking for the Treatment of Keratoconus

GREGOR WOLLENSAK, MD, EBERHARD SPOERL, PHD, AND THEO SEILER, PHD, MD

● PURPOSE: In animal eyes, a significant increase incorneal biomechanical stiffness has been found aftercollagen crosslinking by combined riboflavin/ultravio-let-A (UVA) treatment. The aim of the present studywas to evaluate the clinical usefulness of riboflavin/UVA-induced collagen crosslinking for bringing theprogression of keratoconus to a halt.● DESIGN: Prospective, nonrandomized clinical pilotstudy.● METHODS: Twenty-three eyes of 22 patients withmoderate or advanced progressive keratoconus (maxi-mum K value, 48–72 diopters) were included. Aftercentral corneal abrasion, photosensitizing riboflavindrops were applied and the eyes exposed to UVA (370nm, 3 mW/cm2) in a 1-cm distance for 30 minutes.Postoperative examinations were performed in 6-monthintervals, including visual acuity testing, corneal topog-raphy, slit-lamp examination, measurement of endothe-lial cell density, and photographic documentation. Thefollow-up time was between 3 months and 4 years.● RESULTS: In all treated eyes, the progression of kera-toconus was at least stopped. In 16 eyes (70%) regres-sion with a reduction of the maximal keratometryreadings by 2.01 diopters and of the refractive error by1.14 diopters was found. Corneal and lens transparency,endothelial cell density, and intraocular pressure re-mained unchanged. Visual acuity improved slightly in 15eyes (65%).● CONCLUSIONS: Collagen crosslinking may be a newway for stopping the progression of keratectasia inpatients with keratoconus. The need for penetratingkeratoplasty might then be significantly reduced in ker-atoconus. Given the simplicity and minimal costs of thetreatment, it might also be well-suited for developingcountries. Long-term results are necessary to evaluatethe duration of the stiffening effect and to exclude long

term side-effects. (Am J Ophthalmol 2003;135:620–627. © 2003 by Elsevier Inc. All rights reserved.)

K ERATOCONUS IS A NONINFLAMMATORY CONELIKE

ectasia of the cornea, which is usually bilateral andprogresses over time. Its reported frequency is ap-

proximately 1 in 2,000 in the general population.1 Usually,the condition starts at puberty, progressing in approxi-mately 20% to such an extent that penetrating kerato-plasty becomes necessary.2,3

Besides penetrating keratoplasty, hard contact lenses arethe major treatment modality for keratoconus. In rarecases, epikeratoplasty, photorefractive keratectomy, or in-tracorneal rings can be considered.1,4–7 However, all ofthese techniques only correct the refractive errors ofkeratoconus but do not treat the cause underlying thecorneal ectasia and therefore cannot stop the progressionof keratoconus.

A new technique of collagen crosslinking by the pho-tosensitzer riboflavin and UVA similar to photopolymer-ization in polymers8 has been developed. In extensiveexperimental studies in rabbit and porcine eyes, includingbiomechanical stress–strain measurements,9–11 we showeda significant increase in corneal rigidity by approximately70% in untreated vs treated corneas9 (Figure 1) aftercollagen crosslinking by the combined riboflavin/UVAtreatment.

The aim of the present pilot study was to evaluate theeffect of the new crosslinking method on the progression ofkeratectasia in patients with keratoconus and to excludepossible serious side effects.

DESIGN

THIS WAS A PROSPECTIVE, NON-RANDOMIZED PILOT STUDY.

METHODS

● SETTING AND PATIENTS: Starting in 1998, 23 eyes of22 patients (10 females, 12 males) from the University EyeClinic of Dresden were included in the study. The clinical

Accepted for publication Dec 2, 2002.InternetAdvance publication at ajo.com Feb 26, 2002.From the Department of Ophthalmology, Technical University of

Dresden, Dresden, Germany (G.W., E.S), and the Department of Oph-thalmology, University of Zurich, Zurich, Switzerland (T.S.).

