Download - a recombinação pericentromérica e o estágio meiótico da não

A RECOMBINAÇÃO PERICENTROMÉRICA E O ESTÁGIO MEIÓTICO

DA NÃO DISJUNÇÃO DO CROMOSSOMO 21

NA SÍNDROME DE DOWN

ANTÔNIO FRANCISCO ALVES DA SILVA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE - UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ FEVEREIRO DE 2011

iii





Tese apresentada ao Centro de Biociências

e Biotecnologia – CBB, da Universidade

Estadual do Norte Fluminense, como parte

das exigências para obtenção do título de

Mestre em Biociências e Biotecnologia.

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE - UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ FEVEREIRO DE 2011

iv





Tese apresentada ao Centro de Biociências

e Biotecnologia – CBB, da Universidade

Estadual do Norte Fluminense, como parte

das exigências para obtenção do título de

Mestre em Biociências e Biotecnologia.

Aprovada em 02 de fevereiro de 2011.

Comissão Examinadora:

___________________________________________________________________

Profa Regina Célia de Souza Campos Fernandes (Doutora em doenças infecciosas e parasitárias) – HEAA.

___________________________________________________________________

Profa Telma Nair Santana Pereira (Doutora em melhoramento de plantas) – UENF.

___________________________________________________________________

Prof. Álvaro Fabrício Lopes Rios (Doutor em genética e epigenética animal) – UENF.

___________________________________________________________________

Prof. Enrique Medina-Acosta (Doutor em parasitologia médica e molecular) – UENF.

(Orientador)

v

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Enrique Medina-Acosta, coordenador geral do Núcleo de

Diagnóstico e Investigação Molecular – NUDIM, por toda orientação ao longo

destes anos, pela amizade, convívio, e pelo exemplo raro de dedicação científica,

que permitiram assim a formação do profissional que sou hoje.

Ao M.Sc. Filipe Brum Machado, pela co-orientação, pela amizade, conselhos e

discussões, que contribuíram de maneira efetiva para a realização deste projeto.

À Profa. Dra. Regina Célia de Souza Campos Fernandes, coordenadora clínica do

NUDIM, pelo exemplo diário de dedicação ao próximo e responsabilidade no

cumprimento do dever.

Aos Professores Dr. Álvaro Fabrício Lopes Rios e Dra. Telma Nair Santana

Pereira por aceitarem prontamente o convite para a participação como membros

titulares na banca para defesa desta dissertação, e por todas as sugestões e

correções que foram essenciais para a finalização deste trabalho.

À todo o corpo docente da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro - UENF, que direta ou indiretamente participaram efetivamente da minha

formação acadêmica.

À Profa. Érika Cristina Pavarino-Bertelli, e em especial a doutoranda Joice de

Mattos Biselli, por toda gentileza e forte colaboração com o envio das amostras

controle.

À toda equipe do NUDIM: Maria Emilce da Rosa Francelino, Hazel Nunes

Barboza, Thaís Louvain de Souza, Laís Gomes Sarlo, Cínthia Bernardes

Gomes, Viviane Lamin Lovatel e Luciana Vilar Falleiro, pelo convívio,

companheirismo, e aprendizado mútuo ao longo desses anos.

Aos amigos: Fabrício Moreira Almeida, Giliane da Silva de Souza, Renan

Modesto Monteiro, Monique Camila da Silva, Thatiana Lopes Biá Ventura,

vi

David Gitirana da Rocha e Raul Ramos Furtado Dias, pela amizade, convívio,

momentos de lazer, e por todo trabalho em equipe durante as disciplinas.

Aos amigos de mais de uma década, Sara Cristina da Silva Passos e Marcos

Vasconcelos Pinto, apesar da longa distância, por toda torcida, amizade e apóio.

Em especial...

À toda minha família, minha mãe Maria Célia, meu padrasto Rogério, minhas irmãs

Adriana e Camila, minha sobrinha Camilly, e meus afilhados Pablo e Adriano, por

todo carinho, apóio, força, e paciência, mesmo nos momentos em que precisei estar

ausente, o que foi de vital importância nesta longa caminhada.

Por último...

À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF, em

particular ao Programa de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, pela

oportunidade concedida.

À CAPES, FAPERJ, NUDIM, Hospital Escola Álvaro Álvim, e Fundação Benedito

Pereira Nunes, por todo auxílio técnico e financeiro.

vii

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS ............................................................................................................................................ v

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................................ ix

LISTAS DE TABELAS ........................................................................................................................................ xi

LISTA DE GRÁFICOS ........................................................................................................................................ xii

LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................................................................. xiii

RESUMO............................................................................................................................................................ xiv

ABSTRACT......................................................................................................................................................... xv

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................................ 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................................................... 3

2.1 Aneuploidias humanas. .............................................................................................................................. 3

2.1.1 A síndrome de Down. ................................................................................................................................. 5

2.2 Aspectos moleculares e a expressão gênica na trissomia 21. ................................................................... 6

2.3 Fatores de risco para a não disjunção do cromossomo 21. ....................................................................... 9

2.4 Métodos usuais para o diagnóstico da síndrome de Down. ..................................................................... 12

2.5 Aplicação de marcadores STR na determinação das origens da não disjunção ..................................... 13

3. OBJETIVO GERAL .................................................................................................................................. 23

3.1 Objetivos específicos. ............................................................................................................................... 23

4. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................................... 24

4.1 Material biológico ...................................................................................................................................... 24

4.2 Métodos .................................................................................................................................................... 24

4.2.1 Identificação de marcadores de DNA do tipo STR no cromossomo 21. .................................................. 24

4.2.2 Predição do potencial polimórfico dos marcadores STR selecionados. .................................................. 26

4.2.3 Desenho de Iniciadores para os marcadores STR selecionados. ........................................................... 27

4.2.4 Construção de um mapa genético para os novos marcadores STR identificados. ................................. 28

4.2.5 Caracterização alélica dos novos marcadores STR identificados. .......................................................... 28

4.2.6 Determinação das origens da não disjunção e identificação dos eventos de recombinação em 21q. .... 29

4.2.7 Cálculo dos riscos relativos para a não disjunção do cromossomo 21 em MI e MII ............................... .30

4.2.8 Dados populacionais para os sistemas alélicos avaliados. ...................................................................... 30

4.2.9 Aspectos éticos. ........................................................................................................................................ 30

5. RESULTADOS ......................................................................................................................................... 31

5.1 Caracterização dos marcadores STR atualmente utilizados em análise de segregação alélica em núcleos familiares acometidos pela síndrome de Down. .................................................................................... 31

viii

5.2 Novos marcadores STR identificados na região pericentromérica do cromossomo 21. ......................... 42

5.3 Padronização do ensaio QF-PCR multiplex. ............................................................................................ 49

5.4 Validação experimental do Mpxcen21 na identificação dos eventos de recombinação. ......................... 51

5.5 Percentual de informativo do ensaio Mpxcen21 na determinação das origens da não disjunção do cromossomo 21. .................................................................................................................................................. 60

5.6 Determinação do risco relativo para a não disjunção de origem materna em MI e MII na população na coorte de estudo. ........................................................................................................................................... 62

5.7 Dados populacionais para os cinco marcadores STR incluídos no Mpxcen21. ...................................... 63

6. DISCUSSÃO ............................................................................................................................................. 67

7. CONCLUSÕES ......................................................................................................................................... 74

8. REFERÊNCIAS ........................................................................................................................................ 75

WEBSITES ............................................................................................................................................... 84

9. ANEXO ..................................................................................................................................................... 85

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Esquema representativo da aplicação de marcadores moleculares para a determinação dos

eventos meióticos de não disjunção do cromossomo 21.. ................................................................... 15

Figura 2: Esquema representativo da aplicação de marcadores moleculares na identificação de

recombinação meiótica em núcleo familiar acometido pela trissomia 21.. ........................................... 16

Figura 3: Predição do polimorfismo in silico para uma marcador STR candidato.. ............................. 26

Figura 4: Sequência do produto de amplificação in silico para um marcador STR candidato.. .......... 27

Figura 5: Informações para a interpretação de um eletroferograma.. ................................................. 29

Figura 6: Eletroferogramas comparativos do perfil de amplificação de marcadores STR dinucleotídeo

e tetranucleotídeo em amostra dissômica (cariótipo 46,XY).. .............................................................. 31

Figura 7: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S369.. ............................ 34

Figura 8: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S215.. ............................ 35

Figura 9: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S1993.. .......................... 35

Figura 10: Alinhamento das sequências de referência dos novos iniciadores para o marcador

D21S369.. .............................................................................................................................................. 37


D21S215.. .............................................................................................................................................. 38


D21S1993.. ............................................................................................................................................ 38

Figura 13: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico,

46,XY), marcador D21S369. ................................................................................................................. 39

Figura 14: Eletroferograma representativo do perfil alélico do indivíduo heterozigoto 718M2 (cariótipo

típico, 46,XX) para o marcador D21S369.. ........................................................................................... 40

Figura 15: Eletroferograma representativo do perfil alélico do indivíduo heterozigoto 356 (cariótipo

típico, 46,XY), marcador D21S215........................................................................................................ 40

Figura 16: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 707 para o marcador

D21S1993.. ............................................................................................................................................ 41

x


46,XY), marcador 21p10115899. .......................................................................................................... 45


46,XY), marcador 21p10159751. .......................................................................................................... 46


46,XY), marcador 21p9991707.. ........................................................................................................... 46

Figura 20: Alinhamento das sequências de referência do marcador 21q13539322.. ......................... 47


46,XY), marcador 21q13539322.. ......................................................................................................... 48

Figura 22: Eletroferograma representativo do primeiro ensaio da QF-PCR multiplex.. ...................... 49

Figura 23: Eletroferograma representativo do ensaio da QF-PCR multiplex otimizado.. .................... 50

Figura 24: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 03. .............................. 52



Figura 27: Localização dos marcadores STR mapeados em 21q. ...................................................... 57

xi

LISTAS DE TABELAS

Tabela 1: Dados genômicos do cromossomo 21. .................................................................................. 7

Tabela 2: Relação de marcadores STR descritos na região 21q. ........................................................ 17

Tabela 3: Relação de marcadores STR mapeados na região pericentromérica em 21q. ................... 22

Tabela 4: Caracterização dos 20 marcadores STR descritos na região pericentromérica do cromossomo 21. .................................................................................................................................... 32

Tabela 5: Frequência alélica do marcador D21S369. .......................................................................... 41

Tabela 6: Frequência alélica do marcador D21S1993. ........................................................................ 42

Tabela 7: Caracterização dos marcadores STR inéditos mapeados entre as bandas cromossômicas 21p11.2-q21.1. ...................................................................................................................................... 43

Tabela 8: Descrição dos iniciadores específicos aos cinco novos marcadores pericentroméricos selecionados em 21p. ........................................................................................................................... 45

Tabela 9: Descrição dos iniciadores específicos aos seis novos marcadores pericentroméricos selecionados em 21q. ........................................................................................................................... 48

Tabela 10: Descrição dos parâmetros para otimização do ensaio Mpxcen21. .................................... 50

Tabela 11: Descrição dos marcadores STR incluídos no Mpx21. ....................................................... 51

Tabela 12: Dados comparativos quanto às origens da não disjunção para os ensaios Mpx21 e Mpxcen21. ............................................................................................................................................. 55

Tabela 13: Mapa combinado físico e de ligação para os marcadores STR utilizados no presente estudo e por Oliver et al. (2008). ........................................................................................................... 58

Tabela 14: Perfil alélico determinado para o núcleo familiar nº 09. ..................................................... 59



Tabela 17: Risco relativo para a não disjunção em MI e MII associado à variável de exposição idade materna no momento da concepção. .................................................................................................... 62

Tabela 18: Risco relativo para a não disjunção em MI e MII associado à variável de exposição recombinação ao longo de 21q. ............................................................................................................ 63

Tabela 19: Frequências alélicas para os marcadores STR 21q14446264, 21q14507484, 21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162 (n = 220 indivíduos). .................................................... 64

Tabela 20: Dados populacionais para o Grupo A (n = 100). ................................................................ 65

Tabela 21: Dados populacionais para o Grupo B (n = 120). ................................................................ 65

Tabela 22: Dados populacionais para o Grupo C (n = 220). ................................................................ 66

xii

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Percentual de identidade entre o marcador D21S369 e sua cópia paráloga mapeada nos

cromossomos 18.. ................................................................................................................................. 36

Gráfico 2: Percentual de identidade entre o marcador D21S215 e sua cópia paráloga mapeada no

cromossomos 18.. ................................................................................................................................. 36

Gráfico 3: Percentual de identidade entre o marcador D21S1993 e sua cópia paráloga mapeada no

cromossomos 12.. ................................................................................................................................. 37

Gráfico 4: Percentual informativo dos marcadores STR incluídos no Mpxcen21 na determinação do

estágio meiótico da não disjunção. ....................................................................................................... 61

Gráfico 5: Percentual de informativo dos marcadores STR incluídos no Mpxcen21 na determinação

da origem parental da não disjunção. ................................................................................................... 61

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

APP – Amyloid Precursor Protein; Proteína precursora amilóide.

BLAST – Basic Local Alignment Search Tool.

DSCAM – Down Syndrome Cell Adhesion Molecule; Molécula de adesão celular.

DSCR – Down Syndrome Critical Region; Região Crítica para Síndrome de Down.

ECLAMC – Estudo colaborativo latino-americano de malformações.

FAMERP – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto.

FISH – Fluorescent in situ hybridization; Hibridação in situ por fluorescência.

FMC – Faculdade de Medicina de Campos.

H – Heterozigose.

MI – Meiose I.

MII – Meiose II.

Mb – Megabase.

NCBI – National Center for Biotechnology Information; Centro Nacional de

Informações Biotecnológicas.

NUDIM – Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular.

Pb – Par de base.

PCR – Polymerase Chain Reaction; Reação em cadeia da polimerase.

PD – Poder de discriminação.

PE – Poder de exclusão.

PIC – Conteúdo de informação de polimorfismo.

QF-PCR – Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction; Reação

Quantitativa por Fluorescência em Cadeia da Polimerase.

RR – Risco relativo.

SD – Síndrome de Down.

SOD-1 – Superóxido Dismutase-1.

STR – Short Tandem Repeats.

UENF – Universidade Estadual do Norte Fluminense.

UCSC – University of California Santa Cruz; Universidade da Califórnia Santa Cruz.

UPGEM – Unidade de Pesquisa em Genética e Biologia Molecular.

xiv

RESUMO A Trissomia 21 (síndrome de Down) é uma anomalia genética causada pela não

disjunção do cromossomo 21. Aproximadamente 95% dos eventos de não disjunção

ocorrem durante a meiose. O pareamento e a recombinação meiótica asseguram a

correta segregação dos homólogos e cromátides-irmãs durante a gametogênese.

Alterações nesses eventos são fatores de risco para a não disjunção;

particularmente, ausência de troca ou troca única telomérica, com desfecho em

meiose I (MI); e troca única pericentromérica, com desfecho em meiose II (MII). O

estágio meiótico da não disjunção e os padrões de recombinação podem ser

determinados por análise de segregação de marcadores polimórficos de DNA do tipo

STR (Short Tandem Repeats). Poucos marcadores STR têm sido descritos na região

pericentromérica e os três mais amplamente utilizados (D21S369, D21S215 e

D21S1993) não são únicos, tendo cópias parálogas nos cromossomos 18 e 12.

Visando contribuir para uma análise mais acurada do estágio meiótico e dos eventos

de recombinação na região pericentromérica, e assim investigar a possível

correlação desses eventos com os erros de não disjunção, neste trabalho

descrevemos cinco novos marcadores STR únicos (4 tetranucleotídeo e 1

pentanucleotídeo), identificados na região pericentromérica 21q21.1 por análise

computacional genômica comparada. Os novos marcadores exibiram taxas de

heterozigose entre 0,56-0,82 (n = 220 indivíduos), o que permitiu a correta

elucidação das origens da não disjunção e dos padrões de recombinação

pericentromérica em uma coorte de 60 núcleos familiares. Em 59 casos (98,33%) o

erro meiótico foi de origem materna; 43 (72,88%) ocorridos em MI, e 16 (27,12%) em

MII. Para identificação dos eventos de recombinação foram também genotipados 5

marcadores STR não pericentroméricos. A ausência de recombinação foi fator de

risco para não disjunção em MI (RR= 1,96 IC 95% 1,22-3,14; p=0,0005).

Recombinação (pericentromérica ou não pericentromérica) foi fator de risco para a

não disjunção em MII (RR= 4,31 IC 95%: 2,68-6,94, p=0,0172; RR= 3,25 IC 95%:

1,38-7,65; p=0,0114, respectivamente). Esses resultados indicam que ausência de

recombinação exerce um efeito protetor (RR=0,20; IC 95% 0,07-0,54; p=0,0005)

para a não disjunção em MII, enquanto que recombinação não pericentromérica um

efeito protetor para não disjunção em MI (RR=0,59; IC 95%: 0,37-0,93; p=0,0114).

Palavras-chave: Síndrome de Down, recombinação pericentromérica, não

disjunção, risco relativo.

xv

ABSTRACT Trisomy 21 (Down syndrome) is a genetic disorder caused by non-disjunction of

chromosome 21. Approximately 95% of non-disjunction events occur during

meiosis. The chromosome pairing and meiotic recombination ensure proper

segregation of homologues and sister chromatids during gametogenesis. Alterations

in these events are risk factors for non-disjunction, particularly, absence of exchange

or single telomeric exchange, with an endpoint in meiosis I (MI), and single

pericentromeric exchange with an endpoint in meiosis II (MII). The stage of meiotic

non-disjunction and recombination patterns can be determined by segregation

analysis of STR (Short Tandem Repeats) DNA polymorphic markers. Few STR

markers have been described in the pericentromeric region, and the three more

widely used (D21S369, D21S215 and D21S1993) are not unique, with paralogous

copies in chromosomes 18 and 12. Aiming at contributing to a more accurate

analysis of the stage and meiotic recombination events in the pericentromeric region,

and thus to investigate a possible correlation between those events and the errors of

non-disjunction, in this work we describe five new unique STR markers (4

tetranucleotide and one pentanucleotide) identified in the pericentromeric 21q21.1

region by comparative genomics computational analysis. The new markers exhibited

rates of heterozygosity ranging 0.56 to 0.82 (n = 220 individuals), which allowed a

correct elucidation of the origins of non-disjunction and patterns of pericentromeric

recombination in a cohort of 60 nuclear families. In 59 cases (98.33%) the meiotic

error was of maternal origin; 43 (72.88%) occurred in MI, and 16 (27.12%) in MII. To

identify recombination events five non-pericentromeric STR markers were also

genotyped. Absence of recombination was a risk factor for non-disjunction in MI (RR

= 1.96 95% CI 1.22 to 3.14, p = 0.0005). Recombination (pericentromeric or not

pericentromeric) was a risk factor for non-disjunction in MII (RR = 4.31 95% CI 2.68

to 6.94, p = 0.0172; RR = 3.25 95% CI 1.38 to 7.65, p = 0.0114, respectively). These

results indicate that absence of recombination exerts a protective effect (RR = 0.20,

95% CI 0.07-0.54, p = 0.0005) for non-disjunction in MII, whereas non

pericentromeric recombination a protective effect for non-disjunction in MI (RR =

0.59, 95% CI: 0.37 to 0.93, p = 0.0114).

Keywords: Down Syndrome, pericentromeric recombination, non-disjunction, relative

risk.

1

INTRODUÇÃO

A síndrome de Down (SD), também conhecida como trissomia 21, é a

aneuploidia autossômica mais frequentemente observada, afetando em média 1/660

neonatos (Wiseman et al., 2009). Somente na Índia, nascem por hora pelo menos

três crianças acometidas por essa anomalia cromossômica (Malini e Ramachandra,

2006).

A elevada frequência da trissomia 21 torna-se ainda mais expressiva,

considerando que indivíduos nascidos vivos acometidos representam uma

proporção relativamente pequena, todavia mais de 80% dos conceptos aneuploides

são abortados ainda no primeiro trimestre de gestação (Hassold e Sherman, 2000).

A não disjunção raramente ocorre após a fertilização (4% dos casos), porém

preferencialmente nos processos meióticos durante a gametogênese. Estima-se que

88% dos eventos de não disjunção são de origem materna; 75% destes

correspondem a erros na meiose I (MI). Erros de segregação cromossômica de

origem paterna correspondem a 8%, sem nenhuma diferença significativa entre

meiose I e II (Hassold e Hunt, 2001; Antonarakis et al., 2004).

Atualmente dois fatores de risco para não disjunção de origem materna são

amplamente referenciados: (i) idade materna avançada (>34 anos) no momento da

concepção (Lamb et al., 2005; Alves Da Silva et al., 2008); e (ii) padrões alterados

de recombinação, caracterizados por ausência de recombinação, ou trocas

genéticas sob um mecanismo de formação de quiasmas com configurações

susceptíveis a erros de segregação, os quais foram primeiramente preditos por

ocorrerem sem qualquer relação direta com a idade materna (Lamb et al., 1996;

Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman, 2000; Sherman et al., 2006).

Apesar da elevada ocorrência da SD, ainda pouco se conhece sobre as

causas genéticas e ambientais que estão associadas com os eventos de não

disjunção. Nas últimas décadas um grande avanço foi obtido a partir da análise de

segregação de marcadores STR em núcleos familiares com progênie acometida

(Lamb et al., 1996; Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman, 2000; Lamb et al., 2005;

Sherman et al., 2006; Ghosh et al., 2009).

2

Uma das estratégias para melhor compreensão deste fenômeno foi à tentativa

de uma associação entre diferentes variáveis epidemiológicas, como padrões

alterados de recombinação (Sherman et al., 2006), idade parental (Sherman et al.,

2007), e polimorfismos genéticos associados ao metabolismo anormal do folato e

hipometilação do DNA (Biselli et al., 2009) com as origens parental e meiótica da

não disjunção, as quais ocorrem em proporções variadas entre as diferentes

trissomias (Hassold e Hunt, 2001).

Quanto ao fator de risco idade materna avançada os estudos mais amplos em

termos populacionais são dos relatórios anuais online do Registro Citogenético

Nacional de Síndrome de Down da Inglaterra (http://www.wolfson.qmul.ac.uk/ndscr/).

Esses estudos ao longo dos anos confirmam que a idade materna >34 anos no

momento da concepção é fator de risco para não disjunção.

Quanto aos possíveis padrões alterados de recombinação, ausência de troca

ou evento único de recombinação na região telomérica são considerados fatores de

risco para não disjunção em MI, em contraste, evento único na região

pericentromérica é considerado fator de risco para não disjunção em meiose II (MII).

Contudo a presença de eventos duplos de recombinação em regiões proximais e

medianas parece de certa forma estabilizar a tétrade susceptível (Lamb et al., 1996;

Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman, 2000; Oliver et al., 2008; Ghosh et al., 2009).

