isolasi dna plasmid by amrullah mukhtar

165
ISOLASI DNA PLASMID Disusun dalam rangaka memenuhi tugas terstruktur dalam mata kuliah Bioteknologi Oleh : Amrullah M, S.Pd 8136173002 Kelas A Semester II TA. 2014 Dosen Pengampu : Dr. FAUZIYAH HARAHAP, M.Si

Upload: pengantar_teknik_geofisika_djoko_santoso

Post on 22-Nov-2023

3 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

ISOLASI DNA PLASMID

Disusun dalam rangaka memenuhi tugas terstruktur

dalam mata kuliah Bioteknologi

Oleh : Amrullah M, S.Pd

8136173002

Kelas A Semester IITA. 2014

Dosen Pengampu :Dr. FAUZIYAH HARAHAP, M.Si

Isolasi DNA Plasmid

Pada dasarnya plasmid merupakan identitasgenetik yang ditemukan secara alami di dalamsel beberapa kelompok prokariot dan eukariot.Dengan teknik rekayasa genetik, sekarang telahdikembangkan plasmid artifisial dengan caramenggabungkan gen-gen dari plasmid alamimaupun genom tertentu (Yuwono, 2009).

• Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomyang dikenal pada bakteri, berutas ganda,dan berbentuk sirkuler (Jusuf, 2001).

• Plasmid merupakan salah satu vektorpembawa molekul DNA di dalam prosesrekayasa DNA melalui teknologi DNArekombinan. Plasmid banyak sekalidigunakan dalam pengklonan DNA, karenarelatif mudah dalam penanganannya.

Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid,dalam rekayasa genetika, plasmid digunakansebagai vektor untuk kloning DNA.

Selain itu plasmid juga banyak digunakan untukperbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisamengekspresikan gen tertentu.

Alasan utama pengunaan plasmid ini adalahkarena plasmid memiliki peta restriksi, adanyamarker sehingga dapat diketahui apakah geninsert masuk atau tidak, memiliki copy numberyang besar, dan mudah dimodifikasi sesuaidengan tujuan tertentu.

Plasmid memiliki fungsi yang bisa dimanfaatkankeuntungannya, maka ada banyak cara yangdigunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut.

Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri.Proses ini dikenal sebagai proses minipreparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg.

Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-200µg) digunakan midi preparation dan maxipreparation untuk jumlah yang lebih besar dari200 µg.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalahmenghancurkan membran sel sehingga semuaorganel sel dapat keluar. Sehingga didapatkanDNA kromosomal serta DNA ekstra kromosmal(plasmid). Untuk memperoleh plasmid sajaharus dilakukan pemurnian dari debrismembran sel, organel sel, dan pengotor lainnya.

Metode yang dapat digunakan untuk isolasiplasmid antara lain yaitu boiling lysis, lysiswithdetergent, mechanical lysis, alkaline lysis,dan enzimatic digestion.

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkanplasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor)

kloning, antara lain adalah :

a. Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehinggaDNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;

b. DNA-nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebihstabil selama diisolasi secara kimia;

c. Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapatmemperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inangsecara otonomi;

d. Mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy)sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak danmembuat DNA lebih mudah diamplifikasi;

e. Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahananterhadap antibiotik tertentu sehingga lebihmemudahkan dalam mendeteksi plasmid yangmembawa gen tertentu.

Tahapan Isolasi DNA Plasmid(Brock, et al., 1994).

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu :1. tahap kultivasi dan harvesting,2. tahap lisis dan3. tahap pemurnian DNA plasmid.

Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi bakteri untukmemperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmiddalam jumlah yang banyak.

Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atasmembran luar dan membran dalam, membran luar terdiri ataslipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikansedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayeryang juga terintegrasi protein di dalamnya.

Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer, presipitasi,dan pembilasan DNA plasmid.

1. Kultivasi DNA Plasmid dimulai dengantahapan sebagai berikut:

Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama 1 malam.

15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C.

Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM Tris HClpH 8,100mM NaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), lalu divortek.

10 μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan.

Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit.

Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C.

Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml.

Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan.

Disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan dalamtabung eppendorf 1,5 ml.

Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-pelansehingga timbul benang-benang halus DNA.

Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%.

Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet dikeringkan.

Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml.

Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid) sebanyak yang diperlukan.

2. Tahap resuspensi dan lisis DNA plasmid

Berikut ini adalah prosedur resuspensi dan lisis DNA plasmid: Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke

dalam tabung yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik. Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution 1,

didiamkan dalam es selama 5 menit. Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5

menit. Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara

membolakbalikkan, diinkubasi dalam es selama 5 menit. Disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang. Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur dengan

Vortek. Disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit.

Senyawa-senyawa kimia

• Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawakimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesilsulfat).

• Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikatmagnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupunmempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.

• Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusakmembran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis.

• Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkandengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida(DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol(mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkanprotein dan polisakarida dari larutan).

• Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan danmengendapkan DNA.

3. Tahap pemurnian DNA plasmid

Tahap ini meliputi proses berikut: Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan CIAA dengan

perbandingan 1:1 (v/v).Dicampur dengan vortek. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan

PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA.

Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasipada 37°C semalam.

Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol absolut dingin. Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC selama 10 menit. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, lalu pellet dicuci dengan ethanol

70%. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit. Pellet dikeringkan, ditambah TE 50 μl, masukkan ke dalam tabung. Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk digunakan lebih lanjut pada

suhu - 200C. jika perlu DNA dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnianDNA.

Fungsi Penambahan Senyawa

a. Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masihtersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama.

b. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan singlestranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol absolutdingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas danmencuci plasmid.

c. Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gulafosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantaiDNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatikantara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantaiDNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan + pada Hdan - pada O). Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrikyang tinggi.

d. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untukmenurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatanDNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

Program Pascasarjana UNIMED

Program Studi Pendidikan Biologi

Mata Kuliah: Bioteknologi

Dosen Pengampu: Dr. Fauziyah Harahap, M.Si

By:

Al Khudri Sembiring

8136173001

Kelas: A Semester II

Tahapan Isolasi DNA Plasmid metode alkaline

lysis (Birnboim dan Dolly tahun 1979) (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523).

1. Menyiapkan kultur bakteri Escherichia coli yang diinkubasi

dalam suhu 370 C dan dalam waktu 1 malam.

2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair dengan

menggunakan mikropipet.

3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung eppendorf 15 ml.

4. Mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan

kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet

dan supernatan.

5. Membuang supernatan kemudian menambahkan 2 ml larutan

A (EDTA dan Tris-HCl) ke dalam pelet.

Fungsi-fungsi Senyawa

EDTA : Thrometamine ethylenediamine tetraacetic acid:

sebagai kofaktor yang esensial bagi aktivitas Dnase dalam

mencacah molekul DNA

Tris HCL: Thrometamine HCL: Buffer menjaga pH,

melindungi isi sel agar tidak lisis.

SDS : Sodium dodesil sulfat : Mendenaturasi protein yang ada

dalam lisat, dengan jalan memutuskan ikatan-katan non

kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein, sehingga

kembali ke struktur primernya, sebagai rantai linier

polipeptida.

NaOH (sodium hidroksida) : Pemisahan DNA plasmid dari

DNA kromosomal.

Tahapan Isolasi DNA Plasmid (Lanjutan)

6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm.

7. Menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke

dalam campuran pelet dan larutan A. Kemudian dibolak-

balik 4-6 kali.

8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran

pelet, larutan A, dan larutan B. Setelah itu

memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge

dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga

terbentuk supernatan dan pelet.

9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan memasukkan

ke dalam tabung yang baru kemudian didiamkan selama

1 malam

Tahap presipitasi

1. Menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol larutan

ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang

telah didiamkan selama 1 malam.

2. Menyimpannya ke dalam freezer dengan suhu -

20C sampai -40C selama 1 jam.

3. Mengendapkan DNA plasmid dengan disentrifuge

dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit.

4. Membuang supernatan dan membalik botol konikel di

atas tissue dan mendiamkannya selama ± 5 menit.