Inquiries to Gregor Wollensak, MD, University Eye Clinic Dresden,Fetscherstrasse 74, D-01307 Dresden, Germany; fax: (�49) 351-458-4335; e-mail: [email protected]

© 2003 BY ELSEVIER INC. ALL RIGHTS RESERVED.620 0002-9394/03/$30.00doi:10.1016/S0002-9394(02)02220-1

diagnosis of keratoconus was based on corneal topography(Figure 3) and clinical signs of keratoconus such as stromalthinning, Fleischer ring, Vogt striae, or apical stromal scar.The preoperative progression of keratoconus was con-firmed from medical history in all patients, and it wasclearly documented by serial corneal topography12 in 12eyes (52%; Figure 4). The average age of the recruitedpatients was 31.7 � 11.9 years and ranged from 13 to 58years (Tables 1 and 2). Except for patient 1, who hadcongenital Leber amaurosis and acute bilateral keratoco-nus, the patients had a moderate to advanced degree ofprogressive keratoconus13 with maximum keratometer val-ues between 48 and 72 diopters (Tables 1 and 2). For safetyreasons, in all cases except patient 1, only one eye wastreated; the fellow eye served as a control eye. Patients 11and 22 wore hard contact lenses in the treated eyes beforeand after the treatment. The prospective, nonrandomizedpilot study was conducted in accordance with the princi-

ples in the Declaration of Helsinki. Subjects read andsigned an institutional ethics committee–approved con-sent form before participation in the study.

● OBSERVATION PROCEDURES: The preoperativescreening and the postoperative examinations includedmeasurement of best-corrected visual acuity, corneal to-pography using a videokeratoscope (C-scan; Technomed,Baseweile, Germany), intraocular pressure by Goldmannapplanation tonometry, central endothelial cell densityusing an endothelial cell microscope (EM-1200; Tomey,Erlangen, Germany), corneal photography, and slit-lampand fundus examination. Preoperative pachymetry (Pa-chette; Technomed, Baseweile, Germany) was performedonly in the last eight patients with minimal pachymetryvalues ranging from 460 to 540 �m.

● TREATMENT PROCEDURE: The treatment procedurewas conducted under sterile conditions in the operatingroom. Proxymetacainhydrochloride 0.5% eyedrops wereapplied for preoperative local anesthesia. The central 7mm of the corneal epithelium was cautiously removedusing a blunt knife. As a photosensitizer, riboflavin 0.1%solution (10 mg riboflavin-5-phosphate in 10 ml dextran-T-500 20% solution) was applied 5 minutes before theirradiation and every 5 minutes during the irradiation.After allowing riboflavin to permeate through the corneafor at least 5 minutes, the UVA irradiation was startedusing two UV diodes (370 nm; Roithner Lasertechnik,Vienna, Austria) with a potentiometer in series to regulatethe voltage. Three 1.3-V accumulators were used as apower generator. Before each treatment, the desired irra-diance of 3 mW/cm2 was controlled with a UVA meter(LaserMate-Q; LASER 2000, Wessling, Germany) at a1-cm distance and, if necessary, regulated with the poten-tiometer. The patient’s cornea was irradiated with theUVA-light diodes (370 nm) at a 1-cm distance for 30minutes using 3 mW/cm2 irradiance, which corresponds to

FIGURE 1. (Top) Stiffening effect of porcine cornea aftercrosslinking with preserved curvature in the treated cornea(above) and massive bending of the untreated control cornea(below). (Bottom) Wrinkling of untreated porcine cornea (left)and form stability with impressive smoothness of the centrallycrosslinked porcine cornea (right).

FIGURE 2. Treatment of the central 7 mm of the centrallyabraded cornea with riboflavin drops and two UVA diodes.

TREATMENT OF KERATOCONUS BY CROSSLINKINGVOL. 135, NO. 5 621

FIGURE 3. Corneal topography of a treated patient (Top) shortly before and (Bottom) 10 months after crosslinking with slightregression of the maximum K value by 1.06 diopters.

