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INTRODUÇÃO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO PAPILLOMAVÍRUS HUMANO E SUA PERSISTÊNCIA ENTRE MULHERES GESTANTES HIV+ NO

RIO DE JANEIRO, BRASIL2 2 1,2 1,2 2 1Siqueira Juliana D(ME) , Meyrelles ARI , Almeida GL , Seuanez HN , Soares MA , Machado ES , Soares Esmeralda A

1-Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva, Rio de Janeiro, Brasil; 2-Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil

1

A infecção por HIV é um fator de risco para a persistência do HPV e o desenvolvimento de câncer de colo de útero. Este câncer é o terceiro tipo mais incidente em mulheres no Brasil, e o segundo no mundo, sendo responsável pelo óbito de aproximadamente 230 mil mulheres por ano. Ao mesmo tempo, é um câncer com grande potencial de prevenção e cura quando diagnosticado precocemente. O câncer do colo do útero se desenvolve a partir de lesões cervicais pré-invasivas, que atualmente são divididas em diferentes categorias citológicas: lesão intraepitelial escamosa de baixo grau (LSIL), lesão intraepitelial escamosa de alto grau (HSIL) e câncer invasivo (Figura 1).

Figura 1. Progressão de uma lesão benigna do colo do útero para o câncer cervical invasivo. A evolução é o resultado dos efeitos combinados de genes do HPV, particularmente aqueles que codificam as proteínas E6 e E7, que são as duas oncoproteínas virais; a integração do DNA viral no DNA do hospedeiro; e uma série de mudanças genéticas e epigenéticas nos genes celulares. HSIL, lesão escamosa intraepitelial de alto grau; LSIL, lesão escamosa intraepitelial de baixo grau (modificado de Lowy & Schiller, 2006).

RESULTADOS

Dentre as 91 amostras analisadas, os tipos de HPV encontrados são do gênero alfa e estão divididos entre as espécies 1, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11. O genótipo homozigoto para arginina foi encontrado em 44% dos pacientes, o homozigoto para prolina em 22% e o heterozigoto prolina/arginina em 34%. A citologia da amostra pós-parto de 52% dos pacientes foi coletada até o momento, e 3 pacientes progrediram para lesão intraepitelial escamosa de alto grau, todos com HPV de alto risco. No entanto os resultados moleculares para persistência ainda estão em andamento.

OBJETIVOSCaracterizar a prevalência da infecção pelo HPV, os tipos infectantes, a ocorrência de múltiplas infecções, a persistência da infecção e a prevalência dos diferentes polimorfismos da p53 em uma coorte de gestantes HIV+ com diversos perfis citológicos.

Os papillomavírus podem infectar diferentes vertebrados, e apresentam uma classificação filogenética bastante complexa. Em humanos são descritos 5 gêneros (alfa, beta, gama, mu e nu). Os gêneros são subdivididos em espécies, totalizando 28. As espécies por sua vez são classificadas em 132 tipos diferentes até o presente. Os tipos são divididos em alto risco e baixo risco para câncer e alguns com risco indeterminado. A maioria das infecções pelo HPV pode ser resolvida pelo sistema imune competente, e a persistência é determinada pela detecção do vírus por pelo menos um ano. Fatores virológicos e do hospedeiro que estão envolvidos na persistência ainda não estão elucidados.O HPV possui duas oncoproteías (E6 e E7) que são capazes de interagir com proteínas que regulam o ciclo celular e que atuam como supressoras de tumores, como a p53 e pRb. Essa interação provoca a degradação e inativação das proteínas celulares, o que levaria à transformação e imortalização celular, e posteriormente à formação de neoplasias. O polimorfismo no códon 72 da p53 pode codificar uma arginina ou uma prolina; quando codifica uma arginina a proteína apresenta uma velocidade de degradação maior em presença da proteína E6 do HPV 16 ou 18, e tem sido demonstrado que também confere maior risco na formação de tumores cervicais do que a p53 que possui uma prolina.Estudos sugerem que a freqüência de co-infecção e da persistência do HPV aumentam ainda mais durante a gravidez, mas são escassos dados moleculares detalhados sobre as variantes de HPV envolvidas, especialmente nos países em desenvolvimento como o Brasil.

