Arş. Gör. Mehmet GÜMÜŞTAŞ

Genel olarak kromatografi, çeşitli maddelerin hareketli faz

yardımıyla, sabit bir faz arasından değişik hızlarla hareket

etmeleri esasına dayanır.

İlk defa 1906 yılında bir Rus botanikçi Tswetttarafından kullanılmıştır.

Yaptığı çalışmada yapraklardaki pigmentleriayırmayı CaCO3 kolon ve petrol eteri kullanarakbaşarmıştır.

Bu çalışmalardan sonra kromatografi, 1952 ve 1960 yıllar arasında hızlı bir şekilde gelişerek analitik teknikler arasında önemli bir yer almıştır.

Bütün sıvı kromatografik teknikleri arasında en

yaygın kullanılanı dağılma kromatografisidir. Bu

teknik sıvı-sıvı kromatografi ve sıvı-bağlı faz

kromatografisi olmak üzere iki alt sınıfta

incelenir.

Sıvı-sıvı tekniğinde durgun faz katı yüzeyine

fiziksel adsorpsiyonla, bağlı-faz tekniğinde ise

kovalent bağlar ile tutturulur.

ABSORBSİYON ADSORBSİYON

HPLC ne amaçla kullanılır?

HPLC uçucu olmayan kimyasal ve biyolojik bileşenlerin ayrımı için kullanılır.

Örnek olarak

• İlaç etken maddeler, aspirin, ibuprofen veya asetaminofen

• Proteinler, yumurtanın beyazı veya kan proteinleri

• Poimerler gibi organik kimyasallar (polisitiren or polietilen)

• Gıdalardaki pestisit ve vitaminler

• Birçok doğal bileşen, ginseng, bitkisel ilaçlar, bitki ekstraktları

• Sıcaklık ile kararlılığını kaybeden bileşenler, trinitrotoluen (TNT), enzimler

NOT: Eğer uçucu bir bileşik ile çalışacaksak (bir gaz veya petroldeki bir hidrokarbon türevi), Gaz kromatografi sistemi tercih edilmelidir.

Kromatografik ayırmada maddeler birbiriyle karışmayan iki fazarasında dağılırlar.

Fazlardan birine hareketli (mobil) faz, diğerine ise durgun faz(stasyoner faz) denir.

Karışımdaki her maddenin hareket hızı (tR), maddenin hareketliveya mobil faza olan ilgisine göre belirlenir.

Hareketli faza daha çok ilgisi olan maddeler daha hızlı hareketederler.

Kolondan çıkan her maddenin konsantrasyon profili, pik olarakadlandırılır.

Piklerin oluşturduğu tabloya da kromatogram adı verilir.

Bir kromatogram neye benzer?

Zaman

min0 2 4 6 8 10 12 14

Örneğin enjekte edildiği zaman

Her bir sinyal pik olarak adlandırılır

A

B

C

İlaç endüstrisini baz aldığımızda, dozaj formlarında bulunan aktif bileşenin kalite kontrolü hayati önem taşımaktadır ( ) .

HPLC sistemi bu aktif bileşen veya dozaj formunun içerisinde bulunan, ilacın sentezlenmesinden veya bozunmasından kaynaklanan safsızlıkların ( ) tespiti için kullanılabilir.

Bu noktada yapılan kalite kontrol hastanın güvenliğini sağlamaktadır.

HPLC nin uygulanışı

1. adım: Tabletin uygun çözücüde çözünmesi

Bileşenlerin ayrımı kolonda gerçekleşir

Kolon, çelik bir borudan oluşan içi silika jel ile doldurulmuş bir yapıdan oluşur.

Kolon

Sabit Faz Partikülleri

2. adım: Ayrım

Çözünen karışım kolona enjekte edilir.Kolon

Sabit Faz Partikülleri

Kolon

Sabit Faz Partikülleri

Hareketli Faz

Kolon boyunca sıvının (metanol ve su karışımı gibi) hareket etmesi için bir basınç uygulanır

Bu sıvı karışımına hareketli faz denir.

Hareketli faz, sabit faz boyunca ilerleyerek, enjekte edilen numuneyi taşımakla görevlidir.

Farklı bileşenler, kolonda farklı hızlarda ilerlerler.

Hareketli Faz

Hareketli Faz

Bunun anlamı bileşenlerin kolon çıkışına farklı zamanlarda hareket etmesi demektir.

