DOCTORADO EN CIENCIAS YBIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS

Estudio de las enzimas geraniol 10-hidroxilasay P450 reductasa en raíces transformadas de

Catharanthus roseus

B[ondy Beatriz Canto Canché

Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C.

DOCTORADO EN CIENCIAS YBIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS

Estudio de las enzimas geraniol 10-hidroxilasay P450 reductasa en raíces transformadas de

Catharanth us roseus

Tesis que para obtener el grado deDoctor en Ciencias presenta:

Blondy Beatriz Canto Canché

Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C.

Mérida, Yucatán, México2000

DEDICATORIAS

La familia de proteinas P450 conforman una superfamilia. Por la admiración einterés que despertaron en mi las reconozco no solo como una "superfamilia" sinocomo `.una gran familia" Pero conozco a otra gran familia que despierta en míintensas emociones: mi familia, mi archipiélago pahicular formado de dos amadasislas. Para ti lgnacio, mi compañero, amigo y esposo, y para nuestro islote, Victor,les dedico esta tesis por todo su amor y apoyo incondicional.

A mis padres, Elberth Canto y Guadalupe Canché y a mi hermana Gladys, por sucariño y apoyo.

A la familia Canto Vázquez, porque siempre podemos contar con ellos

A toda la familia Garrido Canto, porque más que primas, siempre han sido como mishermanas, y a todos mis sobrinos. Jazmín, Nandito, Paco, Chela, Miguelito, Karime,Jonathan, Monserrat, Karla, Gaby y Alejandro.

Al tío Felipe, por apoyarme con el cuidado de Victor en el final de esta odisea.

A Rosy Galaz Ávalos, por su amistad incondicional.

A Aldo Ciau Uitz, porque aunque lejos, siempre ha estado presente, brindándome suamistad y apoyo.

RECONOCIMIENTOS

Este trabajo se realizó en la Unidad de Biología Experimental del Centro delnvestigación Científica de Yucatán, baio la dirección del Dr. Víctor M. LoyolaVargas.

Este trabajo fue financíado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología(225135-5-4023N) y una beca del CONACYT (88210) para Blondy Beatriz CantoCanché.

AGRADECIMIENTOS

A mi director de tesis, Dr. Víctor M. Loyola Vargas, por las discusiones académicas,su dirección, apoyo y confianza.

A mi comité de revisión de tesis, Dres. Teresa Hernández Sotomayor, RosarioMuñoz Clares, Diego González Halpein, Luis González de la Vara, Graciela Racagnidi Palma y Enrique Sauri Duch, por enriquecer con sus comentarios estemanuscrito.

A los miembros que conformaron mi comité tutoral, Dres. Teresa HernándezSotomayor, Rosario Muñoz Clares y Victor M. Loyola Vargas, por sus conseios yrecomendaciones durante todo el doctorado.

A toda la plantilla de profesores del posgrado, internos e invitados, por contribuíractiva y entusiastamente en mi formación como estudiante e invitarme a continuareste camino.

A los Dres. lrene Benveniste, Barbara A. Halkier y Daniel O'Keefe por la donaciónde los antisueros contra la CPR de H. {uberosus, la CPR de S. bí.co/or y la proteínade aguacate ARP-1, respectivamente. A los Dres. Roben Verpoone y Annemarie H.Meijer por permitirme trabajar cx)n el antisuero generado durante el doctorado deAnnemarie.

AI Dr. Marco A. Villanueva Méndez, porque en todos los congresos en los quecoincidimos, y también a través del correo electrónico, siempre tuvo tiempo paradiscutir mis resultados y darme consejos y sugerencias.

A todos mis compañeros del posgrado, especialmente a Víctor Suárez Solís, lgnaciolslas Flores, Oscar Moreno Valenzuela, Luis Carlos Rodriguez, Luis CarlosGutiérrez Pacheco, Cesar de lo§ Santos Briones y Mauricio de la Puente, por sucompañerismo, amistad y por tantas veces que discutimos sobre nuestros trabaios

A todos los integrantes del grupo del Dr. Loyola, por su apoyo.

AI Centro de lnvestigación Científica de Yucatán por el apoyo moral y económicodurante todo el doctorado.

AI CONACYT, por su apoyo económico.

Contenido

AbreviaturasResumenAbstractlntroducc.ión

Capítulo l AntecedentesAlcaloides¿Qué son los alcaloides?Alcaloides indólicosAlcaloides monoterpén-indólicos (AMls) y Caiharan{hus roseus

Biosíntesis de los alcaloides monoterpén-indólicosPasos metaból.icos clavesGeraniol 10-hidroxilasa

Citocromos P450Complejo citocromo 9450. HistoriaDescripción generalClasificaciónBiogénesis de las proteínas P450 microsomalesTopología y estructuraLocalizac.ión y transporteF}egulaciónCitocromo P450 reductasa (CPR) , una flavoproteína especial

Proteínas P450 vegetalesDatos generalesLa CPR en el reino vegetalCompanamentalización de las proteínas P450 vegetalesTopología de las proteínas P450 de plantasLas proteínas P450 y el metabolismo secundariolmportanc.ia de las proteínas P450 en la biosíntesi§ de losmetaboritos secu ndariosProteínas P450 y biosíntesis de alcaloides

ObjetivosObjetivos generalesObjetivos específicos

Modelo biológlco

13

1415

1717

19

2022

2527283131

3334

RESULTADOS

Capítulo 11 Multjple forms of NADPH: Cyt P450 reductase ln theMadagascar periwinkle Ca!ha/aníus /oseus

53

Capítulo 111 Non-coordlnated response of cytochrome P450 dependentgeranlol lo-hydroxylase and NADPH: Cyt C (P450) reductaseln ca!haianíus roseus halry roots under different conditions 69

Capítulo lv Character¡zation of polyclonal antibodies against the geranlol1 O-hydroxylase trom Camaranfus roseus

Capítulo v Dlscu§Ión general

Capítulo vI Perspectlvas

Anexo 1 Metodologías empleadas para cuantificar las activldades/A w/Íro de las enzimas geranlol 10-h¡droxllasa y NADPH:clt c (P450) reductasa de C. /oseus

Anexo 11 Geranlol 10-hldroxllasa y NADPH: cit c (P4§O) reductasade C. roseus

105

113

ABREVIATUFUS

ABREVIATURAACTHADNcAhRAM'sAMPcAOSARNmARntBA2HCa4HCPRD6clHDXPSFADFMNG10HGTPHMGRHsplgGslppNADHNADPHNFIPALPCRPKAplsSFISRPSSTDC

SIGNIFICADOHormona ad renocorticotróp icaÁcido desoxirribonucleico complementarioReceptor de aril-hidrocarbonoAlcaloides monoterpén indólicosAdenín nucleótido monofosfato cíclicoAleno óxido sintasaÁcido ribonucleico mensajeroTranslocador nuclear del receptor AhBenzoico 2-hidroxilasat-Cinámico-4-hidroxilasaCitocromo P450 reductasaDihidroxi-pterocarpán 6cL-hidroxilasa1 -deoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasaFlavín adenín dinucleótidoFlavin mononucleótidoGeraniol-10-hidroxilasaGuanín nucleótido trifosfato3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasaProteína de choque térmicolnmunoglobulinas tipo Glsopentenil pirofosfatoNicotín adenín dinuclétido monofosfato reducidoNicotín adenín dinuclétido difosfato reducidoFactor nuclear 1Fenilalanilamonio liasaReacción en cadena de la polimerasaCinasa A de proteínaPuntos isoeléctricosFactor 1 esteroidogénicoPanícula de reconocimiento de señalEstrictosidina sintasaTriptofano decarboxilasa

RESUMEN

La enzima NADPH; citocromo P450 reductasa (CPR, E.C.1.6.2.4) es unaproteína que reduce a las enzimas citocromo P-450 mono-oxigenasas típicas, lascuales t:enen funciones centrales en el metabolismo de los terpenos, alcaloides.flavonoides, fitoalexinas, etc

En la planta Apocynaceaea Caíharanfhus roseus la mono-oxigenasa P-450geraniol 10-hidroxilasa (G10H, E.C.1.14.14) participa en la biosíntesls de losalcaloides monoterpén indólicos. Esta enzima parece representar un puntoimpc>rtante en la regulación de la biosíntesis de estos compuestos, en base a que suactividad correlaciona con la producción de dichos metabolitos secundarios. En elpresente trabajo se estudia la regulación de la enzima G10H así como la regulaciónde su reductasa, la enzima CPR.

En C. roseus la CPR es aparentemente codificada por un solo gen y sepiensa que posee una única proteina con actividad de CPR. La detección dediversos polipéptidos en las inmunodetecciones de CPR o durante el aislamiento dela CPR de C, roseus se han atribuído a degradación proteolítica. En este trabajo semuestra evidencia, apoyada en el uso de antisueros heterólogos, de que la CPR deraíces transformadas de C, roseus es una familia de por lo menos dos péptidos deaproximadamente 87 y 84 kDa. Estas proteínas también fueron inmunodetectadasen las raíces y en el tallo de plantas silvestres de C. roseus. En las hojas y en lasflores se observaron también más de una presunta CPR, pero con masasmoleculares de aproximadamente 78 y 74 kDa, lo que sugiere inmunotipos de CPRtejídos-específicos en esta planta. La actividad de CPR en las raices transformadasde C. roseus fue inhibida en presencia de la lectlna concanavalina A, por lo que esposible de que al menos algunas de las CPRs inmunodetectadas sea el resultadode un procesamiento de glucosilación.

Para obtener información sobre la regulación de las actividades de lasenzimas G10H y CPR de C. roseus se analizaron sus comportamientos en raícestransformadas que fueron sometidas a tratamientos que provocan la síntesis dealcaloides. Ambas actividades aumentaron cuando las raíces estuvieron en unmedio de cultivo libre de fosfatos o cuando se transfirieron a un medjo con altocontenido de sacarosa (medio de producción de alcaloides), presentando unaregulación coordinada. Sin embargo, con otros tratamientos mostraron unaregulación diferencial, ocurriendo un aumento en la actividad de la CPR, pero no enla actMdad de la G10H, lo que sugiere que la regulación de estas enzimas escompleja.

En el presente trabajo se caracterizó un suero contra la GIOH de C. roseus.Este antisuero fue capaz de inhibir la actividad de G10H y de reconocer a unaproteína de aproximadamente 57 kDa en las preparaciones crudas de microsomasen los que se había detectado la actividad de G10H. El antisuero mostró unresultado negativo con las preparaciones microsomales en las que la actividad deG10H estuvo ausente, tanto de C. roseLÍs como de otras especies vegetales. Por lotanto, este suero puede ser usado para continuar con el análisís de la regulación deesta mono-oxigenasa.

Utnizando el suero contra la G10H de C. roseL/s y el suero contra la CPR deH. Íuberosus se obtuvieron algunos resultados sobre la posible regulación espacialde estas proteínas en C. roseus. Los resultado§ sugieren que la G10H tiene una

distribución tejido-específica, mientras que la CPR está presente, y en forma activa,en los diferentes Órganos de la planta. También se exploró si las proteínas G10H yla CPR son inducidas con diferentes tratamientos que se han reportado provocan unaumento de los alcaloides monoterpén-indólicos. La proteina G10H aumentósolamente cuando las raíces se transfirieron a medio de cultivo libre de fosfatos o a.iiedio de cultivo con 8% de sacarosa, mientras que la proteína CPR se indujo enestas condiciones y también con la adición de ácido abscísico o zeatina, apoyandolos resultados obtenidos sobre las actividades, que sugieren que la regulación deéstas enzimas no está estrictamente coordinada.

ABSTRACT

NADPH: Cyt P-450 reductase (CPR, E.C.1.6.2.4) is the redox pahner ofclassical cyt P450-monooxygenases, which have crucial roles in the metabolism ofterpenes, alkaloids, flavonoids, phytoalexins, etc.

ln the Apocynaceae plant Cafharaníhus /oseus the enzyme geraniol 10-hydroxylase (G10H, E.C 1.14.14), a P450 monooxygenase, catalyses a commitedstep in the indol alkaloid biosynthesis lts reaction is apparently one point of controlon this metabolic pathway, because G10H activity correlates with the production ofthis secondary metabolites, The present work was focused on G10H activityregulation and also on the regulation of its reductase, the enzyme CPR.

C. roseus-CPR has been repohed as encoded by a single gene and earlypapers concerning the C. roseus-CPR protein also reponed a single CPRpolypeptide. The observation of diverse CPRs during purification or by immunoblotanalysis was attributed to proteolytic degradation of the native enzyme. Using twoheterologous antisera directed against the CPR from Sorghum b/.co/or andHe//.anfhus fuberosus, respectively, we immunodetected two cross-reactivepolypeptides in C. roseus hairy roots, with molecular masses of 87 and 84 kDarespectively. Both proteins were also visualized in the roots and the stem from plantsgrowing in the field. The leaves and the flowers showed also two immuno-reactiveproteins, but their molecular masses were 78 and 74 kDa respectively, suggestingtissue-specific CPR forms in this plant. The activity of C. roseus hairy rotos-CPR wasinhibited by the lectm concanavaline A, therefore it is probably that some of the CPR-

polypeptides are the result of glycosylation of the original protein.

ln order to obtain basic information about the regulation of the enzymes GIOHand CPR in C. roseus, their responses when C. /oseus hairy roots were subjected tovarious treatments which induce monoterpene-indole alkaloid biosynthesis wasexamined. Both activities increased when the roots were transfered to phosphorous-lacking culture medium or a medium containing high sucrose, showing coordinatedregulations. However, they showed a different response with other treatments; theCPR activity generally was increased but there was no increase on G10H activity,suggesting that the regulation of these enzymes is complex.

ln the present work it was characterized an antiserum against C. roset/s-GIOH. This antiserum was able to inhibit the G10H activity; in crude microsomes inwhich G10H activity was detected the antiserum cross-reacted with a 57 kDa protein,which is congruent with the reported in the literature. The antiserum showed nocross-reaction with crude microsomes in which G10H activity was absent, either fromC. roseous or other plants. We cx)ncluded that this antiserum can be used to analysethe regulation of this P-450 monooxygenase.