Para o estudo dos eventos de recombinação são utilizados, por motivos

históricos, predominantemente um conjunto de 21 marcadores STR distribuídos em

6 intervalos de igual extensão física em 21q; porém, 85,7% desses STR são

repetições de di- e trinucleotídeos. A tipagem destes STR apresenta limitações

técnicas importantes: (i) a amplificação de subprodutos denominados stutters, que

são múltiplos dos alelos verdadeiros que dificultam a designação alélica; e (ii)

amplificação preferencial do alelo menor, com impacto importante no diagnóstico

molecular, levando a resultados falsos positivos e negativos (Alves Da Silva et al.,

2009).

Ademais a distribuição equivocada desses STR entre os 6 intervalos em 21q,

baseada na posição física de cada marcador, e a utilização de marcadores

pericentroméricos (D21S369, D21S215 e D21S1993) não únicos, com sequências

parálogas mapeadas nos cromossomos 21, 18 e 12, podem gerar resultados de

http://www.wolfson.qmul.ac.uk/ndscr/

3

difícil interpretação, e a designação inconsistente de certos padrões de

recombinação na região pericentromérica do cromossomos 21, particularmente

aqueles descritos como fatores de risco para a não disjunção cromossômica (Alves

Da Silva, 2010).

Visando contribuir para a resolução desta problemática, no presente estudo,

através de análise genômica computacional comparada, foi identificado na região

pericentromérica 21p11.2-q21.1 um novo painel de marcadores STR, para o rastreio

da trissomia 21, a elucidação do estágio meiótico da não disjunção, e a identificação

de possíveis padrões de recombinação associados com os eventos de não

disjunção do cromossomo 21 na SD.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Aneuploidias humanas.

As aneuploidias humanas são anomalias genéticas, associadas à alteração

no número dos cromossomos, as quais conduzem ao estado de trissomia ou

monossomia. Estas alterações numéricas podem ser originadas por dois eventos

distintos: por erros mitóticos, que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário,

ou mais frequentemente como consequência de erros meióticos durante a formação

dos gametas (Hassold e Hunt, 2001).

Este fenômeno tipicamente resulta em incompatibilidade para a vida, e,

portanto espera-se que a não disjunção meiótica seja um evento de rara ocorrência.

Em organismos modelos, tal como Drosophila melanogaster, a probabilidade desse

evento ocorrer é relativamente baixa, em torno de 1:6000 a cada processo meiótico.

Não obstante, em modelos murinos a taxa de aneuploidia não ultrapassa 2% na

ovogênese (Hassold e Hunt, 2001).

Os processos meióticos são extraordinariamente conservados entre os

diferentes organismos. Contudo, em humanos, as divisões meióticas são

extremamente susceptíveis a erros de segregação cromossômica, tanto que a

elevada incidência dos eventos de não disjunção observada desvia-se grandemente

do que tem sido descrito para outros organismos (Hassold e Hunt, 2001).

4

Embora a base nos processos meióticos seja a mesma, a gametogênese

entre homens e mulheres apresenta diferenças intrínsecas, como: o tempo de início,

duração e número na formação de gametas viáveis (Hunt, 2006).

Em mulheres, as divisões meióticas iniciam-se durante o desenvolvimento

fetal, por volta da nona semana de gestação. Os ovócitos imaturos progridem de

maneira semi-sincronizada entre os diferentes subestágios da prófase durante a MI,

perdurando até poucas semanas após o nascimento (Bendsen et al., 2006).

No paquíteno (subestágio da prófase caracterizado pela sinapse e

recombinação entre os cromossomos homólogos), os ovócitos imaturos entram em

um estado de meiose suspensa. A primeira divisão meiótica completa-se em

mulheres sexualmente maturas, antecedendo o período da ovulação, assim sendo a

finalização da MI pode levar cerca de 10 a 50 anos. Adicionalmente, a segunda

divisão meiótica caracteriza o processo de ovulação,e completa-se apenas após a

fertilização (Hunt, 2006).

O prolongado período de suspensão da MI conduz ao acúmulo de efeitos

tóxicos que conduzem a erros de segregação tanto em MI quanto em MII, estes

incluem: (i) insultos ambientais; (ii) degradação de proteínas importantes para o

aparato meiótico; e (iii) funcionamento subótimo dos ovários por desbalanço

hormonal (Sherman et al., 2007).

Diferentemente da ovogênese, a espermatogênese inicia-se na puberdade,

progredindo de maneira contínua, sem atrasos entre a MI e MII, assim,

espermatócitos maturos são produzidos continuamente durante a fase adulta (Hunt,

2006).

Em ambos os sexos, erros podem ocorrer na gametogênese, contudo com

uma maior prevalência na ovogênese (20%) quando comparado a espermatogênese

(2%) (Hassold e Hunt, 2001).

Estima-se que 20-30% dos ovócitos humanos fertilizados sejam aneuplóides.

As implicações clínicas desse fenômeno são bastante notórias, visto que

correspondem a cerca de 1/3 dos abortos espontâneos (Hassold e Hunt, 2001;

Nagaishi et al., 2004; Hunt, 2006).

5

As causas mais comuns de morte fetal decorrentes destas alterações

cromossômicas são: a monossomia do alossomo X e as trissomias dos autossomos

16, 21 e 22, que juntas constituem 50% das alterações numéricas identificadas em

todos os abortamentos (Hassold e Hunt, 2001).

No entanto, algumas aneuploidias podem ser compatíveis com a

sobrevivência fetal, sendo responsáveis por diferentes síndromes, das quais se

destacam: Turner (45,X), Klinefelter (47,XXY), Patau (47,+13), Edwards (47,+18) e

Down (47,+21) (Adinolfi e Sherlock, 2001).

2.1.1 A síndrome de Down.

O primeiro relato da SD ocorreu ainda no século XIX no ano de 1866, através

de uma descrição detalhada dos aspectos clínicos observados em pacientes

pediátricos com semelhantes graus de dismorfismo facial e retardo mental, pelo

médico britânico John Langdon Haydon Down. Contudo, a verdadeira causa

genética só foi encontrada no século XX no ano de 1959 pelo médico francês

Jérôme Lejeune. Lejeune e colaboradores observaram que pacientes com

característica faciais semelhantes às descritas por John Down, apresentavam uma

cariótipo atípico (47,+21) composto por uma cópia extra do cromossomo 21 (OMIM

#190685).

A trissomia 21, classifica-se como a alteração numérica de maior ocorrência

no ranking das aneuploidias humanas, com uma incidência de 1 em cada 660

recém-nascidos vivos (Wiseman et al., 2009).

Entre os nascidos vivos, a apresentação clínica é complexa; algumas

características ocorrem em graus diferenciados de um indivíduo para outro, incluindo

o retardo mental e o dismorfismo facial característico. Em geral, entre os achados

clínicos reconhecíveis estão: braquicefalia, face achatada, olhos com fendas

palpebrais oblíquas e voltadas para cima, lobo auricular anormal, com implantação

baixa das orelhas, pescoço curto, boca significativamente pequena, língua protrusa,

e mãos com dedos relativamente curtos, baixa estatura e hipotonia muscular (Roper

e Reeves, 2006; Lyle et al., 2009).

A trissomia 21 está associada a inúmeras doenças; ela está entre as

principais causas de leucemia na infância. Os indivíduos trissômicos apresentam um

risco aumentado em 20 e 600 vezes de desenvolver leucemia linfoblástica aguda e

6

leucemia megacariocítica aguda, respectivamente (Fong e Brodeur, 1987; Izraeli et

al., 2007; Xavier et al., 2010). Adicionalmente, as doenças congênitas do coração

são bastante prevalentes, com uma ocorrência de 40 a 50% (Baptista et al., 2000;

Mcelhinney, 2002; Weijerman et al., 2010).

2.2 Aspectos moleculares e a expressão gênica na trissomia 21.

A trissomia 21 pode ser classificada de acordo com o tamanho do segmento

cromossômico triplicado em três categorias: trissomia livre, trissomia parcial e

microtrissomia (Dutta et al., 2005).

A trissomia livre, também conhecida como trissomia completa, é caracterizada

pela ocorrência de uma cópia inteira do cromossomo 21, como resultado de erros

meióticos ou mitóticos. A trissomia parcial consiste de um segmento triplicado acima

de 5 Mb, resultante de segregação meiótica anormal em indivíduos com rearranjo

cromossômico balanceado, sendo assim menos comum do que a trissomia livre. A

microtrissomia consiste da ocorrência de pequenas duplicações (entre 3-5 Mb),

originada por recombinação desigual durante a meiose, mediado por duplicações

intercromossômicas (Dutta et al., 2005).

O cromossomo 21 é um cromossomo acrocêntrico, e o menor entre os

autossomos, representando assim cerca de 1-1.5% do genoma humano. Desde a

descoberta da associação do estágio de trissomia deste cromossomo com a SD,

aproximadamente 20 locos foram inicialmente traçados como candidatos a uma

variedade de doenças de fundo genético, o que levou a intensivos estudos

envolvendo tanto a análise da estruturação cromossômica quanto o conteúdo

gênico. Consequentemente, o primeiro mapa de ligação, a ser descrito de maneira

ampla foi para o cromossomo 21 (Mclnnis et al., 1993). Dados de sequenciamento

indicam que este cromossomo possui 278 genes codificadores de proteínas

conhecidas (Tabela 1).

7

Tabela 1: Dados genômicos do cromossomo 21.

Dados de anotações do cromossomo 21 Comprimento (pb) 48129895

Genes codificadores de proteínas conhecidas 278

Genes codificadores de novas proteínas 2

Pseudogenes 141

Genes de rRNA 5

Genes de snRNA 13

Genes de miRNA 16

Genes de snoRNA 14

Genes de Misc RNA 8

(*) Fonte: http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Location/Chromosome?r=21:1-48129895

Diversos estudos sugerem um aumento na expressão de muitos genes no

estado de trissomia 21. O desequilíbrio na expressão gênica pode resultar em

muitos fenótipos que caracterizam a SD. Contudo somente alguns genes são vistos

como sensíveis a dose, tal que o fenótipo provocado por estes genes é alterado pelo

numero de cópias (Yahya-Graison et al., 2007; Wiseman et al., 2009).

Um estudo envolvendo a análise de expressão gênica em linfoblástos em

pacientes SD e indivíduos com cariótipo típico, foi observado que no estágio de

trissomia, 71% dos genes ativos, são expressos sob um mecanismo de

compensação de dose. Apenas 29% dos genes ativos nesse tipo celular apresentam

um aumento na expressão no estágio de trissomia. Sendo que 22% apresentaram

um taxa de expressão dentro do esperado, na proporção 1,5:1,0 entre indivíduos

trissômicos e controle, enquanto em 7% foi observado uma amplificação da

expressão, em uma proporção superior a 1,5 (Yahya-Graison et al., 2007).

A maior parte dos genes superexpressos está contida entre as regiões 21q21

e 21q22, denominada Região Crítica para a síndrome de Down (Down Syndrome

Critical Region, DSCR) (Dutta et al., 2005).

O conceito de região crítica, que sugere que a maioria dos fenótipos são

sensíveis à dosagem gênica, tem dominado o campo das pesquisas em SD na

última década (Korenberg et al., 1990; Korenberg et al., 1994). A descrição mais

precisa da região crítica é de aproximadamente 6,7 megabases desde o limite

proximal entre os marcadores D21S17 (região 21q22.12; posição física 35.892.325-

35.892.536 pb) e D21S55 (região 21q22.13; posição física 38.012.252-38.012.412

8

pb) até um limite distal na região 21q22.3 entre os genes MX1 (homólogo do gene

em camundongos para resistência a Myxovirus; posição física 41.720.024-

41.753.008 pb) e TFF1 (trefoil factor 1, 42.655.460-42.659.713 pb) (Lyle et al.,

2009).

Contudo, um estudo em camundongos transgênicos para a região DSCR de

humanos relatou que essa região inesperadamente não causa fenótipos específicos

de dismorfismo craniofacial na versão murina (Olson et al., 2004).

Outro estudo, fundamentado no acompanhamento de pacientes com trissomia

21 e monossomia 21 parciais, demonstrou que 82% dos acometidos apresentavam

um retardo mental moderado. O segmento triplicado nesses pacientes permitiu o

mapeamento de uma região mínima para esta característica, no segmento que se

estende de 37-38 Mb, o qual esta incluso na DSCR, porém outro grupo de

acometidos onde o retardo mental também foi evidenciado o segmento triplicado

estava localizado em 26 Mb, o que contraria o conceito da existência de uma única

região crítica para SD, segundo os autores o que existe são regiões de

susceptibilidade fenotípica (Lyle et al., 2009).

Na trissomia 21 os principais genes localizados na região DSCR encontrados

de forma superexpressa são:

(i) o gene que codifica a enzima superóxido dismutase-1 (SOD-1), presente

na banda 21q22, que gera um quadro de agressão endógena constante, dada à

aceleração da reação de formação de peróxido de hidrogênio (H2O2), com a

consequente oxidação dos grupos sulfídricos e a peroxidação dos lipídios

insaturados causando assim dano celular (Dutta et al., 2005);

(ii) o gene que codifica uma molécula de adesão celular (DSCAM), localizado

entre as bandas cromossômicas 21q22.2 e 21q22.3, expresso no coração durante o

desenvolvimento cardíaco, e portanto associado às doenças congênitas do coração

(Dutta et al., 2005);

(iii) o gene que codifica a proteína precursora amilóide (APP), localizado entre

as bandas 21q11.2-21.05, é expresso no cérebro do embrião, resultando em placas

amilóides, as quais estão associadas com o retardo mental. A produção destas

placas amilóides além de contribuir para anormalidades no aprendizado conduzem a

9

uma redução na capacidade de memorização, assim, a super expressão do gene

APP constitui um fator de risco para a manifestação precoce dos sintomas da

doença de Alzheimer nos indivíduos acometidos pela SD (Dutta et al., 2005;

Wiseman et al., 2009).

(iv) o gene DYRK1A, o qual codifica uma proteína quinase (dual-specificity

proline-directed serine/threonine kinase) é super expressa no cérebro no estágio de

trissomia, sendo descrito como um dos genes correlacionados com o distúrbio

cognitivo entre os pacientes SD (Dowjat et al., 2007).

2.3 Fatores de risco para a não disjunção do cromossomo 21.

Atualmente, dois fatores de risco são amplamente aceitos para a não

disjunção do cromossomo 21: (i) idade materna avançada no momento da

concepção (>34 anos) (Morris et al., 2002) e (ii) padrões alterados de recombinação

(Sherman et al., 2006; Sherman et al., 2007; Allen et al., 2009)

Quanto ao fator de risco “idade materna avançada”, os estudos mais amplos

em termos populacionais são dos relatórios anuais online do Registro Citogenético

Nacional de Síndrome de Down da Inglaterra (http://www.wolfson.qmul.ac.uk/ndscr/).

Esses estudos ao longo dos anos confirmam que a idade materna >34 anos

no momento da concepção é fator de risco para não disjunção. O efeito idade

materna avançada está restrito aos casos de origem materna. Os casos de origem

paterna ou de origem mitótica (pós-zigótica) são independentes da idade parental

(Lamb et al., 2005).

Na Inglaterra, a frequência de acometidos pela trissomia 21 nascidos de

mulheres < 25 anos de idade é de aproximadamente 2%; aos 36 anos de idade sobe

para 10%, alcançando 33% aos 42 anos de idade (Alberman, 2002; Morris et al.,

2002).

Segundo o Estudo Colaborativo Latino-Americano de Malformações

(ECLAMC), 40% dos acometidos nascem de mulheres com idades entre 40 e 44

anos, embora mulheres nesta faixa etária sejam responsáveis por apenas 2% do

total de nascimentos (Castilla et al., 1998; Castilla e Orioli, 2004).

10

Quanto ao fator de risco “padrões alterados de recombinação”, são apontados

“ausência de recombinação ou evento único de recombinação na região telomérica”

como fator de risco para a não disjunção em MI. Para os erros em MII, uma alta

frequência de recombinação, restrita a região pericentromérica tem sido sugerida

como fator de risco para não disjunção neste estágio meiótico (Lamb et al., 1996;

Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman, 2000; Craig e Choo, 2005; Lamb et al., 2005;

Sherman et al., 2006; Oliver et al., 2008; Ghosh et al., 2009).

Contudo, eventos duplos de recombinação, com trocas simultâneas nas

regiões proximais e medianas foram descritos por serem capazes de estabilizar a

tétrade susceptível a não disjunção (Hassold e Sherman, 2000).

Lamb et al. (1996) descreveram um modelo idade-relacionado de dois pontos,

para a elevada frequência de não disjunção de origem materna em MI. O primeiro

ponto, envolve, no ovário fetal, a formação de um bivalente susceptível a não

disjunção (com ausência de troca ou troca única na região telomérica),o qual seria

um processo idade materna-independente. O segundo ponto, envolve, no ovário

adulto, um processamento anormal de um bivalente com configuração susceptível a

erros de não disjunção em metáfase I, e este evento seria idade-dependente,

causado pelo somatório do evento de degeneração das células ovarianas na fase

adulta, causado pelo deficit de oxigênio e aumento da concentração de gás

carbônico, e redução do pH intracelular do ovócitos.

A degeneração ovariana conduz a perda de proteínas de constituição do

aparato meiótico, como as proteínas formadoras de quiasmas e as proteínas

coesinas, as quais executam um papel fundamental para segregação normal dos

cromossomos (Brown et al., 2000).

Durante a MI, a segregação preferencial e bem sucedida dos cromossomos

homólogos sobre as cromátides-irmãs, requer um comportamento singular dos

cromossomos, que engloba: (1) a manutenção de conexões físicas entre os

homólogos na anáfase I, papel realizado pelos sítios de recombinação ou quiasmas

(Smith e Nicolas, 1998), e (2) presença de uma constrição física nos centrômeros

das cromátides-irmãs, mantendo-as anexadas uma a outra de maneira que possam

migrar para um mesmo pólo em MI (Uhlmann, 2003).

11

Neste estágio meiótico, as coesinas localizadas distalmente aos quiasmas

garantem a união dos cromossomos homólogos e provê a resistência à força

necessária exercida no alinhamento correto dos bivalentes. Até que isto ocorra, o

ponto de checagem de montagem do fuso meiótico, SAC do inglês spindle assembly

checkpoint, mantém as células em metáfase I. Uma vez que todos os bivalentes

estão corretamente alinhados, o SAC é silenciado e permite a clivagem de

complexos de coesinas localizadas ao longo dos braços dos cromossomos. A perda

desta população de coesinas permite a movimentação dos cromossomos homólogos

para pólos opostos em anáfase I. A retenção simultânea de coesinas ao redor de

centrômeros impede que as cromátides-irmãs separarem-se prematuramente,

mantendo-as unidas até o estágio de anáfase II (Craig e Choo, 2005).

Recentemente, o mosaisismo gonadal foi apontado como um importante fator

de risco para a não disjunção do cromossomo 21 (Hultén et al., 2008; Hultén et al.,

2010a; Hultén et al., 2010b). Estes autores, analisaram 12,000 células testiculares

fetais de 4 fetos masculinos (Hultén et al., 2010b), e 12,634 ovócitos de oito fetos

femininos aparentemente normais com idade gestacional entre 14-22 semanas

(Hultén et al., 2008). Embora nenhuma evidência de mosaicismo gonadal tenha sido

detectado através da análise das células germinativas primitivas masculinas

(espermatogônia), entre as células constituintes da reserva ovariana dos fetos

femininos (ovogônia), foi observado um percentual significativo de células

trissômicas para o cromossomo 21, entre 0,20-0,88%.

Em outras palavras estes dados sugerem que este tipo de mosaicismo

ovariano seja uma característica constitucional de nossa espécie, e portanto uma

das causas principais para ocorrência de concepções com trissomia 21 de origem

materna.

Este fenômeno desvia-se do dogma amplamente aceito, em que a não

disjunção primária ocorre em MI e envolve a não segregação de dois cromossomos

homólogos. Porém, segundo esses autores na realidade em MI ocorre

obrigatoriamente uma não disjunção secundária de três cromossomos 21 pré-

existentes, gerados por erros de não disjunção mitótica durante a replicação das

células germinativas primitivas femininas (ovogônias) no período embrionário,

processo que antecede as divisões meióticas que caracterizam a gametogênese

(Hultén et al., 2010a).

12

2.4 Métodos usuais para o diagnóstico da síndrome de Down.

A confirmação diagnóstica da suspeita da SD pode ser feita pelo exame de

cariotipagem por banda G, o teste laboratorial diagnóstico padrão ouro, que consiste

na visualização citogenética da cópia extra do cromossomo 21 através da coloração

por Giemsa (Shaw et al., 2008), uma vez corados, os cromossomos passam a

apresentar padrões de bandas distintos, de acordo com os níveis de condensação

do DNA. Os cromossomos corados são visualizados como uma série contínua de

bandas claras e escuras, assim, cada cromossomo, de acordo com a sua

morfologia, pode ser identificado e consequentemente quantificado.

Em países desenvolvidos, o diagnóstico pré-natal ou pós-natal é sempre

confirmado pelo teste citogenético clássico (Alberman, 2002). Enquanto, nos países

em desenvolvimento, a grande maioria dos casos é diagnosticada tardiamente, após

o parto por causas diversas, particularmente, a falta de acesso aos exames

específicos.

Na última década, visando à redução no tempo de espera para obtenção dos

resultados nos casos de suspeita clínica, que em citogenética clássica pode levar de

7-14 dias, técnicas em biologia molecular foram introduzidas para auxiliar no

diagnóstico definitivo da SD. Por exemplo: (i) a técnica de hibridação fluorescente in

situ (FISH), a qual utiliza sondas de DNA marcadas com fluorocromos, específicas a

determinadas regiões do cromossomo 21. Após hibridação das sondas, quando o

núcleo celular normal é analisado por microscopia de fluorescência, dois sinais, um

para cada cromossomo são visualizados, enquanto para as células trissômicas são

observados três sinais; e (ii) a dosagem de marcadores polimórficos de DNA do tipo

STR (Short Tandem Repeats), através da utilização da técnica de reação em cadeia

da polimerase convencional (Polimerase Chain Reaction – PCR) ou quantitativa por

fluorescência (Quantitative Fluorescence Polimerase Chain Reaction – QF-PCR),

que permite uma confirmação diagnóstica precisa e rápida da trissomia 21 (Adinolfi e

Sherlock, 2001; Nicolini et al., 2004; Ogilvie et al., 2005).

Em vários países desenvolvidos a confirmação diagnóstica por QF-PCR é

também ofertada no pré-natal (Ogilvie et al., 2005). Diferentemente da citogenética

clássica, a tipagem de marcadores STR altamente polimórficos (isto é, informativos)

em núcleos familiares (mãe, pai e acometido) permite além do diagnóstico,

determinar com precisão a origem parental e meiótica da não disjunção

13

cromossômica, e evidenciar eventos de recombinação (Hassold e Sherman, 2000;

Machatkova et al., 2005).

2.5 Aplicação de marcadores STR na determinação das origens da não disjunção e identificação dos eventos de recombinação ao longo de cromossomos 21 não disjuntos.

