1
Le spore batteriche
SONO FORME DI RESISTENZA
LE SPORE BATTERICHE
3
Nella seconda metà del 1800 Ferdinand Julius Cohn (botanico Polacco)dimostrò come l'acqua bollente uccideva le cellule vegetative del Bacillus subtilis, ma non le endospore mettendo così definitivamente a tacere la vecchia dottrina della "generazione spontanea".
Descritte da un gruppo di ricercatori in colture di batteri del suolo presi da un recipiente sigillato per 300 anni
Descritte in mummie egiziane di 4000 anni fa
4
SI ORIGINANO
Alcuni bacilli Gram positivi, aerobi ed anaerobi, appartenenti al genere Bacillus e Clostridium,
in determinate condizioni ambientali danno luogo alla
formazione di particolari cellule strutturalmente e funzionalmente differenziate a cui si da il nome
di spore
5
SI ORIGINANO
Le spore batteriche sono delle endospore, ossia che originano all’interno della cellula madre, detta anche sporangioLa spora, oltre ai componenti strutturali della cellula vegetativa possiede molecole e strutture cellulari specifiche che condizionano caratteristiche biologiche peculiari: è metabolicamente inattiva, altamente resistente agli insulti ambientali e stabile per lunghi periodi di tempo
6
SI ORIGINANO
LA CELLULA MADRE SI DISGREGA E LIBERA LA SPORA NELL’AMBIENTE
UBIQUITARIE
Chi sporula?
7
ALCUNI BACILLI GRAM POSITIVI
Bacillus B. anthracis CARBONCHIO
B. cereus TOSSINFEZIONI ALIMENTARI
B. subtilis INFEZIONI RESPIRATORIE
Clostridium C. botulinum BOTULISMO
C. difficile COLITE PSEUDOMEMBRANOSA
C. perfringens GANGRENAGASSOSA
C. tetani TETANO
COCCHI Sporasarcina PATOGENI OPPORTUNISTI
RICKETTSIE Coxiella burneti FEBBRE Q
8
LE ENDOSPORE SONO RESPONSABILI DI NUMEROSI PROBLEMI
EPIDEMIOLOGIA
ALIMENTAZIONE
FARMACEUTICA
9
STERILIZZAZIONE IN AUTOCLAVE 121°C per 15 minuti alla pressione di 1.05 Kg/cm2
Uccisione di tutte le forme viventi
BOLLITURA (100°C) INTERMITTENTE
Tre intervalli di 30 minuti seguiti da periodi di raffreddamentoPrima del secondo e terzo ciclo di bollitura il materiale viene mantenuto a temperatura ambiente per almeno 8 ore
100°C = uccisione delle forme vegetativeRaffreddamento = germinazione delle endospore
SI ELIMINANO
10
UNO STATO DI CRIPTOBIOSI IN CUI OGNI SINTESI
MACROMOLECOLARE E’ ASSENTE.
CARATTERIZZATE DA
11
La criptobiosi è uno stato di vita ametabolico nel quale entrano alcuni organismi semplici in risposta a condizioni ambientali avverse, quali essiccazione, congelamento, e mancanza di ossigeno. Nello stato criptobiotico, tutti i processi metabolici si fermano, impedendo la riproduzione, lo sviluppo e la riparazione. Un organismo in un stato criptobiotico può vivere essenzialmente per un tempo indeterminato fino a quando le condizioni ambientali tornare ad essere ospitali. Quando ciò si verifica, l'organismo tornerà al suo stato di vita metabolico precedente alla criptobiosi.