Tahap pembilasan

1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh dengan menambahkan 2 mlethanol 70 % pada pellet dan mendiamkankannya selama ± 5 menit.

2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampaikering selama ± 5 menit.

3. Menambahkan 50 mikrolit dH2O pada DNA plasmid dengan menyedot danmenyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip warnakuning sampai bercampur.

4. Memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannyake dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.

HASIL akhir

1. Sentrifuge setelah inkubasi : Terbentuk dua lapisan yaitu supernatan yangberwarna keruh dan pellet yang berwarna kuning

2. Setelah Penambahab larutan C : Terbentuk endapan putih

3. Sentrifuge setelah penambahan larutan C : Terbentuk 3 lapisan. Lapisanbawah adalah pellet yang mengandung plasmid lapisan tengah adalahsupernatant, dan lapisan atas adalah debris molekul

Fungsi zat-zat

Glukosa: berfungsi menjaga tekanan osmotik sel agar tidakpecah.

FKI (Phenol : Chloroform : Isoamilalkohol) : Memisahkankandungan lipid, protein dari DNA, menghilangkankontaminan yg masih melekat

NaOAc: menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agarbekerja secara maksimal dan menjaga keseimbanagan sel agartidak lisis

Asam asetat : Menetralkan suasana basa yang diciptakan olehion hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap lisissebelumnya

ethanol absolut 70 % : memurnikan DNA

mikrolit dH2O :

DAFTAR PUSTAKA

Calladine, C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T. 2004.

Understanding DNA. Amsterdam : Academic Press.

Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell. 2002. Biologi

5th ed. Jakarta :Erlangga.

Lodish, H., Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B.

James D. 2000. Molecular Cell Biology. Wh Freeman

Company

Suryani, Yoni dkk. 2007. Petunjuk Praktikum Biologi Sel Dan

Molekuler. Yogyakarta: Universitas Negeri Yogyakarta.

Isolasi DNA Plasmid

ERLIA UTAMI PANJAITAN

8136173009

Kelas A 2013 Pendidikan Biologi

Plasmid adalah molekul DNA sirkular berukuran kecilyang terpisah dari kromsom. Palsmid ini ditemukan didlam bakteri dn ragi yang merupakan eukariotauniseluler. Plasmid dapat bereplikasi tanpa tergantungdengan genom sel yang lain dan kadang-kadangditransfer diantara sel-sel.

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untukkloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkandari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuranyang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom

Isolasi DNA plasmid

Tahapan isolasi DNA plasmid

1. Sampel berupa biakan Escherichia coli yang mengandung plasmid.2. Biakan E. Colli kemudian diisolasi dari cawan dantumbuhan di dalam 2 ml media LB (Luria Bertani) yang mengandung 100 ml/gr ampisilin di dalamshaker (250 rpm) pada suhu 37 0C selama satumalam.3. Diendapkan dengan sentrifugasi pada 10.000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit4. Endapan bakteri disuspensikan dalam 300 µl buffer suspensi sel (50mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mMEDTA).5. Dilakukan vortex.

Fungsi- fungsi Senyawa

Luria Bertani medium yang mengandung Amphisilin ; bergunauntuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambatkontaminan yang peka.

Larutan buffer ; untuk menjaga struktur DNA selamaproses penghancuran dan purifikasi sehinggamemudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA danmencegah perubahan pada molekul DNA. Tris HCl ; Thrometamine HCl; buffer menjaga pH, melindungiisi sel agar tidak lisis EDTA ; ethylenediamine tetraacetic acid: menginaktivasi enzimDNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang di isolasi

6. Bila sudah tidak ada endapan, dilisis denganmenggunakan 300 µl buffer lisis7. Tabung reaksi di balik-balikkan 8x, dan di biarkan 1-2 menit.8. Setelah lisis campuran ditambakan 300 µl buffer netralisasi dan dibalik-balikan kembali agar tercampur rata.9. Disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm pada suhu 4 0C selama 20 menit.10. Cairan jernih di bagian atas di ambil dan dipindahkan ketabung ependorf yang bersih11. Cairan yang mengandung DNA plasmid diekstraksidengan fenol.12. Divortex

Tahapan isolasi DNA plasmid (Lanjutan)

13. Disentrifugasi lagi pada kecepatan 10.000 rpm dengan suhuruang selama 1-2 menit.14. Terbentuk dua fase yang dibatasi oleh dua lapisan putih yang sangat tipis15. cairan bagian atas dipindahkan ke tabung ependorf yang bersih atau yang baru16. Di tambah Rnase dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu37 0C, untuk menghilangkan RNA.17. DNA plasmid diendapkan dengan sentrifugasi padakecepatan 15.000 rpm selama 20 menit.18. Endapan dibilas dengan etanol 70% dan disentrifugasi19. Endapan dikeringkan kemudian ditambah ddH2O dan Rnase.20. Endapan diinkubasi selama satu malam pada suhu 37 0C

Tahapan isolasi DNA plasmid (Lanjutan)

Fenol ; memisahkan kandungan lipid , protein dariDNA, menghilangkan kontaminan yang masihmelekat RNAse ; enzim yang memisahkan DNA denganRNA, melisis RNA Etanol ; dilakukan pencucian dengan etanol, perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkanresidu etanol dari pelet DNA. Larutan ddH2O dan RNAse : berfungsimenghilangkan sisa-sisa RNA untuk memperolehyang murni

Fungsi- fungsi Senyawa

Metode elektroforesis

1. mensuspensikan gel agarose didalam larutanpenyangga yang sesuai (TAE 1x) dengan konsentrasitertentu sesuai dengan kebutuhan di dalamerlenmeyer.2. Kemudian dipanaskan dengan microwave atauhot-plate hingga tidak terlihat lagi butiran agarose, dan dilarutkan menjadi jernih (transparan, tidakputih).3. Agarose dibiarkan dingin terlebih dahulu sambilmenyiapkan tempat untuk menuang gel (tray).4. Kemudian dipasang sisir pada tempat tersebut5. Setelah suhu turun, agarose dituangkan ke dalamtempat tersebut.

6. Setelah beku, gel ditempatkan pada alat untukelektroforesis sedemikian rupa sehingga sisirterletak pada kutub negative7. dituangkan larutan penyangga TAE 1x sampai gel terendam8. Sisir diambil secara hati-hati, selanjutnya ditambahkanethidium bromida (EtBr) pada larutan penyangga sebagiapewarna DNA.9. DNA yang akan dimigrasi dicampur dengan larutanpewarna (loading dye) untuk menandai laju migrasi.10. Larutan DNA yang telah di campur loading dye dimasukkan ke dalam sumur pada gel agarosemenggunakan pipet mikro

Metode elektroforesis (Lanjutan)

Fungsi- fungsi Senyawa

TAE : Tris Asetat EDTA; memisahkan molekulDNA dan RNA

etidhium bromida ; untuk membantuvisualisasi, karena etidhium bromida akanmemendarkan sinar UV

11. Alat elektroforesis dihubungkan dengan alat catulistrik sedemikian sehingga kutub positif dihubungkandengan kutub positif dan kutub negatif dengan kutubnegatif.12. DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif.13. Selanjutnya alat catu listrik dihidupkan pada 30-250 volt (tergantung dari besarnya DNA dan larutanpenyangga yang digunakan)14. Setelah cukup jauh bromfenol biru bermigrasi, catulistrik dimatikan.15. Kemudian gel diambil, dibilas dan diperiksa DNA yang bermigrasi dengan menggunakan sinar ultraviolet.

Metode elektroforesis (Lanjutan)

ISOLASI DNA PLASMID

ISOLASI DNA

PLASMID

DEWI SARTIKA SARI

8136173004

PROGRAM

PASCASARJANA

PENDIDIKAN BIOLOGI

DNA PLASMID

Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal

yang berbeda karakternya dengan DNA

kromosomal, berupa DNA sirkuler yang terdapat

di sitoplasma, beruntai ganda serta mampu

secara independen bereplikasi.

Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil dan

terletak di luar kromosom dalam sel prokariot

khususnya bakteri dan sel eukariot tingkat

rendah seperti khamir.