Using the antisera against C. roseus-G10H and H. 7-uberosus-CPR we obtainsome results concerning the spatial regulation of G10H and CPR in C. roseus. Thedata suggest that G10H has a tissue specific distribution, while CPR is probablypresent, and in an active form, in the different tissues of this plant. We also exploredwhether G10H and CPR polypeptides are Índuced with different treatments whichhad been reported that produce an increase in the monoterpene indole alkaloidscontent.

G10H protein increased when the hairy roots were transferred to culturemedia without phosphorous or med¡a plus 8% sucrose, but CPR protein was inducedin these cx)nditions and also with addition of abscisic acjd or zeatine, supporting theresults obtained wíth the enzymatic activities, which suggest that G10H and CPRregulatíon is not strictly coordinated.

lNTRODUCCIÓN

Las plantas han sido desde los inicios de la civilización un factor muyimportante para restaurar la salud humana. Además han sido ut"zadas a lo largo dela historia como una importante fuente de compuestos con diversas activídades, lascuales van desde las farmacológicas hasta la perfumería, pasando por su empleocomo condimentos para alimentos.

El aumento en la población, así comct la aparición de nuevas enfermedades,ha obligado a Íncrementar la producción de compuestos con actívidadfarmacológica, lo que ha provocado un impohante déficit en el suministro de losdiversos fármacos. Por ello se han estado buscando diversas altemativas parasolucionar esta problemática. La mejor estrategia, si bien es cierto que es a largoplazo, es el conocimíento de las vías de síntesis de los compuestos de interésfarmacológico. El conocimiento de las vías metabólicas permítirá. como ya estádándose el caso para otros tipos de compuestos, su manipulación.

Cafharaníhus roseus (Apocjnácea) es uha planta originaria de Madagascar, lacual produce una importante cantidad de alcaloides monoterpén .indólicos. De todosellos, cinco o seis se utilízan en diversos tratamientos médicos. Destacan lavincristina y la vinblastina, dos alcaloides bisindólicos que son empleados en eltratamiento de diversos tipos de cáncer, pero también se tiene a la ajmalicina, laserpentina, la ajmalina, la catarantina, y varios más.

Los alcaloides bisindólicos requieren de dos vías metabólicas para susíntesis. La via de los aminoácidos aromáticos y la vía de los terpenos. La primeraproporciona triptofano para síntesis de triptamína. uno de los dos precursoresnecesarios para la biosíntesis de este tipo de alcaloides. La segunda producesecologanina, un terpeno. el otro precursor de los alcaloides monoterpén indólicos.La estrictosidina sintasa es la enzima encargada de la condensación de los dosprecursores en el primer producto monoterpén indólico. la estrictosidina.

La descarboxilación del triptofano a triptamina, catalizada por la triptofanodecarboxilasa, es un paso altamente regulado, que sin embargo no es el pasolimitante en la biosíntesis de los alcaloides monoterpén indólicos. Parece ser que labiosíntesis de la secologanina es el paso limitante en la biosintesis de este tipo dealcaloides. Desafortunadamente, de los posiblemente 18 a 20 pasos necesariospara la síntesis de este terpeno sólo se conocen cuatro. Uno de ellos, lahidroxilación del 10-hidroxi geraniol, catalizado por la enzima geraniol 10-hidroxilasa, es hasta ahora el único paso que se ha determinado que es inhibido porun alcaloide, la catarantina.

La geraniol 10-hidroxilasa es un miembro de la familia de las citocromo P450.Como tal, está formada por dos actividades enzimáticas, una actividad de reductasay la otra de oxigenasa. Es una enzima compleja, de la cual se desconocenprácticamente todos los aspectos bioquímicx)s de su regulación y su papel en labiosíntesis de la secologanina. En el trabajo desarrollado en esta tesis se aportandatos sobre la regulación de esta compleja enzima.

CAPITULO I

ANTECEDENTES

ALCAL0lDES

¿QUÉ SON LOS ALCALOIDES?El término alcaloide fue acuñado por W. Meisner en el siglo XIX para identificar

sustancias naturales que reaccionan como bases (al-kali, base, soda). Sin embargo, notodos los compuestos básicos pehenecen al grupo de los alcaloides. Los compuestos

::es:eehs:Lec::ra:'efrcuupa:::L:Sgaé::;::::t:oS:r:;aá:á:"'a:ghúentea'#c:ia=idc:.nÉn::g3:l:definición de un alcaloide verdadero y los distingue de otros compuestos denominadosprotoalcaloides y pseudoalcaloides. Los protoalcaloides son aminas derivadas deaminoácidos. pero el nitrógeno no forma parte de un anillo heterocíclico, como son lamezcalina o la betanina. Los pseudoalcaloides por el contrario, poseen un anilloheterocíclico con nitrógeno. pero sus precursores no son aminoácidos; en este grupose encuentran los pseudoalcaloides diterpénicos (atisina, aconitina) y lospseudoalcaloides esteroidales (paravallarina, samandenona). Actualmente se hanaislado más de 10.000 compuestos que han sido identificados como alcaloides(Kutchan,1995).

lnicíalmente se pensó en estos cQmpuestos como "desechos metabólicos osustancias no vitales para los organismos que los producen.' con base en que no tieneniina distribución universal. Los alcaloides son sintetizados principalmente en lasplantas, en las cuales se estima que iin 30°/o de éstas los producen. También se hanidentificado en algunos hongos y en algunos anfibios. Su producción no es homogénea,aún en las plantas de la misma familia o género, pues pueden presentar diferentesespectros de alcaloides. Por ejemplo, la quinina ~alcaloide quinolínico empleado para eltratamiento de la malaria- representa aproximadamente el 93% del total de losalcaloides extraídos de la corteza de Ci.nchona /eclgen.ana. C/.nchona ca//.saya producemenor concentración de alcaloides totales y de éstos sólo el 50°/o corresponde a laquinina.

A pesar de que para muchos de estos compuestos no se han identificadofunciones definidas en el organi§mo que los sintetiza, la idea original de éstos comomaterial de desecho se reconoce hoy en día como poco probable. La complejidad delas rutas biosintéticas, la baja expresión de algunas de las enzimas y los complejosmecanismos (aún hoy no totalmente entendidos) que controlan la producción de estosmetabolitos hacen suponer que los productos deben tener alguna finalidad. Como ungran número de estos compuestos son tóxicos para los animales, se cree qiie sufunción es conferir resistencia o protección hacia el ataque de organismos patógenos ohacia el ataque de depredadores. Su sabor desagradable, por ejemplo, puededesalentar el devorar una planta productora de alcaloides; si un depredador se alimentade estas plantas, esto puede provocarle la muerte, como ocurre con el ganado quepastorea donde crecen senesio (Compositae) y crotaria (Leguminosae), herbáceas

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productoras de alcaloides pirrolizidínicos tóxicos. Otros alcaloides son potentesrepelentes naturales de insectos, como los alcaloides isoquinolínicos y bisbenzil-isoquinolinicos de algunas cactáceas y la nicotina de W/.coÍ/.ana. Escopolamina yatropina, alcaloides derivados del tropano, son insecticidas que provocan parálisis enlos insectos que los ingieren (Schuler, 1996a). En compatibilidad con su posible funciónde defensa. la biosíntesis de los alcaloides benzofenantridínicos en Papaveráceas yFumaráceas (Dittrich y Kutchan, 1991; Tanahashi y Zenk, 1990). Rutáceas yCaprifoliáceas (lgnatov et al., 1996) y la biosíntesis de los alcaloides monoterpén-indólicos en Apocináceas son estimuladas por patógenos. La gran diversidad existentede alcaloides, y de otros aleloquímicos, puede ser el resultado de una constanteevolución adaptativa, debido a la interacción de las plantas con otros seres vivos, loscuales están continuamente coevolucionando también. Un ejemplo de esta posibleevolución adaptativa es la resistencia de las especies de Drosoph/./a que viven en eldesierto de Sonora, México, hacia los alcaloides isoquinolínicos que producen algunascactáceas de esta región. La carnegina y la gigantina sintetizadas por el saguaro(Cameg/.a g/.ganfea) y el cardón (Pachycert/s pr/.ng/e/) son altamente tóxicas para lasespecies de Drosoph/./a que no viven en el desierto, mientras que resultan inocuas paralas especies que viven en el saguaro u otros cactus. AsÍ mismo, la pilocereína -unalcaloide isoquinolínico trimérico producido por el senita (Lophocereus scho#/./) estóxico para todas las especies de Drosoph/./a, excepto para las especies que viven en elsenita (Schuler,1996a).

Desde el punto de vista antropocéntrico, una de las características másimportantes de los alcaloides es que una gran cantidad de estos metabolitos(potencialmente todos, dependiendo de la dosis) presenta alguna actividad biológica enlos mamiferos. Por ello, a pesar de no conocer la función de los alcaloldes en lasplantas que los producen, el hombre ha usadc) estos compuestos desde hace milenios,ya sea como pociones, medicinas e incluso como venenos. Al inicio del siglo XIX selog.ó aislar el prmcipio somnífero del opio (Papaver somn/.Íert/m); esta sustancia fueposteriormente llamada morfina. Poco después se aislaron la cafeina. la nicotina, laemetina, la estricnina, la cinchonina y la coniína, siendo éstos solo los primeros de estagran familia de principios activos (Bruneton et al., 1995). En términos generales lasobredosis de cualquier alcaloide resulta siempre tóxica al hombre; algunas de lassustancias más frecuentemente encontradas por los forenses son: nicotina, moriina,estricnina, codeína, aconitina y atropina. Otro problema potencial es la fármacodependencia, generada por el abuso de alcaloides que tienen efecto sobre el sistemanervioso, como la morfina, la cocaína, etc. Sin embargo, con un uso racional ycuidadoso los alcaloides son importantes aliados para el tratamiento de enfermedades.Sus aplicaciones farmacológicas son muy diversas: estimulantes (cafeína, nicotina);relajante (papaverina); sedantes (hioscina, morfina); anestésicos (atropina, codeína,cocaína); antibacterianos (berberina), antimalárico (quinina); amebicida (emetina):anticancerígenos (vincristina, vinblastina, camptotecina, taxol, elipticina), etc. Deacuerdo a G. Richter "por el enorme número de alcaloides que existen, su diversidadestructural y sus múltiples aplicaciones, los alcaloides constituyen uno de los gruposmás importantes de sustancias naturales con lnterés farmacéutico" citado por(Bruneton et al., 1995).

Los alcaloides han sido clasificados en base a su estructura química y tambiénen su origen biosintético. El cuadro 1 presenta un resumen de las principales subclases

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de alcaloides, indicando su origen biosintético y su distribución en las familiasvegetales.

Cuadro 1. Clasificación de los alcaloides (Bruneton et al., 1995).

CLASE OR'GEN •DISTRIBUCIÓN EJEMPLOS

(ESTRUCTUIU) BIOSINTÉTICO (FAJyllLIASVEGETALES) _

Pirrolídínicos Omitina (ácido glutámlco) Cruciferae,Erythrolaceae,Orchidaceae,Solanaceae Brunfelsamjdina, hígrina

Derivados del tropano Ornltina (ácido glutámíco) Cruciferae, Cocaína, hioscina,Euphorbaceae,ErythroxylaceaeSolanaceae hiosciamina. escopolamina

Pirrolizidínicos Omitina (ácído glutámico) Asteraceae,Boraginaceae,Fabaceae Heliotrina, senecefilina

Piridínicos Ácido nicotínico (ácido Asclepíadaceae, Arecolina, nicotinaglutámico) Solanaceae

Piperidínicos Llsína Crassulaceae,Lobeliaceae.Punicaceae Peletierina, coniina, lobelina

Quinolizidínicos Hsina Fabaceae Esparteína, lupina, matrina

lndolizidínicos Lisina Convolvulaceae,Orchidaceae Castanospemina

Quinazolínicos Ácido antranílico Araliaceae, Peganina, riitacarpina.Acanthaceae,Fabaceae,Rutaceae vascicina

lsoquinolínicos Tirosina Cactaceae Alcaloides del peyote(cactus).emetina,hordenina

Benzil-isoquinolínicos Tirosina Berberidaceae, Berberina, codeina, momna.Fumariaceae,Papaveraceae opio, reticulina papaverina.

Bisbenziltetrahídro- Fenllalanjna/tirosina Annonaceae. Curare, ciirina, funiferina, 5-isoquinolínicos Berberidaceae,Lauraceae, hidroxiapatelina,sanguinerina,thalicarpina,

Merispemaceae,Monimiaceae.Ranunculaceae tubocurarina

lndólicos Triptofano Euforbaceae,Leguminoseae Fisostigm ina, serotonina

Cuadro 1. Contlnuación.lmidazólicos "stidina Cactaceae, Alcorneina, dolicotelina,

Fabaceae,Rutaceae pilocarpina

Terpénicos (origen biosintético doble) :

Monoterpén-indólicos Triptofano + C,o Apocinaceae, Aimalicina, estricnina,Loganiaceae,Rubiaceae vindolina, vinblastina,vincrístina

Quinolínicos Triptofano + C,o Apocinaceae, Camptotecina, quinina,lcacinaceae,NyssaceaeRubiaceae ql,,n,dLna,

Monoterpén- Tirosina + Cio Alangiaceae, Cefelina, emetina. sicotrinaisoquinolínícos lcacinaceae,Rubiaceae

• Aúgunas clases de alcaloides son producidas lambién en otros reinos.