Os marcadores STR são sequências curtas de DNA repetidas em série

altamente polimórficas, formados por unidades de repetição constituídas por mono-

,di-, tri-, tetra-, penta- ou hexanucleotídeos. Tais marcadores de DNA não variam

somente no número ou extensão de suas unidades de repetição, mas também no

padrão de organização e distribuição destas unidades, assim, são divididos em três

categorias: marcadores STR simples (formados por unidades de repetição

idênticas); marcadores STR compostos (formados por dois tipos de unidades de

repetição); e marcadores STR complexos (formadas por diversos blocos, com

comprimento variado entre as unidades de repetição, e variação nas sequências

consenso) (Butler, 2005).

Estima-se que os marcadores STR estejam presentes em todos os

organismos eucariotos, porém ausentes na maioria dos procariotos. Os diversos

marcadores STR variam em extensão devido a inserções ou deleções (indels) de

uma ou mais unidades de repetição, que são causadas por um fenômeno molecular

conhecido como polimerase slippage. Este fenômeno é responsável por elevadas

taxas de mutação (~0,1% por loco) que conduzem à elevados graus de

polimorfismos entre este tipo de marcadores (Leclercq et al., 2007).

Este polimorfismo deriva principalmente da variabilidade em extensão destas

unidades repetição do que de sua sequência consenso primária. Não obstante

marcadores STR apresentam elevada taxa de heterozigose e presença de alelos

múltiplos. Esta característica faz desses marcadores, sequências altamente

informativas, e por isso, esses tipos de marcadores são a primeira escolha para

diversos estudos, como: mapeamento gênico, investigação de parentesco,

desequilíbrio de ligação, e diagnóstico direto e indireto de anomalias genéticas

(Ellegren, 2004).

Na SD as origens parental e meiótica de cromossomos não disjuntos podem

ser determinadas por meio da tipagem de marcadores STR, seguido do

subsequente confronto entre os genótipos observados para cada indivíduo

14

pertencente a um determinado núcleo familiar (Hassold e Hunt, 2001; Alves Da

Silva, 2007).

Para facilitar uma melhor compreensão das análises dos perfis alélicos

apresentados pelos marcadores STR, requeridos para a elucidação das origens da

não disjunção e dos eventos de recombinação, é consenso observar o raciocínio

metodológico revisado por Thomas e Hassold (2003):

(i) Se para um determinado marcador o acometido apresentar três alelos

diferentes “abc”, enquanto que o progenitor A os alelos “ab” e o progenitor B os

alelos “cd”, conclui-se que a cópia extra do cromossomo 21 foi herdada do

progenitor A, visto que o acometido apresenta ambos os alelos observados em seu

perfil, que neste caso estão ausentes no progenitor B;

(ii) Se para um determinado marcador o acometido apresentar dois alelos

diferentes “ac" em proporções quantitativas 2:1, enquanto que o progenitor A os

alelos “ab” e o progenitor B os alelos “cd” conclui-se que a cópia extra do

cromossomo 21 foi herdada do progenitor A, visto que o acometido apresenta duas

cópias do alelo “a”, que neste caso estão ausentes no progenitor B. Segue-se que

permutações deste cenário aplicam o mesmo raciocínio;

(iii) Caso os progenitores apresentem para um determinado marcador um alelo

em comum (progenitor A – “ab” e progenitor B – “ad"), o sistema alélico não é

informativo para a determinação da origem parental no acometido “aad”. Portanto,

outros sistemas alélicos devem ser analisados;

(iv) O estágio meiótico da não disjunção é convencionalmente designado usando

marcadores pericentroméricos, determinando se a heterozigose observada no

progenitor de origem é mantida (não disjunção dos cromossomos homólogos) ou

reduzida a homozigose (não disjunção das cromátides irmãs). Se a heterozigose for

mantida, conclui-se que o erro ocorreu durante a MI. Se for reduzida, o erro ocorreu

na MII ou após a formação do zigoto. Por exemplo, se o progenitor A apresentar os

alelos “ab” e o progenitor B os alelos “cd” enquanto o acometido os alelos “abc” para

o marcador STR analisado conclui-se que a não disjunção ocorreu na MI, visto que a

heterozigose do progenitor A foi mantida. Seguindo este raciocínio, caso o

acometido apresente dois alelos diferentes “ac" em proporções quantitativas 2:1,

15

conclui-se que a heterozigose observada no progenitor A foi reduzida, o que significa

que a não disjunção ocorreu na MII (figura 1).

Figura 1: Esquema representativo da aplicação de marcadores moleculares para a determinação dos eventos meióticos de não disjunção do cromossomo 21. No cenário 1, o acometido possui para o marcador X um perfil trialélico (com dosagem de 1:1:1) caracterizado pelo genótipo abc. Neste exemplo a heterozigose do progenitor A (alelos ab) foi mantida no acometido. Este cenário é informativo de não disjunção cromossômica em MI. No cenário 2, o acometido possui para o marcador X um perfil dialélico (com dosagem de 2:1) caracterizado pelo genótipo ac. Neste exemplo a heterozigose do progenitor A foi reduzida a homozigose no acometido. Este cenário é informativo de não disjunção cromossômica em MII.

16

(v) os eventos de recombinação podem ser identificados através da observação da

transição do estado de heterozigose parental para homozigose (ou processo

inverso) entre dois marcadores adjacentes no acometido (figura 2).

Figura 2: Esquema representativo da aplicação de marcadores moleculares na identificação de recombinação meiótica em núcleo familiar acometido pela trissomia 21. Neste exemplo, o acometido possui para o marcador X um perfil trialélico (alelos a/b/c) gerado pela manutenção da heterozigose do progenitor A. Para o marcador Z o acometido apresenta um perfil dialélico (alelos f/f/h) gerado pela redução da heterozigose do progenitor A no acometido. A transição da heterozigose do progenitor A observada no marcador X para homozigose no marcador Z, é indicativo da ocorrência de um evento de recombinação entre estes dois marcadores.

17

Atualmente, para este tipo de análise existem 155 marcadores STR já

descritos ao longo da região 21q (tabela 2).

Tabela 2: Relação de marcadores STR descritos na região 21q.

Marcador STR (a)

referência NC_000021.7

(b) Referência AC_000064.1

(c) Referência AC_000153.1

(d)

Localização física (pb) Localização física (pb) Localização física (pb)

D21S369 13678220-13678394 (*)

S/A 402556-402636

D21S215 13719788-13719968 49839-49993 444023-444177

D21S1993 14375677-14375805 611042-611170 823371-823499

D21S258 14548154-14548345 783531-783722 996658-996846

D21S1228 14565099-14565350 800475-800726 1013598-1013855

D21S408 14606578-14606736 841950-842109 1055105-1055263

D21S120 14684025-14684337 919395-919705 1132516-1132826

D21S16 14752283-14752521 1000256-1000494 1213376-1213614

D21S236 14787711-14787832 1035686-1035789 1248802-1248905

D21S1911 15062607-15062732 1310468-1310595 1523505-1523632

D21S13E 15378594-15378712 1625847-1625965 1839151-1839269

D21S1431 15394402-15394573 1641655-1641826 1854959-1855130

D21S1904 15432268-15432423 1679519-1679676 1892825-1892984

D21S192 15705975-15706170 1954369-1954564 2163319-2163514

D21S1231 15749237-15749460 1997623-1997834 2206576-2206787

D21S415 15764913-15765053 2013287-2013426 2222240-2222374

D21S1234 15765779-15765935 2014152-2014308 2223100-2223260

D21S172 15860364-15860514 2108734-2108884 2317685-2317833

D21S1432 16265317-16265448 2513666-2513805 2722716-2722855

D21S1410 16357767-16357974 2606162-2606369 2814994-2815201

D21S1886 16651614-16651846 2900200-2900425 3109686-3109907

D21S225 16906408-16906776 3154724-3155092 3365288-3365656

D21S1256 18244636-18244754 4501229-4501347 4711933-4712049

D21S364 18505260-18505388 4759105-4759237 4971438-4971570

D21S406 18602486-18602628 4856316-4856458 5068700-5068842

D21S1433 18690830-18691069 4944347-4944590 5156891-5157134

D21S1899 18989654-18989820 5243116-5243292 5455619-5455795

D21S366 19258789-19258958 5512259-5512428 5724536-5724707

D21S11 19476134-19476354 5729555-5729775 5941412-5941636

D21S1414 19476187-19476473 5729608-5729894 5941469-5941755

D21S145 (*)

S/A 6093779-6094011 6311737-6311969

D21S1905 19866516-19866712 6114093-6114289 6332056-6332232

D21S1436 20264336-20264513 6513263-6513440 6729585-6729750

D21S2053 20277992-20278249 6526926-6527183 6743238-6743503

D21S1282 20524608-20524782 6773846-6774020 6990172-6990346

D21S1437 20568710-20568831 6817947-6818068 7034273-7034402

GGAA2D10 20568718-20568831 6817955-6818068 7034281-7034402

D21S1261 20795101-20795294 7044305-7044498 7260749-7260946

18

Tabela 2: (continuação).

Marcador STR (a)




(d)


D21S273 20951765-20952034 7200946-7201215 7418262-7418458

D21S1441 21166842-21166993 7416041-7416197 7633309-7633466

D21S1281 21193557-21193731 7442764-7442936 7660036-7660208

D21S1922 21220691-21220840 7469903-7470052 7687170-7687319

D21S414 21350649-21350816 7599824-7599997 7817174-7817347

D21S1884 21549025-21549217 7801691-7801879 8018648-8018832

D21S214 21637395-21637637 7890058-7890300 8107325-8107577

D21S1994 22068916-22069169 8321717-8321970 8538784-8539041

D21S368 22155385-22155532 8408179-8408324 8625162-8625307

D21S1918 22224971-22225151 8479352-8479532 8696325-8696505

D21S222 22680207-22680336 8940728-8940857 9158135-9158265

D21S1409 23270598-23270778 9531119-9531315 9749093-9749289

D21S232 23661784-23661904 9921401-9921517 10139281-10139397

D21S1257 23735731-23735882 9996397-9996555 10214347-10214521

D21S1250 23868595-23868932 10128952-10129289 10346958-10347295

D21S1892 24158728-24158992 10418989-10419253 10637314-10637578

D21S1244 24191004-24191254 10451260-10451510 10670242-10670488

D21S272 24300394-24300602 10561280-10561484 10780526-10780728

D21S367 24500930-24501038 10761685-10761794 10981050-10981164

D21S1914 24544272-24544482 10805028-10805238 11024422-11024636

D21S1264 24681586-24681706 10943315-10943441 11161392-11161518

D21S230 24746377-24746487 11008119-11008229 11225873-11225983

D21S1907 25488483-25488656 11750256-11750429 11970045-11970218

D21S221 25686727-25686830 11948515-11948618 12168297-12168400

D21S265 25841422-25841597 12102955-12103133 12322692-12322867

D21S1268 26113710-26113903 12375257-12375450 12594907-12595100

D21S1253 26356304-26356485 12617849-12618030 12838956-12839133

D21S1443 26444700-26444938 12706242-12706496 12927338-12927592

D21S1896 26746000-26746210 13007569-13007779 13228692-13228902

D21S1435 26770745-26770917 13032313-13032488 13253437-13253597

D21S260 26893332-26893630 13154896-13155194 13376002-13376302

D21S269 26923055-26923318 13184607-13184866 13405716-13405975

D21S217 27340523-27340802 13601943-13602221 13823167-13823446

D21S1442 27740350-27740591 14001743-14001992 14223396-14223645

D21S2052 27740433-27740559 14001826-14001960 14223479-14223613

D21S1258 27741790-27741932 14003191-14003343 14224844-14224996

D21S210 27852150-27852267 14113672-14113789 14335360-14335477

D21S1916 27902951-27903187 14164449-14164688 14386152-14386391

D21S1915 28041889-28042062 14303293-14303466 14525323-14525496

D21S1419 28373189-28373355 14634607-14634773 14856310-14856476

D21S1226 28532166-28532283 14793538-14793661 15015210-15015333

19


Marcador STR (a)




(d)


D21S1265 28651028-28651139 14912385-14912498 15134114-15134231

D21S1227 28866980-28867104 15128406-15128526 15350083-15350203

D21S1223 29225224-29225461 15486086-15486323 15708045-15708282

D21S1421 29638786-29639026 15900035-15900275 16125059-16125299

D21S1901 29768509-29768723 16029746-16029968 16254817-16255039

D21S213 30122098-30122244 16383348-16383494 16609035-16609181

D21S226 30263502-30263663 16524761-16524922 16750463-16750620

D21S1270 30628632-30628821 16889901-16890087 17115651-17115837

D21S1239 30883957-30884213 17145516-17145772 17370979-17371235

D21S263 31143791-31144116 17404885-17405210 17630838-17631163

D21S1908 31164942-31165157 17426037-17426252 17651981-17652196

D21S1913 31350135-31350253 17611235-17611353 17838227-17838335

D21S1909 31455187-31455426 17716281-17716520 17943263-17943508

D21S1280 31504664-31505039 17765759-17766134 17992753-17993122

D21S223 32163321-32163406 18423813-18423898 18650210-18650295

D21S261 32218415-32218540 18478849-18478974 (*)

S/A

D21S262 32738177-32738324 18999936-19000083 19225655-19225802

D21S1413 32769974-32770145 19031733-19031904 19257451-19257626

D21S224 32778121-32778253 19039879-19040011 19265546-19265678

D21S1898 33531101-33531319 19795240-19795458 20074864-20075078

IFNAR 33638892-33639126 19907108-19907342 20185849-20186087

D21S1910 33871644-33871911 20149408-20149675 20428191-20428446

D21S219 34005791-34005967 20283543-20283719 20561986-20562160

D21S216 34018221-34018337 20295973-20296089 20574381-20574497

D21S235 34172099-34172275 20449813-20449989 20728299-20728469

D21S1920 34619062-34619285 20896761-20896984 (*)

S/A

D21S65 35010955-35011146 21288658-21288849 21568068-21568259

D21S1895 35272929-35273190 21550574-21550839 21829958-21830223

D21S1921 35344051-35344258 21621696-21621907 21901076-21901287

D21S1221 35801246-35801481 22078756-22078991 22357917-22358138

D21S211 35948327-35948422 22225666-22225761 22505081-22505172

D21S1283 36002398-36002582 22279737-22279921 22559134-22559316

D21S1252 36748743-36748880 23025253-23025380 23302717-23302848

D21S1222 36849899-36850135 23126384-23126612 23403692-23403920

D21S167 37117684-37117837 23394197-23394352 23671556-23671711

D21S267 37389425-37389535 23665919-23666029 23943187-23943297

D21S1900 37395390-37395639 23671884-23672133 23949157-23949408

D21S270 37752391-37752595 24028910-24029114 24306217-24306441

D21S1439 38063405-38063724 24340102-24340421 24614596-24614918

D21S1440 38063497-38063658 24340194-24340355 24614688-24614852

D21S1917 38264295-38264515 24540995-24541217 24815609-24815839

20


Marcador STR (a)




(d)


D21S1883 38420538-38420767 24696867-24697096 24968367-24968596

D21S1255 38716838-38716945 24992831-24992938 25264794-25264905

D21S1809 38811931-38812147 25087786-25088002 25360168-25360384

D21S156 39257650-39257726 25533556-25533644 25806261-25806349

D21S1891 39343298-39343403 25619200-25619305 25891873-25891970

D21S343 39428914-39429147 25704797-25705030 25977457-25977690

D21S268 39501203-39501402 25777005-25777216 26049657-26049864

HMG14 39638883-39638954 (*)

S/A (*)

S/A

D21S1412 39672158-39672587 25947976-25948405 26219072-26219489

D21S1246 39792974-39793244 26068799-26069069 26341186-26341456

D21S168 39867392-39867505 26143124-26143237 26414930-26415045

D21S416 39869555-39869677 26145287-26145409 26417095-26417219

D21S2055 40113290-40113481 26388901-26389065 26660735-26660890

D21S1893 40278478-40278588 26554342-26554454 26826066-26826178

D21S1889 40746665-40746930 27023652-27023917 27295122-27295401

D21S1906 41050684-41050855 27327298-27327471 27599347-27599520

D21S1887 41137140-41137282 27413741-27413883 27685711-27685843

D21S1235 41387325-41387436 27663633-27663762 27934415-27934544

D21S198 41397232-41397345 27673550-27673663 (*)

S/A

D21S266 41606447-41606603 27882763-27882919 28153414-28153584

D21S1224 41649801-41649948 27926178-27926325 28196834-28196981

D21S1260 41717912-41718121 27994239-27994444 28264896-28265101

D21S212 42026060-42026294 (*)

S/A (*)

S/A

D21S1225 42536520-42536738 28810958-28811174 29081903-29082121

D21S49 42772864-42773018 29048747-29048901 29317058-29317212

D21S1411 43033739-43034036 29310290-29310587 29575876-29576145

D21S1890 43672606-43672758 29954432-29954586 30216721-30216887

D21S1885 43684538-43684722 29966376-29966540 30228679-30228843

D21S1912 44402316-44402488 30683542-30683714 30948715-30948919

PFKL 44543467-44543601 30824291-30824425 31089608-31089746

D21S171 44817095-44817214 31100337-31100456 31366489-31366598

D21S1575 46860787-46861096 33149527-33149836 33416287-33416602

D21S1446 46862013-46862233 33150753-33150973 33417519-33417739

(a) Nomenclatura do marcador STR. Por convenção os marcadores de DNA extragênicos são nomeados de acordo com sua posição no cromossomo, seguindo um padrão ordinal (Butler, 2005). Por exemplo, o marcador STR D21S11, corresponde ao décimo primeiro marcador identificado no cromossomo 21. Sendo o prefixo “D” abreviação de DNA, “21” ao número do cromossomo, “S” abreviação do inglês single copy sequence (sequência com cópia única) e “11” a ordem na identificação deste marcador. Marcadores de DNA intragênicos são usualmente denominados de acordo com o gene no qual estão mapeados. Por exemplo o marcador STR IFNAR, vem do inglês interferon alpha receptor, pois, está mapeado no gene que codifico o receptor1 de interferon alfa.

21

(b) Posição física do marcador STR em pares de base de acordo com informações obtidas no genoma humano primário de referência, disponível no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob o número de acesso NC_000021.7.

(c) Posição física do marcador STR em pares de base de acordo com informações obtidas no genoma humano alternativo de referência, baseado no genoma Celera e disponível no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob o número de acesso AC_000064.1.

(d) Posição física do marcador STR em pares de base de acordo com informações obtidas no genoma humano alternativo de referência, baseado no genoma HuRef e disponível no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob o número de acesso NC_000153.1.

(*) S/A – Sem anotações

Contudo, devido a um maior potencial informativo na discriminação inter

individual, para análise de recombinação ao longo de cromossomos 21 não disjuntos

é utilizado por diversos estudos um painel reduzido, que compreende 14 a 40

marcadores STR (Lamb et al., 2005; Oliver et al., 2008; Ghosh et al., 2009; Ghosh,

2009; Ghosh et al., 2010).

Adicionalmente, somente para a região pericentromérica do cromossomo 21

são descritos 20 marcadores STR, destes um conjunto constituído por nove

marcadores (D21S369, D21S215, D21S1993, D21S258, D21S120, D21S1911,

D21S1431, D21S1904 e D21S1432) são amplamente utilizados para os estudos de

determinação da origem meiótica da não disjunção, e dos padrões alterados de

recombinação na região pericentromérica apontados como fatores de risco para a

não disjunção em MII. Contudo a grande maioria destes marcadores são pouco

informativos, apresentando heterozigose inferior a 60% (tabela 3).

22

Tabela 3: Relação de marcadores STR mapeados na região pericentromérica em 21q.

Marcadores STR (a)

Localização física Heterozigose Observada (%)

NC_000021.7 (b)

Mapa Rutgers (c)

D21S369 13678220-13678394 pb 59%

D21S215 13719788-13719968 pb (*)

S/A

D21S1993 14375677-14375805 pb 47%

D21S258 14548154-14548345 pb (*)

S/A

D21S1228 14565099-14565350 pb (*)

S/A

D21S408 14606578-14606736 pb 51%

D21S120 14684025-14684337 pb 65%

D21S236 14787711-14787832 pb 69%

D21S1911 15062607-15062732 pb 53%

D21S13E 15378594-15378712 pb 54%

D21S1431 15394402-15394573 pb 50%

D21S1904 15432268-15432423 pb 52%

D21S1231 15749237-15749460 pb (*)

S/A

D21S415 15764913-15765053 pb (*)

S/A

D21S1234 15765779-15765935 pb 69%

D21S172 15860364-15860514 pb 74%

D21S1432 16265317-16265448 pb 69%

D21S1410 16357767-16357974 pb 35%

D21S1886 16651614-16651846 pb 34%

D21S225 16906408-16906776 pb (*)

S/A

(a) Nomenclatura do marcador STR pericentromérico.

(b) Posição física do marcador STR em pares de base de acordo com informações obtidas no genoma humano primário de referência, disponível no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob o número de acesso NC_000021.7.

(c) Heterozigose observada na construção do mapa genético humano Rutgers (Rutgers Map Vs.2, (Matise, 2007). O mapa Rutgers é o mapa mais denso até o momento, incluindo o maior conjunto de marcadores STS e SNP, totalizando um número de 28.121 marcadores polimórficos. Este mapa combina dados de genotipagem dos bancos CEPH e deCODE.

(*) S/A – Sem anotações.

Assim, torna-se de grande importância a identificação de novos marcadores

STR na região pericentromérica, a fim de desenvolver um ensaio mais acurado para

o rastreio dos eventos de recombinação e determinação dos estágios meióticos da

não disjunção.

23

3. OBJETIVO GERAL

Determinar a frequência de recombinação na região pericentromérica do

cromossomo 21 e sua possível associação com a não disjunção

cromossômica na síndrome de Down.

3.1 Objetivos específicos.

Identificar por análise genômica computacional comparada novos marcadores

STR altamente informativos na região pericentromérica 21p11.2-21q21.1.

Desenhar iniciadores específicos para as regiões flanqueadoras aos novos

marcadores STR selecionados.

Validar o ensaio em reação multiplex por QF-PCR para tipagem dos novos

marcadores STR.

Criar um banco de frequências alélicas referente aos novos marcadores STR

para a população de estudo.

Determinar o estágio meiótico da não disjunção e identificar eventos de

recombinação ao longo do cromossomo 21.

Avaliar os fatores de risco “idade materna avançada” e “padrões alterados de

recombinação” calculando os riscos relativos para não disnjunção em MI e MII

na coorte de estudo.

24

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material biológico

Para análise de recombinação pericentromérica, foram tipadas amostras de

DNA referentes a uma coorte de 60 núcleos familiares acometido pela SD, referidas

pelo Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de São José do Rio

Preto, como parte de uma colaboração.

Para análise de frequências alélicas foram tipadas amostras de DNA de 100

indivíduos não relacionados geneticamente, pertencentes aos do bando de DNA do

NUDIM, gerado a partir de testes de parentesco, e 120 indivíduos referentes aos

genitores dos 60 núcleos familiares avaliados.