TAHAP ISOLASI DNA PLASMID

Pengamatan DNA plasmid dilakukan melalui

proses :

1. isolasi plasmid

2. elektroforesis

3. visualisasi menggunakan sinar ultraviolet

(UV)

(Yuwono, 2009)

ISOLASI DNA

Prinsip Isolasi DNA

Prinsip dasar isolasi total

DNA/RNA

dari jaringan adalah dengan

memecah dan mengekstraksi

jaringan tersebut sehingga

akan

terbentuk ekstrak sel yang

terdiri DNA, RNA dan

substansi dasar lainnya

• Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,lemak, dan karbohidrat.

Isolasi

•Pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein

Ekstraksi•Menghilangkan

beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol), polisakarida, RNA dan juga protein.

Pemurnian

METODA

ISOLASI DNA

BAKTERI

Kultur Bakteri

(E.Coli)- Kultur selama 1 malam

- Sentrifuge (mengambil kultur dan

menghilangkan medium)

Larutan I

(glucose)

Larutan II

(NaOH & SDS)

NaOH : merusak membran

sel

SDS : sabun untuk

menghancurkan membran

sel

Larutan III

(netralisasi)

- sentrifuge

Menggumpal & menyatu

Supernatan

(berisi DNA)

Indikator untuk melihat

lendir-lendir dimulut

tabung yang menandakan

bahwa bahwa membran sel

telah terpecah

Jika ada larutan

berkonsentrasi

tinggi masuk ke

dalam sel, dengan

sendirinya

membran sel akan

rusak

- Treatment PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl

alcohol)DNA bebas dari komponen

lain

+ etanol 100% dan NaAc (membantu

pengendapan)Pengendapan

- Inkubasi

- Cuci dengan EtOH

70%

- KeringkanDNA murni

TAHAPAN ISOLASI DNA PLASMID

1. Sampel bakteri Escherichia coli yang diinkubasi

dalam suhu 370 C dan dalam waktu 1 malam.

2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair

dengan menggunakan mikropipet.

3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung

eppendorf 15 ml

4. endapkan bakteri dengan microsentrifuge

dengan kecepatan 3500 rpm selam 10 menit

sehingga terbentuk pelet dan supernatan.

5. supernatan dibuang, kemudian menambahkan

2 ml larutan A (EDTA dan Tris-HCl) ke dalam

pelet.

TAHAPAN ISOLASI DNA PLASMID

6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm.

7. Ditambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke

dalam campuran pelet dan larutan A. Kemudian

dibolak-balik 4-6 kali

8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran

pelet, larutan A, dan larutan B. Setelah itu

memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge

dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga

terbentuk supernatan dan pelet.

9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan

memasukkan ke dalam tabung yang baru kemudian

didiamkan selama 1 malam

FUNGSI- FUNGSI SENYAWA

EDTA : ethylenediami tetraacetic acid :

Menginaktivasi enzime DNAse yang dapat

mendenaturasi DNA yang diisolasi

Tris-HCl ( Thrometamine HCL) : merupakan

buffer yang menjaga pH, melindungi isi sel agar

tidak lisis

NaOH (Natrium Hidroksida) merupakan alkali

yang berfungsi merusak membran sel

SDS (sodium dodecyl sulfate): merupakan

detergen, yang dapat melisis dinding sel dan

mendenaturasi protein.

Ka-Asetat (Kalium asetat) sebagai penetralisir

TAHAP PRESIPITASI (PENGENDAPAN)

1. tambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 larutan

ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan

yang telah didiamkan selama 1 malam.

2.Simpan ke dalam freezer dengan

suhu 20C sampai -40C selama 1 jam.

3.Endapkan DNA plasmid dengan disentrifuge

dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit.

4. Membuang supernatan dan membalik botol

konikel di atas tissue dan mendiamkannya

selama ± 5 menit.

FUNGSI ZAT

NaOAc (Sodium Asetat ): sebagai senyawa

berbentuk larutan untuk presipitasi yakni

mengendapkan DNA.

Ethanol untuk presipitasi DNA (pengendapan)

TAHAP PEMURNIAN.

1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh

dengan menambahkan 2 ml ethanol 70 % pada

pellet dan mendiamkankannya selama ± 5 menit.

2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel

di atas tissue sampai kering selama ± 5 menit.

3. Menambahkan 50 mikrolit dH2O pada DNA

plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan

kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip

sampai bercampur.

4. Menghisap larutan dengan mikropipet tip dan

memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian

dimasukkan ke dalam freezer.

FUNGSI ZAT-ZAT

1. ethanol 70 % untuk membersihkan sisa-sisa

larutan yang digunakan untuk mengendapkan

plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh

plasmid yang murni.

2. mikrolit dH2O berfungsi melarutkan DNA agar

DNA yang diendapkan tercampur (Brown

2010).

METODE POLYMERASE CHAIN REACTIONS

(PCR)

Sebanyak 33,6 mL ddH2O (Water Nucleus

Free) dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf.

Kemudian ditambahkan kromosom (template

DNA)1 mL; primer forward 16s rRNA dan primer

reserve 16s rRNA 2 mL;dNTP (10mM) 1 ml; 5 ml

buffer (dapar) PCR dan Mg2+ (MgCl2)sebanyak 5

mL.

PCR (tahap denaturasi awal 94 0C selama

dua menit; penempelan (annealing) 48 0C selama

satu menit, extention 72 0C selama satu menit,

reaksi dilakukan sebanyak 30 siklus).

ELEKTROFORESIS

Produk PCR dielektroforesis dan hasil

elektroforesis dilihat dibawah sinar UV 312 nm

menggunakan alat transilluminatorUV (Cole-

Palmer)

Sebagai penampak bercak digunakan ethidium

bromida.

Disusun oleh :

Dian RamadhaniTanjung

NPM : 8136173005

Pendidikan Biologi A

ISOLASI DNA PLASMID

PLASMID

Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler

(tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di

dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi

secara autonom

Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa

molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui

teknologi DNA rekombinan.

Beberapa hal yang dapat menyebabkan plasmid dapat

digunakan sebagai wahana (vektor) kloning :

Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehinggaDNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;

DNA-nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabilselama diisolasi secara kimia;

Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapatmemperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secaraotonomi

Mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy)sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak danmembuat DNA lebih mudah diamplifikasi;

Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadapantibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalammendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu.

TAHAPAN ISOLASI DNA PLASMID

1. Tahap kultivasi dan harvesting

2. Tahap resuspensi dan lisis DNA plasmid

3. Tahap pemurnian DNA plasmid

Tahap kultivasi dan Harvesting

Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi bakteriuntuk memperbanyak diri sehingga pada saatpemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yangbanyak. Bakteri yang digunakan dalam praktikum iniadalah E. coli yang telah tersisipi plasmid.

Kultivasi dimulai dengan tahapan sebagai berikut:

1. Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama

1 malam.

2. 15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C.

3. Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM

Tris HCl pH 8,100mM NaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), lalu divortek.

4. 10 μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan.

5. Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit.

6. Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm, selama 15 menit, pada

suhu 40C.

7. Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml.

8. Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan.

9. Disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan

dalam tabung eppendorf 1,5 ml.

10. Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-

pelansehingga timbul benang-benang halus DNA

11. Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%.

12. Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet

dikeringkan.

13. Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml.

Fungsi Zat – Zat

1. LB ( Lactose broth ) yang terdiri dari Pepton dan ekstrak beefmenyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri.Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapatdifermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan denganpembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform.Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef;0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.

2. Sentrifugasi adalah proses yang memanfaatkan gayasentrifugal untuk sedimentasi campuran dengan menggunakanmesin sentrifuga atau pemusing

3. Tris HCl pH, NaCl, EDTA, SDS berfungsi untukmenghilangkan polisakarida sementara

4. TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan

EDTA pada konsentrasi tertentu berfungsi sebagai larutan

penyangga , memiliki kapasitas buffering terendah tetapi

memberikan resolusi terbaik untuk DNA yang lebih besar

Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid)

sebanyak yang diperlukan.