ALCALOIDES INDÓLICOS

Este es el nombre que reciben todos los alcaloides que se derivan del triptofano.Los alcaloides indólicos pueden ser de tipo simple o complejo dependiendo del númerode precursores de los cuales provienen. Los alcaloides indólicos simples derivanúnicamente del triptofano, como la fisostigmina, la serotonina y la 5-hidroxitriptamina.mientras que los alcaloides indólicos complejos son sintetizados a partir de lacondensación de dos precursores; uno de ellos es la triptamina -producto de ladescarboxilación del triptofano- y el otro es un compuesto monoterpén-iridoide, Iasecologanina. El producto de esta condensación, la estrictosidina, es el precursor demás de 3,000 compuestos (Verpoorte et al., 1998) producidos en varias familiasvegetales (Cuadro 1). Los principales grupos de alcaloides que pertenecen a estegrupo son los alcaloides quinolínicos de las C/.nchonas y de Campíofeca y losalcaloides monoterpén-indólicos (AMls).

ALCALOIDES MONOTERPEN-lNDÓLICOS y CaíharanlAus roseus

A pesar de que prácticamente todos los alcaloides producen algún efectofisiológico en los mamíferos, únicamente alrededor de 30 alcaloides son comerciales(Verpoorte et al., 1993). De éstos, al menos 7 pertenecen a la familia de los AMls(Cuadro 2). por lo que desde el punto de vista económico éstos han sido y continúansiendo de gran interés.

Los AMls son producidos en algunas plantas de la familia de las Rubiáceas(C/.nchonas). Loganáceas (Gardne/Í.a, Mosíuea, y Ge/sem/.um) y particularmente en lalarriwia de las Apoc}máceas (Hunteria, Melodinus, Picralima, Cricx3ras,Tabernaemontana, Tabemanthe, Voacanga, Kopsia, Rawolfia, Vallesia yCatharanthus).

Dentro de estos grupos, la fuente vegetal más estudiada lo constituyeCaíharaníhus roseus (Apocinacea) de la cual se han aislado más de 100 alcaloides dediversas partes de la planta (Meijer et al.,1993d). Algunos ejemplos de las principalesclases de alcaloides encontrados en Caíhaffiníht/s son ajmalicina, serpentina,catarantina y vindolina. Desde el punto de vista médico, los más importantes son losalcaloides diméricos vinblastina y vincristina por su poderosa actividad anti-tumoral.Éstos son formados a partir de la condensación de catarantina y vindolina y seproducen en cantidades muy pequeñas en la parte aérea de la planta.

Cuadro 2. Alcaloides monoterpén-indólicos usados comercialmente (Bruneton etal.,1995; Verpoorte et al.,1998).

ALCALOIDE PLANTA DE LA QUE EFECTOS USOSSE 0BTIENECOIVIERCIALMENTE Fl§loLÓGICOS

Aimalicina Catharanthus roseus Revierte los efectos de Tratamiento de hipertensión,a adrenalina y regula accidentes cerebro-vascu lares,a actividad de los traumatismos craneales y sus secuelascentros vasomotores. neurológicas.

AJmal,na Rauwolfia sp . Disminiiye lavelocidaddel procesocontracción-relajacióndelosventrículosdelcorazón(antiarrítmico) Tratamiento de arritmia

Vincamina V,'nca sp- Aiimenta el flujo lndicada en los problemas p§icológicossanguíneo cerebral. y de condiJcta derivados de la senilidad

cerebral.

Vinblastina Catharanthus roseus Se une a tubulina Se usa como sa! de siilfato en elimpidiendo la tratamiento de la enfermedad deformación de los Hodgkin, cáncer testicular avanzado,microtúbulos, epitelioma de mama y ovario, sarcomaperlurbando la de Kaposi, coriocarcinomas, y enmetafase de lamitosis.Estóxica. algunos casos de liistiocitosis.

Vincristina Catharanthus roseus Es neurotóxico El sulfato de vincrístina se utiliza encombinación con procarbazina yprednisonapara en el tratamiento de laenfermedad de Hodgkin, se aplica encasos de cáncer de mama y Útero y enel tratamiento de leucemia.

Reserpina Rauwolfiia sp . Neuroléptico e Tratamiento de hipertensión anerial.hipotensivo. Numerosos efec`os secundarios.

Rescinamina Rauwolfiia sp . Neiiroléptico e Tratamiento de hlpertensión ar(erial.hipotensivo. Numerosos efectos secundarios

BIOsiNTESIS DE LOS ALCALOIDES MONOTERPEN-lNDOLICOS

PASOS METABÓLICOS CLAVES

En los últimos años, los esfuerzos de investigación se han encaminado adilucidar la ruta biosintética de estos compuestos así como a caracterizar las enzimasinvolucradas y los mecanismos que regulan su expresión o su actividad (De Luca,1993; Meiier et al.,1993d; Moreno et al.,1995). Se espera que un mejor entendimientode los mecanismos de regulación permita, finalmente, lograr mejorar los rendimientosen la producción de los alcaloides a través de la manipulación genética de los cultivos/.n v/.Íro e incluso de la planta (Hashimoto y Yamada, 1994; Kutchan, 1995).

La biosíntesis de los alcaloides indóIÍcos es extremadamente compleja. Eninicio, requiere de la conjunción de dos vías metabólicas: la vía indólica y laterpénica. Por la vía indólica. la enzima triptofano descarboxilasa (TDC) catalizaconversión de L-triptofano en L-triptamina. derivando ésta hacia el metabolismosecundario. Por la vía terpénica, el precursor es un monoterpén gluco-iridoide, lasecologanina. Estos compuestos, triptamha y secologanina, son condensados aestrictosidina, un glucoalcaloide precursor de todos los alcaloides aislados deCaíharaníhus. La enzima que cataliza la condensación de la triptamina y de lasecologanina es la estrictosidina sintasa (SS) (Figura 1 ).

Por catalizar pasos cruciales de la síntesis de los AMls, las enzimas TDC y SShan sido ampliamente estudiadas. La TDC se ha purificado tanto de células ensuspensión de C. roseus (Fernandez et al.,1989) como de raíces transformadas deesta misma planta (lslas-Flores et al., 1994). La TDC es una enzima soluble,homodimérica. de aproximadamente 110-115 kDa y es modulada por diversos factores:su actMdad aumenta en los cultivos de C. roseus en respuesta a la adición dehomogenados fúngicos (Pasquali et al., 1992) y también de enzimas hidrolíticas

(Moreno-Valenzuela,1999). En el primer caso, se sabe que el aumento de su actividadse debe al incremento en la transcripción del gen y en la traducción del mensajero.Contrario al efecto del homogenado fúngico, las auxinas provocan represión de laexpresión de la TDC (Goddijn et al., 1992).

La TDC no sólo está regulada por factores externos (ataques fúngicos, etc.) sinotambién está sujeta a regulación tejido específica y por desarrollo. En las plántulasgerminadas /.n vffro bajo condiciones de oscuridad su actividad es transitoria; comienzaa detectarse a los 3 días, alcanza su máximo a los 5 días y luego declina (De Luca etal.,1988). En las plántulas, su actividad es mayor en las partes aéreas (siendo mayoren hojas jóvenes que en maduras); en la planta adulta su actividad es mayor en lasraíces (Pasq.uali et al., 1992).

A pesar de que la TDC deriva el triptofano al metabolismo secundario (y de quees una enzima altamente regulada) la sobre-expresión del gen de la TDC en C. roseusno conlleva a una mayor producción de AMls, a pesar de que ociirre un aumento en lacantidad de la proteína con actividad de TDC y en la producción de triptamina (Morenoet al., 1995). Congruente con esta información, múltiples trabajos realizados concélulas en suspensión han reportado que no siempre correlaciona un nivel elevado deTDC con una alta produccjón de AMls (Knobloch y Berlin,1983; Mérillon et al.,1989;Eilert et al„ 1987). La actMdad de la TDC puede incluso disminuir sin afectar el

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contenido total de los AMls. Moreno-Valenzuela et al. (1998) desdiferenciaron uncultivo de raíces transformadas a células en suspensión, y luego las rediferenciaron araíces. Durante este proceso la actividad de la TDC se vió dramáticamente alterada. Enel paso de raíces a células la actividad de la TDC disminuyó en un orden de magnitud omás; los AMls disminuyeron de 10 a 2 mg/g de peso seco durante este proceso. En lasraíces rediferenciadas se encontró un nivel de actividad de TDC similar a la detectadaen las células en suspensión. Sin embargo, la producción de los alcaloides se recuperóhasta en un 90°/o respecto a la producción inicial. Estos datos sugieren que no serequieren niveles elevados de actividad de TDC para producir a los AMls.

FNH2 T

ESTRICTOSI DINA h HH

CH300C

1

ESTRICTOSIDINA

AGUCONA

cH3i#,uSECOLOGA"NA

0 AJMALICI NA

1

V'NI„L'NA/- CATARAl`mNA

OH

© 4, 21 DEHIDRCX3EISSOSCHIZINA

OH

Figura 1. Biosíntesis de la estrictosidina, precursor unlv®rsal de los alcaloides monotorpénindólicos. Los números indican la posición en la vía de las enzimas TDC (1) y de la SS (2)respectivamente (De Luca, 1993).

La otra enzima, la SS, fue purificada a finales de los 70s y se caracterizó comouna enzima soluble de masa molecular entre 35 y 38 kDa (Mizukami et al.,1979). Diezaños más tarde se reportó la identificación de 4 diferentes formas de SS en células ensuspensión y hojas de C. roseus,. éstas presentan puntos isoeléctricos entre 4 y 5(Pfitzner y Zenk,1989). Más tarde De Waal et al. (1995) encontraron que el número de

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SSs es mayor. Estos investigadores purificaron 6 diferentes SSs, distinguibles porelectroforesis empleando geles de alta concentración (20°/o de acrilamida).

La SS es codificada por un solo gen y fue la primera enzima del metabolismo delos AMls que fue clonada, primero de Rawo/Í7a sepeníí.na (Kutchan et al.,1988) y luegode C. roseus (MCKnight et al.,1990). Las diferentes formas se deben a que ocurrenglucosilaciones de la proteína original, aunque no se han caracterizado los tipos decarbohidratos presentes (De Waal et al.,1995). Estas diferentes formas de SSs estánpresentes y en proporciones casi idénticas en los diferentes Órganos de la planta, loque excluye la regulación tej'ido-específica de las múltiples isoformas (De Waal et al.,1995). En contraste con estos resultados, datos preliminares sobre la SS obtenidos enla linea J-1 de raíces transformadas en nuestro laboratorio muestran que la proporciónde las diferentes isoformas varían en algunos dias del ciclo de cultivo (Galaz-Ávalos yLoyola-Vargas, datos no publicados). Al momento no se sabe si las diferentesisoformas de SSs tienen diferentes funciones en la planta.

A diferencia de la TDC que muestra regulación tejido específica, la SS presentaniveles de actividad similares en los diferentes Órganos de la planta (De Luca et al.,1988), y su actividad no se altera cuando los cultivos /.n v/tro de C. roseus sontransferidos al "medio de producción de alcaloides" (8% de sacarosa) (Knobloch et al..1981). Tampoco parece estar regulada por el proceso de desarrollo (De Luca et al.,1988). por lo que pareciera no estar sujeta a mecanismos de regulación. Sin embargo,durante el proceso descrito por Moreno-Valenzuela et al. (1998) sobre ladesdiferenciación-rediferenciación de la líneas J-1 de raíces transformadas de C.roseus, la actividad de la SS disminuyó en un 60% cuando las raíces sedesdjferenciaron a células en suspensión. La actividad de la SS sólo se recuperó a lamitad cuando las células se rediferenciaron a raíces, en tanto que el patrón deisoformas cambió, por lo que no es claro si esta enzima se regula por el proceso dediferenciación (Moreno-Valenzuela et al. 1998)

Con base en la información disponible sobre la SS, esta enzima parece no serun paso metabólico limitante para la producción de los AMls, a pesar de su posiciónestratégica en la vía de biosíntesis de estos compuestos.

Moreno et al. (1993) reportaron que la producción de los alcaloides aumentacuando se añade secologanina o alguno de sus precursores inmediatos. El efecto de laadición de triptofano o de triptamina no es claro. porque los datos en la ljteratura soncontradictorios (Mérillon et al.,1989; Decendit et al.,1993).

Por otro lado, Doireau et al. (1987) y Stevens et al. (1992) han medido laactividad de la TDC y de la SS. así como las concentraciones de triptamina. en cultivosde células de C. mseus y de otros géneros. Estos autores observaron que hay unaacumulación de triptamina a pesar de haber una elevada actívidad de SS. Estosresultados apoyan la hipótesis de que la limitante para la biosíntesi.s de estrictosidina ysus múltiples derivados lo constituye el contenido del precursor terpénico secologanina.Los resultados de nuestro grupo de trabajo (Moreno-Valenzuela et al„ 1998) tambiénsugieren que los principales puntos de regulación para la producción de laestrictosidina deben estar en alguna(s) enzima(s) que participan en la biosíntesi.s de lasecologanina.