4.2 Métodos

4.2.1 Identificação de marcadores de DNA do tipo STR no cromossomo 21.

Para a identificação de marcadores STR na região pericentromérica do

cromossomo 21, foi realizado uma análise genômica computacional comparada

utilizando as informações para três sequências de referência para o cromossomo 21

presentes no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas

dos Estados Unidos – NCBI (National Center Information for Biotechnology) NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), disponíveis com os seguintes números de acesso:

NC_000021.7 para o genoma primário de referência, AC_000064.1 e AC_000153.1

para as sequências alternativas de referência, basedas nos genomas Celera e

HuRef, respectivamente.

Para tal, foi utilizado o programa Tandem Repeat Finder (Benson, 1999),

disponível online (http://tandem.bu.edu/trf), calibrado com o parâmetro de

estringência de alinhamento de {2,7,7} para correspondência, não correspondência

entre as cópias, respectivamente. Este programa utiliza um algoritmo capaz de

encontrar os elementos repetitivos pelo percentual de identidade e pela frequência

de indels (inserções e/ou deleções) comparado a uma sequência referência com

repetições perfeitas em série. Quanto maior for o número de repetições e o tipo de

repetição, maior será a pontuação final. Por exemplo: 10 repetições perfeitas de

tetranucleotídeos apresentam pontuação igual a 80 enquanto 10 de dinucleotídeos

apresentam pontuação 40. Vinte repetições dinucleotídicas fazem 80 pontos. As

sequências imperfeitas possuem pontuação menor do que as perfeitas com o

25

mesmo número de repetições, exemplo: a sequência [ACACACATACACACAC]

possui pontuação menor do que a sequência [ACACACACACACACAC] pela

descontinuidade [TA]. Os descontos na pontuação final dependem da proporção dos

erros de pareamento com uma sequência perfeita. Os parâmetros de busca das

repetições {2,3,5}, {2,5,5}, {2,5,7}, {2,7,7}) também influenciam na pontuação final. O

parâmetro que desconta o menor valor da pontuação final devido às imperfeições é

o {2,3,5}; portanto, o mais permissivo. Por outro lado, o parâmetro {2,7,7} é o mais

restritivo.

No quadro 1 está ilustrado um exemplo do resultado do programa TRF na

identificação e caracterização in silico de candidatos a marcadores STR sob o

parâmetro {2,7,7}.

Indice (a)

Período (b)

Número

Identidade % (d)

Indels % (e)

Pontuação (f)

Conteúdo ACGT (%)

de cópias (c)

A C G T

9991707--9991797 4 22.8 93 0 155 27 0 47 25

9991697 AAGAGACGTG

* *

9991707 TGGA TGGA TGGA TGAA TGGA TGGA TGGA TGAA TGGA TGGA TGGA TGGA

1 TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA

*

9991755 TGGA TGGA TGAA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGG

1 TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGG

9991798 GGTATACTTG

(a) Posição física do candidato a marcador STR em pares de base.

(b) Extensão em pares de base da unidade de repetição contituínte do marcador STR candidato (consenso TGGA).

(c) Número de cópias da unidade de repetição constitutiva do marcador STR candidato.

(d) Percentual de homologia encontrado no alinhamento da sequência referência submetida e a sequência virtula gerada pelo programa.

(e) Percentual de inserções e deleções.

(f) Valor dado pela razão e desconto das penalidades referentes ao tipo de período, número de cópias e percentual de identidade da sequência de interesse.

Quadro 1: Identificação e caracterização in silico de candidatos a marcadores STR. O programa TRF (http://tandem.bu.edu/trf/trf.html) possui um algoritmo capaz de encontrar os elementos repetitivos pelo percentual de identidade e pela frequência de indels (inserções e/ou deleções) comparado a uma sequência referência com repetições perfeitas em série. Realçado em cinza a sequência referência submetida, e abaixo a sequência perfeita, com a mesma unidade de repetição gerada virtualmente pelo programa. Asteriscos realçados em negrito representam os polimorfismos entre as sequências. Para cada polimorfismo encontrado, penalidades são geradas (de acordo com o parâmetro utilizado), seguidas da redução da pontuação total.

http://tandem.bu.edu/trf/trf.html

26

Após varredura da região pericentromérica, em uma primeira triagem, foram

selecionados os marcadores STR do tipo tetranucleotídeo e pentanucleotídeo com

pontuação mínima de 80 e identidade igual ou superior a 85%.

Para a verificação da unicidade dos marcadores STR selecionados, foi

realizada uma análise genômica comparada através de alinhamento de sequências

utilizando a ferramenta online BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

disponível no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information,

USA – www.ncbi.nlm.nih.gov).

4.2.2 Predição do potencial polimórfico dos marcadores STR selecionados.

Para a predição do potencial polimórfico dos marcadores STR selecionados,

foi realizado uma análise genômica comparada através do alinhamento das três

sequências referências disponíveis para o cromossomo 21 (NC_000021.7,

AC_000064.1 e AC_000153.1) utilizando o recurso online Multiple Sequence

Alignment por CLUSTALW (http://align.genome.jp/). Para tal, foi elaborada uma

escala com índice de 1-3, índice 1 para uma única forma alélica, índice dois para

duas variações alélicas, e índice 3 para três variações alélicas nos três genomas

referência (figura 3).

Sequência 1: ref|AC_000021.7|cromossomo_21 181 pb



1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 TCTAAAACAGTGTGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAAA



**************************************************

1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 TTATATGTCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACT

2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 TTATATGTCACACACACACACACACTC--------------------A--

3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 TTATATGTCACACACACACACA-------------------------A--

**********************

1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CTCAGTCACCTAATCAGAAAAACAAGAAACTGATTTTCTTTAGATTCTCA

2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 ----GTCACCTAATCAGAAAAACAAGAAACTGATTTTCTTTAGATTCTCA


**********************************************

1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 GAATGACAACACTCACAACTGTCACGTCAGC



******************************

Figura 3: Predição do polimorfismo in silico para uma marcador STR candidato. As sequências referências NC_000021.7, AC_000064.1 e AC_000153.1 foram alinhadas e comparadas para a identificação de variações alélicas. Para tal, foi utilizado o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). O polimorfismo é destacada em realce amarelo. Em realce vermelho as variações alélicas determinadas. O índice de polimorfismo deste candidato a marcador STR é três em uma escala de um a três.

http://align.genome.jp/


27

4.2.3 Desenho de Iniciadores para os marcadores STR selecionados.

Para o desenho de iniciadores específicos aos marcadores selecionados,

foram utilizados os programas livres e online: OligoPerfect™ Designer da

Invitrogen™ (http://www.invitrogen.com/) e o OligoCalc - Oligonucleotide Properties

Calculator (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html).

Os iniciadores foram sintetizados pela Applied Biosystems, USA, com as

seguintes fluorescências 6-FAMTM, VICTM, NEDTM e PETTM.

Para avaliar a complementaridade específica de cada par de iniciadores as

regiões flanqueadoras dos marcadores de interesse, foi utilizada a ferramenta online

iPCR – UCSC ( in silico PCR University of California Santa Cruz, USA –

http://www.genome.ucsc.edu).

Na figura 4, está ilustrado um exemplo da validação in silico de iniciadores

pelo programa iPCR – UCSC.

>chr21:9991594+9991944 351bp CATGCAGGCTCCTGAGAGTA TCATCCACTAGTCCACAGACAA

CATGCAGGCTCCTGAGAGTAaattccacaaatgtccaccagtctcctttc

tctttggtctatgtttccatcatgtgcatggattagtttgtgtaagtgtg

ttgaagagacgtgtggatggatggatgaatggatggatggatgaatggat

ggatggatggatggatggatgaatggatggatggatggatggatggatgg

atggggtatacttgctcatgtgcctgtgtgtgtatagttctatgcacact

tatgctgacgggtgactttaactatttattgctcacctttctttcgcagg

tgcctcctcggttgctcctttaaattcacTTGTCTGTGGACTAGTGGATG

A

>chr13:18965345+18965652 308bp CATGCAGGCTCCTGAGAGTA TCATCCACTAGTCCACAGACAA

CATGCAGGCTCCTGAGAGTAaatttcacaaacctccatcagtctcctttc

tccttggtctatgtttccatcatgtgcatggattagtttgtgtacgcgtg

ttgaagagaagtgtggatggatggatggatggatggatggatggatggat

ggatggatatatttgctcatatgcctgtgtgtgtgtatagttctatgcac

acttatgctgacgggtgactttatttaactatttattacttacctttctt

tcgcaggtgcctcctcggttgttcctttaaattcgtTTGTCTGTGGACTA

GcGGATGA

>chrY:27070580-27070891 312bp CATGCAGGCTCCTGAGAGTA TCATCCACTAGTCCACAGACAA

CATGCAGGCTCCTGAGAGTAaattccacaaatgtccatcagtctcctttc

tctttggtctgtttccatcatgtgcatggattagtttgtgtacatgtgtt

gaagagaagtgtggatggatggatggatggatggatggatggatggatgg

atcgatggatggatatatttgctcatgtgcctgtgtgtgtatagttctat

gcacacttatgctgacggatgactttatttaactatttattactcacgtt

tctttcgcaggtgtctcctcggttgtgcctttaaattcatTTGTCTGTGG

ACTAGTGGATGA

Figura 4: Sequência do produto de amplificação in silico para um marcador STR candidato. Em realce amarelo alocalização física desta sequência no genoma primário de referência NC_000021.7. Em realce azul e vermelho, as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente. O par de iniciadore utilizado gerou in silico dois fragmentos, um de 308pb no cromossomo 13, e outro de 312pb no cromossomo Y, e programa utilizado foi o iPCR do browser da UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start.

http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?hgsid=184318101&db=hg18&position=chr21:9991594-9991944&hgPcrResult=pack

http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?hgsid=184318101&db=hg18&position=chr13:18965345-18965652&hgPcrResult=pack

http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?hgsid=184318101&db=hg18&position=chrY:27070580-27070891&hgPcrResult=pack

http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start

28

4.2.4 Construção de um mapa genético para os novos marcadores STR identificados.

Para a construção do mapa genético foram utilizadas as informações do

Rutgers Map, mapa combinado físico e de ligação do genoma humano elaborado

por pesquisadores da Universidade Rutgers - Filadélfia (Kong et al., 2004; Matise,

2007), também disponível online (http://compgen.rutgers.edu/maps/). O Rutgers é o

mapa de ligação mais denso e informativo existente até o presente. Somente para o

cromossomo 21, existem informações sobre o mapeamento de 425 marcadores, 140

do tipo PCR-específico ou STS do inglês Sequence Tagged Site; e 285 com

polimorfismo de base única ou SNP do inglês Single Nucleotide Polymorphism.

Essas informações foram utilizadas para, por meio de interpolação, estimar a

distância genética de cada marcador selecionado neste estudo, uma vez conhecida

a posição física de cada marcador candidato.

4.2.5 Caracterização alélica dos novos marcadores STR identificados na região pericentromérica do cromossomo 21.

Os novos marcadores STR foram tipados pelo método da reação em cadeia

da polimerase quantitativa por fluorescência (QF-PCR) em sistema multiplex

(amplificação simultânea de diversos locos em uma única reação).

Aos produtos de amplificação foram adicionados formamida (Hi-Di

Formamida, Applied Biosystems) e o padrão de peso molecular GeneScan LIZ 500,

marcado com o fluorocromo LIZTM (fluorescência laranja) (Applied Biosystems). Os

produtos de amplificação foram separados por eletroforese em capilar com o

polímero POP 4 (contendo 4% de acrilamida), utilizando o sequênciador ABI PrismTM

310 Genetic Analyzer.

Os perfis eletroforéticos foram analisados utilizando os programas

GeneScanTM e GenotyperTM (Applied Biosystems).

Os alelos tipados foram designados de acordo com o tamanho em pares de

base do fragmento amplificado. As informações para a interpretação de um

eletroferograma estão resumidas na figura 5.

29

Figura 5: Informações para a interpretação de um eletroferograma. No eixo X, representado em A, escala em número de pares de base (pb). Em B, informações alélicas representadas, caracterização dos alelos em pares de base e dosagem alélica dada pela proporção da área do sinal de fluorescência. Em C, identificação da amostra analisada. No eixo Y, representado em D, escala da intensidade de fluorescência em unidades arbitrárias. A intensidade de fluorescência está diretamente relacionada com a quantidade de produto amplificado.

4.2.6 Determinação das origens da não disjunção e identificação dos eventos de recombinação em 21q.

Após caracterização do perfil alélico de cada núcleo familiar, a determinação

da origem parental caracterizou-se pelo confronto entre os genótipos do genitores

materno e paterno com o genótipo do indivíduo acometido, uma vez identificado no

acometido a cópia extra do cromossomo 21 e sua correspondência com o genótipo

de uma ou outro genitor, a origem parental foi então inferida (Thomas e Hassold,

2003; Alves Da Silva, 2007; Ramírez et al., 2007; Ghosh et al., 2010).

Para a determinação do estágio meiótico de não disjunção, seguiu-se o

critério da observação da manutenção ou redução da heterozigose do parental que

originou a trissomia no acometido. Se mantida, foi inferido um evento de não

disjunção durante a MI (erro de segregação entre cromossomos homólogos). Se

reduzida, foi inferido um evento de não disjunção durante a MII (erro de segregação

entre cromátides-irmãs) (Thomas e Hassold, 2003; Alves Da Silva, 2007; Ramírez et

al., 2007; Ghosh et al., 2010).

30

A identificação dos eventos de recombinação baseou-se no critério da

observação da transição da heterozigose para homozigose (do parental que originou

a trissomia), ou processo inverso, no acometido entre dois marcadores adjacentes.

Se observada esta transição de informações quanto ao estágio meiótico entre dois

marcadores foi inferido um eventos de recombinação entre esses dois pontos

(Thomas e Hassold, 2003; Alves Da Silva, 2007; Ramírez et al., 2007; Ghosh et al.,

2010).

4.2.7 Cálculo dos riscos relativos para a não disjunção do cromossomo 21 em MI e MII.

Para a verificação da existência de forças de associação, e

consequentemente calcular o risco relativo (RR) para a não disjunção, os dados

obtidos com a tipagem dos marcadores STR foram subdivididos de acordo com as

variáveis observadas, e gerenciados utilizando o programa Epidata versão

3.1(Lauritsen e Bruus, 2008) e analisados com o programa Epidata Analysis

v2.2.1.171.

4.2.8 Dados populacionais para os sistemas alélicos avaliados.

Dados populacionais relevantes: PD, poder de discriminação; PIC, conteúdo

de informação de polimorfismo; PE, poder de exclusão; H, heterozigose observada,

e as frequências alélicas para cada marcador STR analisado, foi estabelecido,

através do programa PowerStats, um programa executável em uma planilha de

Microsoft Excel (http://www.promega.com/geneticidtools/powerstats/).

O teste exato do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (p >0.05) foi executado

utilizando o programa DNAView (Brenner, 1997), os genótipos observados e

esperados foram analisados através de 30.000 simulações de Monte Carlo.

4.2.9 Aspectos éticos.

Todas as amostras de DNA foram coletas perante assinatura do Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido (anexo). A coleta foi realizada por profissional

autorizado que referenciou o estudo com o encaminhamento para o NUDIM.

O presente estudo foi aprovado sob a folha de rosto nº 347482, pelo Comitê

de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Campos – FMC, devidamente

constituído nos termos das resoluções nº 196/96 do Conselho Nacional de Saúde.

http://www.promega.com/geneticidtools/powerstats/

31

5. RESULTADOS

5.1 Caracterização dos marcadores STR atualmente utilizados em análise de segregação alélica em núcleos familiares acometidos pela síndrome de Down.

Para a caracterização dos marcadores STR amplamente utilizados em análise

de segregação alélica em núcleos familiares acometidos pela SD, foi realizado

primeiramente uma revisão bibliográfica destes marcadores.

Ao longo da região 21q foram encontradas na literatura informações sobre

155 marcadores STR. A análise genômica computacional comparada, revelou que

64,5% (n=100) destes marcadores são dinucleotídeos, 2,6% (n=4) trinucleotídeos,

14,2% (n=22) tetranucleotídeos e 18,7% (n=29) correspondem a marcadores com

sequências complexas, constituídas por dinucleotídeos associados a diferentes tipos

de unidade de repetição.

Destes marcadores STR, 85% correspondem a um conjunto de sequências

simples e complexas de di- e trinucleotídeos. Estes apresentam após amplificação

por PCR, perfis de difícil interpretação, devido a limitações técnicas intrínsecas a

amplificação de marcadores di- e trinucleotídeos, que consistem em: (i) formação

de produtos stutters (múltiplos do alelo verdadeiro); (ii) amplificação preferencial do

alelo menor, que em testes moleculares pode conduzir a resultados falsos positivos

ou falsos negativos (figura 6).

Figura 6: Eletroferogramas comparativos do perfil de amplificação de marcadores STR dinucleotídeo e tetranucleotídeo em amostra dissômica (cariótipo 46,XY). Em (A) foi utilizado o marcador STR D21S1270, o qual apresenta uma sequência complexa formada pelo consenso (TG)n/(ATAG)n. Setas em vermelho na vertical evidenciam os produtos stutters formados durante o processo de amplificação, e seta em azul na horizontal evidencia a amplificação preferencial do alelo menor, inerente a amplificação deste tipo de repetição. Em (B) foi utilizado o marcador D21S226, o qual apresenta uma sequência simples formada pelo consenso (ATAA)n. Setas na vertical demonstram a ausência de formação de produtos stutters na amplificação deste marcador.

32

Quanto a região pericentromérica, foram encontrados referenciados na

literatura 20 marcadores STR mapeados na região 21q21.1. Destes, 75% são

dinucleotídeos,10% trinucleotídeos e 15% tetranucleotídeos.

A análise genômica computacional comparada dos três genomas de

referência, NC_000021.7; AC_000064.1 e AC_000153.1, disponibilizados pelo

Centro Nacional de Biotecnologia – NCBI, revelou que embora 95% desses

marcadores STR apresentassem um alto potencial polimórfico in silico, dos 14

marcadores com validação da frequência alélica (Mapa Rutgers) apenas 35%

apresentaram heterozigose > 60% (tabela 4).

Tabela 4: Caracterização dos 20 marcadores STR descritos na região pericentromérica do cromossomo 21.

Marcador Período

(b)

Sequência Número Identidade (e)

Pontuação

(f)

Índice de Heterozigose (%)

STR (a)

Consenso (c)

de cópias (d)

(%) Polimorfismo (g)

Mapa Rutgers (h)

D21S369 2 (TA) * (TG) 33.5/15.5 87/100 35/62 2 59%

D21S215 2 (CA) 20.5 100 82 2 (*)

S/A

D21S1993 3 (TTA) * (TAG) 5.0/10.7 100/100 30/64 1 47%

D21S258 2 (GT) 25.0 100 100 2 (*)

S/A

D21S1228 2 (TA) * (TG) 10.0/7.5 100/100 40/30 2 (*)

S/A

D21S408 2 (AC) 9.5 100 38 2 51%

D21S120 2 (TG) 18.0 100 72 2 65%

D21S236 2 (AC) 19.5 100 78 2 69%

D21S1911 2 (AC) * (CA) 12.5/8.5 100/100 50/34 2 53%

D21S13E 2 (GT) 17.0 100 68 1 54%

D21S1431 3 (CTA) * (TGT) 10.3/2.6 100/88 62/40 1 50%

D21S1904 2 (TG) 15.5 100 62 3 52%

D21S1231 2 (TG) * (TA) 7.5/7.5 100/100 30/30 2 (*)

S/A

D21S415 2 (AC) * (AG) 19.5/10.5 100/100 78/42 3 (*)

S/A

D21S1234 2 (AC) 19.5 100 78 2 69%

D21S172 2 (TG) 20.0 100 80 3 74%

D21S1432 4 (TATC) 15.5 87 92 2 69%

D21S1410 4 (ATCT) 14.5 85 80 1 35%

D21S1886 2 (GT) 22.0 100 88 3 34%

D21S225 4 (AAAT) 8.8 100 70 1 (*)

S/A

33

(g) Nomenclatura do STR pericentromérico.

(h) Período do marcador STR, dado pela extensão em nucleotídeos da unidade de repetição. Por exemplo, período igual a 2, corresponde a uma unidade de repetição constituída por um dinucleotídeo.

(i) Sequência primária em nucleotídeos da unidade de repetição constitutiva do marcador STR.

(j) Número de cópias das unidades de repetição constitutiva do marcador STR.

(k) Percentual de homologia dado pelo alinhamento da sequência referência de interesse com

outra perfeita constituída por período, unidade consenso e número de cópias idênticos.

(l) Valor dado pela razão e desconto das penalidades referentes ao tipo de período, número de cópias e percentual de identidade da sequência de interesse.

(m) Predição do polimorfismo in silico, dado pela análise combinada dos três genomas humanos

de referência disponíveis no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob os códigos de acesso: NC_000021.7, AC_000064.1 e AC_000153.1. Para esta análise foi estipulada uma escala de 1-3, sendo índice 1 para a observação de uma única forma alélica, índice 2 para duas variações alélicas, e índice 3 para três variações alélicas em um determinado loco.

(n) Heterozigose observada na construção do mapa genético humano Rutgers (Rutgers Map

Vs.2, (Matise, 2007). O mapa Rutgers é o mapa mais denso até o momento, incluindo o maior conjunto de marcadores STS e SNP, totalizando um número de 28.121 marcadores polimórficos. Este mapa combina dados de genotipagem dos bancos CEPH e deCODE.


34

Adicionalmente, os três marcadores STR descritos mais próximos à região

centromérica, D21S369, D21S215 e D21S1993 (figuras 7, 8 e 9) não são únicos ao

cromossomo 21. Cópias parálogas foram identificadas nos cromossomos 18

(D21S369 e D21S215) e 12 (D21S1993). A análise computacional comparada por

alinhamento de sequências específicas, revelou correspondências alélicas entre os

marcadores D21S369 e D21S215 para os genomas referência NC_000018.8

(cromossomo 18), AC_000064.1 e AC_000153.1 (cromossomo 21) (figura 7 e 8).

Sequência 1: ref|NC_000021.7|cromossomo_21 175 pb



1) ref|NC_000021.7|cromossomo_21 CTAAGCTGATATAGTAAGTACATTTATCATCTATTTATACATATATATAT

2) ref|NC_000153.1|cromossomo_21 CTAAGCTGATATAGTAAGTACATTTATCATCTATT---------------

3) ref|NC_000018.8|cromossomo_18 CTAAGCTGATATAGTAAGTACATTTATCATCTATT---------------

***********************************

1) ref|NC_000021.7|cromossomo_21 ACACACATATATATGTGTGTATATATATATACACACACATATATATATAT

2) ref|NC_000153.1|cromossomo_21 --------------------------------------------------

3) ref|NC_000018.8|cromossomo_18 --------------------------------------------------

1) ref|NC_000021.7|cromossomo_21 ATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATATATATATATTCAACT

2) ref|NC_000153.1|cromossomo_21 -----------------------------TATATATATATATATTCAACT

3) ref|NC_000018.8|cromossomo_18 -----------------------------TATATATATATATATTCAACT

* *******************

1) ref|NC_000021.7|cromossomo_21 AGATTCAGCATTTAGCCAAGGCCAT

2) ref|NC_000153.1|cromossomo_21 AGATTCAGCATTTAGCCAAGGCCAC

3) ref|NC_000018.8|cromossomo_18 AGATTCAGCATTTAGCCAAGGCCAC

************************

Figura 7: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S369. As sequências alélicas correspondentes a um fragmento de 175pb para o genoma referência NC_000021.7, e 81pb para os genomas referência AC_000153.1 e NC_000018.8 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho, estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente. Correspondência do alelo 81 foi observada entre as sequências de referência AC_000153.1 e NC_000018.8.