CARATTERIZZATE DA
12
CONSENTONO
CARENZA DI
CARBONIO AZOTO
FOSFORO
AD ALCUNI BATTERI DI SOPRAVVIVERE IN CONDIZIONI
AMBIENTALI SFAVOREVOLIPossono sopravvivere per
anni in soluzione di alcool al 70%
13
RESISTONO A
ELEVATE TEMPERATURE
RADIAZIONI UVCONGELAMENTO
AGENTI BATTERICIDI
CONDIZIONINORMALMENTE
LETALI PER LA CELLULA BATTERICA
14
La SPOROGENESI è una particolare espressione della capacità
di adattamento cellulare alla disponibilità di nutrienti
nell’ambiente
“Le spore sono prodotte da cellule sane minacciate dalla fame” Knaysi
Ogni specie batterica sporigena può essere indotta a formare spore o mantenuta costantemente in fase
vegetativa agendo sulla composizione e la disponibilità dei nutrienti
15
GLICOLISI
La SPOROGENESI è un processo altamente energetico in quanto
richiede una serie di modificazionimorfologiche e la sintesi
di nuovi enzimi e metaboliti
16
MORFOLOGIA
BATTRIDIOSpora centrale che non deforma la cellula madre
CLOSTRIDIO Spora centrale con diametro maggiore che deforma la cellula madre
PLETTRIDIOSpora terminale che deforma la cellula madre
Bacillus anthracis
Clostridium tetano
Clostridium perfringens
17
SI EVIDENZIANO
metodo di Gram metodo di Schäffer e Fulton
AL MICROSCOPIO OTTICO IN PREPARATI
COLORATI
AL MICROSCOPIO ELETTRONICO
cellula vegetativa spora
18
SI EVIDENZIANO
metodo di Gram
AL MICROSCOPIO OTTICO IN PREPARATI COLORATI. La spora appare come un corpicciolo rifrangente e incolore all’interno del
batterio, essendo la spora difficilmente penetrabile da
sostanze quali i coloranti, per la complessità dei suoi
involucri
19
ULTRASTRUTTURA
Le spore batteriche hanno una struttura molto simile a quella della cellula vegetativa ma si
differenziano per il fatto di essere circondate da peculiari
involucri responsabili dei peculiari aspetti biologici delle
spore
20
ULTRASTRUTTURA
La parte centrale, il core, ripete la struttura della cellula vegetativaintorno alla quale si sviluppano una serie di membrane molto
peculiari e voluminose
21
CORE PROTOPLASTO IN FORMA QUIESCENTEcircondato di una parete sporale
cromosoma addossato alla membrana plasmatica
ribosomi, alcuni tRNA, nessun mRNA
Small acid soluble proteins (SASP). Sono proteine a basso pesomolecolare che consentono alla spora di resistere ai raggi UV. L’energia è conservata sotto forma di 3-fosfoglicerato, invece che ATP, una molecola a minore concentrazione energetica ma più stabile
Acido dipicolinico
Enzimi sporali
ridotta concentrazione di enzimi della cellula vegetativa
ridotto contenuto di H2O
22
ULTRASTRUTTURA
Formata da peptidoglicani. Circondata da due rivestimenti. Contiene, inoltre, l’acido dipicolinico, un acido che insieme a grandi quantità di calcio stabilizza la struttura
Due rivestimenti formati daproteine molto stabili, lipidi (1-2%)e a volte peptidoglicani, circondano la cortex
Una sottile membrana di composizionefosfolipoproteica simile alla membrana
plasmatica
23
CORTEX
costituita soprattutto di PEPTIDOGLICANO MODIFICATO
Molti residui di acido N-acetilmuramico sono sostituiti da anelli di acido lattamico (lattami muramici) siti di attacco degli enzimi della germinazione
Formazione di legami crociati tra il peptidoglicano e il dipicolinato di calcio. Ciò determina contrazione del peptidoglicano ed eliminazione di acqua per “strizzamento”
E’ una struttura flessibile poiché il peptidoglicano sporale contiene un basso numero di legami trasversi, rispetto a quello della cellula vegetativa. Ciò è fondamentale per mantenere la disidratazione sporale
24
Contiene diverse proteine cheratino-simili, molto stabili, ricche di ponti disolfuro. L’impermeabilità di questo strato rende le spore resistenti alle sostanze antibatteriche ed ai
coloranti
TUNICASPORALE
coat interno (elettronlucido)
coat esterno (elettrondenso)
ESOSPORIO
E’ una struttura accessoria, di natura fosfolipidica, simile alla
membrana plasmatica. Contiene basse concentrazioni di acidi
teicoici, acido diaminopimelico e glucosammina. Quando presente determina massima rifrangenza e
completa impermeabilità ai coloranti
25
CORTEXCOATS
ESOSPORIO
TERMORESISTENZA intrinseca composizione molecolare disidratazione mineralizzazione
Il ridotto contenuto di acqua delle spore rende le proteine sporali meno attive e più resistenti alla denaturazione termica. Contribuisce a talepeculiare aspetto biologico delle spore la presenza di acido dipicolinicocomplessato con ioni calcio, sotto forma di dipicolinato di calcio.