La secologanina deriva del isopentenil pirofosfato (lpp), compuesto del cualprovienen todos los isoprenoides (ácido abscísico, citocininas. giberelinas,carotenoides, esteroles, plastoquinonas, gomas, etc.) (Bach.1987; Goldstein y Brown,1990; Wolf et al.,1990). Hasta principios de esta década se creía qiie todos estoscompuestos eran sintetizados a partir de mevalonato (Bach, 1995; Chappell et al..1995; Chappell,1995a; Chappell,1995b) y que la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril CoAreductasa (HMGR) podría representar un paso limitante para la síntesis de losisoprenoides vegetales, como ocurre para la síntesis del colesterol en los animales(Goldstein y Brown, 1990). También se pensaba que el lpp se sintetizabaexclusivamente en el citosol y se metabolizaba allí mismo, o se transportaba a losplástidos. Sin embargo, Heintze et al. (1990) observaron que los plástidos de trigo soncapaces de s.intetizar carotenos a partir de [14C]-acetato. lo que indica que en losplástidos también se lleva a cabo la síntesis de lpp. Como se creía que la HMGRtendria que estar involucrada (y ésta se localiza en el retículo endoplásmico) sepropuso la existencia de una HMGR plastidica, lo cual ha sido motivo de gran debateen los últimos años.

Recientemente Rohmer et al. (1993) reportaron la existencia en Eschen.ch/.a co//.de una vía alterna, independiente del mevalonato, para la síntesis de lpp. En esta viael lpp se origina de la condensación de piruvato y gliceraldehido 3-fosfato. los cualesse condensan en 1-desoxixilulosa 5-fosfato. La enzima que cataliza esta reacción sedenominó 1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXPS, por sus siglas en inglés).

Actualmente ya se sabe que en las plantas también existe la vía alterna desíntesis de lpp y que es la vía principal que sintetiza lpp para la síntesis deisoprenoides en los plástidos, como son los monoterpenos, diterpenos, carotenos yplastoquinona (Adam y Zapp,1998; Lange et al.,1998; Mccaskill y Croteau,1998)(Figura 2).

De acuerdo a Contin et al. (1998) la secologanina proviene principalmente de lavía alterna de síntesis de lpp, aunque los datos sugieren que la vía del mevalonatotambién participa en la síntesis de este monoterpeno, aunque en menor grado. Lacoexistencia de ambas vías también se ha propuesto para la síntesis de P-caroteno,fitol y luteína en C. roseus (Arigoni et al.,1997) y para los sesquiterpenos de Maín.can.arecL/Í/.Ía (chamomila) (Adam y Zapp,1998).

No sólo los pasos iniciales de la biosíntesis de la secologanina sondesconocidos, sino en general es una via de la que se sabe muy poco todavía. La rutase ha postulado a partir de experimentos llevados a cabo con trazadores i.n vi.voadministrando glucosa, mevalonato, geraniol u otros precursoi.es intermedios,marcados con 3H o i4C. Para ello se han empleado cutivos de células en suspensión deC. roseus, Rawolfia serpentina, Gardenia jasminoides, Teucrium marum y Ne_pet_acafar/.a, así como a plantas de diversas especies de Lon/.cena (Contin et al.,1998). EIprimer compi esto que compromete a los esqueletos hidrocarboiiados hacia la síntesisdel monotei.p\3no is el geraniol. Se ha propuesto que entre éste y la secologaninaexistan al menos 11 pasos enzimáticos, de las cuales únicamente se conocen 4: lageraniol 10 hidrc`xilasa, la NADP+:monoterpén oxidorreductasa, la monoterpén(iridodial) ciclasa y la S-adenosil metionina: ácido logánico metil transferasa (Figura 3).Estas enzimas se han caracterizado de manera superficial por lo que se sabe pocosobre ellas, particularmente de las 3 últimas mencionadas.

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Acetil-CoA

tAcetoacetil-CoA

'HMGCoA

HMGR

Mevalonato\ \ \lpp

Piruvato+

Gliceraldehído 3-fosfato

1deoxi-xilulosa-5-fosfato

////Figura 2. Rutas alternativas para la biosintosis dol isopentenil pirofosfato (lpp). HMGR, 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa; HMG-CoA, 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA; lpp, isopentenil pirofo§fato; DXPS,1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sin(asa (Adam y Zapp, 1998; Arigoni et al , 1997; Mccaskill y Croteau,1998).

Se ha propuesto que el primer punto regulatorio en la biosíntesis de lasecologanina se encuentra a nivel de la oxigenación del geraniol. La reacción escatalizada por la enzima geraniol 10-hidroxilasa (G10H) y se ha sugerido que estaenzima es la que compromete los esqueletos carbonados a la síntesis delmonoterpeno. Algunas observaciones que apoyan el hecho de que esta enzima pudierarepresentar un punto de control son: su actividad es inducida en condiciones en las quese produce un aumento en el contenido de alcaloides e inversamente, la adición defosfatos que provocan una disminución en el contenido de alcaloides inhiben laactividad de la G10H (Schiel et al.,1987). Otras condiciones que provocan un aumentoo una disminución en el contenido de alcaloides han correlacionado con la actMdad dela G10H (Meijer et al., 1993d) por lo que su papel parece fundamental para labiosintesis de este tipo de compuestos. Además, esta enzima es inhi.bida por lacatarantina (K,=1 mM) (MCFarlane et al.,1975), lo cual pudiera tener un significadofisiológico al acumularse este alcaloide en el mismo organelo, e inhibirla por productofinal (Meijer et al..1993d).

GEIUNIOL IO-HIDROXILASA, MON00XIGENASA DE LA FAMILIA DELCITOCROMO P450

La G10H es una monooxigenasa de la familia de las proteínas P450 (Meehan yCoscia, 1973) y se encuentra localizada en las membranas de las provacuolas(Madyastha et al.,1977). Su catálisis consiste en oxigenar el geraniol (o a su isómeronerol) en sus derivados 10-hidroxilados (Figura 4), para lo cual requiere 02 y NADPH

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(Meehan y Coscia,1973). Los electrones del NADPH son transferidos al grupo hemode la monooxjgenasa a través de la NADPH: citocromo P450 reductasa (Donaldson yLuster, 1991). Esta flavoproteína es absolutamente necesaria para que lamonooxígenasa realice su catálisis (Meijer et al., 1993b).

La G10H ha sjdo aislada a partir de células en suspensión de C. roseus (Meijeret al.,1993a). Recientemente este mismo grupo ha producido anticuerpos policlonalescontra esta enzima, pero éstos mostraron una elevada inespecjficidad. Réplicas tipoWestern de extractos crudos inmunorrevelados con estos antlcuerpos presentan unpatrón de proteínas tan complejo que no permite distinguir a la G10H (A. H. Meijer,comunicacíón personal). Actualmente el mismo grupo está rediseñando el protocolopara la extracción y purlficación de esta enzíma.

Por otro lado, se ha tratado de abordar el problema a nivel molecular. A partir decélulas en suspensión de C. roseus transferidas a medio de producción de alcaloidesse ha ajslado un ADNc de P450, empleando como sonda regiones altamenteconservadas entre estas proteínas. Los anticuerpos generados contra la proteína quecodifica el ADNc cruzaron con la proteína purificada por la Dra. Meijer (Vetter et al.,1992); sin embargo, cuando este ADNc se empleó para transformar N/.coÍ/.ana Íabacumy Arab/.dops/'s Íha//.ana, la proteína se expresó pero no se detectó actividad de G10H.

También se ha determinado que los homogenados de tabaco no inhiben laactividad /.r) vt.fro de la G10H de C. roseus (Mangold et al., 1994). Los autoresensayaron otras actividades de P450 reportadas y no lograron identificar el sustrato dela proteína que introdujeron a tabaco. Meijer et al., (1993c) han reportado el aislamientode 16 clonas de ADNc de proteínas P450 de C. roseus. Estas clonas fueron obtenidasmediante la técnica de la reaccíón en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas eninglés), empleando como cebadores secuencias de oligonucleótidos que correspondena la región conservada para la unión del grupo hemo en las proteínas P450. Mediantela secuenciación de las clonas y la identificación de otras regiones conservadas en estegrupo de proteínas se confirmó que estos ADNc codifican proteínas de la familia P450;sin embargo, no se jdentificó ninguna clona que codifique para la enzima G10H, y hastahoy no hay certeza de que esta enzima haya sido clonada en ningún grupo. Ladificultad para obtener la clona del ADNc de la G10H, aún a partir de tejidos sometidosa condiciones que pi.ovocan aumento en el contenido de alcaloides, puede deberse a laexistencia de múltiples proteínas P450 que pudieran estar siendo inducidassimultáneamente en esas condiciones. Se ha reportado la identificación de otras 3enzimas de naturaleza citocromo P450 involucradas en la biosíntesis de alcaloidesindólicos (Falkenhagen y Stóckigt,1995; St-Pierre y De Luca,1995). AsÍ mismo se hasugerido que la hidroxilación de la piperitona en los carbonos 3 y 4 en los cultivos decélulas en suspensíón de C. mseus y N. Íabacum esté mediada por proteínas de lafamilia P450 (Hamada et al., 1994). Estos hechos indican que varias proteínas de lafamilia P450 están presentes en C. roseus.

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lpp + DMAPP

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GEF"lL-PP

Sosqulterponos,dlterpenos, etc

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Figura 3. Biosintosls del monotei.pono iridoide secologanina. El isopentenn pirofosfato (lpp) escondensado con su isómero el dimetil alil pjrofosfato (DMAPP), formándose el geranil pirofosfato Esteprecursor puede ser empleado para la síntesis de otros terpenos o ser canalizado hacia la síntesis de losmonoterpenos. Los números encerrados en los círculos corresponden a las enzimas geraniol 10hjdroxilasa (1 ); NAPDP+ :monoterpén oxidorreductasa (2); monoterpén (iridodial) ciclasa (3) y S-adenosil-L-metionjna:ácido logánico metil transferasa (4). Al principio de la vía se señala la posición de lafosfatasa específica para el geranil pirofosfato, propuesta por el grupo del Dr. R. Verpoorte (Meijer,1993d). pero cuya existencia no ha podído ser demostrada hasta el momento. En los pasos termínales,no es claro si el ácido logánico es convertido a ácido secologánico y posteriormente metilado Ó si esmetilado primero dando lugar a la loganma y ésta posteriormente se convierte a secologanina. Diagramabasado en De Luca (1993)

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fo+HNADPM H++ °2 -#oHH+

10 Hldroxlg®raniol

Figura 4. Reacción catalizada por la ®nzima P450, geraniol 10-hidroxilasa. La enzJma utiliza loselectrones del NADPH para reducir el oxígeno molecular. El destino de cada uno de los átomos deoxígeno reducidos es diferente. Un átomo es introducido en el sustrato monoterpénico y el otro secombina con dos protones, formándose agua (Meehan y Coscia,1973).

Debido a la importancia que esta familia de enzimas juega en el metabolismo deC. noset/s y para establecer un marco donde ubicar a la GIOH, se describirá acontinuación que son las proteínas P450.

CITOCROMOS P450

COMPLEJO CITOCROMO P450. HISTORIA

El descubrimiento del citocromo P450 inició en los 40's cuando se explorabanunas reacciones inusuales que involucraban oxígeno molecular: un átomo de oxígenose combinaba con los hidrógenos de 2 moléculas de NADPH y el otro átomo eraincorporado a un sustrato orgánico. Estas reacciones fueron denominadas ''reaccionesde función mezclada" (Guengeri.ch,1993). Al principio de los 50's J. Axelrod y 8. 8.Brodie iniciaron el estudio del metabolismo de drogas y de otras sustancias extrañas alorganismo (xenobióticos). Al inicio trabajaron con anfetaminas, encontrando quepreparaciones microsomales obtenidas a partir de hígado de conejo eran capaces dedesaparecer este fármaco, requiriéndose de oxígeno y de un factor soluble queidentificaron como NADPH (Axelrod, 1983). Poco después observaron que losmicrosomas también podían N-demetilar efedrina, o-demetilar codeína, oxidarbarbitúricos e hidroxilar anilina; los resultados fueron similares empleando el hígado deotros mamíferos. En 1957 K. Ryan y L Engel observaron que la degradación deestrógenos -catalizada por el sistema microsomal- era inhibida por monóxido decarbono. sugiriendo la participación de citocromos; casi simultáneamente M.Klingenberg publicó una característica espectroscópica curiosa observada en losmicrosomas hepáticos: al unirse con el CO absorben luz a 450 nm (Estabrook,1996).Casi una década después Omura y Sato (1964) identificaron un pigmento microsomalde naturaleza hemoproteica, que al unirse con el CO, daba un espectro con un máximo

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de absorbancia a 450 nm. Sato denominó provisionalmente a esta hemoproteína"P450" (P, pigmento) (Omura y Sato, 1964). Al mismo tiempo en el laboratorio de

Ronald Estabrook se demostró que este pigmento era el responsable del metabolismooxidativo de drogas y esteroides (Axelrod,1983), iníciándose con esto una época deintensa investigación sobre el citocromo P450.

DESCRIPCIÓN GENERAL

El citocromo P450 es una superfamilia de hemoproteinas en la que el hierro delgrupo hemo está unido en su quinto enlace a una cisteína -conservada en estasproteínas- y el sexto enlace está ocupado por agua. La unión del CO con el ligandohemo (Fe2+)-tiol produce el espectro de absorción caracteristico de estas proteinas, conel máximo de absorción a 450 nm (Fígura 5). Aunque el término P450 fue micialmenteusado para identificar a una hemoproteína microsomal del hígado de mamíferos, el cit-P450 se ha encontrado en prácticamente todos los tejidos de mamíferos analjzados,incluyendo el sistema nervioso central (Gonzalez y Lee,1996); también está presenteen otros animales, así como en microorganismos y plantas (Porter y Coon, 1991 ).