2. Tahap Resuspensi dan Lisis DNA Plasmid

Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas

membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas

lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan

sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid

bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and

Parkers, 1999).

Lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa

kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS

(sodium dodesil sulfat).

Berikut ini adalah prosedur resuspensi dan lisis DNA plasmid:

1. Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke

dalam tabung yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik.

2. Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam.

3. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.

4. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution

1, didiamkan dalam es selama 5 menit.

5. Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5

menit.

6. Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara

membolakbalikkan, diinkubasi dalam es selama 5 menit.

7. Disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.

8. Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang.

9. Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur denga

Vortek.

10. Disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit.

Fungsi Zat – zat

Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat

magnesium yang berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun

mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.

Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk

merusak membran sel yang menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel

yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan

cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA

dan RNA).

Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat

protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein

dan polisakarida dari larutan).

Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan

mengendapkan DNA.

3. Tahap pemurnian DNA plasmid

1. Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan

CIAA dengan perbandingan 1:1 (v/v).

2. Dicampur dengan vortek.

3. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas

diambil.

4. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan

ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk

memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA.

5. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase

dan diinkubasi pada 37°C semalam.

6. Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol

absolut dingin.

7. Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC

selama 10 menit.

8. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, lalu pellet

dicuci dengan ethanol 70%.

9. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.

10. Pellet dikeringkan, ditambahTE 50 μl, masukkan ke dalam

tabung.

11. Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk

digunakan lebih lanjut pada suhu - 200C. jika perlu DNA

dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnian

DNA.

Fungsi Zat – zat

Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer,

presipitasi, dan pembilasan DNA plasmid.

Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin

masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama.

Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan

single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut.

etanol absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan

juga untuk membilas dan mencuci plasmid.

Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada

gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan

menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif.

Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk

menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak

ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah

terpresipitasi.

Uji Kuantitas

Uji Kuantitas DNA dilakukan dengan spektrofotometer UV

dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA

yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan

protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA

pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio

OD260/OD280 antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif

murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi

pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi

konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda

tiap ml (Suharsono danWidyastuti, 2006)

Uji Kulitas

Uji Kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis. DNA yang

terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr),

kemudian dilihat di atas sinar ultra violet

Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu

harus ditambahkan loading buffer (dye)

Pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan

ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan

DNA standar

PCR

Sebanyak 5µl komposisi PCR koloni yang telah dimix dengan

0,3 µl primer L1 dan 0,3µl primer L2, selama dalam mesin

PCR dilakukan pradenaturasi pada suhu 95ºC selama 5 menit,

berlanjut terjadinya denaturasi selama 5 menit, proses

annealing pada suhu 52ºC selama 30 menit, kemudian

extension 72ºC selama 2 menit dan proses akhir selama 10

menit.

Restriksi

Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali

urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di

antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut.

Enzim yang digunakan dalam isolasi DNA plasmid adalah

Enzyme tipe II yang menghasilkan fragmen-fragmen tertentu

dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa.

Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara

sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam.

Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA

Plasmid

Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-

fragmen, 2 ul larutan penyangga reaksi 10x (10%), 1 ul enzim restriksi (10

unit/ul) dan dH2O hingga volume larutan menjadi 20 ul dimasukkan ke

dalam tabung eppendorf 500 ul (dengan urutan: dH2O, larutan penyangga,

DNA plasmid, enzim).

Kemudian larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C

Bila DNA belum terpotong sempurna, waktu inkubasi dan/enzim restriksi

ditambahkan lagi.

Bila telah terpotong, aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan larutan

DNA pada suhu 65-70°C.

Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: 1. NotI, 2. EcoRI, 3.

HindIII, 4. SacI, 5. EcoRI dan HindIII, 6. HindIII dan SacI, 7. NotI dan

HindIII, 8. NotI dan EcoRI.

ISOLASI DNA PLASMIDM. K : BIOTEKNOLOGI

JHONAS DONGORAN ( 8136173010 )PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI ( Kelas- A )PROGRAM PASCASARJANAUNIVERSITAS NEGERI MEDAN2014

ISOLASI DNADNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua

kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin

dan pirimdin.

DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat

berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang

menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.

Isolasi DNA adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom

dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman,

kultur mikroorganise, atau sel manusia.

PLASMID

PLASMID :

Molekul DNA utas ganda sirkular, berukuran kecil yang

terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan

replikasi secara autonom

KARAKTER PLASMID

1. Dapat melakukan replikasi

2. Terdapat di luar kromosom

3. Secara genetik dapat ditransfer dengan stabil

1 sel 1 plasmid

KELOMPOK PLASMID

1. Plasmid F (fertilitas) ---- gen tra (konjugasi)

2. Plasmid R (resisten) ---- antibiotik, L.B.

3. Plasmid dengan penyandi toksin dan bakteriosin

4. Plasmid degradatif ---- metabolisme mol. organik (Pseudomonas putida)

5. Plasmid virulensi ---- patogenitas sel inang (Agrobacterium tumifaciens)

Isolasi DNA Plasmid

Isolasi DNA plasmid adalah menghancurkan membran

sel sehingga semua organel sel dapat keluar, sehingga

didapatkan DNA kromosomal serta DNA

ekstrakromosmal (plasmid).

Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu

boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis,

alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang

paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode

alkaline lysis.

Tahapan Isolasi DNA Plasmid

1) Tahap kultivasi dan harvesting

Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi

bakteri untuk memperbanyak diri sehingga

pada saat pemanenan didapatkan plasmid

dalam jumlah yang banyak.

Kultivasi dimulai dengan tahapan sebagai berikut:

- Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama 1 malam.

- 15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C.

- Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM Tris HCl pH

8,100mM NaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), lalu divortek.

- 10 μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan.

- Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit.

- Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C.

- Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml.

- Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan.

- Disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan dalam tabung

eppendorf 1,5 ml.

- Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-pelansehingga timbul

benang-benang halus DNA.

- Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%.

- Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet dikeringkan.

- Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml.

Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid) sebanyak yang diperlukan.

2) Tahap resuspensi dan lisis DNA plasmid

Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar

dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid,

lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran

fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and

Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan

menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan

SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel

dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan

integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak

asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk

merusak membran sel. Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan

phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan

protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan,

memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA.

Berikut ini adalah prosedur resuspensidan lisis DNA plasmid:

Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke dalam tabung

yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik.

Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam.

Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.

Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution 1, didiamkan

dalam es selama 5 menit.

Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5 menit.

Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara membolakbalikkan,

diinkubasi dalam es selama 5 menit.

Disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.

Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang.

Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur dengan

Vortek.

Disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit.

3) Tahap pemurnian DNA plasmid

Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer, presipitasi, dan

pembilasan DNA plasmid. penambahan C-I dilakukan dua kali karena

protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I

pertama. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan

single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol absolut

dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan

mencuci plasmid. Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge

pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti

rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik

antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA

masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan + pada H dan -

pada O). Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi.

Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk

menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA

dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

Tahap pemurnian meliputi sebagaiberikut :

Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan CIAA dengan

perbandingan 1:1 (v/v).

Dicampur dengan vortek.

Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil.

Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI

(fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA.

Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada

37°C semalam.

Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol absolut dingin.

Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC selama 10 menit.

Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, lalu pellet dicuci dengan ethanol 70%.

Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.

Pellet dikeringkan, ditambah TE 50 μl, masukkan ke dalam tabung.

Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk digunakan lebih lanjut pada suhu -

200C. jika perlu DNA dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnian DNA.

Fungsi-fungsi Zat / Senyawa

EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil

sulfat). fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara

mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan

integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim

nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang

merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak

membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Untuk

menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat

protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan

protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk

memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan

DNA.

Lanjutan,,,!!!

Na Asetat

Fungsinya membuat konsentrasi garam tinggi dan single

stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol

absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk

membilas dan mencuci plasmid.

Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge

pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan

menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam

air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih

lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air

(ingat air memiliki 2 muatan + pada H dan - pada O).

Lanjutan,,,!!!