La comparsa della termoresistenza si osserva solo dopo che la cellula acquisisce rifrangenza per riduzione del contenuto di acqua e dopo che l’accumulo di acido dipicolinico ha raggiunto un limite soglia
26
CORTEXCOATS
ESOSPORIO
TERMORESISTENZA disidratazione intrinseca composizione molecolare mineralizzazione
RESISTENZA Al LISOZIMA
RESISTENZA AI SOLVENTI ORGANICI
27
SPORULAZIONEProcesso di differenziamento cellulare
DIVISIONE ASIMMETRICA
DA UNA CELLULA BATTERICA SI GENERA UNA SOLA SPORA
DIFFERENZIAMENTO CELLULARE
ATTIVAZIONE DI NUOVI PROCESSI BIOSINTETICI
28
L’INTERO PROCESSO DURA CIRCA 8 ORE E PUÒ ESSERE SUDDIVISO IN 6-7 STADI
OGNUNO DEI QUALI E’ CARATTERIZZATO DA EVENTI BIOCHIMICI E MORFOLOGICI
IN PARTE SPECIFICI
Addensamento del materiale nucleareDivisione del cromosoma e separazione verso il polo oppostoLa membrana citoplasmatica si introflette con divisione asimmetrica della cellula in due compartimenti di diversa grandezzaSi forma la presporaSi completa il setto di divisione e si formano le diverse membrane che caratterizzano la spora
29
Il processo di sporulazione nelle prime fasi è reversibile.
L’evento più importante della sporulazione è la sintesi di acido dipicolinico e delle SAPS, che legandosi al DNA lo proteggono dalle radiazioni UV
30
Nelle prime fasi del processo di sporulazione è frequente la produzione
da parte dello sporangio di piccoli peptidi ad attività
antibatterica
31
La sporulazione inizia quando si verificano due condizioni
carenza di nutrienti alta densità cellulare
Il monitoraggio della densità cellularesi realizza con un MECCANISMO “QUORUM SENSING”
È un meccanismo di comunicazione tra cellule batteriche che ha come finalità il controllo dell’espressione genica in funzione della densità di popolazioneLa comunicazione tra cellule avviene per mezzo di molecole segnale
ATTIVAZIONE
32
MECCANISMO “QUORUM SENSING”
secrezione e riconoscimento di EDF-1 (fattore di differenziamento extracellulare). Si lega al batterio e segnala ad esso di iniziare il processo di sporulazione. La sporulazione parte quindi all’inizio della fase stazionaria di crescita
< [GTP] (fattore di differenziamento intracellulare). La ridotta concentrazione di GTP rappresenta il segnale biochimico intracellulare che dà l’avvio alla sporulazione
ATTIVAZIONE
33
ATTIVAZIONE
La formazione di spore implica la produzione di numerose nuove strutture, enzimi e metaboliti, assieme alla scomparsa di numerosicomponenti della cellula vegetativa.
Affinchè ciò si attui deve essere attivata una serie di geni, i cui prodottideterminano la formazione e la composizione finale della spora mentre un’altra serie di geni, quelli necessari alle funzioni della cellula vegetativa, deve essere inattivata.