Figura 5. Espoctro de absorción típico producido por las hemo-tiol proteínas P450. El máximo deabsorción a 450 nm es producido por la umón del CO al grupo hemo-cisteína reducido (Omura y Sato,1964).

Actualmente la superfamilia de proteínas P450 abarca alrededor de 450miembros conocidos y representa uno de los grupos de catalizadores biológicos másversátiles que se conocen, pues sus reactividades comprenden hidroxilaciones (C-hidroxilaciones, N-hidroxilaciones, S-hidroxilaciones), de-halogenaciones, de-

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alquilaciones, deaminaciones y epoxidaciones (Schuler, 1996b). Básicamente elmecanismo de acción es similar e involucra la unión con el sustrato, lo que desplaza lamolécula de agua ligada al sexto enlace del Fe3.. Oprea et al. (1997) proponen que lasargininas e histidinas vecinas al sitio activo forman un canal para el agua (acueducto)

::Ldb:onddeeévsatFe::,:d:e¡aÉ,:3qeds:uhéesx:eae;érnatra::Feunstt:aftaoc:,t:ní:a::t,r:a,ár::pur:deu,:tcotróE[que reduce a éste a Fe2+ El siguiente paso es la unión del oxigeno molecular con el[Fe2+]-P450 seguido por la entrada de un segundo electrón, lo que provoca ladisociación de la molécula de oxígeno. Un átomo de oxígeno es reducido a agua, lacual se libera, y el otro átomo de oxígeno es insertado al sustrato. La liberación delproducto deia al [Fe3+]-P450 libre para un nuevo ciclo catalítico (Halkier,1996).

Aunque en un principio las proteínas P450 fueron relacionadas con ladetoxificación de sustancias xenobióticas en mamíferos (anestésicos, pesticidas,alcoholes, colorantes, antibióticos, saborizantes, etc.) es claro que también participanen el metabolismo de algunas sustancias endógenas de éstos (esteroides,eicosanoicos, ácidos grasos, retinoides, leucotrienos, tromboxanos, prostaglandinas,etc.). Un mismo sustrato puede ser metabolizado en diferentes posiciones por un grupode diferentes proteínas P450 o bien una misma proteina puede metabolizar múltiplessustratos, incluso estructuralmente diferentes (Gonzalez y Nebert, 1990; Schuler,1996b). Las enzimas P450 que participan en reacciones biosintéticas -como lasesteroidogénicas- suelen ser altamente o totalmente específicas a un sustrato; por elcontrario, las enzimas catabólicas, -particularmente las hepáticas-, muestran un altogrado de inespecificidad, (Coon et al.,1992)

En la mayoría de los casos los electrones son transferidos a la proteina P450 por

íFn,3uflr:vo|P.r;teÉnsa,e-q::,,ceosnpt:enndeetaan,topF,f:,®sTs:eFt";adt:nt%'-npa4d5aopá:gcruebq::toas;representa al grupo más abundante (Donaldson y Luster,1991 ; Halkier,1996).

CLASIFICACIÓN

Aunque tradicionalmente se les ha llamado "citocromos P450", actualmente sepropone cambiar dicha nominación por el de "proteínas hemo-tioladas P450" (Chapple,1998) en base a que no son verdaderos citocromos, pues su función no es únicamentetransferir electrones, sino más bien tienen actividad de oxigenasa (Coon et al.,1996).También cabe mencionar que, a pesar de que originalmente estas proteínas fueronagrupadas en base a sus propiedades espectroscópicas, actualmente se agrupan enbase de sus secuencias (http//drnelson.utmem.edu/p450dbplant.html, últimaactualización de esta página: junio 23,1998).

El espectro de absorción, con un máximo a 450 nm, se reconoce hoy como elespectro de las proteínas hemo-tioladas en general, más que de proteínas P450. Lacloroperoxidasa (Coon et al.,1992) y la Óxido nitrico sintasa (Bredt et al„ 1991 ; Masterset al.,1996) presentan espectros similares a las proteínas P450, pero no pertenecen aesta familia.

La gran mayoria de las proteínas P450 tienen actividad de monooxigenasas,particularmente de hidroxilasas, presentando la reacción tipica que emplea electrones yoxígeno molecular (Halkier,1996). Dada su alta distribuc.ión, estos sistemas catalit.icos

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se conocen como "P450 clásicos". Estos complejos son proteínas membranalesubicadas principalmente en el retículo endoplásmico, aunque es posible que tambiénse localicen en otros compartimentos subcelulares. Las proteínas P450 "no-clásicas"son aquellas que no requieren de la flavoproteina para la activación del oxígeno o queno incorporan oxígeno molecular en sus sustratos (Schuler, 1996b). A este grupopertenecen la aleno Óxido sintasa. la tromboxano sintasa y la prostaciclina sintasa, lascuales catalizan isomerizaciones de endoperóxidos (Halkier, 1996); la berbemuninasintasa de las plantas de la familia Papaveracea es un ejemplo de proteína P450 no-clásica, pues no reciuiere oxígeno molecular. La berbemunina sintasa cataliza lahomodimerización de la (R)-~-metilcoclaurina -alcalojde tetramdrobenzilisoqujnolínico-mediante el acoplamiento del oxígeno presente en una molécula del sustrato y elcarbono presente en otra molécula del mismo (acoplamiento oxidativo C-O) (Stadler yZenk,1993).

Las proteínas P450 pueden clasificarse también dependiendo del número deelementos (1, 2 Ó 3) que conforman el sistema catalítico (Shumyantseva et al.,1996).Los sistemas de 3 componentes están formados por una NADPH o NADH reductasa(flavoproteína que contiene FAD), un transportador de electrones (sulfo-proteína denaturaleza no hemínica) y la proteína P450. Los 3 componentes son solubles; a estegrupo pertenecen las proteínas P450 de bacterias y las mitocondriales de las glándulassuprarrenales de los mamíferos (Takemori y Kominami, 1984). Los sistemas de 2componentes consisten de una enzima denominada P450 reductasa -una flavoproteínaque contiene FAD y FMN-y de la proteína P450; ambas son proteínas integrales de lamembrana. Más del 90% de las proteínas P450 pertenecen a este grupo (Schuler,1996b). Los sistemas de un componente son el grupo más pequeño, con unos cuantosejemplos conocidos. Estos son polipéptidos solubles que poseen un dominio queasemeja a la P450 reductasa y un dominio con las características de las proteínasP450. Un ejemplo de este grupo es la P4508M€, la cual es una proteína de Bac/.//usmegaíer/.um, soluble. de 119 kDa y con activídad de ácido graso ®-2 hidroxilasa (Porter,1991 ).

Debido a que la familia de proteínas P450 es muy numerosa y sus reactividadesson muy variadas, la identificación y clasificación de estas proteínas ha llegado a ser untanto confusa: no toda proteína que presente el espectro típico es P450, algunas norequieren de poder reductor, unas cuantas no emplean oxigeno molecular, etc.

El criterio de identificación y clasjficación más aceptado en la actualidad fuepropuesto por un comité creado para evaluar tal problema y dírigido por el Dr. DanielNebert (Neber[ et al.,1991 ). Este sistema identifica y clasifica a las proteinas P450 enbase a sus secuencias génicas; los genes que codifican proteínas P450 sondesignados y reconocidos por el prefijo Cyp (por cytochrome P450). Por acuerdo, unafamilia Cyp está comprendida por miembros que presentan más de 40% de identidad.Dentro de una familia. los elementos se agrupan en una mjsma subfamilia si tienenmás de 55% de identidad y se les considera variantes alélicas si el nivel de identidad esmayor al 97°/o. La nomenclatura aceptada designa a las familias con números ordinales(1, 2, 3, etc.), a las subfamilias con letras mayúsculas (A, 8, C, etc.) y a los elementoscon más del 97°/o de identidad con vl , v2, etc„ excepto cuando se ha demostrado quelas reactividades de estos aparentes alelos son muy divergentes. En este caso se lesdesigna con un número ordinal, no precedido por la "v".

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En la actualidad la superfamilia P450 comprende 114 famllias de genes, 40 delas cuales corresponden a familias de proteinas P450 de plantas(http//drnelson utmem.edu/p450dbplant.html. Última actualización de esta página:enero 15, 2000). En todos los reinos, y particularmente en el reino vegetal, se estánidentificando nuevas proteínas P450, por 1o que esta superiamilia se encuentra encontinua expansión. Únicamente la familia CYP51 que codifica para esteroles-14cr-demetilasas se encuentra presente y muy conservada en todos los reinos (Kahn et al.,1996), por lo que se les considera genes ortólogos (Bak et al ,1997). Las otras 64familias de proteinas P450 son específicas de determinados reinos e incluso dedeterminados géneros o especies (Nebert et al., 1991 ).

BIOGÉNESIS DE LAS PROTEÍNAS P450 MICROSOMALES

Las proteínas P450 microsomales son sintetizadas en los polisomas (Bar-Nun etal„ 1980, González y Kasper,1980) e insertados co-traduccionalemente en el retículoendoplásmico (Bar-Nun et al., 1980). El extremo amino contiene una secuenciahidrofóbica de aproximadamente 20-30 aminoácidos (abundante en leucinas y valinas)que sirve como secuencia señal (Bar-Nun et al„ 1980) y también como secuencia deanclaje y retención (Black,1992). Esta secuencia ha sido invariablemente identificadaen proteínas P450 microsomales.

La secuencia señal es identificada por una proteína soluble conocida comopartícula de reconocimiento de señal (SRP) que se asocia al péptido P450 "naciente"(Sakaguchi et al ,1987) El complejo ribosoma-proteína naciente-SRP difunde hacia lamembrana del reticulo endoplásmico donde se asocia al complejo heterotriméricoSec61 (Kida et al., 1998), receptor del SRP; al menos una molécula de GTP esnecesaria para la disociación del SRP. La proteína naciente y el ribosoma quedanunidos a la membrana del retículo endoplásmico mientras la traducción continúa.Posteriormente la asociación P450-ribosoma se rompe, para 1o cual también serequiere de energía.

TOPOLOGÍA Y ESTRUCTURA

Después de su inserción en la membrana, la secuencia señal permanece en laproteína anclada, de tal forma que la secuencia de la proteina "naciente" correspondecon la de la proteina madura (Bar-Nun et al ,1980: Black,1992). El extremo amino

parece atravesar completamente la membrana del reticulo y queda expuesto a la luz deéste, según sugiere la presencia de glucosilación (Shimozawa et al„ 1993). No estátotalmente claro si este segmento atraviesa una sola vez la membrana o si adquiereuna estructura de horquilla dentro de la membrana reticular, con el asa expuesta en ellumen (Szczesna-Skorupa et al.,1993).

Además de la secuencia señal, el extremo amino contiene otros 3 motivosestructurales conservados: una pequeña secuencia de aminoácidos cargadosnegativamente, la cual antecede a la secuencia hidrofóbica; una secuencia pequeña,compuesta de aminoácidos con carga positiva, después de la secuencia hidrofóbica ypor último una región rica en prolina y glicina. Los aminoácidos con carga positiva quecontinúan al trecho hidrofóbico funcionan con secuencia de paro incrementando laeficiencia de retención de la proteína en la membrana (Black,1992). Su sustitución poraminoácidos negativos provoca que la proteína sea translocada a través de la

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membrana (Halkier,1996). La secuencia rica en prolina y glicina tiene un consenso de(P/l)PGPX(G/P)XP (Szczesna-Skorupa et al., 1993). Como estos aminoácidosdesestabilizan las hélices G, esta secuencia desestabiliza la estructura secundaria delpolipéptido. actuando como una bisagra entre el dominio catalítico y el dominio deanclaje (Halkier,1996) (Figura 6). La función de esta regjón bisagra parece ser la depermitir una adecuada orientación de la proteína con la membrana; su eliminaciónprovoca la pérdida total de actividad (Szczesna-Skorupa et al., 1993). y su mutaciónperturba suficientemente la estructura final de la proteína, evitando la incorporación delgrupo hemo (Chapple,1998).

Fioura 6. Repros®ntación osquemática do los modolos de ®structura terciaria y de la topología delas protolnas P450 mlcrosomalos. NH3' y COO-representan los ex(remos del polipéptido; A y D son losdominios estructurales relacjonados funcionalmente a la unión del sustrato y a la unión del grupo hemorespectivamente. La flecha indica la región de bisagra que permitiri'a el movlmiento del dominiocitosólico En ambos modelos una parte del extremo amjno está expuesto a la luz del retículoendoplá§mico, pero en el modelo de la derecha se propone la formación de una pequeña asa (Choe etal„ 1998; Howes et al.,1974; Halkier,1996; Kalb y Lopor,1988: Shimozawa el al„ 1993; Szczesna-Skorupa et al., 1993).

Las proteínas P450 típicamente presentan 4 dominios estructuralesdenominados A, 8, C y D (Kalb y Loper,1988). El dominio A se relaciona con la unióndel sustrato y el oxígeno molecular y el dominio D con la unión del grupo hemo; lasfunciones de los dominios 8 y C aún son desconocidas (Choe et al.,1998).