Fungsi penambahan pelarut organik seperti

etanol adalah untuk menurunkan konstanta

dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan

DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih

mudah terpresipitasi.

SELESAITERIMAKASIH

Tahapan Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri

Escherchia Coli

Oleh:

Maiderawati (8136173012)

Program Studi Pendidikan Biologi

Program Pascasarjana

Universitas Negeri Medan

2014

Dosen Pengampu:

Dr. Fauziyah Harahap, M.Si

Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA darimolekul-molekul lain di inti sel.

Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal padabakteri, berutas ganda, dan berbentuk sirkuler (Jusuf, 2001).Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil dan terletak diluar kromosom dalam sel prokariot khususnya bakteri dansel eukariot tingkat rendah seperti khamir. Plasmidmengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang.Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNArekombinan menggunakan Escherichia coli sebagai inangsehingga dalam rekayasa genetika, plasmid seringdigunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentuyang diinginkan ke dalam suatu sel inang.

Tahapan Isolasi DNA plasmid dari bakteri

Escherchia coli

Tahap isolasi

1. Menyiapkan kultur bakteri Escherichia coli yang diinkubasi dalam suhu 370 C

dan dalam waktu 1 malam.

2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair dengan menggunakan mikropipet.

3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung eppendorf 15 ml.

4. Mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm

selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan.

5. Membuang supernatan kemudian menambahkan 2 ml larutan A (EDTA dan Tris-

HCl) ke dalam pelet.

6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm.

7. Menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke dalam campuran pelet dan

larutan A. Kemudian dibolak-balik 4-6 kali.

8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran pelet, larutan A, dan larutan

B. Setelah itu memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge dengan

kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga terbentuk supernatan dan pelet.

9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan memasukkan ke dalam tabung yang

baru kemudian didiamkan selama 1 malam.

Fungsi Zat-zat

o EDTA dapat berfungsi sebagai penghambat DNAse yang dapat

mendenaturasi DNA dan sebagai pengkhelat magnesium yang

berperan dalam merusak stabilitas membran plasma sehingga

membran plasma menjadi tidak stabil.

o Tris-HCl menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga pada

pH nya.

o NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal) dan

mulai menghidrolisis RNA.

o SDS berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan

mendenaturasi protein

o kalium asetat (Ka-Asetat) menyebabkan renaturasi plasmid

Tahapan DNA plasmid (Lanjutan)

Tahap presipitasi

1. Menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol larutan

ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah

didiamkan selama 1 malam.

2. Menyimpannya ke dalam freezer dengan suhu -20C sampai -

40C selama 1 jam.

3. Mengendapkan DNA plasmid dengan disentrifuge dengan

kecepatan 3500 rpm selama 15 menit.

4. Membuang supernatan dan membalik botol konikel di atas

tissue dan mendiamkannya selama ± 5 menit.

Fungsi Zat-zat

o NaOAc adalah garam buffer yang membantu proses

pengendapan.

o Ethanol absolut berguna untuk mengendapkan

plasmid karena perbedaan polaritas.

Tahapan Isolasi DNA Plasmid (Lnjutan)

Tahap pembilasan

1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh dengan

menambahkan 2 ml ethanol 70 % pada pellet dan

mendiamkankannya selama ± 5 menit.

2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas

tissue sampai kering selama ± 5 menit.

3. Menambahkan 50 mikrolit dH2O pada DNA plasmid dengan

menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali

dengan mikropipet tip warna kuning sampai bercampur.

4. Memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan

memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian

dimasukkan ke dalam freezer.

Fungsi Zat-zat

o Ethanol 70 % berfungsi untuk membersihkan sisa-

sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan

plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh

plasmid yang murni.

o dH2O steril yang berfungsi untuk melarutkan DNA

plasmid.

Daftar Pustaka

Akmalia, L. 2012. Tahapan DNA plasmid dari bakteri Escherchia coli, (Online),

(http://lulluakmalia.blogspot.com/2012/10/laporan-praktikum-bio-logi-sel-uler-mol.html, diakses 14 Januari

2014).

Febrina, G, Dkk. 2011. Isolasi DNA Plasmid, (Online), (http://kampungbiologi.blogspot.com/2011/10/isolasi-

dna-plasmid.html, diakses 14 Januari 2014).

Lab Biomol. 2011. Isolasi DNA, (Online), (http://labbiomol.blogspot.com/2012/12/v-

behaviorurldefaultvmlo_17.html, diakses 14 Januari 2014).

Mubin, A.M. 2013. Isolasi Plasmid Dna Bakteri (E. coli), (Online),

(http://duniapeternakanunram.blogspot.com/2013/12/tugas-pengantar-bioteknologi-isolasi_1580.html,

diakses 14 Januari 2014).

Prima. 2011. Isolasi Plasmid Dan Elektroforesis, (Online), (http://prima31.wordpress.com/2011/03/18/isolasi-

plasmid-dan-elektroforesis/, diakses 14 Januari 2014).

Waliyuddin , M. 2013. Isolasi Dan Pemurnian Dna Plasmid, (online),

(http://muhammadwaliyuddin10.blogspot.com/2013/01/laporan-praktikum-tanisolasi-dan.html, diakses 14

Januari 2014)

ISOLASI DNA PLASMID

OLEH : SISKA OBERLINA PURBA

NIM : 813 6173014

DOSEN PENGAMPU :

Dr. FAUZIYAH HARAHAP, M.Si

PROGRAM PASCA SARJANA

PENDIDIKAN BIOLOGI

UNIVERSITAS NERGERI MEDAN

2014

Plasmid merupakan salah satu vektor

pembawa molekul DNA di dalam proses

rekayasa DNA melalui teknologi DNA

rekombinan. Plasmid banyak sekali

digunakan dalam pengklonan DNA, karena

relatif mudah dalam penanganannya.

Plasmid adalah molekul DNA utas ganda

sirkuler (tidak berujung) yang berukuran

kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan

dapat melakukan replikasi secara autonom

(Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid

dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara

lain adalah :

a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga

DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;

b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih

stabil selama diisolasi secara kimia;

c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat

memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara

otonomi;

d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy)

sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan

membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;

e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap

antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam

mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et

al., 1994).

Tahapan Isolasi Plasmid pada Bakteri E.Coli

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan,

yaitu

tahap kultivasi dan harvesting, yakni memberikam kesempatan

bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat

pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak .

tahap lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun

atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas

lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan

sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid

bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and

Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan

dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA

(ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat).

tahap pemurnian DNA plasmid menghilangkan protein dari

larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil

RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida

dari larutan).

Sambungan...

Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung plasmid

ditumbuhkan dalam 10 ml media LB (bacto tryptone 10g/l,

bacto-yeast extract 5g/l, NaCl 10 g/l) lalu diinkubasi di atas

shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37°C selama

semalam.

Kemudian 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml

lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm (Tomy

MRX-150) 4°C selama 10 menit. Lalu endapan bakteri

disuspensikan ke dalam 100 ul buffer suspensi sel (Tris HCl

pH 7.5 + EDTA) dan di-vortex.

Kemudian ditambah 200 ul buffer lisis (0.2M NaOH, 1%

SDS). Suspensi dihomogenkan dengan membolak-balik

tabung (6-8kali) lalu didiamkan 3 menit.

Buffer netralisasi (1,32M Na-asetat pH 4,8) ditambahkan

sebanyak 300 ul dan dihomogenkan dengan membolak-balik

tabung. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C

selama 10 menit.

Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian

dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil

alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein

dengan DNA. Fase air (supernatan) yang mengandung

DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C

semalam.

Kemudian DNA diendapkan dengan penambahan Na-

asetat pH 5,2 sehingga larutan menjadi netral dan etanol

absolut untuk mengikat air.

Setelah diinkubasi pada 30°C selama 2 jam, dilakukan

sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit.

Pelet dibilas dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi

kembali 10.000 rpm selama 10 menit pada 4°C.

Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Selanjutnya

pelet dilarutkan ke dalam buffer TE (Tris-HCl pH 8 10

mM, EDTA 1 mM).