35











**************************************************

1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 TTATATGTCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACT




5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 TTATATGTCACACACACACACACACACACACACACACACAC--------T

************************* *






**********************************************

1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 GAGTGACAACACTCACAACTGTCACGTCAGC




5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 GAGTGACAACACTCACAACTGTCACGTCAGC

** ****************************

Figura 8: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S215. As sequências alélicas correspondentes a um fragmento de 181pb para o genoma referência NC_000021.7, 155pb para os genomas referência AC_000064.1, AC_000153.1 e NC_000018.8, e 173pb para o genoma AC_000150.1 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho, estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente. Correspondência do alelo 155 foi observada entre as sequências de referência AC_000064.1, AC_000153.1 e NC_000018.8.



1)ref|NC_000021.7|cromossomo_21 CCGAGATTGCACCATTACTCTCCAGCCTGGGCAAGAAGAGTGAAACTCCG

2)ref|NC_000012.11|cromossomo_12 CCGAGATTGCACCATTACTCTCCAACCTGGGCAACAAGAGCGAAACTCCG

************************ ********* ***** *********

1)ref|NC_000021.7|cromossomo_21 TATCCAAAATACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTAATAATAATA

2)ref|NC_000012.11|cromossomo_12 TATCCAACATAATAG---------------TAACAATAATAATAAAATAA

******* *** ** ** * ** ****** * *

1)ref|NC_000021.7|cromossomo_21 ATAAAAAATGAGTTTCCAGGAAAAAAGAA-

2)ref|NC_000012.11|cromossomo_12 AAAATAAGCGAGTCTCCAGGAAAAAAGAAA

* ** ** **** ***************

Figura 9: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S1993. As sequências alélicas correspondentes a um fragmento de 129pb para o genoma referência NC_000021.7, 115pb para o genoma referência NC_000012.11 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho, estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente.

36

Visando reduzir os possíveis erros de interpretação originados na tipagem

de marcadores STR não únicos, os iniciadores para os marcadores D21S369,

D21S215 e D21S1993 foram redesenhados.

Devido ao elevado percentual de identidade das sequências que

flanqueiam os elementos repetitivos que compõem estes marcadores STR e suas

cópias parálogas nos cromossomos 12 e 18, o qual se mantém acima de 70% em

um fragmento que se estende até 500pb a montante e a jusante (compreendendo

1kb) nos três marcadores (gráficos 1, 2 e 3), não foi possível desenhar iniciadores

exclusivos as sequências mapeadas no cromossomo 21, assim, foram selecionados

os pares de iniciadores que apresentaram menor percentual de identidade com suas

cópias parálogas nos respectivos cromossomos, figuras 10, 11 e 12.

Gráfico 1: Percentual de identidade entre o marcador D21S369 e sua cópia paráloga mapeada nos cromossomos 18. Dados obtidos a partir do alinhamento das sequências primárias de referência NC_000021.7 e NC_000018.8. Para tal, foi utilizada a ferramenta online BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Gráfico 2: Percentual de identidade entre o marcador D21S215 e sua cópia paráloga mapeada no cromossomos 18. Dados obtidos a partir do alinhamento das sequências primárias de referência NC_000021.7 e NC_000018.8. Para tal, foi utilizada a ferramenta online BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

98,50%

96,50%

97,50%

89,75%

93,16% 93,16%

88%

90%

92%

94%

96%

98%

100%

Início ←100pb→ ←200pb→ ←300pb→ ←400pb→ ←500pb→

Marcador D21S369

Identidade %

93%

97,66%98,33%

99% 99%

98,12%

93%

95%

97%

99%

Início ←100nt→ ←200nt→ ←300nt→ ←400nt→ ←500nt→

Marcador D21S215

Identidade %

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

37

Gráfico 3: Percentual de identidade entre o marcador D21S1993 e sua cópia paráloga mapeada no cromossomos 12. Dados obtidos a partir do alinhamento das sequências primárias de referência NC_000021.7 e NC_000012.10. Para tal, foi utilizada a ferramenta online BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).




1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ********************CTAAGCTGATATAGTAAGTACATTTATCAT

2) ref|AC_00153.1|cromossomo_21 ********************CTAAGCTGATATAGTAAGTACATTTATCAT

3) ref|AC_000018.8|cromossomo_18 -------TTCAAACTTCCTGAAAGAAAGTGGCCTTGGCTAAATGCTGAAT

* * * * * * * * ** ** **

1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CTATTTATACATATATATATACACACATATATATGTGTGTATATATATAT

2) ref|AC_00153.1|cromossomo_21 CTATT---------------------------------------------

3) ref|AC_000018.8|cromossomo_18 CTAGT---------------------------------------------

*** *

1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ACACACACATATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT

2) ref|AC_00153.1|cromossomo_21 -------------------------------------------------T

3) ref|AC_000018.8|cromossomo_18 -------------------------------------------------T

*

1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 GTATATATATATATTCAACTAGATTCAGCATTTAG---************

2) ref|AC_00153.1|cromossomo_21 ATATATATATATATTCAACTAGATTCAGCATTTAG---************

3) ref|AC_000018.8|cromossomo_18 GAATATATATATATATAAATAGATGATAAATGTACTTACTATATCAGCTT

************ ** ***** ** ** * * * **

1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ********----

2) ref|AC_00153.1|cromossomo_21 ********----

3) ref|AC_000018.8|cromossomo_18 AGAAACATGCCT

**

Figura 10: Alinhamento das sequências de referência dos novos iniciadores para o marcador D21S369. As sequências dos novos iniciadores para o marcador D21S369 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho, estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente, e em amarelo as regiões sem correspondência entre a cópia paráloga mapeada no cromossomo 18 (genoma referência AC_000018.8) e as sequências referências dos novos iniciadores (NC_000021.8 e AC_000153.1).

77%

84%

80%81%

77,50%

80,15%

76%

78%

80%

82%

84%

86%

Início ←100nt→ ←200nt→ ←300nt→ ←400nt→ ←500nt→

Marcador D21S1993

Identidade %

38






1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ********************GCTTTAG---AGTCACACTT-CTAAA---A



4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 ----GGAATTCTGATCTTTACTTTGAGGAAAGTTTCACTTGCTGACGTGA

5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 ----GGAATTCTGATCTTTACTTTGAGGAAAGTTTCACTTGCTGACGTGA

* * * * * ** ** *** ***** ** * *

1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CAGTG--------TGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAA



4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 CAGTTGTGAGTGTTGTCATTCTGAGAATCTAAAGAAAATCAG-TTTCTTG

5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 CAGTTGTGAGTGTTGTCACTCTGAGAATCTAAAGAAAATCAG-TTTCTTG

**** **** * *** ** * * * * ***

1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ATTATATGTCACACACACACACACACACACACACACACACACA*******

2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 ATTATATG--------------------------TCACACACA*******

3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 ATTATATG--------------------------TCACACACA*******

4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 TTTTTCTG----------------------------ATTAGGTGACTGAG

5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 TTTTTCTG----------------------------ATTAGGTGACTGAG

** * ** * ** *

1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ****************----------



4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 TGTGTGTG------------------

5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 AGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG

* **

Figura 11: Alinhamento das sequências de referência dos novos iniciadores para o marcador D21S215. As sequências dos novos iniciadores para o marcador D21S215 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente, e em amarelo as regiões sem correspondência entre a cópia paráloga mapeada no cromossomo 18 (genomas referência NC_000018.8 e AC_000150.1) e as sequências referências dos novos iniciadores (NC_000021.8, AC_000064.1 e AC_000153.1).



1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 -********************ATGTCACTAT--------TGGTTTTATTT

2)ref|AC_000012.11|cromossomo_12 AAAGGAGAATTACTTGAACCCAGGAGACAGAGGTTGCGGTGAGCCGAGAT

***** * * ** * * ** ** * *

1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 TTTTCTTTTTTCCTGGAAACTCATTTTTTATTATTATTATTAGTAGTAGT

2)ref|AC_000012.11|cromossomo_12 TGCACCATTACTCTCCAACCTGGGCAACAAGAGCGAAACTCCGTATCCAA

* * ** ** ** ** * * * ***

1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 AGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTATTTTGGATACGGAGTTTCACTCTTCTTG

2)ref|AC_000012.11|cromossomo_12 CATAATAGTAACAATAATAATAAAATAAAAAATAAG--------------

** ***** * ** ** ** * * * **

1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CCCAGGCTGGAG********************

2)ref|AC_000012.11|cromossomo_12 -CGAGTCTCCAGGAAAAAAGAAAA--------

* ** ** ** ** * *

Figura 12: Alinhamento das sequências de referência dos novos iniciadores para o marcador D21S1993. As sequências dos novos iniciadores para o marcador D21S1993 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente, e em amarelo as regiões sem correspondência entre a cópia paráloga mapeada no cromossomo 12 (genomas referência NC_000012.11) e a sequência referência dos novos iniciadores (NC_000021.7).

39

Após a síntese, os novos iniciadores para os marcadores D21S369,

D21S215 e D21S1993 foram validados experimentalmente. Para avaliar a

especificidade ao cromossomo 21 gerado pela percentual de identidade reduzido

entre as sequências dos novos iniciadores para as sequências mapeadas no

cromossomo 21 e suas cópias parálogas localizadas nos cromossomos 12 e 18,

os novos iniciadores foram submetidos a um gradiente de temperatura de

anelamento de 59ºC - 69ºC. Para o marcador D21S369 na temperatura de 59 ºC

foi possível observar a amplificação simultânea dos alelos correspondentes aos

cromossomos 18 e 21, porém em temperaturas mais elevadas >67ºC apenas os

alelos específicos ao cromossomo 21 foram observados (figuras 13 e 14).

Figura 13: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico, 46,XY), resultante de um gradiente de temperatura de anelamento para os novos iniciadores específicos ao marcador D21S369. Em (A) está ilustrado o ensaio da QF-PCR correspondente a amplificação das sequências alvos sob uma temperatura de anelamento dos iniciadores de 59ºC. O pseudo-perfil dialélico com dosagem alélica de 2:1 para os alelos 107pb e 202pb reflete a amplificação simultânea das sequências mapeadas nos cromossomos 18 e 21. Setas em vermelho evidenciam os alelos cromossomo 18 específicos. Os ensaios (B), (C) e (D) correspondem a amplificação da sequência alvo sob as temperaturas de anelamento dos iniciadores de 65ºC, 67ºC e 69ºC, respectivamente. O aumento da especificidade na amplificação dos alelos cromossomo 21 específicos, e consequentemente a redução na amplificação dos alelos correspondentes ao cromossomo 18 foi obtida nos ensaios com temperaturas de anelamento superiores a 59ºC.

40

Figura 14: Eletroferograma representativo do perfil alélico do indivíduo heterozigoto 718M2 (cariótipo típico, 46,XX) para o marcador D21S369. Em (A) está ilustrado o ensaio da QF-PCR correspondente a temperatura de anelamento dos iniciadores de 59ºC. O pseudo-perfil trialélico com dosagem alélica de ~ 3:1:1 para os alelos 107pb, 200pb e 208pb reflete a amplificação simultânea das cópias parálogas mapeadas nos cromossomos 18 e 21. O ensaio (B) corresponde a amplificação da sequência alvo sob a temperatura de anelamento dos iniciadores de 67ºC. O quadrante vermelho evidencia o aumento da especificidade na amplificação dos alelos cromossomo 21 específicos, e consequentemente a redução na amplificação dos alelos correspondentes ao cromossomo 18 à níveis não detectáveis na temperatura de anelamento de 67ºC.

Quanto aos iniciadores para o marcador D21S215, ao longo de todo

gradiente de temperatura de anelamento dos iniciadores, foi observado a

amplificação simultânea dos alelos correspondentes aos cromossomos 18 e 21

(figura 15).

Figura 15: Eletroferograma representativo do perfil alélico do indivíduo heterozigoto 356 (cariótipo típico, 46,XY), resultante de um gradiente de temperatura de anelamento para os novos iniciadores específicos ao marcador D21S215. Em (A) está ilustrado o ensaio da QF-PCR correspondente a temperatura de anelamento dos iniciadores em 59ºC. O pseudo-perfil trialélico com dosagem alélica inicialmente de 1:1:1 para os alelos 119pb, 121pb e 133pb reflete a amplificação simultânea das cópias parálogas mapeadas nos cromossomos 18 e 21. Setas em vermelho evidenciam o aumento da especificidade na amplificação dos alelos cromossomo 21 específicos, e consequentemente a redução na amplificação dos alelos correspondentes ao cromossomo 18 nas temperaturas de anelamento de 65ºC - 69ºC.

41

Interessantemente, para o marcador D21S1993, apenas os alelos

específicos ao cromossomo 21 foram amplificados ao longo de todo gradiente de

temperatura (dados não mostrados), o resultado sob a temperatura de

anelamento de 67ºC está representado na figura 16.

Figura 16: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 707 para o marcador D21S1993. Nesse ensaio o indivíduo acometido apresenta um perfil trialélico, caracterizado pelos alelos 165pb e 177pb herdados do genitor materno, e o alelo 180pb herdado do genitor paterno. A dosagem alélica de ~1:1 no genitor materno, e de ~1:1:1 no acometido é indicativo da elevada especificidade do novo par de iniciadores ao cromossomo 21.

Após padronização das condições dos ensaios de amplificação e

discriminação dos alelos cromossomo 21 específicos para os marcadores STR

D21S369 e D21S1993, 20 indivíduos não aparentados geneticamente, foram

selecionados aleatoriamente no banco de DNA NUDIM para tipagem desses

marcadores. As frequências alélicas para cada marcador foram calculadas

utilizando o programa PowerStats, tabelas 5 e 6.

Tabela 5: Frequência alélica do marcador D21S369.

Marcador D21S369

Frequência alélica Alelos 200 202 204 206 208 210

0,05 200 0

0,4 202 0 5

0,1 204 0 1 1

0,1 206 0 1 0 1

0,325 208 2 4 1 1 2

0,025 210 0 0 0 0 1 0

nº de cromossomos 40

Heterozigose observada 55%

42

Tabela 6: Frequência alélica do marcador D21S1993.

Marcador D21S1993

Frequência alélica Alelos 165 177 180

0,025 165 0

0,7 177 1 9

0,275 180 0 9 1

nº de cromossomos 40

Heterozigose observada 50%

5.2 Novos marcadores STR identificados na região pericentromérica do cromossomo 21.

Inserido no objetivo principal deste trabalho, que consiste em uma abordagem

metodológica que conduza a identificação de um novo painel de marcadores STR

altamente informativos para a elucidação inequívoca da origem meiótica da não

disjunção e dos padrões de recombinação na região pericentromérica do

cromossomo 21, foi gerado um mapa combinado físico e de ligação restrito ao

intervalo de 5,4 Mb entre as bandas cromossômicas 21p11.2 e 21q21.1. A análise

dessa região, por genômica computacional comparada, previamente descrita em

materiais e métodos, gerou um painel de 36 marcadores STR inéditos, sendo 10 na

região 21p e 26 na região 21q, tabela 7.

43

Tabela 7: Caracterização dos marcadores STR inéditos mapeados entre as bandas cromossômicas 21p11.2-q21.1.

Marcador Período

(b)

Sequência Localização física (pb) Número Identidade Pontuação

(g)

Índice de

STR (a)

Consenso (c)

NC_000021.7 (d)

de cópias (e)

(%) (f)

Polimorfismo (h)

21p9795799 5 GAATG 9795799-9882591 17326.4 68 29212 1

21p9991707 4 TGGA 9991707-9991797 22.8 93 155 1

21p10017403 4 ATAC 10017403-10017449 11.8 100 94 1

21p10115899 4 AAAT 10115899-10115947 12.3 100 98 1

21p10130327 5 AAAAT 10130327-10130384 11.8 88 91 1

21p10132551 5 TGGTT 10132551-10132602 10.4 100 104 1

21p10139479 4 TAGA 10139479-10139968 122.3 69 244 1

21p10158763 4 GATA 10158763-10159053 78.3 70 164 1

21p10159751 4 TCTT 10159751-10159860 27.5 85 134 2

21p10163941 4 ATAG 10163941-10165344 362.3 65 195 1

21q13295315 4 AAAG 13295315-13295388 18.3 94 130 1

21q13326787 5 AAAAT 13326787-13326846 11.6 92 102 1

21q13519091 5 AAAAC 13519091-13519139 9.8 90 80 1

21q13539322 4 AAAG 13539322-13539456 34.0 89 213 1

21q13562016 4 AAAT 13562016-13562062 11.8 100 94 1

21q13846825 5 TTTTA 13846825-13846952 24.8 87 114 1

21q13889887 5 TTTAT 13889887-13889945 11.6 96 109 1

21q13953231 4 TTCC 13953231-13953337 26.5 92 169 1

21q13997652 4 AAGA 13997652-13997773 31.5 85 168 2

21q14081492 4 GAAA 14081492-14081697 51.5 84 249 2

21q14341331 5 GAGTG 14341331-14341399 13.4 87 84 1

21q14371352 4 GAAA 14371352-14371490 36.0 80 96 2

21q14446264 4 TTTA 14446264-14446310 11.8 100 94 2

21q14507484 4 TTCC 14507484-14507530 11.8 100 94 2

21q14591269 4 TTTA 14591269-14591355 22.8 85 110 3

21q14597752 5 AAAAT 14597752-14597803 10.4 97 86 1

21q14618215 4 AGAA 14618215-14618350 34.3 86 156 3

21q14626534 4 GGAA 14626534-14626709 44.8 75 87 1

21q14649447 4 AAAG 14649447-14649514 17.0 100 136 2

21q14719508 5 TTTTA 14719508-14719560 10.8 95 99 1

21q14770335 4 AAAG 14770335-14770667 82.8 87 319 2

21q14900000 4 ATTT 14900000-14900047 12.0 100 96 1

21q15282614 4 TAGA 15282614-15282681 16.8 90 100 2

21q15311075 4 AAAG 15311075-15311190 28.8 84 128 1

21q15368162 5 TTCTC 15368162-15368262 21.4 93 160 3

21q15414442 4 ATCT 15414442-15414503 15.8 93 108 1

44

(a) Nomenclatura dos novos marcadores STR identificado na região pericentromérica 21p11.2-q21.1. Os novos marcadores foram nomeados de acordo com a região cromossômica seguido da posição física inicial em pares de base de acordo com o genoma primário de referência disponível no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob o código de acesso NC_000021.7.

(b) Período do marcador STR, dado pela extensão em nucleotídeos da unidade de repetição. Por exemplo, período igual a 2, corresponde a uma unidade de repetição constituída por um dinucleotídeo.

(c) Sequência primária em nucleotídeos da unidade de repetição constitutiva do marcador STR.

(d) Localização física em pares de base dos marcadores STR, baseado no genoma humano primário de referência NC_000021.7.

(e) Número de cópias das unidades de repetição constitutiva do marcador STR.

(f) Percentual de homologia dado pelo alinhamento da sequência referência de interesse com

outra perfeita constituída por período, unidade consenso e número de cópias idênticos.

(g) Valor dado pela razão e desconto das penalidades referentes ao tipo de período, número de cópias e percentual de identidade da sequência de interesse.

(h) Predição do polimorfismo in silico, dado pela análise combinada dos três genomas humanos

de referência disponíveis no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob os códigos de acesso: NC_000021.7, AC_000064.1 e AC_000153.1. Para esta análise foi estipulada uma escala de 1-3, sendo índice 1 para a observação de uma única forma alélica, índice 2 para duas variações alélicas, e índice 3 para três variações alélicas em um determinado loco.


Para o desenho dos iniciadores específicos a cada novo marcador STR

identificado, primeiramente uma seleção criteriosa foi realizada de acordo com os

seguintes parâmetros restritivos: (i) mapeados em 21p, somente marcadores STR

com unidades de repetição constituída por sequências simples de tetranucleotídeos

ou pentanucleotídeos, e com número de cópias <35; (ii) mapeados em 21q, somente

marcadores com índice de polimorfismo in silico ≥2, constituídos por sequências

simples de tetranucleotídeos ou pentanucleotídeos, e com número de cópias <35.

A análise genômica computacional da região 21p pericentromérica, revelou

um grau considerável de homologia desta região com outras regiões mapeadas ao

longo do genoma humano (dados não mostrados).

Devido a este elevado grau de homologia, com exceção dos marcadores

21p10115899 e 21p10159751, não foi possível desenhar iniciadores únicos para os

demais marcadores mapeados em 21p, assim, foram selecionados pares de

iniciadores que apresentaram o menor percentual de identidade entre as sequências

45

específicas ao cromossomo 21 e suas cópias parálogas nos demais cromossomos.

Os iniciadores selecionados para os cinco marcadores mapeados em 21p, e o

produto de amplificação esperado para cada marcador estão resumidos na tabela 8.

Tabela 8: Descrição dos iniciadores específicos aos cinco novos marcadores pericentroméricos selecionados em 21p.

Marcador Iniciador A Iniciador B Fluorocromo

Produto (pb)/localização STR (Sentido) (Anti-sentido)

21p9991707 CATGCAGGCTCCTGAGAGTA TCATCCACTAGTCCACAGACAA 6-FAM

351pb/cromossomo 21

308pb/cromossomo 13

312pb/cromossomo Y

21p10017403 CCTGGATGACATAGTGAGACC CAGCAATCAGGTTTTATAAGGAAA VIC 362pb/cromossomo 21

342pb/cromossomo 7

21p10115899 CTGCAAGGAGCCATGATTG ATGTGCAGTTTTGCCAGAGG 6-FAM 150pb/cromossomo 21

21p10132551

GGGAGACAGTGAGAAGGTTG CCTGGACAATGGAGCAAGAC

NED

158pb/cromossomo 21

123pb/cromossomo 22

GGGAGACAGTGAGAAGGTTG CCAGCCTGGACAATGGAG 161pb/cromossomo 21

126pb/cromossomo 22

GGGAGACAGTGAGAAGGTTG ACTGTACTCCAGCCTGGACAATG 173pb/cromossomo 21

138pb/cromossomo 22

21p10159751 TGGCACCTTCCTGCTAAATC TGGGCGATAGAGCAAGACTC PET 235pb/cromossomo 21

Para a validação experimental dos novos iniciadores em 21p, um primeiro

ensaio baseado em um gradiente de temperatura de anelamento de 59ºC – 69ºC foi

realizado. Embora a validação por BLAST (Basic Local Alignment Search Tool -

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) dos marcadores 21p10115899 e 21p10159751 tenham

os definido como únicos ao cromossomo 21, os dados experimentais demonstraram

a amplificação de múltiplos sítios mesmo em temperatura de anelamento de 69ºC

(figura 17 e 18).