METODOLOGIACento e dezenove gestantes HIV+ acompanhadas na clínica pré-natal da UFRJ, que não sabiam se eram HPV+ por testes moleculares, tiveram uma amostra cervical coletada no 2º trimestre de gravidez e outra seis meses após o parto. O DNA viral foi extraído e usado para determinar a seqüência de nucleotídeos parcial do gene codificante do capsídeo viral (L1), usando iniciadores degenerados, gerando um fragmento de 450 pb. O códon 72 da p53 foi amplificado e seqüenciado com iniciadores específicos para o éxon 4, gerando um fragmento de 450 pb. Os vírus foram classificados por filogenia utilizando referências dos tipos encontrados selecionadas do banco de dados do PAVE (http://pave.niaid.nih.gov/index.html). As análises foram feitas no programa MEGA5, usando neighbor-joining e Kimura 2-parâmetros. Vírus com eletroferogramas apresentando ambigüidade de bases foram clonados. Um questionário detalhado com histórico clínico e laboratorial foi preenchido para cada paciente.

CONCLUSÃOUma alta diversidade genética do HPV foi encontrada em gestantes HIV+, destacando o papel da imunossupressão causada pela infecção pelo HIV e pela gravidez na infecção pelo HPV. O HPV tipo 18 foi apenas o oitavo tipo mais prevalente, uma descoberta importante com implicações para o uso da vacina disponível atualmente. A ocorrência de infecção por múltiplos tipos de HPV também é primordial nesta coorte. Foi observado que mulheres infectadas pelo HIV e HPV podem ser portadoras de subtipos oncogênicos, mesmo quando os esfregaços citológicos mostram normalidade citológica. Mais estudos são necessários para avaliar os resultados clínicos das infecções por HPV neste cenário.

Total de pacientes 119

Média de idade (anos) 27 (14-44)

Número de parceiro sexuais na vida

1 a 3 30%

4 ou mais 68%

Profissionais do sexo 1%

Sem informação 1%

Tabagismo

Fuma ou já fumou 42%

Nunca fumou 58%

Número de gestações

1 ou 2 36%

3 ou 4 41%

5 ou mais 23%

Uso de anticoncepcional

Sim 50%

Idade da primeira relação sexual

< 16 75%

DSTs

Herpes 5%

Sífilis 18%

Tabela 1. Fatores de risco para HPV e câncer das pacientes do estudo

119Pacientes do estudo

1a Coleta (2º trimestre da gestação)

103PCR HPV Positivo

16PCR HPV Negativo

91Seqüenciados e/ou

clonados

12Analise não finalizada

75Monoinfectados

16Multiploinfectados

Citologia65 Normal

6 Ascus27 Lsil (sugestivo de HPV)4 Hsil (sugestivo de HPV)

1 Sem informação

Citologia14 Normal

1 Ascus1 Lsil (sugestivo de HPV)

Figura 2. Prevalência do HPV e citologia na 1a Coleta (2º trimestre da gestação).

Citologia Potencial oncogênicoPolimorfismo do codon 72 - p53

#

Pro/Pro Pro/Arg Arg/Arg

Normal(47)

Alto risco (30)HPV16(4), HPV33(2), HPV56(1), HPV73(1)

HPV16(6), HPV18(1), HPV33(1), HPV35(1), HPV58(2)

HPV16(7), HPV18(1), HPV45(1), HPV58(2)

Baixo risco(4) 0 HPV61(1), HPV70(1) HPV81(2)

Risco indeterminado (13)

HPV53(1), HPV62(1), HPV69(1), HPV85(1)