Fungsi Zat-zat

EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat

magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan

integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim

nuklease yang merusak asam nukleat.

Buffer TE Tris-HCl menjaga pH larutan sehingga DNA

tetap terjaga pada pH nya.

SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan

untuk merusak membran sel atau DNA (DNA double strain

menjadi single strain).

NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal)

dan mulai menghidrolisis RNA. Sehingga DNA

kromosomal akan kehilangan bentuknya setelah

terdenaturasi dan yang dapat diperoleh setelah proses ini

kemungkinan besar adalah DNA plasmid.

Sambungan...

PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan

untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya

dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari

senyawa organik dan komponen lipid.

RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa

fragmen RNA.

natrium acetat untuk menciptakan kondisi netral dan

alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada

DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi.

phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan

chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari

larutan).

Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA

dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).

Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi

DNA dengan Spektrofotometer

Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan

mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau TE.

Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca

absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm

dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang

gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam

konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 ug DNA utas

ganda tiap ml. Untuk mengetahui kemurnian DNA

terhadap kontaminan protein, nilai absorbansi 260

nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm.

Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan

Elektroforesis Gel Agarosa

Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam

buffer TAE 1x (Tris-HCl pH 8,3 40 mM, asam asetat pekat 1,98 mM,

EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl 100 mM, asam borat 83 mM,

EDTA 1 mM), dipanaskan hingga jernih dengan microwave.

Setelah suhu tidak terlalu panas (60°C), gel dicetak dengan

menggunakan gel tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat

sumuran, lalu dibiarkan beku. Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke

dalam electrophoresis chamber. Sebanyak 1-2 ul DNA dicampur

dengan larutan pewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25%, xylene

cyanol FF 0,25%, sukrosa 40%).

Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker, λ

yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa.

DNA dimigrasikan kemudian setelah selesai migrasi, direndam

dengan larutan etidium bromide, dan dilihat di atas UV setelah dicuci

dengan H2O. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara

pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita

DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 ng. Bentuk DNA plasmid

ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel.

OLEH :

Elena Mayanti Nduru

813673008

Pendidikan Biologi A’ 2013

PRORAM STUDI MAGISTER PENDIDIKAN BIOLOGISEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN

T.P. 2013/2014

Plasmid adalah molekul DNA utas gandasirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecilyang terdapat di dalam sitoplasma dan dapatmelakukan replikasi secara autonom(Suharsono dan Widyastuti, 2006)

Plasmid banyak sekali digunakan dalam kloninggen karena relatif mudah dalampenanganannya. Untuk itu, DNA plasmid harusdiisolasi.

1. Satu koloni bakteri E. coli yang mengandungplasmid ditumbuhkan dalam 10 ml media LBsemalaman pada suhu 37°C

2. sebanyak 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalamtabung 1,5 ml

3. Diendapkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm(Tomy MRX-150) 4°C selama 10 menit.

4. Endapan bakteri disuspensikan ke dalam 100l buffer suspensi sel (Tris HCl pH 7.5 +EDTA), di-vortex

Media LB : Luria-Bertani media : mediapertumbuhan bakteri yang terdiri dari ekstrakragi, tryptone/pepton, dan NaCl

Tris HCl : Thrometamine HCl : buffer penjagapH, melindungi isi sel agar tidak lisis

EDTA : Ethylenediamine tetraacetic acid :Menginaktivasi enzim DNAse yang dapatmendenaturasi DNA yang diisolasi

5. Ditambah 200 l buffer lisis (0.2M NaOH, 1%SDS)

6. Suspensi dihomogenkan dengan membolak-balikkan tabung sebanyak 6-8 kali

7. Didiamkan selama 3 menit8. Ditambahkan Buffer netralisasi (1,32M Na-

asetat pH 4,8) sebanyak 300 l.9. Tabung dibolak-balik agar suspensi menjadi

homogen10. Disentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10

menit

NaOH : Natrium Hidroksida : larutan basaberfungsi untuk denaturasi protein atau DNA(DNA double strain menjadi single strain).

SDS : Sodium Dodesil Sulphate) : merupakandeterjen yang berperan untuk melisis dindingatau membran sel yang terdiri dari lipid(fosfolipid).

Na-Asetat : Sodium asetat : Untukmenetralkan / menjaga pH

11. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru

12. Diekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol)

13. Fase air (supernatan) yang mengandung DNAdi tambah RNase dan diinkubasi pada 37°Csemalaman

14. DNA diendapkan dan ditambahkan Na-asetatpH 5,2 dan etanol absolut

15. Diinkubasi pada 30°C selama 2 jam

16. Disentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 m

PCI : fenol-kloroform-isoamil alkohol : pelarutorganik untuk memisahkan antara DNA dankomponen lainnya

Rnase : enzim yang memisahkan antara DNA danRNA, melisis RNA

Na-Asetat : Sodium Asetat : Untuk menetralkanpH

Etanol : mengikat air yang sebelumnya terikatpada DNA sehingga DNA mengendap dengansentrifugasi.

17. Pelet dibilas dengan etanol 70%

18. Disentrifugasi kembali 10.000 rpm selama 10menit pada 4°C

19. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan.

20. Pelet dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl pH 810mM, EDTA 1 mM).

Etanol 70% : Untuk mendapatkan pelet yang murni

TE : Tris HCl-EDTA : Menjaga Struktur DNA tetap seimbang, menetralisir DNA agar tidakrusak

1. Suspensi DNA plasmid diencerkan denganmengambil 1 l dalam 99 l H2O atau TE

2. Dibaca absorbansinya pada panjang gelombang260 nm dan 280 nm

3. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260nm dikonversikan ke dalam konsentrasi, yaitu 1OD260 = 50 g DNA utas ganda tiap ml.

4. Untuk mengetahui kemurnian DNA terhadapkontaminan protein, nilai absorbansi 260 nmdibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm.

H2O : Air : Untuk mengencerkan suspensi DNA plasmid

TE : Tris HCl-EDTA : Untuk mengencerkansuspensi Dna plasmid

Gel agarose 1% dipanaskan hingga jernihdengan microwave.

Pada suhu 60°C, gel dicetak denganmenggunakan gel tray (cetakan gel) dandipasang sisir untuk membuat sumuran, laludibiarkan beku.

Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalamelectrophoresis chamber.

Sebanyak 1-2 l DNA dicampur dengan larutanpewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25%,xylene cyanol FF 0,25%, sukrosa 40%).

sampel DNA beserta penanda kuantitas (marker, λ yangdipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gelagarosa.

DNA dimigrasikan, lalu direndam dengan larutan etidiumbromide

Dilihat di atas UV setelah dicuci dengan H2O.

Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antarapendaran pita DNA plasmid yang dianalisis denganpendaran pita DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 mg.

Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlahpita di dalam gel.

20 l larutan dH2O+larutan penyangga+DNAplasmid,+enzim restriksi dimasukkan ke dalam tabungeppendorf 500 l

Larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C

Dielektroforesis untuk mengecek apakah enzim telahmemotong DNA

Bila telah terpotong, DNA dipanaskan pada suhu 65-70°C.

Dielektroforesis kembali untuk menentukan ukuranplasmid dan fragmen-fragmennya.

Anam, K. 2010. Isolasi dan Pemetaan DNAPlasmid. Laporan Praktikum RekayasaGenetika, IPB

Brown, T.A. 1991. Pengantar Kloning Gen(terjemahan). Yayasan Essentia Medica

Suharsono dan Widyastuti. 2006. PenuntunPraktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen.Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati danBioteknologi IPB

PLASMID DNA ISOLATION

Compiled by :

SUKMAWATI SUNDARI SIREGAR

8136173016

Pendidikan Biologi-A

Program Pascasarjana

Universitas Negeri Medan

OUTLINE AIMS:

To isolate DNA PLASMID from Bacteria

METHOD:

This is the classical method of isolating plasmid dna, using small resin

filters that nest within a microcentrifuge tube, are also as kits from

suppliers of materials for molecular biology.