3. Adım: Bileşenlerin miktarlarının tayin edilmesi

Bileşenler ayrıldıktan sonra, karışım içerisindeki bileşenlerin miktarlarının tayini için UV ışık kaynağından faydalanılır

Işığın madde tarafından absorblanması, madde miktarı ile orantılıdır diyebiliriz

Örneğin madde miktarını 2 katına çıkarırsak, madde 2 kat daha fazla ışığı absorblayacak demektir.

Detector

Dedektör ışığın yoğunluğunu ölçmekle görevlidir.

Işık geöişindeki azalma dedektörde bir cevap oluşturur ve buna da pik denir.

4. Adım: Bileşenlerin nicel olarak tayini Öncelikli olarak temel maddeye

ait pik görülmekte Görüntüyü yaklaştırdıkça küçük

pikler gözükmeye başlamaktadır.Businyaller safsızlıklara aittir.

Hasta sağlığı açısından bu safsızlıklar belirlenen limitlerin altında olmak zorundadır.

Genel olarak 5 kısımdan oluşur

• Pompa

• Enjektör

• Kolon

• Dedektör

• Kaydedici

Bu kısımlardan bazıları çalışılacak bileşene göre değişiklik gösterebilir

HPLC sistemine genel bakış

Agilent 1200 Infinity SKSistem

Pompanın görevi sıvının sistemde dolaşımını sağlamaktır. Dakikada akan mL cinsinden gösterilir.

• HPLC için normal bir akış 1- 2-mL/dk aralığındadır.

• Maksimum 400 bar.

• UHPLC pompaları ile 600 - 1500 bar.

Bir deney esnasında, pompa değişmeyen, sabit bir akış sağlıyorsa bu sisteme isokratik sistem denir.

Fakat hareketli fazda analiz esnasında değişimler gerçekleşirse çalışılan sisteme gradient sistem adı verilir.

HPLC sisteminin parçalarıPompa

1260 Infinity Izokratik pompa– Çalışma prensibi

AIV: Active inlet valveOBV: Outlet ball valve

1260 Infinity Çoklu pompa– Çalışma prensibi

Pump head A Pump head B

From solventbottle

From solvent bottle

Inlet ValveInlet Valve

Outlet Valve

Outlet Valve

Mixing Chamber

To waste

Purgevalve

Pumpoutlet

Mixer

Damper

Seal Seal

Piston Piston

Gradient ve Isokratik Koşulların Kıyaslanması

İzokratik

Çözücü bileşimi hep sabittir

• Basit ayrımlar için idealdir

• Kalite kontrol departmanlarında sıklıkla tercih edilir.

Gradient

Hareketli faz bileşimi zamanla değişim gösterir.

• Kompleks karışımların ayrımı için idealdir.

• Bilinmeyen karışımlarda metodgeliştirmek için tercih edilir.

• En yaygın kullanılan şekli doğrusal artan gradient tir.

Neden gradiente ihtiyaç duyuyoruz?

Time (min)

2

0 25 50 75 0 5 10 15 20 25 30

Time (min)

1,2

3

4

5

6

7

8

1

3

45

6

7

8

Herbisitlerin ZORBAX StableBond-C18 kolon kullanılarak ayrımıKolon: ZORBAX SB-C18

4.6 x 150 mm, 5 µm

Hareketli faz: A: H2O 0.1% TFA, pH 2

B: Asetonitril

Akış Hızı: 1.0 mL/min

Sıcaklık: 35°C

Örnek: 1. Tebuthiuron

2. Prometon3. Prometryne4. Atrazine5. Bentazon6. Propazine7. Propanil8. Metolachlor

Izokratik70% su/30% Asetonitril

Not:Son pikinalıkonma süresi 25 dakikadır

0 25 50 75Time (min)

0 5 10 15 20 25 30

Time (min)

1,2

3

4

5

6

7

8Not:Son pikinalıkonma süresi 70 dakikadır

1

2

3

45

Gradient 20 – 60% Asetonitrile/su

6

7

8

Enjektör:

– Genellikle enjekte edilen numune hacimleri

0.1- 20-mikrolitre (µL) arasındadır.

– Sistemdeki yüksek basınca dayanıklı olmalıdır.

Günümüzde oto örnekleyiciler analizcilerin zaman kaybını en aza indirecek şekilde tasarlanmaktadır.