La "cavidad de unión para el sustrato" es accesible a través de un canalhidrofóbico; la unión del sustrato a la proteína es determinada por interaccioneshidroíóbicas (Halkier, 1996). En congruencía con la diversidad de sustratosmetabolizados por las proteínas P450, Ios elementos estructurales y los resjduos queson importantes para el reconocimiento y unión del sustrato varían entre estas

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proteínas (Gotoh, 1992; Andersson et al.. 1997), según el sustrato en particular.Comparando P450cam y P450BM.3 por ejemplo; esta última presenta un canal de accesotipo caverna que comunica con la cavidad y permite el paso al sustrato propio, aeicosanoides y a ácidos grasos de cadena larga. El alcanfor, sustrato de la P450cam, esuna molécula pequeña y, en concordancia, el canal de acceso para el sustrato enP450cam es casi inexistente (Graham-Lorence y Peterson, 1996).

El sitio de unión del grupo hemo (dominio D) se localiza en la región carboxiloterminal, con la secuencia de aminoácidos F(G/S)XGX(H/R)XCXGX(l/L/F)A, en dondela X corresponde a cualquier aminoácido y la C a la cisteína con la que se liga el grupohemo (Kalb y Loper,1988; Graham-Lorence y Peterson,1996). Esta secuencia estápresente en las diferentes clases de proteínas P450: microsomales, mitocondriales ysolubles (Kalb y Loper,1988), por lo que debe constituir un motivo estructural tipico enesta familia (Figura 7).

AB

/-A N C L AJ E:

AA NEGATIVOS,AA HIDROFÓBICOS,AA POSITIVOS,

/\SUSTRAT.,/F¥RÍ=,A

(P/I)PGPX(G/P)XP

Figura 7. Representación osquemática de las protoínas P450. (Gotoh, 1992; Graham-Lorence yPeterson,1996; Kalb y Loper,1988).

Excepto la región de anclaje, todo el péptido se encuentra en el citosol (Edwardset al.,1991). Se propone que el dominio citosólico se encuentra recostado sobre lamembrana, con el sitio activo y el canal del sustrato en ligero contacto con lamembrana (Halkier,1996).

LOCALIZACIÓN Y TRANSPORTE

En los mamíferos las proteínas P450 se encuentran unidas al reticuloendoplásmico, mitocondrias y peroxisomas (Donaldson y Luster,1991). Las prote¡nasdel reticulo son del tipo de complejos de dos componentes y su función principal es lade detoxificación (Axelrod,1983; Taniguchi et al.,1984; West,1980); las mitocondrialesson del tipo de tres componentes (adrenodoxina reductasa, adrenodoxina y proteína

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P450) y participan en el proceso de esteroidogénesis (Black et al.,1994; Bóttner et al„1996; Takemori y Kominami, 1984); las del peroxisoma son del tipo no-clásicas -norequieren de poder reductor- y particípan en la peroxidación de los ácidos grasos(Scott, 1966).

La localización de las proteínas P450 en membranas de otros compartimentoscelulares ha sido con frecuencja atribuida a contaminacíón de las preparacionesmembranales. Algunas observaciones, sin embargo, no pueden explicarse comoconsecuencias de contaminación con membranas del retículo. En las membranasplasmáticas de los hepatocitos de humano y de rata se ha detectado la presencia deCYP3A1, proteína P450 involucrada en la degradación de fármacos esteroidales (Neveet al., 1996). Apoyando que su localización es plasmática, el contenido específico deCYP3A en esta membrana aumenta cuando el organismo es expuesto adexametasona; y ésta enzima es activa en dicha fracción membranal.

También se han encontrado proteínas P450 en el aparato de Golgi de las célulasde los hepatocitos de rata. Neve et al. (1996) analizaron la distribución de variasproteínas P450. CYP2El y CYP4Al se detectaron (en forma activa) en el retículoendoplásmico y en todas las fracciones del aparato de Golgi -cÍs, medí.a y fmns-mientras que CYPIA2 se localizó en el retículo endoplásmico y en las fracciones c/`s ymed/.a, CYP3Al únicamente se encontró en el reticulo endoplásmico y en la fracci.onesc/.s. Dado que estos análisis fueron realizados en las mismas preparaciones, lasdiferencias relativas en los contenidos de esas proteínas P450 es un argumento qiieexcluye la probabilidad de que su presencia en las fracciones correspondientes aaparato de Golgi se deba a contaminación con retículo endctplásmico.

Es probable que las proteínas P450 que llegan a la membrana plasmática seantransportadas a través del aparato de Golgi (Neve et al.,1996). La presencia de fucosaen los residuos de carbohidrato apoyan esta hipótesis (Bolwell et al.,1994).

REGULACIÓN

La investigación para dilucidar los mecanismos que regulan las proteínas P450ha sido un tema de constante escrutinio desde el inicio de los años 50s. La primeraobservación es que son enzimas que pueden ser inducidas. Los fármacos, el alcohol,contaminantes ambientales, adjtivos alimenticios, el humo del cigarro, etc, actúan comoinductores (Guengerich, 1993). El mecanismo regulatorio más común en estasproteínas es el control transcnpcional (Abu-Abed et al„ 1998; Scott, 1966; Prabhu et al.,1995: Jeong et al., 1996). Se han identificado las secuencias (elementos c/.s) y losfactores Ímns que participan en algunas de las respuestas transcripcionales.

En los promotores de las proteínas P450 esteroidogénicas (familias CYP11,CYP17, CYP21), por ejemplo, se ha identificado la secuencia nucleotídica AAGGTCA(Sadovsky et al.,1995), la cual media la respuesta de las proteínas esteroidogénicashacia la hormona adrenocorticotropi.na (ACTH). La ACTH provoca el aumento delAMPc y éste activa a la protein cinasa A (PKA). Los pasos subsecuentes no han sidoidentificados, pero al final los factores de transcripción son fosforjlados y éstos se iinena la secuencia AAGGTCA, activando la transcripción (Venepally y Waterman, 1995;Waterman y Bischof. 1997). Las proteínas P450 esteroidogénicas se expresandiferencialmente por desai.rollo y también son tejido-específicas. CYP11A1 -enzima

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limitante en la síntesis de todos los esteroides- se expresa en gónadas, placenta ycerebro (Chou et al„ 1996). Aunque en todos los casos la proteína responde a laregulación por ACTH. en cada tejido la respuesta es mediada por la combinación delfactor de transcripción SF1 (por steroidogenic factor 1) con diferentes proteínas condominios de dedos de zinc como Spl y NF1 (por nuclear factor 1) (Chou et al.,1996).Similarmente, la combinación de diferentes factores de transcripción coordina lainducción de las diferentes proteínas esteroidogénicas en respuesta a ACTH i} AMPc(Coopgr et al„ 1997; Waterman y Bischof, 1997).

Una de las familias más estudiadas es CYPIA (Coon et al.,1992; Guengerich,1993: Whitlock, Jr. et al„ 1996), particularmente la proteína CYPIA1. CYPIA1 (arilhidrocarburo hidroxilasa) es una proteína frecuentemente responsable del cáncer depulmón; CYPIAl es fuertemente inducida por hidrocarburos aromáticos policíclicoscomo la dioxina (un potente promotor de tumores). La dioxina se une a un receptorcitosólico denominado AhR (por aril hydrocarbon receptor) (Mufti et al..1995; Smith etal.,1995) el ciial se encuentra normalmente unido con la proteína hsp-90 (por heatshock protein). La hsp se libera y el complejo dioxina-AhR se une con la proteínatransportadora, la Amt (por Ah receptor nuclear translocator) (Zhang et al.,1998). Estecomplejo entra en el núcleo donde se une a la secuencia TnGCGTG en la región 5' queflanquea al gen de la aril hidrocarburo hidroxilasa, activando su transcripción.

Al igual que con la CYPIA1, la CYPIA2 -proteina altamente relacionada a lalA1- es indLicida por dic)xina y otros hidrocarburos aromáticos policíclicos. Sinembargo, el incremento de ARNm provocado por los hidrocarburos aromáticospolicíclicos no es debido a la activación de la transcripción, sino a regulación post-transcripcional. Raffalli-Mathieu et al., (1997) identificaron dos proteínas, de 37 y 44kDa respectivamente, inducibles por 3-metil-colantreno. Estas proteínas se unen a laregión 3' no traducible (3'UTR) del ARNm de CYPIA2, incrementando su estabilidad.

Aunque la regulación transcripcional ha sido la más frecuentemente observada,la estabilización del ARNm se ha reportado para otros miembros de la familia como2C12 y 2E1 (Coon et al., 1992). Algunas otras pueden presentar ambos tipos deregulación: CYP2A5 es regulada transcripcionalmente por el fenobarbital y post-transcripcionalmente por el pirazol (Raffalli-Mathieu et al.,1997).

La actividad de CYP3A, por ejemplo, aumenta en respuesta a la presencia deglucocorticoides, a treolandomicina y a dimetil sulfóxido. Los prime[os provocan suincremento mediante la activación de la transcripción; el segundo, aumentando lasíntesis de la proteína y disminiiyendo su degradación, y el último únicamentedisminuyendo la degradación de la proteína (Zangar y Novak,1998).

También hay reportes de regulación a otros niveles. Como revelan estos hechos,la regulación de las proteínas P450 es muy compleja. Dada la versatilidad en losmecanismos que controlan a las proteínas P450, se tiene que tener sumo cuidado enhacer extrapolaciones:

1) una misma proteína puede tener una respuesta similar hacia diferentesestímulos, pero siguiendo distintos mecanismos de control. La actividad de CYP3A, porejemplo, aumenta en respuesta a glucocorticoides, a treolandomicina y a dimetilsulfóxido. Los primeros provocan su aumento mediante la activación de latranscripción; el segundo, aumentando la síntesis de la proteína y disminuyendo su

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degradación, y el último únicamente disminuyendo la degradación de la proteína(Zangar y Novak, 1998).

2) Una proteína ortóloga (con la misma actividad) puede ser regulada de distintamanera en organismos diferentes. En los roedores las enzimas que degradanxenobióticos decaen con la edad (regulación temporal), mientras que en los primates lacapacidad de degradar estas sustancias se mantiene (Bestervelt et al.,1995).

3) Un mismo factor puede provocar efectos contrarios en diferentes proteínasP450. La G-naftoflavona disminuye el catabolismo del benzopireno por CYPIA1, peroaumenta el catabolismo del benzopireno por CYP3A4 (Koley et al., 1997).

La regulación de las proteínas P450 de mamíferos es muy compleja y se da atodos los niveles, aurique no se sabe si esto ocurre con todas estas proteínas.

CITOCROMO P450 REDUCTASA, UNA FLAVOPROTEÍNA ESPECIAL

Múltiples proteínas P450 coexisten usualmente en un mismo organismo(Guengerich,1991); por ejemplo, en la rata se han identificado al menos 38 genes.Como se mencionó anteriormente, con excepción de unas cuantas proteíTias P450, lacatálisis de la gran mayoría de estas diversozímas requiere de la participación deelectrones (Coon et al., 1996). Dichos electrones son provistos por nucleótidos depiridina reducidos, particularmente NADPH, y transferidos generalmente a unareductasa particular, la citocromo P450 reductasa (CPR).

La CPR es una flavoproteína membranal de 71-82 kDa, presente en las célulaseucarióticas. A diferencia de las proteínas P450 que suelen presentar similitudesmenores al 40%, aún cuando provengan de un mismo organismo, la CPR se encuentraconservada. Entre los mamíferos, por ejemplo, el grado de similitud es del 90% (Porter,1991) y de s0% entre los peces. La divergencia ocurre con la lejanía en la escalaevolutiva; entre la CPR de mamíferos y la de levadura hay alrededor de 40% desimilitud (Yabusaki et al., 1988).

La CPR es una enzima monomérica con dos dominios estructurales: un dominiohidrofóbico y otro hidrofílico. El dominio hidrofóbíco es un dominio pequeño, deaproximadamente 6-7 kDa, compuesto de aproximadamente 50 aminoácidos (Black etal., 1979) y se localiza en el extremo N-terminal y actúa como región de anclaje a lamembrana del reticulo endoplásmico (Black y Coon, 1982), aunque también se hareportado en otros compartimentos celulares (Sem y Kasper, 1993). Este dominiohidrofóbico no sólo tiene un papel estructural. sino que funcionalmente es necesariopara lograr la transferencia de electrones a las proteínas P450; cuando se digiereparcialmente la CPR y se elimina este fragmento, se libera la proteína de la membrana.Esta proteína solubilizada es capaz de reducir al sustrato artificial citocromo c, pero noa los sustratos fisiológicos, Ias proteínas P450. Por el contrario, Ia CPR solubilizada condetergentes es capaz de reconstituír /.n v/.fro las actividades de las proteínas P450.Adicionalmente, el péptido hidrofóbico es capaz de inhibir la actividad demonooxigenasas (Black et al.,1979), indicando que el dominio hidrofóbico es necesario

para la función biológica de la CPR.

El dominio hidrofílico es de aproxlmadamente 70 kDa (Narayanasami et al.,1995) y contiene FAD y FMN en dos dominios funcionales (Vermilion et al„ 1981). Eldominio que contiene al FMN se encuentra en el extremo N-terminal (Smith et al.,

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1994a) y en el también se encuentra una región rica en aminoácidos ácidos que es laque une al sustrato (Nadler y Strobel,1991). El dominio que contiene FAD se localizaen el extremo C-termiiial. Este dominio también contiene la región de unión para elNADPH (Smith et al„ 1994a) (Figuras s y 9). Ambos dominios son capaces de reducirdiversos sustratos artificiales; por ejemplo, el dominio FMN es capaz de transferirelectrones al sustrato artificial citocromo c y el dominio FAD-NADPH transfiereelectrones al ferricianuro (Shen y Kasper, 1995). Sin embargo, en el caso de lareducción del sustrato fisiológico se requiere obligatoriamente la participación deambos dominios (Smith et al.,1994a). La ruta de los electrones en este sistema esNADPH -FAD -FMN -proteína P450 (Vermilion et al„ 1981 ).