Figura 17: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico, 46,XY). Em (A) e (B) está representado o perfil alélico referente a amplificação do marcador 21p10115899 sob as temperaturas de anelamento de 59ºC e 69ºC. Em ambos os ensaios, múltiplos sítios foram amplificados. Setas em vermelho evidenciam a redução na detecção de produtos inespecíficos na temperatura de anelamento de 69ºC.

46

Figura 18: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico, 46,XY). Em (A) e (B) está representado o perfil alélico referente à amplificação do marcador 21p10159751 sob as temperaturas de anelamento de 59ºC e 69ºC. Em ambos os ensaios, múltiplos sítios foram amplificados.

Quanto aos demais marcadores sabidamente não únicos selecionados em

21p, apenas para o marcador 21p9991707 foi observado a redução na amplificação

de produtos inespecíficos como indicativo do aumento da especificidade ao

cromossomo 21 na temperatura de anelamento >65ºC (figura 19).

Figura 19: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico, 46,XY) resultante de um gradiente de temperatura de anelamento para os iniciadores específicos ao marcador 21p9991707. Em (A), (B), (C) e (D) estão ilustrados os ensaios com as temperaturas de anelamento de 59ºC, 65ºC, 67ºC e 69ºC, respectivamente. No retângulo em vermelho estão delimitados os alelos 354pb e 358pb, os quais são específicos ao cromossomo 21. As setas em vermelho nos ensaios (B), (C) e (D) enfatizam a redução na detecção de produtos inespecíficos em temperaturas de anelamento > 59ºC.

47

Quanto aos marcadores selecionados em 21q, apenas o 21q13539322

mostrou-se não único por validação computacional, com cópia paráloga mapeada no

cromossomo 2 (figura 20).



1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 *********************AACCTGGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCC

2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 *********************AACCTGGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCC

**************************************************

1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 GAGGTCACGCCATTGTACTACAGCCTGAGTGACAGGAGAAAAACTCCATC

2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 GAGGTCATGCCATTGTACTACAGCCTGAGTGATAGGAGCAAAACTCCATC

******* ************************ ***** ***********

1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 TCAAAAAAAAGAAAGAAAGAGGAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGA

2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 TCAAAAAAAAGAAAGAAAGAGGAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAGAGAGAGA

****************************************** *** ***

1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 AAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAAAAG

2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 AAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGCAAGCAA----

*************************************** *** **

1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 AAAGAAAGAGAGAAAGAGAGAAAGAGAAAGAAAGAAAGAAAGCTAATAAA

2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 -----------------------------------------GCTAATAAA

*********

1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CACCATAACAATGTTTCTTTCTCTGAATTCTTTTAGAACTTGCTAAGCAT

2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 CACCATAACAATGTTTCTTTCTCTGAATTCATTTAGAACTTGCTAAGCAT

****************************** *******************

1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CCTAATGTAGTTATCAATGAGGAATCGTATACT*****************

2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 CCTAATGAAGTTATCAATGAGGAATCGTATACT*****************

******* ******************************************

1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 GCGA

2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 GCAA

** *

Figura 20: Alinhamento das sequências de referência do marcador 21q13539322. As sequências referência para o marcador 21q13539322 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente, e em amarelo as regiões sem correspondência entre a cópia paráloga mapeada no cromossomo 12 (genoma referência NC_000002.10) e a sequência referência no cromossomo 21 (NC_000021.7).

A validação experimental com os iniciadores para o marcador 21q13539322

em um gradiente de temperatura, demonstrou o aumento da especificidade para o

cromossomo 21 na temperatura de anelamento de 67 ºC (figura 21).

48

Figura 21: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico, 46,XY), resultante de um gradiente de temperatura de anelamento para os iniciadores específicos ao marcador 21q13539322. Em (A), (B) e (C) estão ilustrados os ensaios correspondentes as temperaturas de anelamento de 59ºC, 67ºC e 69ºC, respectivamente. Setas em vermelho evidenciam os alelos cromossomo 18 específicos. A redução na amplificação dos alelos 310pb e 314pb no ensaio (C) é indicativo do aumento da especificidade do par de iniciadores à região mapeada no cromossomo 21 nas temperaturas de anelamento superiores a 59ºC.

Informações sobre os iniciadores específicos ao marcador 21q13539322, e

aos demais STR pericentroméricos selecionados na região 21q estão resumidas na

tabela 9.

Tabela 9: Descrição dos iniciadores específicos aos seis novos marcadores pericentroméricos selecionados em 21q.

Marcador Iniciador A Iniciador B Fluorocromo

Produto (pb)/localização STR (Sentido) (Anti-sentido)

21q13539322 CTGAGGCTGGAGATTGGTGT TCGCACATCTTCTTACAATGC VIC 354pb/cromossomo 21

309pb/cromossomo 2

21q14446264 TGGTTAGGAAAAACACTCCAATG TTGAACCCAGGAGGTGGA VIC 205pb/cromossomo 21

21q14507484 TTGGCCAACCTCCTTTCCT TTCAGTACCTAAGACAATCTTTGACA 6-FAM 235pb/cromossomo 21

21q14591269 GACCTGGCTAATTTTCATTTTGA GGAGGAAAAATGTGATTCAGG NED 308pb/cromossomo 21

21q14618215 GGAGCTGAAGAACCTGCCTA TTCCTGTCTCCTCCCCTCTT NED 210pb/cromossomo 21

21q15368162 TCCCAGGAGGACTAATCCAG ATTGCCTGAGCCCCAGAG PET 362pb/cromossomo 21

49

5.3 Padronização do ensaio QF-PCR multiplex para a tipagem dos cinco novos marcadores pericentroméricos únicos identificados na região 21q.

Para a padronização de um ensaio multiplex (reação de amplificação

simultânea de múltiplos locos) para a tipagem dos marcadores 21q14446264,

21q14507484, 21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162, cada par de iniciadores

a uma concentração de 0,8µM foi validado experimentalmente com gradientes de

temperatura de anelamento de 58ºC – 63ºC, concentrações de MgCl2 de 0,5 mM – 2

mM e concentrações de DNA alvo de ~1 – 4 ng. Individualmente, os melhores

resultados foram: (i) temperatura de anelamento igual a 59ºC; (ii) concentração de

MgCl2 igual a 2 mM; e (iii) concentração de DNA de ≈2ng, e estes foram os

parâmetros para o primeiro ensaio multiplex (figura 22).

Figura 22: Eletroferograma representativo do primeiro ensaio da QF-PCR multiplex. Os marcadores utilizados foram: 21q14446264, 21q14507484, 21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162. As condições deste ensaio foram mantidas em: (i) concentração de 0,8µM de cada par de iniciadores; (ii) concentração de 2ng de DNA alvo; (iii) concentração de 2mM de Mgcl2; (iv) ciclos térmicos com temperaturas de desnaturação, anelamento e extensão dos iniciadores de 94ºC, 59ºC e 72ºC, respectivamente.

Para a otimização do ensaio da QF-PCR multiplex, um segundo teste foi

realizado baseado em uma curva de concentração dos iniciadores de 0,08µM-

1,2µM. Ao final dos testes, o ensaio denominado Mpxcen21 (figura 23) foi otimizado

nas seguintes condições: (i) concentração dos iniciadores de 0,8µM (21q14446264),

0,64µM (21q14507484), 0,32µM (21q14591269), 0,08µM (21q14618215) e 1,2µM

(21q15368162); (ii) Tampão pH 8,3 com 15mM de Tris-HCl, 50mM KCl e 2mM de

50

MgCl2, (iii) 1,25 U da enzima Taq Gold polimerase, (vi) ciclos térmicos com hotstart a

95ºC por 11 minutos, desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 59ºC por 1

minuto, extensão 72ºC por 1 minuto, e extensão final a 60ºC por 60 minutos (tabela

10)

Tabela 10: Descrição dos parâmetros para otimização do ensaio Mpxcen21.

Ensaio Mpxcen21

Iniciadores: Concentração (µM)

21q14446264 0,8µM

21q14507484 0,64µM

21q14591269 0,32µM

21q14618215 0,08µM

21q15368162 1,2µM

Tampão: 15mM de Tris-HCl

50mM KCl

2mM de MgCl2

pH 8,3

Enzima Taq Gold Polimerase: 1,25U

Volume final da reação: 12,5µL

Ciclos térmicos: 28X

Desnaturação 94˚C/1min

Anelamento 59˚C/1min

Extensão 72˚C/1min

Extensão final 60˚C/60min

Figura 23: Eletroferograma representativo do ensaio da QF-PCR multiplex otimizado. As condições ótimas deste ensaio foram: (i) concentração de 2ng de DNA alvo; (ii) concentração de 2mM de Mgcl2; (iii) ciclos térmicos com temperaturas de desnaturação, anelamento e extensão dos iniciadores de 94ºC, 59ºC e 72ºC, respectivamente. (vi) concentração dos iniciadores em 0,8µM para o marcador 21q14446264; 0,64µM para o 21q14507484; 0,32µM para o 21q14591269; 0,08µM para o 21q14618215; e 1,2µM para o 21q15368162.

51

5.4 Validação experimental do Mpxcen21 na identificação dos eventos de recombinação e na determinação das origens da não disjunção do cromossomo 21.

Para a validação do Mpxcen21 (21q14446264, 21q14507484, 21q14591269,

21q14618215 e 21q15368162) foi utilizada uma coorte composta por 60 núcleos

familiares com pelo menos um acometido pela SD. Para análise global de

recombinação ao longo da região 21q foram adicionados a este estudo cinco

marcadores STR amplamente utilizados no diagnóstico da trissomia 21: D21S11,

D21S226, D21S1270, IFNAR e D21S1411. A tipagem desses marcadores foi

otimizada em ensaio multiplex, e este ensaio foi denominado Mpx21. Informações

sobre os marcadores STR incluídos no Mpx21 estão resumidas na tabela 11.

Tabela 11: Descrição dos marcadores STR incluídos no Mpx21.

Marcador Mapa físico (pb) Iniciador A Iniciador B Fluorocromo Referência

STR NC_000021.7 (Sentido) (Anti-sentido)

D21S11 19.476.380 TTTCTCAGTCTCCATAAATATGTG GAGAACATTGACTAATACAACATC 6-FAM (Mann et al., 2001)

D21S226 30.263.730 GCAAATTTTGCTGGATGGGATTAACAG AGAATAACTACAGACATTTAGCTT 6-FAM (Mann et al., 2001)

D21S1270 30.628.990 CTATCCCACTGTATTATTCAGGGC TGAGTTTCCAGGTTGCAGGTGACA VIC (Mann et al., 2001)

IFNAR 33.639.130 CATTTGATCTTAGCCATCTATTGC TAGTCTTTCAAATGGCTGCATAGT PET (Mann et al., 2001)

D21S1411 43.034.040 ATGATGAATGCATAGATGGATG AATGTGTGTCCTTCCAGGC NED (Mann et al., 2001)

De acordo com a tipagem do Mpxcen21, dos 60 núcleos familiares

analisados, em 59 casos (98,33%) os eventos de não disjunção foram determinados

como erros de origem materna. Destes, 72,88% foram correspondentes a erros em

MI e 27,12% a erros em MII.

Nas Figuras 24, 25 e 26 estão representados os eletroferogramas de alguns

núcleos familiares analisados.

Na tabela 12, estão resumidos a distribuição da idade materna, as origens da

não disjunção do cromossomo 21 e os eventos de recombinação identificados na

população de estudo. Realçados em cinza estão os eventos de recombinação

observados. Realçados em vermelho os eventos de recombinação inferidos pela

transição da heterozigose parental para homozigose no acometido, ou processo

inverso, entre os ensaios Mpx21 e Mpxcen21.

52

Figura 24: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 03 para os marcadores 21q14507484, 21q14618215 e IFNAR. Nos cenários 1 e 2 estão ilustrados os perfis alélicos para os marcadores 21q14507484 e 21q14618215 (Mpxcen21), respectivamente. Em ambos os cenários a heterozigose materna, correspondente aos alelos 232pb/248pb (21q14507484) e 188pb/194pb (21q14507484) foi mantida no acometido. Estes dados são indicativos de não disjunção de origem materna durante a MI. No cenário 3 estão ilustrados os perfis alélicos para o marcador IFNAR (Mpx21). Neste cenário, a heterozigose materna, correspondente aos alelos 395pb/400pb foi reduzida a homozigose no acometido (alelo 400pb em dose dupla). Este evento de transição da heterozigose materna (perfil alélico - 395pb/400pb) para homozigose (perfil alélico – 400pb) no acometido é indicativo da ocorrência de um evento de recombinação na região delimitada pelos marcadores 21q14507484 e IFNAR.

53

Figura 25: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 43 para os marcadores 21q14507484 e 21q14618215. Nos cenários 1 e 2 estão ilustrados os perfis alélicos para os marcadores 21q14507484 e 21q14618215 (Mpxcen21), respectivamente. Em ambos os cenários a heterozigose materna, correspondente aos alelos 236pb/244pb (21q14507484) e 200pb/208pb (21q14507484) foi reduzida a homozigose no acometido. Estes dados são indicativos de não disjunção de origem materna durante a MII.

54

Figura 26: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 24 para os marcadores 21q14507484 e 21q15368162. Nos cenários 1 e 2 estão ilustrados os perfis alélicos para os marcadores 21q14507484 e 21q15368162 (Mpxcen21), respectivamente. Em ambos os cenários a heterozigose paterna, correspondente aos alelos 228pb/240pb (21q14507484) e 349pb/367pb (21q15368162) foi reduzida a homozigose no acometido. Estes dados são indicativos de não disjunção de origem paterna durante a MII.

55

Tabela 12: Dados comparativos quanto às origens da não disjunção para os ensaios Mpx21 e Mpxcen21.

Núcleo Origem parental Idade materna

Origem Meiótica

Familiar Mpx21 Mpxcen21

nº 01 Materna 15,1 Meiose I Meiose I

nº 02 Materna 14,1 Recombinação Meiose II

nº 03 Materna 35 Recombinação Meiose I




nº 07 Materna 39,9 Recombinação Meiose I

nº 08 Materna 26,2 Meiose II Meiose II

nº 09 Materna 24 Meiose I Meiose II - Recombinação


nº 11 Materna 22,1 Meiose I Meiose II



nº 14 Materna 40,1 Recombinação Meiose II - Recombinação









nº 23 Materna 38,6 Meiose I Meiose II - Recombinação

nº 24 Paterna 19,1 Recombinação Meiose II







56


Núcleo Origem parental Idade materna

Origem Meiótica

Familiar Mpx21 Mpxcen21


nº 32 Materna 34 Meiose I Meiose I







nº 39 Materna 28 Meiose I Meiose II



















nº 58 Materna 36 Meiose I Meiose II



Para uma melhor compreensão da distribuição dos marcadores STR utilizado

para o rastreio dos eventos de recombinação em 21q, estes foram agrupados nos 6

intervalos propostos por Oliver et al. (2008), figura 27.

57

Para predição da freqüência e localização dos eventos de recombinação

entre os marcadores utilizados nesse estudo, um mapa genético foi construído

através de informações do mapa combinado físico e de ligação para o genoma

humano (Rutgers Map). Para efeitos de comparação foram somados a este mapa

genético os marcadores STR utilizados por Oliver et al. (2008), tabela 13.

Figura 27: Localização dos marcadores STR mapeados em 21q, incluídos no Mpxcen21 e Mpx21. A região foi dividida em seis intervalos conforme os critérios usados por Oliver et al. (2008) para efeitos de comparação.

58

Tabela 13: Mapa combinado físico e de ligação para os marcadores STR utilizados no presente estudo e por Oliver et al. (2008).

Marcador Posição física (pb)* Distância genética para

mulheres(cM)** Distância genética para

homens(cM)** Distância genética média

para os sexos(cM)**

D21S369 13678220-13678394 0 0 0

D21S215 13719788-13719968 0,1681 0,0999 0,1548

D21S1993 14375677-14375805 3,9302 0,9448 2,6063

21q14446264 14446264-14446310 4,3029 1,0443 2,8524

21q14507484 14507484-14507530 4,6232 1,1318 3,0629

D21S258 14548154-14548345 4,8377 1,1905 3,2013

21q14591269 14591269-14591355 5,0571 1,2532 3,3467

21q14618215 14618215-14618350 5,1935 1,2926 3,437

D21S120 14684025-14684337 5,5219 1,3899 3,655

21q15368162 15368162-15368262 8,608 2,4732 5,7487

D21S1431 15394402-15394573 8,7157 2,5186 5,8243

D21S1904 15432268-15432423 8,8692 2,5849 5,9329

D21S192 15705975-15706170 9,9278 3,089 6,702

D21S1432 16265317-16265448 11,7337 4,0975 7,9371

D21S11 19476134-19476354 25,3931 6,6734 15,8638

D21S2053 20277992-20278249 27,481 7,3185 17,1451

D21S1914 24544272-24544482 37,2615 12,092 24,4582

D21S226 30263502-30263663 48,239 17,3844 32,613

D21S1270 30628632-30628821 48,423 17,7298 32,8716

D21S1908 31164942-31165157 48,9783 18,4077 33,48

D21S224 32778121-32778253 51,5302 21,6772 36,2912

IFNAR 33638892-33639126 54,0974 22,2069 37,8937

D21S1222 36849899-36850135 61,0122 29,244 44,9195

D21S168 39867392-39867505 65,9523 35,1464 50,3245

D21S212 42026060-42026294 76,3695 41,9333 58,7195

D21S1411 43033739-43034036 79,8246 45,7786 62,4449

D21S1890 43672606-43672758 80,3927 47,3282 63,5396

D21S1446 46862013-46862233 81,5108 59,2376 69,9721

(*) Localização física em pares de base dos marcadores STR disponível no banco de dados do Centro Nacional

de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob os códigos de

acesso: NC_000021.7.

(**) Distância genética dos marcadores STR dada pelo mapa genético humano Rutgers (Rutgers Map Vs.2, (Matise, 2007). Para os novos marcadores STR pericentroméricos identificados no presente estudo as distâncias genéticas (em centiMorgan – cM) foram estipuladas por meio de interpolação das distâncias físicas e genéticas dos marcadores STR já descritos.

59

Eventos de recombinação na região pericentromérica foram identificados em

3 casos com não disjunção de origem materna em MII. Em 2 casos foi possível

determinar com precisão o ponto de recombinação entre dois marcadores

adjacentes, 21q14618215 e 21q15368162 (fragmento cromossômico de 749Kb). Os

perfis alélicos determinados para cada núcleo familiar estão resumidos nas tabelas

14, 15 e 16.

Tabela 14: Perfil alélico determinado para o núcleo familiar nº 09.

(*) Alelos Caracterizados

Marcador Genitor

Materno Acometido

Genitor Paterno

Estágio Meiótico

21q14446264 199 199 199 199 199 199 199 Não informativo


21q14591269 297 301 297 297 305 297 305 MII

21q14618215 182 204 182 182 196 194 196 MII

21q15368162 349 359 349 359 373 353 373 MI



Marcador Genitor

Materno Acometido

Genitor Paterno

Estágio Meiótico




21q14618215 188 196 196 196 200 200 202 MII

21q15368162 357 363 357 363 357 353 359 MI



Marcador Genitor

Materno Acometido

Genitor Paterno

Estágio Meiótico

21q14446264 199 203 199 199 199 199 203 MII




21q15368162 357 367 357 367 357 357 357 MI

De acordo com a distância genética predita (para mulheres) por interpolação

do mapa combinado físico e de ligação, entre os marcadores 21q14618215 e

21q15368162 incluídos no Mpxcen21, são esperados 3,7% de recombinação.

60

De maneira mais ampla, entre a região total delimitada pelo Mpxcen21

(21q14446264 – 21q15368162) são esperados 4,3% de recombinação. Assim

sendo, os eventos de recombinação observados entre os marcadores 21q14446264

– 21q15368162 (5%) e 21q14618215 e 21q15368162 (3,38%) estão de acordo com

a freqüência esperada.

Dentre todos os casos de origem materna, eventos de recombinação na

região mediana e distal delimitadas pelo Mpx21, foram identificados em 15 (25,4%)

indivíduos acometidos. Em seis casos foi possível determinar com precisão o ponto

de recombinação. Destes, um evento de recombinação (1,7%) foi observado entre

os marcadores D21S11 e D21S226; um evento (1,7%) entre os marcadores

D21S1270 e IFNAR; e quatro eventos (6,8%) entre os marcadores IFNAR e

D21S1411.

De acordo com o mapa genético gerado por interpolação para mulheres, as

freqüências esperadas de eventos de recombinação entre os marcadores D21S11 e

D21S226; D21S1270 e IFNAR; IFNAR e D21S1411 são de 22,8%, 5,7% e 26,7%,

respectivamente.

A frequência reduzida de eventos de recombinação entre os marcadores

mapeados na região não pericentromérica, que se afasta grandemente do

percentual de eventos de recombinação esperado, pode ser explicado pelo grande

número de casos recombinantes não informativos quanto ao ponto de

recombinação.

5.5 Percentual de informativo do ensaio Mpxcen21 na determinação das origens da não disjunção do cromossomo 21.

O Mpxcen21 apresentou um elevado potencial informativo na determinação

das origens da não disjunção. Quanto à origem meiótica, em 100% dos casos

analisados pelo menos um marcador STR foi informativo (gráfico 4).

Quanto à origem parental, em 95% dos casos pelo menos um marcador STR

foi informativo (gráfico 5). Para os 5% dos casos restantes, onde o Mpxcen21 não

foi informativo, a origem parental foi determinada através da análise dos marcadores

incluídos no Mpx21.

61

Gráfico 4: Percentual informativo dos marcadores STR incluídos no Mpxcen21 na determinação do estágio meiótico da não disjunção.

Gráfico 5: Percentual informativo dos marcadores STR incluídos no Mpxcen21 na determinação da origem parental da não disjunção.

100% 98%

77%

43%

17%

60 5946

26

10

1 2 3 4 5

Número de marcadores informativos

Frequência Relativa Frequência absoluta

5%

95%

65%

32%

12%2%3

57

39

19

71

0 1 2 3 4 5

Número de marcadores informativos

Frequência relativa Frequência absoluta

62

5.6 Determinação do risco relativo para a não disjunção de origem materna em MI e MII na população de estudo.

Para o cálculo do RR na população de estudo, os 59 casos de origem

materna foram subdivididos de acordo com as variáveis dependentes e de desfecho.

Foram considerados como variável de desfecho os estágios meióticos da não

disjunção (MI e MII), e como variáveis de exposição ao risco, idade materna no

momento da concepção (subdividida em três faixas etárias: <29; 29-34, >34 anos), e

perfis de recombinação (recombinação pericentromérica, recombinação não

pericentromérica, e ausência de recombinação).