AMERICAN JOURNAL OF OPHTHALMOLOGY622 MAY 2003

FIGURE 4. (Top) Column diagram demonstrating pretreatment progression of maximum K value in the half year before treatmentand posttreatment regression as measured at the latest follow-up examination for each patient. y axis: difference in maximum K valuein diopters; x axis: patient number; shaded bars � preoperative change of K value; solid bars � postoperative change of K value.(Bottom) Biphasic curve illustrating the mean change over time of the maximum K value relative to the K value on the day oftreatment with mean preoperative progression by 1.4 diopters and postoperative regression by 2.0 diopters (x axis: time in months;y axis: change of maximum K value in D).


a dose of 5.4 J/cm2 (Figure 2). After the treatment, anantibiotic ointment was applied until reepithelialization.

RESULTS

THE FOLLOW-UP TIME RANGED FROM 3 TO 47 MONTHS,

with a mean follow-up time of 23.2 � 12.9 months (Tables1 and 2). Best-corrected visual acuity improved statisticallysignificantly in 15 patients (65%) by an average of 1.26lines (95% confidence interval, �0.68 to 2.21; P � .026,paired Student t test), comparing the preoperative valueson the day of treatment vs the postoperative values of thelast examination. The refractive correction improved sig-nificantly by an average of 1.14 diopters (95% confidenceinterval, 0.12 to 2.17; P � .03) in spherical equivalent(Table 2).

The mean preoperative progression of the maximum Kvalue was 1.42 � 1.18 diopters (Figure 4, bottom) in 12eyes (52%). Postoperative regression of keratoconus, asmeasured by the maximum K values (Table 1), was foundin 16 patients (70%; Figure 4, top and bottom) with anaverage reduction of 2.01 diopters (95% confidence inter-

val, 1.23 to 3.07 diopters; P � .001, paired Student t test),comparing the preoperative values on the day of treatmentvs the postoperative values of the last examination (Figure3). In five patients the K value remained stable, and in onepatient a minimal increase of the K value of 0.28 diopterswas present. In the fellow control eyes, however, 5 of 23eyes (22%) showed a continuous progression of the max-imum K value by an average of 1.48 diopters in the firstyear after the crosslinking treatment of the contralateraleye.

The postoperative healing process was unremarkable,except for slight transient stromal edema until reepitheli-alization after 3 days. There were no side effects, such aspersistent epithelial defects or scarring. During the firstpostoperative night, some pain medication was adminis-tered. The corneal and lens transparency and the endo-thelial cell density (P � .45) remained unchanged (Tables1 and 2). Contact lens wear for refractive correction inpatients 19 and 22 could be continued without tear filmstability problems.

No statistically significant difference was found betweenthe mean preoperative intraocular pressure of 13.6 � 2.0mm Hg on the day of treatment and the mean postoper-