Enjektör sistemleri

Manuel enjeksiyon valfi

Oto örnekleyici sistemi

Enjektör bölmesi hakkında bilinmesi gerekenler

Enjeksiyon hacmi aralığı: 0.1 µl den 100 µl ye kadar enjeksiyon yapılabilir. Farklı enjektörler kullanılarak bu miktar arttırılabilir.

Enjektör bölmesi: Farklı hacimdeki vialler kullanılabilir.

Carryover (Bulaşma): Numunenin enjeksiyonlar arasında bulaşmasını ifade eden bir terimdir. En aza indirmek için yıkamalar yapılabilir.

Numune kapasitesi: Oto örnekleyicinin plaka tipine göre değişir.

Kesinlik: Enjeksiyon hacimlerinin tekrarlanabilirliğini ifade eder.

Doğruluk: Kesin olarak alınan numune hacminin doğru değere yakınlığıdır.

5 – 100 °C arasında ayarlanabilmektedir.

Kromatografik sistemin kalbi olarak nitelendirilir.

Ayrım, bileşenlerin fiziksel veya kimyasal özelliklerine göre gerçekleşir.

• Partikül boyutu küçüldükçe, uygulanan basınç artar.

Kolon bölmesi

Kolon, ısıtıcı bloklar arasına yerleşir.

Analizler için doğru kolon seçimini yapmak çok önemlidir.

HPLC de kullanılan kolon tipleri

• Analitik: iç çapı (i.d.) 1.0 - 4.6 mm; uzunluğu 15 – 250 mm

• Preparatif: i.d. > 4.6 mm; uzunluk 50 – 250 mm

• Kapiler: i.d. 0.1 - 1.0 mm; boyları değişkendir

• Nano: i.d. < 0.1 mm, ya da < 100 µm

Kolon bağlantı materyalleri

• Paslanmaz çelik En çok tercih edilen bağlantı ekipmanı türüdür, yüksek basınca dayanıklıdır.

• Cam (Biomoleküller için kullanılır)

• PEEK polimer (Baınca daha az dayanıklıdır fakat kullanımı daha pratiktir.)

Kolon

Kolonlar genellikle poroz silica partikuller iledoldurulurlar

En cok kullanılan ebatlar 5 μm, 3.5 μm, ve 1.8 μm

Yüksek basınç altında dolum yapılmalıdır.

Bu yüzden bir çok kişi hazır kolon kullanır

Bir bileşiğin alıkonma zamanı partikül büyüklüğüne, yapısına ve kimyasına göre değişiklik gösterir.

Kolon dolgumateryali

Kolon partikülleri

Kolon seçimi

Çözücü Mod

Molekül ağırlığı < 2,000

Organik

Hekzan Normal faz

MeOH /MeOH:H2O veyaACN /ACN:H2O

Ters Faz (RP)HILIC ( polar bileşikler için)

THF Jel permasyon

Sulu faz

Iyonik olmayanTers FazHILIC

IyonikTers Faz

Molekül ağırlığı> 2,000

Organik Jel permasyon

Sulu faz

Jel permasyonIon-değişim kromatografiTers Faz(Daha büyük partiküllü kolon ile)

Ayrım şekilleri

Temelde 4 yöntem kullanılır

• Ters Faz

• Normal Faz

• Iyon değişim kromatografi

• Boyut eleme kromatografi

Mevcut bileşenlerin 90% ındanfazlası için kullanılabilir.

Apolar, polar, iyonlaşabilen veya iyonik bileşenler için kullanılabilir.

Kolon apolar özellik gösterirken (C18, C8, C3, phenyl) hareketli faz polar özellik gösterir.

(tampon) + su ile karışabilen organik çözücü ( metanol veyaasetonitril)

10 sulfa tipi ilacın ayrımı

Ters Faz

Normal Faz

10% kadar bileşik için tercih edilebilecek bir yöntemdir.

Aşağıdaki durumlarda kullanılabilir:

• Suya karşı hassas bileşikler

• izomerler

• Kiral analizler

Kolon polar (e.g., silika jel, cyanopropyl-bonded, amino-bonded) özellik gösterirken hareketli faz apolarolmalıdır.(hekzan, iso-oktan, methilenklorür, ethil acetate gibi).