Para análise estatística foram aferidas as frequências das variáveis de

exposição ao risco (idade materna e perfis de recombinação) e realizadas análises

bivariadas com as variáveis de desfecho (MI e MII).

Quanto a variável idade materna no momento da concepção, não houve

diferença significativa entre as faixas etárias materna, com valor de p igual a 0,543,

0,7128, e 0,7765 para as faixas etárias materna <29, 29-34, e >34 anos,

respectivamente (tabela 17).

Tabela 17: Risco relativo para a não disjunção em MI e MII associado à variável de exposição idade materna no momento da concepção.

Variável Idade Materna

Total MI Total MII

n (%) n (%) RR (a)

(IC 95%) p n (%) n (%) RR (a)

(IC 95%) p

< 29 anos 43 (100) 14 (32,55) 0,87 (95% CI: 0,62-1,24) 0,543 16 (100) 7 (43,75) 1,41 (95% CI: 0,61-3,23) 0,543

29 - 34 anos 43 (100) 8 (18,60) 1,12 (95% CI: 0,78-1,60) 0,7128 16 (100) 2 (12,50) 0,70 (95% CI: 0,19-2,61) 0,7128

> 34 anos 43 (100) 21 (48,85) 1,06 (95% CI: 0,77-1,44) 0,7765 16 (100) 7 (43,75) 0,86 (95% CI: 0,37-2,01) 0,7765

(a) Risco relativo.

Quanto às variáveis de exposição ao risco: recombinação pericentromérica e

não pericentromérica, e ausência de recombinação, diferenças significativas foram

observadas entre os desfechos em MI e MII. Nos casos com desfecho em MI, houve

associação entre as variáveis, ausência de recombinação com RR= 1,96 (IC 95%:

1,22-3,14; p=0,0005) atuando como fator de risco, e recombinação não

pericentromérica, com RR <1 (RR=0,59; IC 95%: 0,37-0,93; p=0,0114)

caracterizando um efeito protetor para a não disjunção. Enquanto, nos casos com

63

desfecho em MII, houve associação entre as variáveis “recombinação

pericentromérica”, com RR= 4,31 (IC 95%: 2,68-6,94, p=0,0172), e “recombinação

não pericentromérica”, com RR= 3,25 (IC 95%: 1,38-7,65; p=0,0114) atuando como

fator de risco, e “ausência de recombinação”, com RR <1 (RR=0,20; IC 95% 0,07-

0,54; p=0,0005), caracterizando um efeito protetor (tabela 18).

Tabela 18: Risco relativo para a não disjunção em MI e MII associado à variável de exposição recombinação ao longo de 21q.

Variável Recombinação Total MI MII

n (%) n (%) RR (a)

(IC 95%) p n (%) RR (a)

(IC 95%) p

Recombinação Global

Presença 22 (37,2) 10 (23,3) 0,51 (0,32-0,82) 0,0005 12 (75) 5,05 (1,85-13,73) 0,0005

Ausência 37 (62,7) 33 (76,7) 1,96 (1,22-3,14) 0,0005 4 (25) 0,20 (0,07-0,54) 0,0005

Recombinação Pericentromérica

Presença 3 (5,1) 0 (0) 0

3 (18,75) 4,31 (2,68-6,94) 0,0172

Ausência 56 (94,9) 43 (100) NA

13 (81,25) 0,232 (0,144 to 0,374) 0,025

Recombinação não Pericentromérica

Presença 20 (33,9) 10 (23,3) 0,59 (0,37-0,93) 0,0114 10 (62,5) 3,25 (1,38-7,65) 0,0114

Ausência 39 (66,1) 33 (76,7) 1,692 (1,07-2,676) 0,012 6 (37,5) 0,308 (0,131-0,725) 0,012

Total 59 (100) 43 (72,9) 16 (27,1)

(a) Risco relativo.

5.7 Dados populacionais para os cinco marcadores STR incluídos no Mpxcen21.

Para a determinação das frequências alélicas dos cinco marcadores STR:

21q14446264, 21q14507484, 21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162, que

constituem o Mpxcen21, foram utilizados 220 indivíduos não relacionados

geneticamente, 100 indivíduos provenientes do banco de DNA do Núcleo de

Diagnóstico e Investigação Molecular (NUDIM), e 120 indivíduos correspondentes

aos genitores dos 60 núcleos familiares pertencentes a este estudo. Na tabela 19,

está resumida as frequências alélicas observadas para o Mpxcen21.

64

Tabela 19: Frequências alélicas para os marcadores STR 21q14446264, 21q14507484, 21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162 (n = 220 indivíduos).

Alelos Marcador Marcador Marcador Marcador Marcador

21q14446264 21q14507484 21q14591269 21q14618215 21q15368162

168

0,002

172

0,002

178

0,005

180

0,005

182

0,03

184

0,032

186

0,016

188 0,025

0,059

190 0,036

192

0,068

194 0,02

0,093

196

0,141

198 0,359

0,098

200

0,164

202 0,543

0,059

204

0,136

206 0,016

0,023

208

0,048

212

0,014

216

0,002

0,007

220

0,005

224

0,061

228

0,136

232

0,386

236

0,1

240

0,198

278

0,005

296

0,198

300

0,216

304

0,582

325

0,002

335

0,023

340

0,011

345

0,05

350

0,136

355

0,168

360

0,225

365

0,168

370

0,175

375

0,034

378

0,002

380 0,005

65

Para efeitos de comparação a população de estudo foi dividida em 3 grupos:

(i) somente os 100 indivíduos do banco de DNA NUDIM; (ii) somente os 120

indivíduos provenientes dos genitores dos núcleos familiares FAMERP; e (iii) a soma

do primeiro e segundo grupo, totalizando 220 indivíduos. Interessantemente, o

percentual de heterozigose e o nível de equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) foi

variável entre os grupos A, B e C, tabelas 20, 21 e 22. Isto pode ser devido ao

pequeno tamanho amostral, que influencia particularmente as frequências de alelos

raros (isto é, a aparente ocorrência de alelos privativos em cada grupo). Também

não pode ser excluída a possibilidade de existirem diferenças intrínsecas a cada

população. Por exemplo, diferentes graus de endogamia, levando a um excesso de

homozigotos e portanto à frequências elevadas desses alelos nas populações.

Ressalta-se que o fato de alguns marcadores se encontrarem em desequilíbrio de

Hardy-Weinberg (DHW) não impede a sua utilização em diagnóstico molecular das

origens parentais da não disjunção.

Tabela 20: Dados populacionais para o Grupo A (n = 100).

(*) Marcador Marcador Marcador Marcador Marcador

21q14446264 21q14507484 21q14591269 21q14618215 21q15368162

N 200 200 200 200 200

H 0,52 0,77 0,65 0,84 0,81

PD 0,723 0,915 0,746 0,97 0,945

PIC 0,48 0,75 0,53 0,87 0,83

PE 0,206 0,545 0,355 0,675 0,618

p 0,09047 0,58273 0,00782 0,86403 0,00233

Tabela 21: Dados populacionais para o Grupo B (n = 120).


21q14446264 21q14507484 21q14591269 21q14618215 21q15368162

N 240 240 240 240 240

H 0,608 0,775 0,533 0,817 0,8

PD 0,716 0,908 0,749 0,975 0,944

PIC 0,5 0,72 0,5 0,9 0,8

PE 0,301 0,553 0,218 0,63 0,599

p 0,11123 0,88887 0,7479 0,0001 0,9119

66

Tabela 22: Dados populacionais para o Grupo C (n = 220).


21q14446264 21q14507484 21q14591269 21q14618215 21q15368162

N 440 440 440 440 440

H 0,566 0,733 0,586 0,827 0,805

PD 0,728 0,915 0,754 0,979 0,951

PIC 0,5 0,74 0,51 0,89 0,82

PE 0,254 0,549 0,275 0,651 0,608

p 0,04562 0,5095 0,02143 0,1345 0,12447

()Definições segundo Butler, 2005.

N: Número de Cromossomos.

H: Heterozigose, calculada pelo percentual de indivíduos heterozigotos na

população de estudo.

PD: Poder de discriminação, probabilidade de discriminação, é igual a 1 menos a

soma do quadrado das frequências dos genótipos (PD = 1-P1).

PIC: Conteúdo de informação de polimorfismo, reflete a probabilidade de um dos

descendentes de um dos progenitores portador de um alelo não frequente em

um determinado lócus, permitir a dedução do genótipo parental neste loco. O

valor PIC é determinado pela soma das frequências de cruzamentos

multiplicada pela probabilidade de que um descendente seja informativo.

PE: Poder de exclusão, probabilidade de exclusão pode ser determinada pela

fórmula PE = H2 (1-(1 – H)H2, onde H é a heterozigose.

p: Teste exato de equilíbrio de Hardy-Weinberg. A interpretação de p é,

assumindo equilíbrio, qual fração dos genótipos aleatórios (isto é, entre um

número definido de simulações) poderia ser menos provável que a fração de

genótipos observados. Se os valores de p forem menores que 0,05, deve-se

duvidar da hipótese. Se os valores p forem maiores que 0,95, os dados estão

muito perfeitos para serem verdadeiros.

67

6. DISCUSSÃO

Os eventos de pareamento e recombinação meiótica são fundamentalmente

importantes para assegurar a correta segregação dos cromossomos homólogos e

cromátides-irmãs durante a gametogênese humana (Robles, 2007)

Alterações nesses eventos foram primeiramente descritos por Lamb et al.

(1996) como fatores de risco para a não disjunção do cromossomo 21 na síndrome

de Down.

Diversos estudos posteriores envolvendo a análise de segregação alélica de

marcadores STR em diferentes populações observaram de maneira consistente a

existência de alguns padrões de recombinação ao longo da região 21q de

cromossomos não disjuntos, caracterizados por ausência de troca, e trocas únicas

na região pericentromérica ou telomérica (Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman,

2000; Lamb et al., 2005; Sherman et al., 2006; Ghosh et al., 2009).

Contudo, em todos esses estudos, por motivos históricos, foi

predominantemente utilizado um conjunto de 14-40 marcadores STR distribuídos

entre 6-12 intervalos de igual extensão física em 21q(Lamb et al., 2005; Sherman et

al., 2006; Oliver et al., 2008; Ghosh, 2009; Ghosh et al., 2010), porém de maneira

aleatória no que se refere à distância genética (em centiMorgan - cM) entre eles.

Aproximadamente 85,7% deste conjunto de marcadores STR amplamente

utilizados são do tipo dinucleotídeo e trinucleotídeo. Limitações técnicas importantes,

intrínsicas à amplificação de marcadores com estes períodos podem ser

observadas. Estas consistem na amplificação de subprodutos denominados stutters,

múltiplos dos alelos verdadeiros que dificultam a designação alélica (Ellegren, 2004),

e a amplificação preferencial do alelo menor.

Adicionalmente, a utilização dos marcadores STR dinucleotídeos, não únicos,

D21S369, D21S215 e D21S1993 podem conduzir a falsos resultados no diagnóstico

da trissomia 21, na determinação das origens da não disjunção, e não menos

importante, no estabelecimento dos padrões de recombinação na região

pericentromérica, particularmente aqueles preditos como fatores de riscos para a

não disjunção.

68

Por exemplo, em um estudo no Canadá, foram analisadas quatro gerações de

uma família com quatro casos de síndrome de Down. Perfis dialélico na proporção

de 2:1 para o marcador D21S369 e trialélico na proporção de 1:1:1 para o marcador

D21S215 foram caracterizados na mãe e na avó materna de um indivíduo

acometido. Com base nesses dados, os autores especularam sobre a existência de

uma duplicação dessa região que poderia estar associada com alterações nos

eventos de recombinação e consequentemente com a frequência de trissomia 21

observada neste núcleo familiar. Contudo, os próprios autores não confirmaram esta

hipótese, visto que esta observação não foi consistente para os outros três casos

(Gair et al., 2005).

No presente estudo, utilizando os marcadores D21S369 e D21S215, um

cenário idêntico com dosagem alélica de 2:1 e 1:1:1 foi observado em casais

fenotipicamente normais com prole não acometida. Assim, este perfil genético deve

ser atribuído a alelos adicionais derivados de cópias parálogas destes marcadores

STR nos cromossomos 18 e 21, como validado computacionalmente, e não a uma

duplicação dessa região no cromossomo 21, contrário ao sugerido no estudo de Gair

et al. (2005).

Por análise computacional comparada foi possível mensurar o percentual de

identidade das sequências destes marcadores e suas cópias parálogas. Em

fragmentos que se estendem 500pb a montante e a jusante, similariedades entre os

cromossomos 21, 18 e 12 estão em torno de 93,16%, 98,12% e 80,15% para os

marcadores D21S369, D21S215 e D21S1993, respectivamente.

Este elevado percentual de identidade pode ser atribuído a presença de

genes truncados gerados por duplicação cromossômica, e sequências repetidas

interespaçadas do tipo LTR (Long Terminal Repeat) e Alu, acumuladas na região

pericentromérica do cromossomo 21 por transposição durante o processo evolutivo

dos primatas (Brun et al., 2003).

Assim, a região pericentromérica do cromossomo 21 apresenta homologia

com diversas outras regiões no genoma. No presente estudo, esta alta densidade

de cópias parálogas foi um fator limitante na identificação de novos marcadores STR

únicos na região 21p11.2-q21.1.

69

Dos 36 marcadores STR identificados, apenas cinco mapeados em 21q

apresentaram unicidade ao cromossomo 21: 21q14446264, 21q14507484,

21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162.

Os marcadores 21p9991707 e 21q13539322 apesar de não serem únicos,

devido a correspondência incompleta dos iniciadores entre a sequência alvo e suas

cópias parálogas, com a aplicação de variações nas condições de amplificação foi

possível discriminar de maneira acurada os alelos cromossomo 21 específicos,

validando a utilização desses marcadores na construção de mapas genéticos, visto

que o marcador 21p9991707 é o primeiro marcador STR mapeado em 21p

enquanto o marcador 21q13539322 o primeiro mapeado em 21q.

Um estudo recente, envolvendo a análise de recombinação em ovócitos

através da detecção por imunofluorescência de proteínas participantes dos

processos de permuta genética, demonstrou que em 21p eventos de recombinação

ocorrem com uma freqüência 2,4% (Cheng et al., 2009). Assim sendo, o marcador

21p9991707 é um bom candidato no rastreio desses eventos, os quais, devido à

escassez de marcadores nessa região, são negligenciados nos mapas genéticos

amplamente utilizados.

No presente trabalho, para o estudo das origens de não disjunção e eventos

de recombinação ao longo da região 21q, foram tipados cinco marcadores STR

pericentroméricos inéditos (21q14446264, 21q14507484, 21q14591269,

21q14618215 e 21q15368162), e cinco não pericentroméricos (D21S11, D21S226,

D21S1270, IFNAR e D21S1411) em uma coorte de 60 núcleos familiares

acometidos pela SD.

Dos 60 núcleos familiares analisados, 59 casos (98,33%) foram identificados

como sendo de origem materna. Destes, 43 (72,9%) foram consistentes com erros

em MI e 16 (27,1%) com erros em MII. Distribuições semelhantes foram observadas

em diferentes populações (Muller et al., 2000; Machatkova et al., 2005; Ghosh et al.,

2009).

Não obstante, Ramírez et al., (2007) descreveram discrepâncias importantes

nessas frequências; em suas análises 46,1% dos erros de não disjunção entre os

cromossomos maternos ocorreram durante a MI, e 53,9% durante a MII. Os dois

marcadores proximais utilizados nesse estudo foram o D21S1432 e D21S11, os

70

quais estão afastados da região centromérica a uma distância de 11 cM e 25 cM,

respectivamente. A falta de resolução dos padrões de manutenção da heterozigose

parental a montante do marcador D21S1432, e consequentemente a não

identificação de eventos de recombinação ocorridos nessa região, podem ter

contribuído para alterações da frequência esperada para os erros de não disjunção

em MI. No entanto, os mesmos autores atribuem esse desvio ao tamanho reduzido

da população estudada.

A elevada prevalência dos casos de origem materna observada neste estudo,

com uma maior frequência em MI, está de acordo com o que tem sido descrito em

diversos estudos (Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman, 2000; Lamb et al., 2005;

Sherman et al., 2006; Ghosh et al., 2009; Ghosh et al., 2010).

Dentre os casos de não disjunção de origem materna, o fator de risco mais

bem documentado é a idade materna avançada (Yoon et al., 1996; Castilla et al.,

1998; Egan et al., 2004; Freeman et al., 2007). Contudo, no presente estudo, 55%

dos acometidos avaliados, nasceram de mães jovens, incluídas abaixo da faixa

etária considerada de risco (>34 anos).

A média da idade materna manteve-se em torno de 31,8 anos, o que sugere

que para esta coorte, outros fatores, que não a idade materna, no momento da

concepção, estejam associados com os eventos de não disjunção observados, como

por exemplo, o que tem sido descrito como padrões alterados de recombinação

(Lamb et al., 1996; Yoon et al., 1996; Lamb et al., 1997; Lamb et al., 2005; Sherman

et al., 2006).

Os padrões alterados de recombinação caracterizam-se pela formação de

bivalentes susceptíveis a não disjunção. Estas configurações de susceptibilidade

consistem em: (i) bivalentes aquiasmáticos (não recombinados) e bivalentes com

formação de quiasmas restrita a região telomérica os quais são frequentemente

observados na não disjunção em MI; (ii) bivalentes com formação de quiasmas

restrita a região pericentromérica os quais são frequentemente observados entre os

erros de segregação em MII (Lamb et al., 1996; Lamb et al., 2005; Oliver et al.,

2008; Ghosh et al., 2009; Ghosh et al., 2010).

No presente estudo, dos 43 casos de origem materna com não disjunção em

MI, em 33 casos (76,7%) não foram observados eventos de recombinação. Nos 10

71

casos (23,3%) restantes eventos de recombinação foram identificados apenas nas

região não pericentromérica do cromossomo 21.

Quanto aos 16 casos de origem materna com não disjunção em MII, em dois

casos (12,5%) eventos de recombinação foram observados apenas na região

pericentromérica; em nove casos (56,2%) apenas nas não pericentroméricas; e em

um caso (6,2%) foi observado um evento duplo de recombinação, um na região

pericentromérica e outro na região telomérica. Nos quatro casos (25,1%) restantes

nenhum evento de recombinação foi observado ao longo do cromossomo 21.

De acordo com estes resultados, a força de associação e o risco relativo (RR)

da variável recombinação (pericentromérica, não pericentromérica, e ausência de

recombinação) para o desfecho em MI e MII foram calculados e a sua significância

estatística estimada pelo teste exato de Fisher e intervalo de confiança de 95%.

Nos casos com desfecho em MI, o principal fator de risco observado para a

não disjunção foi a variável ausência de recombinação, com RR= 1,96 (IC 95%:

1,22-3,14; p=0,0005). Interessantemente, eventos de recombinação não

pericentroméricos, apresentaram RR com valor <1, (RR=0,59; IC 95%: 0,37-0,93;

p=0,0114), o que caracteriza um efeito protetor para a não disjunção.

Nos casos com desfecho em MII, o principal fator de risco observado para a

não disjunção foi a variável recombinação pericentromérica, com RR= 4,31 (IC 95%:

2,68-6,94, p=0,0172), seguido pela variável recombinação não pericentromérica,

com RR= 3,25 (IC 95%: 1,38-7,65; p=0,0114). Interessantemente, ao contrário do

observado para os casos com desfecho em MI, a variável ausência de

recombinação apresentou um valor RR <1 no desfecho em MII (RR=0,20; IC 95%

0,07-0,54; p=0,0005), o que caracteriza um efeito protetor.

Embora, eventos de recombinação na região pericentromérica, os quais

correspondem a fatores de risco para a não disjunção em MII, sejam considerados

como padrões alterados de recombinação, no presente estudo, nenhum desvio na

frequência esperada desses eventos foi observado.

Assim, é possível especular que possíveis divergências na frequência dos

eventos de recombinação esperados e observados na maioria dos estudos possam

72

ser em parte devido a discrepâncias pontuais existentes nos mapas de

recombinação preditos para cromossomos disjuntos e não disjuntos.

No estudo de Oliver et al., (2008) o primeiro ponto no mapa de recombinação

para indivíduos dissômicos é referente ao marcador SNP (Single Nucleotide

Polymorphism) rs990141, o qual está afastado aproximadamente a 5 cM (distância

genética interpolada para mulheres com base no mapa Rutgers) do primeiro

marcador STR D21S369 do mapa estipulado para indivíduos trissômicos.

O mesmo pode ser observado no mapa de recombinação estipulado para

indivíduos dissômicos descrito por Lamb et al. (2005), o primeiro marcador,

D21S120 está afastado 5,26 cM (distância genética interpolada para mulheres com

base no mapa Rutgers) do primeiro marcador D21S369 do mapa de recombinação

para indivíduos trissômicos.

Diante deste cenário, sem considerar o número de marcadores informativos e

não informativos, no mínimo 5% dos eventos de recombinação esperados na região

pericentromérica podem ter sido omitidos no mapa genético estipulado para

cromossomos normalmente disjuntos nesses dois estudos. Em outras palavras, até

mesmo os mapas utilizados como referência para padrão normal de recombinação

podem ser imprecisos.

Oliver et al. (2008), analisando 253 casos de não disjunção de origem

materna em MII, observaram uma frequência de 29,4% de recombinação no

intervalo 1 (mapa estipulado para cromossomos não disjuntos).

No presente estudo, dos 16 casos ocorridos durante a MII, foi observada uma

frequência de 18,8% de recombinação na região pericentromérica. Este resultado,

assim como o observado por Oliver et al. (2008) para casos de não disjunção em

MII, desvia-se grandemente dos 2% de recombinação pericentromérica predito por

esses autores para cromossomos normalmente disjuntos.

Contudo, analisando a frequência global de recombinação pericentromérica,

de maneira independente, sem agrupamentos no que se refere a idade parental e

estágio meiótico da não disjunção, assim como o realizado na geração de mapas

genéticos em cromossomos normalmente disjuntos, no presente estudo, entre os 59

73

casos de origem materna foi observada uma frequência de 5% de recombinação na

região pericentromérica.

De acordo com o mapa genético Rutgers, a distância genética (interpolada

para mulheres) entre o primeiro marcador, 21q14446264, e o último marcador

analisado, 21q15368162, são de 4,3 cM, portanto são esperados 4,3% de

recombinação nesta região, o que está próximo ao observado.

Seguindo o mesmo raciocínio, de acordo com a distância genética interpolada

no mapa Rutgers (estimada para mulheres) entre o primeiro marcador, D21S369, e

o último marcador, D21S1432, que delimitam o intervalo 1 proposto por Oliver et al.

(2008), é de 11,7 cM, e portanto, são esperados 11,7% de recombinação.

Considerando a frequência global dos eventos de recombinação observados nos

868 casos analisados por esses autores, foram observados no intervalo 1 cerca de

8,64% de recombinação.