TIMING:

It takes about 60 minutes, including a period of 30 minutes when the

materials are being chilled.

PLASMID

A plasmid is a small DNA molecule that

is physically separate from, and can

replicate independently of, chromosal

DNA within a cell.

Most commonly found as small circular,

double-stranded DNA molecules in

bacteria, plasmids are sometimes present

in archae and eukaryotic organisms.

They are genetically modified and are

used in the recombinant DNA

technology..They are able of carrying 20

genes at a time

Source:

http://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid

APPARATUS AND MATERIAL

A. APPARATUS

1) Beaker Glass3) Microcentrifuge

tube pellet

2) Vortex Mixer

APPARATUS FUNCTIONS

Beaker Glass are normally used in holding liquids and work with

them during chemical analysis. Generally, beakers are calibrated to

allow the user to measure the liquid that is to be used. The type of

glass that is normally used in making beakers can also be heated and

cooled without breaking.

Vortex Mixers are used in bioscience laboratories to mix two different

chemicals for a desired effect or to dilute an acid or alkali by mixing

them with water.

Centrifuge tubes are conical tubes of various sizes made of plastic or

glass material. They are mainly used in micro-centrifuges in molecular

biology laboratories and vary in capacity.

APPARATUS AND MATERIAL

A. APPARATUS

5) 1,5 cm3 Micropipette4) 8 tips of Micropipette

APPARATUS AND MATERIAL

A. APPARATUS

5) 1,5 cm3 Micropipette7)Centrifuge

APPARATUS FUNCTIONS

Micropipette tips are used to measure and transfer small

volumes of liquids.

Centrifuges are often used to separate suspensions in liquids.

Because of their high rotation rates, centrifuges are delicate

and can break easily.

Hair drier is for drying the eppendorf tube

APPARATUS AND MATERIAL

1 cm3 liquid culture of E.coli containing plasmid DNA, grown overnight at

370C. It is best to use a plasmid with a high copy number. Antibiotics is need in

the medium to mantain the plasmid

crushed ice, in an expanded polystyrene cup, as an incubation container

Lysis Solution I (Resuspension solution):

100 µl Glucose/EDTA/Tris (Get) Buffer

Glucose maintains the osmotic pressure and prevents lysis of the cells

EDTA weakens the cell membrane and bind Mg2+ ions that are needed by

Dnases, protecting the DNA from breakdown

Tris buffers the solution at pH 8

A. MATERIALS

APPARATUS AND MATERIAL

Lysis Solution II (lysis solution):

200µl SDS/Sodium Hydroxide (SDS/NaOH) :

SDS dissolves the cell membrane lipids and degrades the celluler proteinsbut not plasmid DNA

NaOH splits the double stranded DNA into single strands.

Lysis Solution III (Neutralizing solution)

150µl Potassium acetate/ Ethanoic acid (KOAc)

Ethanoic acid neutralises the solution, enabling the DNA to renature

Potassium acetate precipitates SDS, proteins, lipid, and large DNA molecules

A. MATERIALS

TECHIC : HOW TO GET THE PLASMID

DNA Isolation

Cutting The DNA

Combining the DNA

Inserting the DNA recombinant into a living cells

Process of getting the plasmid as a vector shown

on video: DNA cloning.mp4.mp4

PROCEDURE

1. Spin down 1 cm3 of

bacterial culture in a 1.5

cm3 microcentrifuge tube

for 1 minute or until a

mass of cells some 2-3

mm in diameter is visible

PROCEDURE

2. Decant the supernatant

(liquid) into disinfectant in a

waste container

The substantion result of

centrigutaion are pellet and

supernatant

3. Ensure that all liquid is

removed, using a micropipette to

draw off any thatremains in a

tube

PROCEDURE

4. Add 100µl of GET bufffer to

the tube, resuspended the cells by

closing the tube, then flicking the

side repeatedly with a finger.

PROCEDURE

SDS is an ionic detergent which

dissolves the phospolipids and

proteins of the cell membrane.

This lyses the cells, releasing the

DNA.

The sodium hydroxide splitts

both the plasmid and

chromosomal DNA into single-

strained molecules, but each

denaturated plasmid remains

stuck as two interwined rings

PROCEDURE

PROCEDURE

8. Very carefully transfer 400µl

of the supernatant (liquid) to a

clean microcentrifuge tube.

Ensure that none of the cell

debris is carried over.

The supernatant contains the

plasmid DNA.

9. Add 400µl of ice cold ethanol.

Mix gently.

PROCEDURE

PROCEDURE

11. Decant the supernatant into a waste

container; taking care not to discard the

pellet of plasmid DNA

12. With a micropipette, remove the last

drops of liquid. If convenient, leave the

uncapped tube to stand at room

temperature for 15 minutes or use a hair

drier so that all the alcohol evaporates.

13. Dissolve the pellet in 15µl of TE

buffer; vigorous mixing is need to ensure

that this happens. Store the plasmid

solution in a freezer or run it on e gel

DIFFERENCES

Isolation of plasmids can be done manually or using KIT

is available from a variety of biotechnology companies

(eg Thermo Scientific, Invitrogen, Qiagen, Macherey-

Nagel, Integrated DNA Technology).

Actually both of them use the same principle, namely it

will lysis the chromosomal DNA under alkaline

conditions (Alkaline Lysis), but using KIT more efficient

of time and is usually more pure on plasmid obtained,

but the manual method and is much more economical.

VIDEO OF DNA PLASMID ISOLATION PROCESS

1. PLASMID DNA ISOLATION PROCESS BY USING KIT

Plasmid DNA Extraction (Miniprep).mp4

2. PLASMID DNA ISOLATION USING VORTEX AND VIAL

Plasmid isolation protocol.mp4

REFERENCES

Bloom mark, et.al. Laboratory DNA Science: An introduction to

recombinant DNA techniques and methods of genome analysis, (Online),

(http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/DNA/PDF/DNA07.pdf,

accessed on January 2014).

Rifa’i Muhammad. 2010. Buku Ajar Genetika MAB4261:Genetika

Rekombinasi dan Populasi,(Online),

(http://muhaiminrifai.lecture.ub.ac.id/files/2011/01/Modul-Genetika.pdf,

accessed on January 2014)

http://www.ppsk.usm.my/lecturers/mravi/PDF_FIles/Plasmidextraction20

02.pdf, accessed on January 2014

THANK YOU

BIOLOGY EDUCATION

POST GRADUATED PROGRAM

STATE UNIVERSITY OF MEDAN

2013

ISOLATION OF

PLASMID DNA

Compiled by :

Raja Novi Ariska

(8136173013)

Plasmid

• Plasmid is a double

stranded, circular extra

chromosomal DNA of

bacterium.

• Used in recombinant

DNA experiments to

clone genes from other

organisms and make

large quantities of their

DNA.

Schematic drawing of a bacterium with its plasmids. (1) Chromosomal DNA. (2) Plasmids

1. Fertility-(F)plasmids: they are capable of conjugation or

mating.

2. Resistance-(R) plasmids: containing antibiotic or drug resistant

gene(s). Also known as R-factors, before the nature of plasmids

was understood.

Types of Bacterial Plasmids

3. Col-plasmids: contain genes that code for colicines, proteins

that can kill other bacteria.

4. Degrative plasmids: enable digestion of unusual substances,

e.g., toluene or salicylic acid.

5. Virulence plasmids: turn the bacterium into a pathogen.

Based on their function, there are five main classes:

How to Isolate Plasmid DNA??

Alkaline Lysis a method used in molecular biology to isolate plasmid

DNA or other cell components such as proteins by breaking the cells open.

Bacteria lyse with an alkaline lysis buffer consisting of a detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) and a strong base sodium hydroxide.

The detergent cleaves the phospholipid bilayerof membrane and the alkali denatures the proteins which are involved in maintaining the structure of the cell membrane.

Steps involving agitation, precipitation, centrifugation, and the removal of supernatant, cellular debris is removed and the plasmid is isolated and purified.