TABLE 1. Investigation Parameters

Patient Age Postoperative Interval

Visual Acuity Refractive Correction Maximum K Value

Endothelial Cell

DensityCorneal and Lens

TransparencyPreop Postop Preop Postop Preop Postop Preop Postop

1r 13 47 no LP no LP — — — — — — �

1l 13 47 no LP no LP — — — — — — �

2 41 35 HM 20/400 — — — — — — �

3 32 33 20/50 20/22 �3 �1.5 49.69 48.30 2,300 2,300 �

4 19 33 20/40 20/33 �1.75 �1.5 57.94 57.90 2,400 2,390 �

5 38 31 20/25 20/20 �0.75 �0.75 49.36 49.32 2,200 2,250 �

6 58 31 HM HM �3 �2.75 49.10 48.20 1,700 1,700 �

7 49 30 20/25 20/25 3.5 3.5 50.32 44.45 — — �

8 36 29 20/33 20/28 �8.25 �3.5 50.94 48.20 2,600 2,640 �

9 29 29 20/66 20/33 �13 �13.125 56.49 53.29 2,580 2,600 �

10 36 27 20/25 20/22 �4.5 �2.125 53.19 51.11 — 2,700 �

11 31 27 20/40 20/33 �6 �7 49.85 50.13 2,150 2,130 �

12 29 24 20/50 20/28 �7 �5.5 55.50 52.61 2,450 2,450 �

13 39 20 20/66 20/40 �3 0 55.17 54.56 2,290 2,280 �

14 39 19 20/50 20/66 �2.75 �2.5 52.80 52.00 2,110 2,090 �

15 31 19 20/40 20/25 �6.75 �2.125 45.88 45.44 2,360 2,400 �

16 19 12 20/100 20/66 �10.25 �4.25 59.00 57.34 2,060 2,100 �

17 28 9 20/66 20/33 �0.75 �4 56.00 53.81 2,400 2,420 �

18 51 8 20/66 20/200 0.375 �0.875 55.60 52.18 2,100 2,050 �

19 32 7 20/66 20/50 �3.5 �2.5 67.07 62.72 2,700 2,700 �

20 30 6 20/33 20/20 �1.0 0.5 51.06 47.08 2,050 2,050 �

21 24 5 20/66 20/50 �3.0 �2.5 72.47 68.60 1,850 1,850 �

22 22 3 20/50 20/40 �1.25 �0.25 46.07 45.70 1,950 1,900 �

The preoperative values for visual acuity and maximum K value were determined on the day of treatment. The postoperative values are

given for the last visits.

� indicates unchanged transparency; HM � hand motion; LP � light perception; postop � postoperative; preop � preoperative.


ative intraocular pressure of 13.8 � 2.5 mm Hg (P � .615)at the last visit.

DISCUSSION

THIS STUDY HAS SHOWN THAT COLLAGEN-CROSSLINKING

appears to be effective in stopping the progression ofkeratoconus quasi “freezing” the cornea. This effect iscorroborated by the following data of the study1: Postop-erative regression was observed in 70% of patients with adecrease of the mean keratometer values by 2.01 diopterspostoperatively despite documented preoperative progres-sion by 1.42 diopters in 52%.2 The postoperative refractivecorrections could also be reduced by an average of 1.14 �2.18 diopters.3 In the untreated fellow control eyes, apostoperative progression of keratectasia by 1.48 diopterswas found in 22%.4 In biomechanical measurements ofearlier experiments, an increase in biomechanical stabilityof approximately 70% was measured.9

In contrast to other therapeutic measures for treatingkeratoconus, such as thermal keratoplasty, intracornealrings, or epikeratoplasty (which basically are only transientrefractive corrections),4–7 the new minimal invasivemethod presented here seems to be the first approach tostop or even reduce the progression of keratoconus. Anarrest of keratoconus by contact lenses has been describedonly in anecdotal reports but has never been confirmed ina systematic study.1

The success of crosslinking treatment in keratoconus isnot surprising, because a significantly reduced tensilestrength has been measured biomechanically14 in kerato-conous and a significant increase in corneal rigidity hasbeen measured in porcine and rabbit corneas treated by

riboflavin/UVA using quantitative biomechanical stress-strain measurements.9–11 The impressive stiffening effectafter riboflavin/UVA treatment (Figure 1) is similar toformaldehyde-induced tissue stiffening and fixation inpathologic specimens caused by collagen crosslinking.

Pathohistologically, we were able to demonstrate asignificant increase in collagen fiber diameter as theunderlying histopathologic correlate.15 Increased cornealcollagen fiber diameters and increased collagen rigidityhave also been described in diabetes mellitus and aging,where collagen crosslinking is also increased.16–18 In theseconditions, keratoconus rarely occurs.19 Increased resis-tance to pepsin digestion after crosslinking has beenfound,20 which might be important for keratoconus be-cause a significantly elevated activity of collagenases hasbeen found.21,22

The arrest of the progression of keratoconus in ourpatients could have been spontaneous as a so-called formefruste of keratoconus.23 In epidemiologic studies, however,21% of patients with keratoconus progress to a state wherekeratoplasty is required.2,3 In all our cases a progression ofkeratoconus was known before the beginning of thetreatment at least by clinical history and clearly docu-mented by corneal topography in 12 eyes (52%; Figure 4,top). Moreover, postoperative regression was observed in16 eyes (70%) after treatment, and this has never beenreported in the natural course of the disease.

In the two cases with hard contact lens wear (patients11 and 22), the keratometry readings might have beeninfluenced by an orthokeratoplastic effect,24 but these twocases did not show regression. The contact lenses were stilltolerated after crosslinking, and their use did not have tobe stopped.