La compartimentalizzazione dell’espressione genica riguarda modificazioni della specificità trascrizionale della RNA polimerasi
34
CELLULA VEGETATIVAI geni della cellula vegetativasono letti da molecole di RNA polimerasi che contengono
fattori A di riconoscimento. La subunità riconosce il promotoree legge il DNA in punti specifici
A
F
G
SPORULAZIONELa RNA polimerasi viene clivatadiventando incapace di riconoscerei fattori sigma della cellula vegetativa. Vengono sintetizzati nuovi fattori sigma,ciascuno specifico per il gruppo di genidella sporulazione
RNA-polimerasi batterica
35
SPORULAZIONETale processo porta quindi ad una modificazione della RNA polimerasi che rende capace l’enzima di riconoscere solo i promotori dei geni sporali
RNA-polimerasi batterica
36
ATTIVAZIONE
Divisione del DNA Attivazione di SpoOA “regolatore della risposta” Sintesi del fattore specifico per il primo gruppo di geni
della sporulazione) Formazione del setto di divisione asimmetrico, primo
evento irreversibile
< [GTP] è il segnale biochimico intracellulare che da l’avvio alla sporificazione; inoltre, porta alla
sintesi del fattore H e alla fosforilazione della proteina SpoOA, che dereprime i geni
d’inizio della sporulazione
37
EH e SpoOA attivano la trascrizione de fattori F e E
Formazione della PRESPORE e della CELLULA MADRE
Sintesi di SpoIIID (proteina binding del DNA)
Localizzazione di E nella cellula madre Localizzazione di F nella prespora
38
La sporulazione determina l’attivazione di circa 200 geni che codificano sia per proteine strutturali che regolatrici e che controllano una cascata di genimolto complessa
39
F nella prespora attiva la trascrizione di G e dei fattori di attivazione di E nella cellula madre
La prespora è inglobata da una doppia membrana citoplasmatica
Sintesi delle SAPS nella prespora La prespora sintetizza i componenti della PARETE SPORALE La cellula madre sintetizza i componenti della CORTEX
(peptidoglicano modificato e acido dipicolinico)
40
Il fattore E nella cellula madre attiva la trascrizione di K e dei fattori di attivazione di G nella prespora
Sintesi di GerE (proteina bindig del DNA) La cellula madre completa la sintesi dei componenti della
cortex e sintetizza i componenti dei COATS
Lo scambio di segnali bidirezionali (criss-cross) cellula madre -prespora e viceversa assicura che la sequenza degli eventi venga rispettata
41
Lo scambio di segnali bidirezionali (criss-cross) cellula madre -prespora e viceversa assicura che la sequenza degli eventi venga rispettata
42
LA SPORA MATURA SI LIBERA NELL’AMBIENTE
La cellula madre si lisa e la spora matura
è liberata nell’ambiente
43
GERMINAZIONE
In condizione ambientali favorevoli una spora ritorna alla condizione di cellula vegetativa
in 90’ e si suddivide in 3 fasi:
ATTIVAZIONE GERMINAZIONE VERA E PROPRIA ESOCRESCITA
44
GERMINAZIONE IN VITRO
Si può realizzare esponendo le spore per 1 h alla temperatura di 60°C in presenza di indutturi
del processo di germinazione quali zuccheri, amminoacidi o lisozima
45
Perdita delle attività biologiche della spora senza che siano evidenti
modificazioni morfologiche
ATTIVAZIONE
INDUTTORE:Stimolo traumatico
(shock termico)
L-alanina, Asparagina,inosina, glucosio,fruttosio, Ca++ Mn++
FATTORI DI GERMINAZIONE:
46
Attivazione
Una delle ipotesi più accettabile per spiegareil fenomeno dell’attivazione si riferisce alla rotturadei ponti S-S delle proteine dei coats, responsabilidella maggiore permeabilità della spora attivata.Se non si aggiungono gli induttori del processo digerminazione, la spora non entra nella seconda fase.
47
GERMINAZIONE
Perdita di frammenti degradati di peptidoglicano e dipicolinato di Ca++. Assunzione di H2O e aumento di
volume. Perdita della termoresistenza e della resistenza
all’essiccamento, al lisozima e agli agenti chimici
ESOCRESCITA
La cellula vegetativa fuoriesce completamente dagli involucri sporali e riprende la
sua normale attività metabolica. Ripresa della sintesi proteica e degli acidi nucleici