Requirements for Plasmid Isolation

a. Tools • Micro centrifuge.• Water bath (37°C).• Automatic micropipettes

with tips.• 95-100% isopropanol Ice.

b. Media• 2 ml Rich medium LB

(Luria-Bertani) containing antibiotic w/ a single colony of transformed bacteria incubate overnight at 37°C.

c. Buffers and Solutions:• Alkaline lysis solution I.• Alkaline lysis solution II.• Alkaline lysis solution III.• Antibiotic for plasmid

selection.• Ethanol.• Phenol: chloroform (1:1,

v/v).• STE.• TE (pH 8.0) containing 20

μg/ml RNAse A.

Alkaline Lysis Solution

Alkaline Lysis Solution I :

• 50 mM glucose.25 mM Tris-Cl (pH 8.0).10 mM EDTA (pH 8.0).Prepare Solution I from standard stocks in batches of approx. 100 ml, sterilize by autoclaving and store at 4°C.(For plasmid preparation.)

Alkaline Lysis Solution II:

• 0.2 N NaOH (freshly diluted from a 10 N stock).1% (w/v) SDS.Prepare Solution II fresh and use at room temperature.(For plasmid preparation.)

Alkaline Lysis Solution III:

• 5 M potassium acetate, 60.0 ml.Glacial acetic acid, 11.5 ml.H2O, 28.5 ml.The resulting solution is 3 M with respect to potassium and 5 M with respect to acetate. Store the solution at 4°C and transfer it to an ice bucket just before use.(For plasmid preparation.)

• LB Media:• Deionized H2O, to 950 ml.

Tryptone, 10 g.Yeast extract, 5 g.NaCl, 10 g.To prepare LB (Luria-Bertani) medium, shake the ingredients with Distilled water until the solutes have dissolved. Adjust pH to 7.0 with 5 N NaOH and make up the final volume of the solution to 1 liter with deionized H2O. Then sterilize it for 20 minutes by autoclaving at 15 psi .

Procedures

1. Inoculate 2 ml of rich medium

(LB, YT, or Terrific Broth)

containing the appropriate

antibiotic with a single colony

of transformed bacteria.

Incubate the culture overnight at

37°C with vigorous shaking.

2. Pour 1.5 ml of the culture into a

microfuge tube (eppendorf).

Centrifuge at maximum speed

(13.000 rpm) for 30 seconds at

4°C in a microfuge. Store the

unused portion of the original

culture at 4°C.

3. Remove the medium by

aspiration, leaving the bacterial

pellet as dry as possible.

1.5 ml culture

4. Resuspend the bacterial pellet in 100 μl of ice-cold Alkaline lysis solution I (Glucose, Tris-Cl (buffering agent)‏, EDTA (metal chelator)‏, RNAse A) by vigorous vortexing.

Function of chemical substances

• Rich medium LB : as a medium culture for the

bacteria

• Glucose : maintain the osmotic pressure and

prevent lysis of the cell.

• Tris-Cl : buffers the solution at pH 8

• EDTA : weakens the cell membrane and chelates Mg2+ ions that are needed by a DNAses , protecting the DNA from breakdown

• RNAse A : degrades RNA

5. Add 200 μl of freshly prepared Alkaline lysis solution II (NaOH, SDS) to each bacterial suspension. Close the tube tightly, and mix the contents well by inverting the tube . Do not vortex. Store the tube in ice.

SDS

NaOH

• Dissolves membranes

• Binds to and denatures proteins

• Denatures DNA

Because plasmids are supercoiled, both DNA strands remain entangled after denaturation

• NaOH

The NaOH splits the double- stranded DNA into single strands

• SDS

The SDS dissolves the

cell membrane lipids and degrades the cellular proteins.

Function of chemical substances

6. Add 150 μl of ice-cold Alkaline lysis solution III (Potassium acetate, Glacial acetic acid, H2O). Close the tube and disperse Alkaline lysis solution III through the viscous bacterial lysate by inverting the tube several times. Store the tube in ice for 3-5 minutes.

1. Potassium acetate / acetic acid solution• Neutralizes NaOH (renatures plasmid DNA)‏

• Converts soluble SDS to insoluble PDS

sodium dodecyl sulfate potassium dodecyl sulfate(H2O sol. = 10%) (H2O sol. < 0.02%)‏

Function of chemical substances

• Potassium acetate

The potassium acetate precipitates SDS, proteins,lipids and large DNA molecules.

• Acetic acid

Neutralises the solution,enabling the DNA to renature.

• Ethanol ; organic solvent, precipitates DNA

7. Centrifuge the bacterial lysatefor 5 minutes at maximum speed at 4°C in a microfuge. Collect the supernatant to a fresh tube.

Separate plasmid DNA from contaminants by centrifugation

Supernatant contains:- Plasmid DNA- Soluble cellular constituents

Pellet contains:- PDS- Lipids- Proteins- Chromosomal DNA

8. Precipitate nucleic acids from the supernatant by adding 2 volumes of ethanol at room temperature. Mix the solution by vortexingand then allow the mixture to stand for 2 minutes at room temperature.

• Collect the precipitated nucleic acids by centrifugation at maximum speed for 5 minutes at 4°C in a microfuge.

• Discard the supernatant by aspiration.

• Add 1 ml of 70% ethanol to the pellet and invert the closed tube several times. Recover the DNA by centrifugation at maximum speed for 2 minutes at 4°C in a microfuge.

• Remove all of the supernatant by aspiration.

• Remove any beads of ethanol from the tube. Store the open tube at room temperature until the ethanol has evaporated and no fluid is visible in the tube (5-10 minutes).

• Dissolve the nucleic acids in 50 μl of TE (pH 8.0) containing 20 μg/ml DNase-free RNase A (pancreatic RNase). Vortex the solution gently for a few seconds and store the DNA at -20°C.

Quantifying Plasmid DNA

Quantify DNA using UV absorbance

– DNA UV absorbance peaks at 260 nm

– protein UV absorbance peaks at 230 nm (peptide bond) and 280 nm (aromatic amino acids)

– The ratio of the absorbance at 260 nm/280

nm is a measure of the purity of a DNA

sample; it should be between 1.65 and 1.85.

DNA Electrophoresis• The process using electro-field to separate macromolecules

in a gel matrix is called electrophoresis.

• DNA, RNA and proteins carry negative charges, and

migrate into gel matrix under electro-fields.

• The rate of migration for small linear fragments is directly

proportional to the voltage applied at low voltages.

• At low voltage, the migration rate of small linear DNA

fragments is a function of their length.

• At higher voltages, larger fragments (over 20kb) migrate at

continually increasing yet different rates.

• Large linear fragments migrate at a certain fixed rate

regardless of length.

• In all cases, molecular weight markers are very useful to

monitor the DNA migration during electrophoresis.

Conformations of Plasmid DNAs

Plasmid DNA may appear in the following five

conformations:

Super Coiled

Linear DNA

SC

Relaxed region

Nicked DNAs

1) "Supercoiled" (or "Covalently Closed-Circular")

DNA is fully intact with both strands uncut.

2) "Relaxed Circular" DNA is fully intact, but "relaxed"

(supercoils removed).

3) "Supercoiled Denatured" DNA. small quantities occur

following excessive alkaline lysis; both strands are uncut

but are not correctly paired, resulting in a compacted

plasmid form.

4) "Nicked Open-Circular" DNA

has one strand cut.

5) "Linearized" DNA has both

strands cut at only one site.

Conformation of Plasmid DNAs

The relative electrophoretic mobility (speed) of these DNA

conformations in a gel is as follows:

Nicked Open Circular

(slowest)

Linear

Relaxed Circular

Supercoiled Denatured

Supercoiled (fastest)

Reference

• Amrita virtual lab, Plasmid Isolation (Mini Preparation), available at http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=77&sim=314&cnt=1

• NCBE, 2000, Extraction of Plasmid DNA , available at http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/DNA/PDF/DNA07.pdf

• Rohde and Henze, 2011, Plasmid Isolation from Bacteria. Available at http://www.dsmz.de/fileadmin/Bereiche/Microbiology/Dateien/Kultivierungshinweise/Plasmid_Isolation_from_Bacteria.pdf