HPV53(2), HPV62(2), HPV83(1)

HPV62(1), HPV66(1), HPV83(2)

Ascus (5)

Alto risco (2) 0 HPV82(1) HPV31(1)

Baixo risco 0 0 0

Risco indeterminado (3)

0 0HPV53(1), HPV83(1), HPV32(1)

Lsil (17)

Alto risco (9) HPV35(1)HPV16(3), HPV45(1), HPV58(1)

HPV16(2), HPV58(1)

Baixo risco (4) 0 HPV11(1), HPV81(1) HPV6(1), HPV81(1)

Risco indeterminado(4)

0 HPV66(1), HPV69(1) HPV53(1), HPV84(1)

Hsil (4)

Alto risco (4) HPV73(1) HPV16 (1) HPV16 (1) HPV35 (1)

Baixo risco 0 0 0

Risco indeterminado 0 0 0

Total 14 29 30

* Duas amostras não possuem dados de p53 ou citologia, mas possuem HPV16# Pro/ Pro - homozigoto prolina; Arg/Arg - Homozigoto para arginina; Pro/Arg - heterozigoto Prolina/Arginina

Amostra Tipos de HPV* Citologia P53#

RJ08-001 HPV31, HPV56 LSIL A/A

RJ08-004 HPV58, HPV61, HPV62 Normal A/P

RJ09-011 HPV82, HPV84 LSIL P/P

RJ08-018 HPV53, HPV83 Normal A/A

RJ09-030 HPV6, HPV83 Normal A/P

RJ09-040 HPV16, HPV35, HPV55, HPV58 Normal A/P

RJ10-057 HPV16, HPV53, HPV81 Normal A/P

RJ09-069 HPV45, HPV58, HPV81 Normal P/P

RJ10-071 HPV32, HPV62 Normal A/A

RJ10-080 HPV16, HPV35, HPV44, HPV58 Normal A/P

RJ10-087 HPV55, HPV56 LSIL P/P

RJ10-088 HPV42, HPV52, HPV68 LSIL P/P

RJ10-089 HPV53, HPV55, HPV58 LSIL A/A

RJ10-093 HPV16, HPV35 LSIL A/A

RJ10-098 HPV16, HPV52 LSIL A/P

RJ10-114 HPV11, HPV16, HPV66 LSIL A/P*Em vermelho os tipos de HPV de alto risco#P/P - homozigoto prolina; A/A- Homozigoto para arginina; P/A - heterozigoto Prolina/Arginina

Tabela 2. Prevalência dos genótipos de HPV e a associação com a citologia cervical e o polimorfismo do códon 72 da p53 dentre as 73 pacientes monoinfectadas*

Tabela 3. Prevalência dos genótipos de HPV e a associação com a citologia cervical e o polimorfismo do códon 72 da p53 dentre as amostras multiploinfectadas

Figura 3. Gráfico da prevalência dos tipos de HPV em monoinfectados.

Figura 4. Gráfico de prevalência dos tipos de HPV em multiplos infectados.

HPV1635%

HPV588%

HPV334%

HPV354%

HPV183%

HPV453%

HPV733%

HPV821%

HPV561%

HPV311%

HPV537%

HPV626%

HPV816%

HPV836%

HPV663%

HPV693%

HPV61%

HPV111%

HPV321%

HPV611%

HPV701%

HPV841%

HPV851%

Prevalência dos tipos do HPV em monoinfectados

* Tipos em vermelho são de alto risco

HPV1615%

HPV5812%

HPV358%

HPV525%

HPV565%

HPV312%HPV45

2%HPV68

2%

HPV822%

HPV538%

HPV558%

HPV625%

HPV815%

HPV835%

HPV62%

HPV112%

HPV322%

HPV442%

HPV422%

HPV612%

HPV662%

HPV842%

Prevalência dos tipos do HPV em multiploinfectados

* Tipos em vermelho são de alto risco