Source: Application # 5991-0395EN

Normal-faz kromatografide,

polarlığı en az olan bileşen kolondan ilk önce çıkar;

hareketli fazın polarlığı arttıkça elüsyon zamanı azalır.

Ters-faz tekniğinde ise,

aksine, polarlığı en çok olan bileşik kolondan ilk önce çıkar

ve hareketli fazın polarlığı arttıkça elusyon zamanı artar.

Polaritesi yüksek olan bileşik kolonu önce terkeder.

DedektörKolonu terk eden bileşenleri görebilmemizi sağlar

• Ayrılan moleküllerin miktarını belirlememizi sağlar

• Dedektörden geçen maddeler bir kaydedici yardımıyla kaydedilerek, zamana karşı dedektör cevabına ait bir grafik oluştururlar buna da kromatogram denir.

En çok kullanılan dedektörler

• Spektroskopik

• Floresans

• Kırılma indisi

UV Absorbsiyonuna dayanan Spektroskopik dedektör

UV dedektör

DAD dedektör

Zaman t

Ayrım tr2-tr1

Pik genişliğiWb1,2

tr2-tr1

Mukemmel Ayrim Kabul edilebilir bir ayrim

tr2-tr1

tr1

tr2

Wb1 Wb2

W1/2

h

t

tri Alıkonma zamanı

W1/2 Yari yükseklikteki pik genişliği

Wbi Taban pik genişliği

Ayrım Gücü

Ayrım gücü, kolonun pikleri ayırma kapasitesini ifade eder.

Etkin tabaka sayısına (N), seçiciliğe (a) ve kapasite faktörüne bağlıdır (k)

• Rs değeri 1.5 ve üzeri olursa pikler birbirinden kesin olarak ayrılmıştır diyebiliriz.

Rs 14

N

a 1

a

k

1k

Ayrım gücünü hesaplamak için

SeçicilikEtkinlik Kapasite faktörü

Ayrım gücünün artması aşağıdaki koşullar ile sağlanır

• Bunlardan en önemlisi seçiciliktir. Seçicilik parametresindeki ufak bir değişimin ayrıma etkisi çok büyük olur

• Alıkonma zamanını etkisi k değeri küçük olduğunda önem taşımaktadır.

• Etkinlik ise kolonun ayrım gücünü ve yeni olduğunu ifade eder.

Etkin tabaka saysının hesaplanması (N)

Yüksek tabaka sayısı daha hızlı, simetrik ve keskin piklerin elde edileceğini gösterir.

Kolonun etkinliği

• Kolon uzunluğuna

• Kolon dolgu partiküllerinin boyutuna bağlıdır

2

2/1

54.5

W

tN r

2

16

b

r

W

tN

Tabaka ne demek?

LC Kolon uzunluğu

dp Partikül büyüklüğü

h 1 tabakanın yüksekliği

N41~Rs

p

c

dh

L41~

H

L41~R c

s

Yüksek tanaka sayısı:

• Keskin ve dar piklerin oluşmasını

• Daha iyi bir tayini

• Bileşenlerin birbirinden daha güzel ayrılmasını sağlar

Kapasite faktörü(k)

 

k =tr - t0

t0

æ

è ç

ö

ø ÷

Kapasite faktörü, maddelerin bağıl alıkonmasının bir ifadesidir.

Hesaplanması için maddelerin alıkonma zamanlarının yanı sıra ölü zamanın da (t0) belirlenmesi gerekir.

t0- kolonda tutunamayan maddenin alıkonma zamanını ifade eder.

Urasil, KBr gibi maddeler ölü zaman belirteci olarak kullanılabilir

Kapasite faktörünü:

• Sabit faz

• Hareketli faz etkiler.

Seçicilik (α)

Birbirini takip eden iki pik arasındaki ayrımın ifadesidir.

α=1 olduğunda iki pik birbirinden ayrılamaz ve birleşerek kolonu terk eder.

α yı etkileyen faktörler:

• Hareketli faz

• Sabit faz

• Sıcaklıktır

a Seçicilik

k1 ilk bileşene ait alıkonma zamanı

k2i ikinci bileşene ait alıkonma zamanı1

2

k

ka

N, α ve k nın ayrım gücüne etkisi

Kolonun ayrım gücüne etkisi

pH etkisi

26.5.2015

Organik çözücü yüzdesi azaldıkça alıkonma zamanı uzamaktadır!!!

Sıcaklığın etkisi