TABLE 2. Summary of Patient Data and Results

Mean � SD P Value

Mean follow-up 23.2 � 12.9 months

Preoperative progression in K value 1.42 � 1.18 D

Postoperative regression K value 2.01 � 1.74 D .0001

Postoperative regression in refractive error (spherical

equivalent)

1.14 � 2.18 D .030

Postoperative increase in visual acuity 1.26 � 1.5 lines .026

Postoperative intraocular pressure Unchanged .612

Postoperative transparency of lens and cornea Unchanged

Postoperative density of endothelial cells Unchanged .45

Number of patients: 22

Number of eyes: 23

Gender: 12 males, 10 females

Age: 31.7 � 11.9 years

The postoperative values were calculated as the difference between the value on the day of

treatment and at the last follow-up visit. The preoperative progression K value was calculated as the

difference in K value between the value half a year before treatment and the day of treatment.


In the present study, we treated moderate to advancedkeratoconus stages.13 If the good results of the new methodare corroborated over time, it would be preferable to treatearlier stages of the disease so that a better visual acuitymight be preserved. Earlier stages were not included in thisstudy, because the possible risks involved were not yetknown.

We did not find an increase of the mean intraocularpressure values postoperatively. Applanation tonometry isnot sensitive enough to reflect the increase in cornealrigidity. A slight increase in intraocular pressure measure-ment might also be masked by the normal slight variabilityin intraocular pressure.

We have not observed any complications or adverseevents of the new method, especially no decrease inendothelial cell density or cataract formation. We havepreviously measured the amount of irradiation intensitytransmitted by the porcine cornea using a UVA photo-meter. With 3 mW/cm2 of UVA irradiance at the surfaceof the cornea and a riboflavin concentration of 0.1%, thereis a massive reduction of the UVA light by 95%, resultingin an irradiance of 0.15 mW/cm2 (� an irradiation dose,0.27 J/cm2) at the endothelial level in a 500-�m-thickcornea.9 Without riboflavin, the UVA light would bereduced in the cornea only by approximately 30%, withapproximately 50% UVA absorption in the lens.25

In experiments with rabbit eyes, the cytotoxic thresholdirradiance for the endothelial cells after combined ribofla-vin/UVA treatment is 0.36 mW/cm2 (�0.65 J/cm2),which may be reached with a corneal thickness of under400 �m using 3 mW/cm2 irradiance (�5.4 J/cm2) at theepithelial level.26 Preoperative pachymetry is essential andwas included in the last eight patients of the study. Thecentral corneal thickness in keratoconus usually is notreduced to less than 400 �m.27 If so, however, the cross-linking treatment should be avoided.

The UVA dose of 0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2) is farbelow a cataractogenous level of 70 J/cm2.28 In addition,lens damage is usually induced by UVB light in thewavelength range of 290 to 320 nm, which has a higherenergy because of a shorter wavelength than UVA.28,29

The durability of the stiffening effect is unknown.Because the collagen turnover in the cornea is estimated tobe between 2 to 3 years,30,31 a repeat treatment maybecome necessary in the long run.

Collagen crosslinking could also be useful for the treat-ment of iatrogenic keratectasia resulting from laser in situkeratomileusis32,33 either as prophylaxis or as postoperativetreatment. The new treatment can also be used for treatingcorneal melting lesions or superficial ulcers.34 The residualcorneal thickness should be at least 400 �m to spare theendothelium.

We believe that collagen crosslinking might become astandard treatment for progressive keratoconus. Long-termstudies must exclude serious late complications and con-firm the durability of the stiffening effect. The new method

might reduce the need for donor material resulting fromkeratoconus, which represents approximately 16% of allkeratoplasty indications.35 Given the very low costs andthe simplicity of the new method, it could be applied indeveloping countries where access to keratoplasty or con-tact lenses is a problem.

ACKNOWLEDGMENT

The authors thank Prof. Josef Wollensak (Berlin) forcontinuous support and stimulation in the development ofthe new method.

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