Figura 8. Representac!ón esquemática do la estructura y topología do la CPR. La flecha indica elsitio de unión del NADPH, cercano al sitio de unión del FAD. Los electrones siguen la ruta NADPH -FAD- FMN La punta de flecha localizada entre el FMN y el dominio transmembranal señala la salida de los

electrones, hacia la proteína P450. NH3+ y COO-indican los extremos amino y carboxílo del polipéptido

(Smith et al„ 1994a).

La CPR se encuentra en menor proporción respecto de las proteínas P450,usualmente en proporciones entre 1:10 y 1:20 (Vermilion et al.,1981; Porter et al.,1990). La CPR y las proteínas P450 forman complejos transitorios a consecuencia dela colisión entre ellas. debido a sus movimiento laterales en la membrana (Bridges etal.,1998; Yamada et al.,1995). La CPR y las proteínas P450 interaccionan medianteatracciones iónicas, entre las cargas negativas de la CPR (región rica en aspártico)(Shen y Kasper,1995) y las cargas positivas en las proteínas P450 (lisinas y argininas)localizadas cerca del sitio donde se localiza el grupo hemo (Bridges et al.,1998).

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1 2 3 3 2 4 5 4

FlgLira 9. Localización de los dominios funcionales do la onzima P450 reductasa en la cadenapolip®ptídica.1, dominio transmembranal; 2, unión del sustrato; 3, unión del FMN; 4, unión del FAD; 5,unión del NADPH (Porter et al..1990; Smith et al ,1994a; Zhao et al ,1996).

La CPR es una pToteína codificada por un solo gen, tanto en los animales(Simmons et al„ 1985) como en las levaduras (Yabusaki et al.,1988), por lo que enestos sistemas biológicos es la misma CPR la que actúa con las múltiples proteínasque estuvieran presentes, (Figuras 10 y 11). Con base en la menor cantidad de CPRrespecto a las proteínas P450. la interacción CPR-P450 puede estar regulando, encondiciones fisiológicas, el metabolismo mediado por proteínas P450.

Floura 10. Mod®lo ®squemátíco do los complojos P450 on oucariotes. X, V y Z representandiferentes protoínas P450. Los electrones del NADPH son transferidos a las proteínas P450 por unaflavoproteína específica, la P450 reductasa (CPR). El diagrama presenta la reacción típica dehidroxilación. ln vjím, el citocromo c o el ferricianuro también pueden ser reducídos por la CPR

(Donaldson y Luster, 1991 ).

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PROTEÍNAS P450 VEGETALES

DATOS GENERALES

Las proteínas P450 de plantas conforman un grupo numeroso, que continúa encrecimiento por la identificación de nuevas proteínas P450. De las 114 familias deproteínas P450 que se conocen, 40 son de origen vegetal (CYP 71 a CYP 110, másCYP51, familia presente en todos los reinos de organismos vivos) (Durst y Nelson,1995), (http//drnelson.utmem.edu/p450dbplant.html). Muchas de estas proteínas hansido identificadas con base en la presencia, en el ADNc. de las secuenciasconservadas en las proteínas P450 y a sus características espectrales, pero sussustratos fisiológicos aún se desconocen (Chapple,1995; Clark et al..1997; Hutvágneret al„ 1997; Schuler,1996b; Sugiura et al.,1996).

NADPH

Figura 11. Reacción de hidroxilación mediada por un complejo P450 reductasa-protoína P450. Loselectrones del NADPH siguen la ruta FAD ---- FMN---P450 En la proteína P450 el grupo hemo esreducido y esto permite la unión de oxigeno molecular Los átomos de la molécula de oxígeno siguendestino§ diferentes: uno es introducido al sustrato y el otro es combinado con los protones, dando lugar auna molécula de agua En ambas proteina§ el dominio catalitico está fuera de la membrana y se localizaen el extremo carboxilo, mientras que el extremo amino funciona como dominio de anclaie. Diagramatomado de Meiier (1993), con modificaciones.

Las proteínas P450 vegetales participan en la biosíntesis de una importantevariedad de compuestos como son: fitorreguladores, terpenos, fenilpropanoides,flavonoides, Iign.inas, etc. En los últimos años se ha visto que también estáninvolucradas en la degradación de xenob.ióticos, como diversos herbicidas, anilinas,naftalenos, bencidina, etc. (Batard et al.,1995; Hansíková et al.,1995: Zimmerlin yDurst, 1992). Por esta habilidad, Khatisashvili et al. (1997) considei.an a las plantas

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como el "hígado verde" o los "pulmones verdes" de la naturaleza. De ambas funcíones(biosíntesis-degradación). la función más cónspicua de las proteínas P450 de lasplantas es la de biosíntesis.

En general, la purificación de proteínas P450 a partir de fuentes vegetales hasido más difícil que la purificación a partir de tejidos de animales: el contenido de estasproteínas es más bajo respecto al contenido en mamíferos. numerosos compuestosvegetales interiieren con la determinación espectrofotométrica, la actividad es difícil demedir y además son altamente inestables debido a la presencia de quinonas ysustancias fenólicas en los exti.actos. En la actualidad se han aislado alrededor de 10proteínas P450 de plantas; en la mayoría de los casos los rendimientos han sido muybajos (Cuadro 3). Sus masas moleculares van de alrededor de 46 a 60 kDa (Gabriac etal.,1991; Higashi et al..1985; Donaldson y Luster,1991; Kochs y Gíisebach,1989;Meijer et al., 1993a; O'Keefe y Leto,1989; Petersen y Seitz,1988; Stadler y Zenk,1993).

Cuadro 3. Proteínas P450 aisladas de plantas.ENZ'MA FUENTE RECUPERAcióN(o/.) REFERENCIA

Digitoxina 12P-hjdroxilasa Digñalis lana{a 27& Petersen y Seitz,1988

3, 9 dihidroxiptero- Glycine max 0.16 Kochs y Grisebachcarpan 6a-mdroxilasa 38 1989Kochs et al..1992

Proteína P450. Persea americana 9 O.keefe y Leto, 1989

Aleno óxido síntasaÁcidocinámico Tulipa gesteriana 73 Higashj et al.,1985Linum usitatissimum 13 Song y Brash, 1991Parthenium argentatum Pan et al , 1995

GWcine max 2.621_07 Kochs et al„ 19924-hidroxilasa Helianthus tuberosus Gabriac et al.,1991

Vigna radjata MÍzutani et al„ 1993Phaseolus vulgaris Rodgers et al., 1993;Smithetal..1994b

Berbamunina sintasa Berberis stolonifera 0.2 Stadler y Zenk,1993

Geraniol 10-h idroxilasa Catharanthus roseus 0.09-0.12 Meijer el al.,1993a

Tirosina N-h idroxilasa(P450TYR) Sorghum bicolor 0.25 Sibbesen et al., 1994

Obtusifoliol14a-demetílasa Sorghum bicolor 1.03 Kahn et al.,1996

& Purificacíón parcial únícamente. . Función desconocida hasta el momento (D. P. O'Keefe,

comunicacjón personal). -Dato no reportado.

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La mayoría de las proteínas P450 conocidas de plantas son del tipo clásico, esdecir de dos componentes membranales: la proteína P450 y la CPR (Bolwell et al.,1994; Chapple,1998). Las excepciones son la benzoico 2-hidroxilasa (BA2H) y la alenoóxido sintasa (AOS, CYP74). La primera es una proteína soluble (la única solubleconocida en plantas) de 160 kDa y que contiene en un mismo polipéptido un dominiode hemoproteína (P450) y otro homólogo a la CPR. Esta proteína es similar a laCYPBM.3 de Bac/.//us megafer/.um y antigénicamente es reconocida por anticuerposcontra P450s solubles de bacterias, mientras que anticuerpos contra proteínas P450microsomales de plantas no la reconocen (León et al.,1995).

La AOS es una proteína P450 no clásica, que no requiere poder reductor niutiliza oxígeno molecular, sino que produce un rearreglo sobre el ácido lirtolénico 13-hidroperóxido, formando el óxido de aleno, un epóxido. Este compuesto es precursordel ácido jasmónico (Laudert et al.,1996). La AOS es la proteína P450 mayoritaria enlas monocotiledóneas (Lau et al„ 1993).

LA CPR EN EL REIN0 VEGETAL

Mientras en los animales y en las levaduras la misma CPR reduce a todas lasproteínas P450 de estos organismos. en las plantas - o al menos en algunas plantas-es diferente. Hasta hace poco tiempo se creía que la CPR vegetal era también única;los reportes sobre la posibilidad de la existencia de múltiples CPRs eran atribuidos aproteólisis de la CPR u otros artificios (Fujita y Asahi,1985; Menting et al„ 1994; Shetet al., 1993). Sin embargo. se ha demostrado la existencia de más de un gen enalgunos sistemas vegetales. En Arab/.dops/.s Íha//.ana se han encontrado dos genes alos que se les denominó A7-R7 y ArR2, respectivamente (Urban et al„ 1997); estospresentan un 64°/o de similitud. Tanto ATR7 como ATR2 se expresaron en una cepa delevadura que no expresa CPR endógena y en ambos casos se detectó actividad dereductasa, empleando citocromo c como sustrato y usando específicamente NADPH,como es común en la CPR de plantas. La funcionalidad de ambas proteínas comoP450 reductasas se determinó coexpresando en la levadura cada una de ellas juntocon la proteína P450 Í-cinámico 4-hidroxilasa (Ca4H). Ambas complementaron laactividad de esta enzima, confirmando la identidad de ATR7 y ATR2 como P450reductasas. Los autores proponen que la localización de A7-R2 es extra~reticular; enbase a que el extremo N-terminal posee secuencias de poliserina y polilisina y ademástiene un largo segmento anfipático, proponen que se localiza en el cloroplasto.

Mizutani y Ohta (1998) también reportaron dos genes de CPRs en A. Íha//.ana, alos que denominaron AR7 y AR2 respectivamente. Comparando las seciiencias, éstascorresponden respectivamente a los genes ArR7 y ATR2 que reportaron Urban et al.(1994). Ambos genes se expresan en todos los órganos de la planta pero sólct AR2 fueinducible cuando se sometieron los tejidos a daño mecánico y a tratamiento con luzcontinua. Estas mismas condiciones provocaron la inducción de la fenil alanina amonioliasa (PAL) y de Ca4H, dos enzimas involucradas en la biosíntesis de losfenilpropanoides, por lo que es posible que la función de AR2 sea permitir al organismoajustarse a condiciones de extremos ambientales.

Resultados similares se obtuvieron en Peímse//.num cr/.spum (Koopmann yHahlbrock,1997). En esta planta la CPR está codificada también por dos genes. Estos

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genes se expresan en todos los tejidos de la planta. pero uno de ellos se inducecoordinadamente con Ca4H en respuesta a Phyíophíora so/.ae.

lncluso las plantas en las que se ha reportado un sólo gen para la CPR podrianposeer más de una isoforma de esta enzima. Yamada et al. (1998) clonaron la CPR deW. fabacum y sometieron la secuencia a un programa que permite predecir localizaciónsubcelular de proteínas. Estos autores encontraron que si la proteína empieza en lametionina-1 se localizaría en retículo endoplásmico y si comenzara en la metionina-14se localizaría en el cloroplasto.

Como puede verse en algLmas publicaciones recientes (Rosco et al., 1997;Yamada et al„ 1998) estos resultados cambian la postura de esperar que la CPR y lasproteínas P450 de plantas tengan que ser iguales a los sistemas homólogos deanimales.

Es posible que muchas otras plantas tambjén posean más de una CPR, comoBenveniste y su grupo han insistido para He//.aníhL/s fuberosus desde principio de estadécada (Benveniste et al.,1991 ; Lesot et al.,1992; Lesot et al.,1995).

COMPARTAMENTALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS P450 VEGETALES

La evidencia de la multiplicidad de CPRs en plantas ha renovado el interés endeterminar su localización. así como tambíén la localización de las proteínas P450 deplantas. pues se propone que las diferentes CPRs pueden localizarse en diferentescompartimentos celulares (Koopmann y Hahlbrock,1997; Mizutani y Ohta,1998; Urbanet al.,1997). La idea general que ha prevalecido es que, al igual que en animales, lasproteínas P450 de plantas se encuentran en el retículo endoplásmico (Halkier,1996;Schuler. 1996b). La localización subcelular de proteínas P450 de plantas se hadeterminado sólo en algunos casos. En general se ha seguido un protocolo queconsiste en preparar microsomas crudos centrifugando el extracto de proteínas a altasvelocidades, tal como 100,000 ó 150,000 x g. En estas condicíones las proteínas P450son recuperadas en la pastilla. En consecuencia se dice que las proteínas P450 "serelacionan con la fracción microsomal". Sin embargo, si las muestras no fueronsometidas a centrifugación más ligera (3,500,10,000 Ó 20.000 x g), los microsomasobtenidos al final están compuestos por todas las endomembranas celulares y no sepuede indicar con certeza una localización específica.