Estes dados sugerem que padrões de recombinação considerados alterados

na literatura têm relação com interpretações equivocadas, geradas por discrepâncias

pontuais nos mapas de recombinação, e a inclusão de variáveis (agrupamentos por

idade parental e estágio meiótico da não disjunção) nas análises dos eventos de

recombinação identificados em cromossomos não disjuntos e normalmente

disjuntos.

74

7. CONCLUSÕES

A análise computacional genômica comparada mostrou-se extremamente

precisa na identificação de novos candidatos a marcadores STR na região

pericentromérica do cromossomo 21. Adicionalmente, a predição por

bioinformática do potencial polimórfico foi positivamente aplicável na seleção

de marcadores altamente informativos.

O ensaio Mpxcen21 mostrou-se robusto e acurado na determinação do

estágio meiótico da não disjunção, sendo em 100% dos casos informativo

para pelo menos um marcador STR.

O ensaio Mpxcen21 mostrou-se altamente eficiente na determinação da

frequência dos eventos de recombinação na região pericentromérica, a qual

revelou uma força de associação significativa para os eventos de não

disjunção em MII.

Recombinação pericentromérica ao longo do cromossomo 21 é um fator de

risco para a não disjunção em MII, enquanto que ausência de recombinação

confere um efeito de proteção.

Ausência de recombinação ao longo do cromossomo 21 é um fator de risco

para a não disjunção em MI, enquanto que eventos de recombinação não

pericentromérica conferem um efeito de proteção.

Os mapas genéticos atualmente utilizados na caracterização dos eventos de

recombinação ao longo de 21q são inconsistentes. A fragmentação e

discrepâncias pontuais entre mapas genéticos estipulados para cromossomos

normalmente disjuntos e não disjuntos conduzem a interpretações

equivocadas quanto ao perfil de recombinação ao longo do cromossomo 21.

75

8. REFERÊNCIAS

Adinolfi, M. e Sherlock, J. 2001. Prenatal detection of chromosome disorders by QF-PCR. Lancet, v.358, p.1030-1031

Alberman, E. 2002. The National Down Syndrome Cytogenetic Register (NDSCR). J Med Screen, v.9, p.97-98

Allen, E.G., Freeman, S.B., Druschel, C., Hobbs, C.A., O'leary, L.A., Romitti, P.A., Royle, M.H., Torfs, C.P. e Sherman, S.L. 2009. Maternal age and risk for trisomy 21 assessed by the origin of chromosome nondisjunction: a report from the Atlanta and National Down Syndrome Projects. Hum Genet, v.125, p.41-52

Alves Da Silva, A.F. 2007. Recombinação em 21q dificulta a determinação da origem meiótica da não disjunção em portadores da Síndrome de Down. (Monografia). Campos dos Goytacazes, Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro 75 p.

Alves Da Silva, A.F., Machado, F.B., Fernandes, R.C.S.C. e Medina-Acosta, E. 2008. Implementação da citogenética molecular para o diagnóstico rápido da trissomia 21 e a incidência da Síndrome de Down no município de Campos dos Goytacazes, Brasil, no período de 2006-2008. Revista Científica da Faculdade de Medicina de Campos, v.3, p.02-10

Alves Da Silva, A.F. Novos Marcadores STR localizados na região pericentromérica do cromossomo 21: Apicação clínica da análise de segregação em síndrome de Down. XXI Congresso Brasileiro de Genética Médica. Belo Horizonte-MG, 2009. 1 p.

Alves Da Silva, A.F., Machado, F.B.; Fernandes, R.C.S.C.; Medina-Acosta, E.;. Implicações da pseudo-recombinação pericentromérica na determinação do estágio meiótico da não disjunção do cromossomo 21 na síndrome de Down. X mostra de Pós Graduação da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Campos dos Goytacazes-RJ, 2010. 1 p.

Antonarakis, S.E., Lyle, R., Dermitzakis, E.T., Reymond, A. e Deutsch, S. 2004. Chromosome 21 and down syndrome: from genomics to pathophysiology. Nat Rev Genet, v.5, p.725-738

76

Baptista, M.J., Fairbrother, U.L., Howard, C.M., Farrer, M.J., Davies, G.E., Trikka, D., Maratou, K., Redington, A., Greve, G., Njolstad, P.R. e Kessling, A.M. 2000. Heterotrisomy, a significant contributing factor to ventricular septal defect associated with Down syndrome? Hum Genet, v.107, p.476-482

Bendsen, E., Byskov, A.G., Andersen, C.Y. e Westergaard, L.G. 2006. Number of germ cells and somatic cells in human fetal ovaries during the first weeks after sex differentiation. Human Reproduction, v.21, p.30-35

Benson, G. 1999. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences. Nucleic Acids Res, v.27, p.573-580

Biselli, J.M., Machado, F.B., Zampieri, B.L., Alves Da Silva, A.F., Goloni-Bertollo, E.M., Haddad, R., Eberlin, M.N., Vannucchi, H., Carvalho, V.M., Medina-Acosta, E. e Pavarino-Bertelli, E.C. 2009. Double aneuploidy (48,XXY,+21) of maternal origin in child born to a 13-year-old mother: evaluation of the maternal folate metabolism. Genetic Counseling, v.20, p.225-234

Brenner, C.H. 1997. Symbolic kinship program. Genetics, v.145, p.535-542

Brown, A.S., Feingold, E., Broman, K.W. e Sherman, S.L. 2000. Genome-wide variation in recombination in female meiosis: a risk factor for non-disjunction of chromosome 21. Hum Mol Genet, v.9, p.515-523

Brun, M.E., Ruaulta, M., Venturab, M., Roize, G. e De Sario, A. 2003. Juxtacentromeric region of human chromosome 21: a boundary between centromeric heterochromatin and euchromatic chromosome arms. Gene, v.312, p.41-50

Butler, J.M. 2005. Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and Genetics of STR Markers. Oxford: Elsevier Academic Press, 1-647 p.

Castilla, E.E. e Orioli, I.M. 2004. ECLAMC: the Latin-American collaborative study of congenital malformations. Community Genet, v.7, p.76-94

77

Castilla, E.E., Rittler, M., Dutra, M.G., Lopez-Camelo, J.S., Campana, H., Paz, J.E. e Orioli, I.M. 1998. Survival of children with Down syndrome in South America. ECLAMC-Downsurv Group. Latin American Collaborative Study of Congenital Malformations. Am J Med Genet, v.79, p.108-111

Cheng, E.Y., Hunt, P.A., Naluai-Cecchini, T.A., Fligner, C.L., Fujimoto, V.Y., Pasternack, T.L., Schwartz, J.M., Steinauer, J.E., Woodruff, T.J., Cherry, A.M., Hansen, T.A., Vallente, R.U., Broman, K.W. e Hassold, T.J. 2009. Meiotic Recombination in Human Oocytes. PLoS Genet, v.5, p.e1000661

Craig, J.M. e Choo, K.H. 2005. Kiss and break up--a safe passage to anaphase in mitosis and meiosis. Chromosoma, v.114, p.252-262

Dowjat, W.K., Adayev, T., Kuchna, I., Nowicki, K., Palminiello, S., Hwang, Y.W. e Wegiel, J. 2007. Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome. Neurosci Lett, v.413, p.77-81

Dutta, S., Nandagopal, K., Gangopadhyay, P.K. e Mukhopadhyay, K. 2005. Molecular aspects of Down syndrome. Indian Pediatr, v.42, p.339-344

Egan, J.F., Benn, P.A., Zelop, C.M., Bolnick, A., Gianferrari, E. e Borgida, A.F. 2004. Down syndrome births in the United States from 1989 to 2001. Am J Obstet Gynecol, v.191, p.1044-1048

Ellegren, H. 2004. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nat Rev Genet, v.5, p.435-445

Fong, C.T. e Brodeur, G.M. 1987. Down's syndrome and leukemia: epidemiology, genetics, cytogenetics and mechanisms of leukemogenesis. Cancer Genet Cytogenet, v.28, p.55-76

Freeman, S.B., Allen, E.G., Oxford-Wright, C.L., Tinker, S.W., Druschel, C., Hobbs, C.A., O'leary, L.A., Romitti, P.A., Royle, M.H., Torfs, C.P. e Sherman, S.L. 2007. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep, v.122, p.62-72

78

Gair, J.L., Arbour, L., Rupps, R., Jiang, R., Bruye`Re, H. e Robinson, W.P. 2005. Recurrent trisomy 21: four cases in three generations. Clin Genet, v.68, p.430–435

Ghosh, S., Bhaumik, P., Ghosh, P. e Dey, S.K. 2010. Chromosome 21 non-disjunction and Down syndrome birth in an Indian cohort: analysis of incidence and aetiology from family linkage data. Genet Res, v.92, p.189-197

Ghosh, S., Feingold, E. e Dey, S.K. 2009. Etiology of Down Syndrome: Evidence for Consistent Association Among Altered Meiotic Recombination, Nondisjunction, and Maternal Age Across Populations. Am J Med Genet Part A, v.149A, p.1415–1420

Ghosh, S.F., E.; Dey, S.K. 2009. Etiology of Down Syndrome: Evidence for Consistent Association Among Altered Meiotic Recombination, Nondisjunction, and Maternal Age Across Populations. Am J Med Genet Part A, v.149A, p.1415–1420

Hassold, T. e Hunt, P. 2001. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet, v.2, p.280-291

Hassold, T. e Sherman, S. 2000. Down syndrome: genetic recombination and the origin of the extra chromosome 21. Clin Genet, v.57, p.95-100

Hultén, M.A., Patel, S., Jonasson, J. e Iwarsson, E. 2010a. On the origin of the maternal age effect in trisomy 21 Down syndrome: the Oocyte Mosaicism Selection model. Reproduction, v.139, p.1-9

Hultén, M.A., Patel, S.D., Tankimanova, M., Westgren, M., Papadogiannakis, N., Jonsson, A.M. e Iwarsson, E. 2008. On the origin of trisomy 21 Down syndrome. Mol Cytogenet, v.1, p.21

Hultén, M.A., Patel, S.D., Westgren, M., Papadogiannakis, N., Jonsson, A.M., Jonasson, J. e E., I. 2010b. On the paternal origin of trisomy 21 Down syndrome. Molecular Cytogenetics, v.3, p.1-8

79

Hunt, P.A. 2006. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochemical Society Transactions, v.34, p.574-577

Izraeli, S., Rainis, L., Hertzberg, L., Smooha, G. e Birger, Y. 2007. Trisomy of chromosome 21 in leukemogenesis. Blood Cells Mol Dis, v.39, p.156-159

Kong, X., Murphy, K., Raj, T., He, C., White, P.S. e Matise, T.C. 2004. A Combined Linkage-Physical Map of the Human Genome. Am. J. Hum. Genet, v.75, p.1143–1148

Korenberg, J.R., Chen, X.N., Schipper, R., Sun, Z., Gonsky, R., Gerwehr, S., Carpenter, N., Daumer, C., Dignan, P., Disteche, C. e Et Al. 1994. Down syndrome phenotypes: the consequences of chromosomal imbalance. Proc Natl Acad Sci U S A, v.91, p.4997-5001

Korenberg, J.R., Kawashima, H., Pulst, S.M., Allen, L., Magenis, E. e Epstein, C.J. 1990. Down syndrome: toward a molecular definition of the phenotype. Am J Med Genet Suppl, v.7, p.91-97

Lamb, N.E., Feingold, E., Savage, A., Avramopoulos, D., Freeman, S., Gu, Y., Hallberg, A., Hersey, J., Karadima, G., Pettay, D., Saker, D., Shen, J., Taft, L., Mikkelsen, M., Petersen, M.B., Hassold, T. e Sherman, S.L. 1997. Characterization of susceptible chiasma configurations that increase the risk for maternal nondisjunction of chromosome 21. Hum Mol Genet, v.6, p.1391-1399

Lamb, N.E., Freeman, S.B., Savage-Austin, A., Pettay, D., Taft, L., Hersey, J., Gu, Y., Shen, J., Saker, D., May, K.M., Avramopoulos, D., Petersen, M.B., Hallberg, A., Mikkelsen, M., Hassold, T.J. e Sherman, S.L. 1996. Susceptible chiasmate configurations of chromosome 21 predispose to non-disjunction in both maternal meiosis I and meiosis II. Nat Genet, v.14, p.400-405

Lamb, N.E., Yu, K., Shaffer, J., Feingold, E. e Sherman, S.L. 2005. Association between maternal age and meiotic recombination for trisomy 21. Am J Hum Genet, v.76, p.91-99

80

Lauritsen, J.M. e Bruus, M. 2008. EpiData Entry (version 3.1). A comprehensive tool for validated entry and documentation of data. Odense, Denmark

Leclercq, S., Rivals, E. e Jarne, P. 2007. Detecting microsatellites within genomes: significant variation among algorithms. BMC Bioinformatics, v.8:125, p.1-18

Lyle, R., Bena, F., Gagos, S., Gehrig, C., Lopez, G., Schinzel, A., Lespinasse, J., Bottani, A., Dahoun, S., Taine, L., Doco-Fenzy, M., Cornillet-Lefebvre, P., Pelet, A., Lyonnet, S., Toutain, A., Colleaux, L., Horst, J., Kennerknecht, I., Wakamatsu, N., Descartes, M., Franklin, J.C., Florentin-Arar, L., Kitsiou, S., Ait Yahya-Graison, E., Costantine, M., Sinet, P.M., Delabar, J.M. e Antonarakis, S.E. 2009. Genotype-phenotype correlations in Down syndrome identified by array CGH in 30 cases of partial trisomy and partial monosomy chromosome 21. Eur J Hum Genet, v.17, p.454-466

Machatkova, M., Brouckova, M., Matejckova, M., Krebsova, A., Sperling, K., Vorsanova, S., Kutsev, S., Zerova, T., Arbuzova, S., Krejci, R., Petersen, M. e Macek Sr, M. 2005. QF-PCR Examination of Parental and Meiotic Origin of Trisomy 21 in Central and Eastern Europe. J Histochem Cytochem, v.53, p.371-373

Malini, S.S. e Ramachandra, N.B. 2006. Influence of advanced age of maternal grandmothers on Down syndrome. BMC Med Genet, v.7, p.4

Mann, K., Fox, S.P., Abbs, S.J., Yau, S.C., Scriven, P.N., Docherty, Z. e Ogilvie, C.M. 2001. Development and implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health Service and implications for the future of prenatal diagnosis. Lancet, v.358, p.1057-1061

Matise, T.C.C., F.; Chen, W.; De La Vega, F. M.; Hansen, M.; He, C.; Hyland, F. C.; Kennedy, G. C.; Kong, X.; Murray, S. S.; Ziegle, J. S.; Stewart, W. C.; Buyske, S. 2007. A second-generation combined linkage physical map of the human genome. Genome Res, v.17, p.1783-1786

Mcelhinney, D.B.S., M.; Goldmuntz, E.; Zackai, E.H. 2002. Correlation Between Abnormal Cardiac Physical Examination and Echocardiographic Findings in Neonates With Down Syndrome. Am J Med Genet, v.113, p.238–241

81

Mclnnis, M.G., Chakravarti, A., Blaschak, J., Petersen, M.B., Sharma, V., Avramopoulos, D., Blouin, J.L., Konig, U., Brahe, C., Matise, T.C., Warren, A.C., Talbot, C.C., Roeckhoven, M.L. e Antonarakis, S.E. 1993. A Linkage Map of Human Chromosome 21: 43 PCR Markers at Average Intervals of 2.5 cM. Genomics, v.16, p.562-571

Morris, J.K., Mutton, D.E. e Alberman, E. 2002. Revised estimates of the maternal age specific live birth prevalence of Down's syndrome. J Med Screen, v.9, p.2-6

Muller, F., Rebiffe, M., Taillandier, A., Oury, J.F. e Mornet, E. 2000. Parental origin of the extra chromosome in prenatally diagnosed fetal trisomy 21. Hum Genet, v.106, p.340-344

Nagaishi, M., Yamamoto, T., Iinuma, K., Shimomura, K., Berend, S.A. e Knops, J. 2004. Chromosome abnormalities identified in 347 spontaneous abortions collected in Japan. J Obstet Gynaecol Res, v.30, p.237-241

Nicolini, U., Lalatta, F., Natacci, F., Curcio, C. e Bui, T.H. 2004. The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Hum Reprod Update, v.10, p.541-548

Ogilvie, C.M., Donaghue, C., Fox, S.P., Docherty, Z. e Mann, K. 2005. Rapid Prenatal Diagnosis of Aneuploidy Using Quantitative Fluorescence-PCR (QF-PCR). J Histochem Cytochem, v.53, p.285-288

Oliver, T.R., Feingold, E., Yu, K., Cheung, V., Tinker, S., Yadav-Shah, M., Masse, N. e Sherman, S.L. 2008. New Insights into Human Nondisjunction of Chromosome 21 in Oocytes. PLoS Genet, v.4

Olson, L.E., Richtsmeier, J.T., Leszl, J. e Reeves, R.H. 2004. A Chromosome 21 Critical Region Does Not Cause Specific Down Syndrome Phenotypes. Science, v.306, p.687-690

82

Ramírez, N.J., Belalcázar, H.M., Yunis, J.J., Quintero, L.N., Arboleda, G.H. e Arboleda, H. 2007. Parental origin, nondisjunction, and recombination of the extra chromosome 21 in Down syndrome: a study in a sample of the Colombian population. Biomédica, v.27, p.141-148

Robles, P.R., I .; Garcia, R.; Ortega, A.; Egozcue, J.; Cabero, L. L.; Garcia, M. 2007. Pairing and synapsis in oocytes from female fetuses with euploid and aneuploid chromosome complements. Reproduction, v.133, p.899–907

Roper, R.J. e Reeves, R.H. 2006. Understanding the basis for Down syndrome phenotypes. PLoS Genet, v.2, p.e50

Shaw, S.W., Hsu, J.J., Lee, C.N., Hsiao, C.H., Chen, C.P., Hsieh, T.T. e Cheng, P.J. 2008. First- and second-trimester Down syndrome screening: current strategies and clinical guidelines. Taiwan J Obstet Gynecol, v.47, p.157-162

Sherman, S.L., Allen, E.G., Bean, L.H. e Freeman, S.B. 2007. Epidemiology of Down syndrome. Ment Retard Dev Disabil Res Rev, v.13, p.221-227

Sherman, S.L., Lamb, N.E. e Feingold, E. 2006. Relationship of recombination patterns and maternal age among non-disjoined chromosomes 21. Biochem Soc Trans, v.34, p.578-580

Smith, K.N. e Nicolas, A. 1998. Recombination at work for meiosis. Curr. Opin. Genet. Dev., v.8, p.200-211

Thomas, N.S. e Hassold, T.J. 2003. Aberrant recombination and the origin of Klinefelter syndrome. Human Reproduction, v.9, p.309-317

Uhlmann, F. 2003. Chromosome cohesion and separation: from men and molecules. Curr Biol, v.13, p.R104-114

Weijerman, M.E., Van Furth, A.M., Van Der Mooren, M.D., Broers, C.J.M. e Gemke, R.J.B.J. 2010. Prevalence of congenital heart defects and persistent

83

pulmonary hypertension of the neonate with Down syndrome. Eur J Pediatr, v.169, p.1195–1199

Wiseman, F.K., Alford, K.A., Tybulewicz, V.L. e Fisher, E.M. 2009. Down syndrome--recent progress and future prospects. Hum Mol Genet, v.18, p.R75-83

Xavier, A.C., Yubin, G. e Taub, J.W. 2010. Down Syndrome and Malignancies: A Unique Clinical Relationship. J Mol Diagn, v.11, p.371–380

Yahya-Graison, E.A., Aubert, J., Dauphinot, L., Rivals, I., Prieur, M., Golfier, G., Rossier, J., Personnaz, L., Cre´Au, N., Ble´Haut, H., Robin, S., Delabar, J.M. e Potier, M.C. 2007. Classification of Human Chromosome 21 Gene-Expression Variations in Down Syndrome: Impact on Disease Phenotypes. Am. J. Hum. Genet, v.81, p.475–491

Yoon, P.W., Freeman, S.B., Sherman, S.L., Taft, L.F., Gu, Y., Pettay, D., Flanders, W.D., Khoury, M.J. e Hassold, T.J. 1996. Advanced maternal age and the risk of Down syndrome characterized by the meiotic stage of chromosomal error: a population-based study. Am J Hum Genet, v.58, p.628-633

84

WEBSITES

http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html.

http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Location/Chromosome?r=21:1-48129895.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM #190685.

http://www.promega.com/geneticidtools/powerstats/

http://www.wolfson.qmul.ac.uk/ndscr/

http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast


http://tandem.bu.edu/trf/trf.submit.options.html

85

9. ANEXO ATENDIMENTO ESPECIALIZADO GRATUITO

Projeto de Pesquisa: Rastreio de cromossomopatias: Sublinha: Pesquisa genética laboratorial sobre anomalias numéricas por meio da técnica da PCR Quantitativa de Fluorescência (QF-PCR).

Objetivo: A tipagem de DNA proposta nesta investigação laboratorial tem por finalidade confirmar ou afastar a suspeita de aneuploidia ou caracterizar os cromossomos sexuais na criança ----------------------------------------, que foi diagnosticada pela abordagem clínica como suspeita portadora de --------------------------------------------. O estudo visa à determinação e identificação de marcadores genéticos, cuja dosagem atípica está associada a cromossomopatias ou a caracterização do sexo cromossômico, a partir de amostra biológica. A amostra será doada pelos assistidos ao Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular NUDIM da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro UENF, sediado no Hospital Escola Álvaro Alvim HEAA da Fundação Benedito Pereira Nunes.

Prof. Dr. Enrique Medina-Acosta. M.Sc., Ph.D.

Coordenador Científico

Dra. Regina Célia de Souza Campos Fernandes, MD, M.Sc., Ph.D.

Coordenadora de Pesquisa Clinica

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Eu -------------------------------------------------------------------- ( ) MÃE, ( ) PAI e/ou ( ) RESPONSÁVEL LEGAL da criança ---------------------------------------, tendo sido satisfatoriamente informado(a) sobre o exame supracitado, e seus objetivos gerais, declaro por livre e espontânea vontade que concordo em participar do mesmo. Declaro estar ciente de que a identidade do(a) meu(minha) filho(a) será mantida sob sigilo absoluto, e que todas as dúvidas que porventura ocorram durante o processo desta pesquisa laboratorial serão devidamente esclarecidas, e que não haverá nenhum tipo de constrangimento ou ação em contra, caso decida por revogar a autorização aqui concedida para utilização das informações obtidas a partir dos estudos da amostra biológica coletada, a qualquer momento. Declaro não ter nenhum tipo de interesse econômico, em qualquer época, sobre os possíveis resultados alcançados durante as etapas subsequentes do andamento deste exame, deixando claro ser o meu interesse particular nessa pesquisa somente o de colaborador anônimo para o desenvolvimento científico em benefício do(a) meu(minha) filho(a).Em Campos (RJ), ---- de --------- de 2010.

________________________________________________________

Assinatura (mãe, pai e/ou responsável legal)

Download - a recombinação pericentromérica e o estágio meiótico da não

Top Related