Los organelos de las células vegetales donde se han reportado la presencia deproteínas P450 o de la CPR incluyen al retículo endoplásmico (Fujita y Asahi, 1985;Rodgers et al.,1993), cloroplasto (Blée y Joyard,1996; Harms et al„ 1995; Urban et al.,1997), vacuola (Madyasttia et al., 1977), peroxisomas (Alani et al„ 1990; Hicks yDonaldson, 1982; Luster et al., 1988), aparato de Golgl (Smith et al., 1994b) ymembrana plasmática (Kjellbom y Larsson, 1984; Kjellbom et al., 1985). Aunquealgunos de estos reportes son discutibles, otros si demuestran claramente unaubicación extra-reticular. Por ejemplo, las aleno óxido sintasas (AOS) clonadas de lino(Song et al.,1993) y de A. Íha/Í.ana (Laudert et al.,1996) presentan en el extremo N-terminal una secuencia de 58 aminoácidos, con una composición de 20% de serinas ytreoninas y una elevada fí.ecuencia de aminoácidos de carga positiva, característicasque sugieren que se trata de un péptido de tránsito para entrar en el cloroplasto. Con elfin de determinar la compartamentalización de las enzimas involucradas en el

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metabolismo del ácido linolénico (octadecanoico), ruta en la que participa la AOS, Bléey Joyard (1996) aislaron cloroplastos de Sp/nac/.a o/eraceae. La actividad de la AOS fuedetectada en los cloroplastos aislados, unida especificamente a la membrana externa,confirmando así su localización en este organelo.

Otro ejemplo es el de la Ca4H de la cual se ha realizado el análisis deinmunolocalización Smith et al (1994b) generaron un anti-suero contra la Ca4H dePhaseo/us vu/garí.s y purificaron las lgGs, logrando eliminar totalmente elreconocimiento no específico de otras proteínas Bajo estas condiciones la Ca4H de P.w/gar/.s fue localizada en retículo endoplásmico y también en aparato de Golgi, siendola primera proteína P450 vegetal reportada en este compartimento Previamente,Kochs et al. (1992) reportaron la presencia de fucosa y xilosa en la Ca4H de G/ycí.nemax. La xilosa y la fucosa son azúcares incorporados a las proteinas en el aparato deGolgi, lo que concuerda con su inmunolocalización en estas membranas. Aún no sesabe si la Ca4H del aparato de Golgi de P, w/gar/.s es funcional en estas membranas,pero si lo fuera, es de esperar también la presencia de la CPR, dado que la Ca4H esuna proteína P450 clásica, absolutamente dependiente de CPR (Benveniste et al.,1989).

Otra enzima P450 que es absolutamente dependiente de la CPR y que estálocalizada fuera del retículo endoplásmico es la propia GIOH. Madyastha et al. (1977)determinaron que la actividad de esta enzima se encuentra en las vacuolas de lascélulas de C. roseus. En consecuencia, C. roseus debe poseer una CPR vacuolar. LaCPR de C. roseus fue la primera CPR vegetal en ser clonada y ésta parece sermonogénica (Meijer et al.,1993b). Al igual que en la CPR de animales y de levadura,en el extremo N-terminal de la CPR de C. roseus se encuentra un dominio hidrofóbicoque le sirve de anclaje a la membrana.

Actualmente la CPR se ha clonado también de PeíL/n/.a hybr/.c/a (Toguri y Ohtani,1993), V/.gna rad/.aía (Shet et al.,1993), H tuberosus (Lesot et al.,1995), A. Íha//.ana(Urbán át ai., iggi). P. somniferm. Eschschoizi?_ £aMornica. (Rosco,`.e` ai.,. i?97).Peírose//.num cr/.spum (Koopmann y Hahlbrock,1997) y N. fabacum (Yamada et al„1998). Mizutani y Ohta (1998) han comparado algunas de las secuencias conocidas ynotan que con base en las secuencias del extremo N-terminal, las CPRs de las plantasse pueden dMdm en dos grupos. A uno de estos grupos lo denominan "de tipo AR2"(refiriéndose a una de las CPRs de A. Íha//.ana) que corresponde a las CPRs. queposeen una presecuencia, la cual es anfipática y con una secuencia rica en serina ytreonina El otro grupo, "de tipo AR1'', corresponde a las CPRs que no poseen estemotivo. Por su secuencia, la CPR de C. roseus queda clasificada en el grupo de tipoAR2 (Figura 12). Resulta interesante notar que, aunque con diferente simbología, laAR2 es la misma que la ATR2 reportada por Urban et al, (1997), la cual

potencialmente se localiza en un compartimiento distinto al retículo endoplásmico.En el cuadro 4 se presenta un resumen de la comparación de las proteínas P450

de animales y de plantas.

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AR2

N. tabacum

C. roseus

MSSSSSSSTS MIDLMAAIKGMESTSEKLSP FDFMAAIFKGMDSSSEKLSP FELMSAILKG

Figura 12. PresectJencias ol)servadas antes del ex(romo amino terminal de algunas CPRsv®g®tal®8 (Mzutani y Ohta,1998, Yamada et al„ 1998).

Cuadro 4. Protoinas P450 de animales y de plantas.CARACTERÍSTICA ANIMALES PLANTAS

Abundancia Alta (600 pmoles/ mg proteína) Baja (4-5 pmoles/ mg protei'na)

Sistema de 3 proteínas S Í (esteroidogénícas) No se ha reportado

Sistema de 2 proteínas(clásico) SÍ (el más abundante) SÍ (el más abundante)

Sistema de 1 polipéptido(soluble) No se ha reportado Un ejemplo conocido

Funciones Principalmente cata bolismo: Principalmente anabolismodegradación de xenobióticos` si.ntesis de compuestosSíntesis de esteroides, vegetales. Degradación de

prostaglandinas, tromboxanos herbicidas

Especificidad por elsustrato Generalmente baja Generalmente alta

Coexjstencia de múltiplesP450enelmismoorganismo SÍ SÍ

Especies tejido-específicas SÍ SÍ

lnducibles por su sustrato SÍ Algunos ejemplos conocidos

Control transcripcionai SÍ SÍ

Control post-tradiJcciona l Algunos ejemplos Probable para la Ca4H haciaalgunos factores

Control trad uccional S' Dos ejemplos conocLdos

(Ca4H y AOS)

Modificaciones post- Algunos repohes de Algunos reporles detraduccionales gluco§ilación. Acetilacíón en la glucosilación Acetilación en la

AOS Algunos reportes defosforilaclón AOS

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ro on inuación.Localizacion Retículo endoplásmico, Retícu lo endoplásm ico,

Mitocondria de glándulassuprarrenales cloroplasto, vacuola, aparato deGolgi, membrana plasmática

CPR (# de genes) Uno Uno en algunas plantas.

Dos o más en algunos sistemasvegetales

CPR (# de isoenzimas o Una VarLas, al menos en algunas

isoformas) plantas

CPR (PM) 79 kDa 79-84 kDa

TOPOLOGiA DE LAS PROTEiNAS P450 DE PLANTAS

Se sabe que la enzima Ca4H de diferentes fuentes vegetales está glucosilada(Gabriac et al.,1991 ; Kochs et al„ 1992., Rodgers et al„ 1993) al igual que la dihidroxi-pterocarpan 6ci-hidroxilasa (D6cH) (Kochs et al., 1992). La Ca4H se localizaprincipalmente en retículo endoplásmico (Alani et al.,1990; Rodgers et al.,1993). Estosugiere que la topología de estas proteinas es semejante a la de los animales, es decirque el dominio transmembranal atraviesa la membrana y el extremo N-terminal estáexpuesto en la luz del reticulo endoplásmico, donde se glucosila. No se sabe si otrasproteinas P450 vegetales también están glucosiladas.

Al momento no hay datos disponibles sobre la topología de proteínas P450 quese localizan en otros organelos. Es posible que éstas presenten otra topologia, esdecir, que el dominio catalitico no estuviera expuesto hacia el citosol, sino hacia laparte soluble del organelo donde se encuentran. La enz.ima que sigue después de laAOS en la sintesis del ácido jasmónico, por ejemplo, está en el estroma (Blée y Joyard,1996). En el caso de la G10H, algunas enzimas posteriores en la via se encuentran enla parte soluble de la vacuola (Meijer et al., 1993d). No se puede descartar, sinembargo, que los productos de estas enzimas sean transportados al interior de eslosorganelos, pues se sabe que éste es uno de los mecanismos de regulación que existenen el metabolismo secundario.

LAS PROTEÍNAS P450 Y EL METABOLISMO SECUNDARlo

En las plantas la principal func.ión de las proteinas P450 se relaciona con lasíntesis de metabolitos secundarios. En algunas vías metabólicas incluso participanvarias proteínas P450. Por ejemplo, en la sintesis de la cumarina xantotoxina participan3 proteínas P450: Ia marmesina sintasa, la psoralen sintasa y la psoralen 8-monooxigenasa (Schuler,1996b). Otros ejemplo son la ruta de los flavonoides dondeestán involucradas al menos 9 proteínas P450 (Bolwell et al.,1994) y la síntesis delglucósido cianogénico durrin, en la que de los 6 pasos enzimáticos que llevan de L-tirosina al durrin, dos están mediados por proteínas P450 (Halkier y Moller,1991).

Contrario a las enzimas P450 catabólicas que muestran una baja especificidad,las proteinas P450 biosintéticas son altamente específicas (Gerardy y Zenk, 1993;Halkier y Moller,1991 ; Karp et al.,1987; Chou y Kutchan,1998). Una gran variedad de

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compuestos vegetales son sustratos de proteínas P450, por lo que se puede suponer lagran diversidad de proteínas P450 que existen en el reino vegetal. De éstas, muypocas tienen distribución amplia o ubicua en las plantas. La mayoría de las proteínasP450 sólo está presente en los grupos o familias de plantas que producen losmetabolitos secundarios en cuya biosintesis participan (BolweH et al.,1994; Schuler,1996b). En el cuadro 5 se muestra la distribución de algunas de las proteínas P450 devegetales.

uadro 5. Distribución de algunas proteínas P450 en el reino vegetalENZ'MA BIOSÍNTESIS DE DISTRIBUclóN EN LASPLANTAS

Esterol 14ademetilasa Esteroles ubicua.

Aleno óxido sintasa Óxido de aleno (precursor dejasmonatos) Amplia, posiblemente iibicua

t-cínám ico 4-h`droxilasa p-Cumárico (precursor defenilpropanoides,flavonoides,lignlnas) UbiclJa

Geran¡ol 10-hidroxilasa 10-hjdroxigeran íol (precursor Apocináceas",del monoterpeno jridoide, Caprifoliáceas",secologanina) Loganáceas", Rubiáceas"MenthapiperitaMenthaspicata

Limoneno 3-hidroxjlasa t-lsopiperitenol (monoterpeno)

Limoneno 6-hidroxílasa t-Carveol ( monoterpeno)

Limoneno 7-hidroxilasa Alcohol perillil(monoterpeno) Perilla frutescens

Ácido láurico ®2-hidroxilasaÁcidoláuricoail-hidroxilasa Ácido láurico 10-hjdroxi Helianthus tuberosus

Ácido graso 11 -hidroxi Trilicum aestívum

Ácido láurico oi-hidroxilasa Acido graso 12-hidroxi Vicia faba, y otrasleguminosas

Vinorina hidroxilasa Vomilenina Rawolfia serpentina

Berbamunína sintasa Berbamunina Berberis stolonifera

S-N-m etilcoclaurina 3-hidroxilasa S-3.-hidroxi-N-metilcoclaurina Eschscholzia californica

Presente también en hongos y mamíferos " En algunos géneros de estas famílias. Más ampliamentedistribuída en las Apocináceas.

Al i.gual que los metabolitos secundarios, las proteínas P450 pueden sólo estarpresentes en determinados Órganos de la planta. -como la flavonoide 3-hidroxilasa(F3'H) y la flavonona 3,5-hídroxilasa (F3.5.H), que panicipan en la síntesis de lasantocianinas y se expresan en las flores (Holton et al.,1993; Tanaka et al„ 1998)-oúnicamente se expresan en determinada edad -durante la germinación de Rí.c/.nLíscommun/.s (Alani et al.,1990). o durante la maduración del fru{o de Persea amen.cana

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(Bozak et al., 1990), en donde hay una alta expresión de proteínas P450. Otras seexpresan únicamente bajo condiciones de estrés. Por ejemplo, en respuesta al ataquede insectos, patógenos o a daño mecánico, las coníferas secretan resinas diterpénicascomo el abiético que al solidificar sella el daño físico sufrido. Las proteínas P450abietadieno hidroxilasa y abietadienol hidroxilasa participan en la sintesis de estaresina; estas enzimas resultan lndetectables bajo condiciones normales, pero soninducidas por daño mecánico (Funk et al.,1994).

Los ejemplos antenores ilustran que la regulación de estas proteínas en lasplantas es compleja. Hasta el momento se ha explorado muy poco sobre losmecanismos que median este control, ya que no se disponen de sondas o anticuerposespecíficos para la mayoría de estas proteínas.

Por su ubicuidad y por su función central en la biosíntesis de los compuestosfenólicos la enzima P450 que más se ha estudiado en las plantas es la Ca4H. Si secompara su comportamiento en respuesta a herida y a presencia de aminopirina, seobserva un hecho interesante. Aunque ambos tratamientos provocan un aumento de laactividad, los mecanismos de regulación parecen no ser totalmente idénticos. Larespuesta a la herida es más rápida y se observa correlación entre el aumento deltranscrito, el del péptido y el de la actividad enzimática. La cinética de declinación delmensajero, proteína y actividad son parecidas.

En el caso de la aminopirina ocurre también un incremento del transcrito, del

péptido y de la actividad, pero en este caso los patrones muestran discrepancias. Laexpresión del mensajero alcanza su máximo a las 50 h y luego va disminuyendogradualmente. Contrariamente la proteína no dísminuye después de alcanzar sumáximo, lo cual ocurre también a las 50 h; la cantidad de esta proteína se mantieneinalterable al menos hasta las 80 h. Por el contrario. la actMdad disminuye después dealcanzar un máximo a las 30 h., a las 80 h ha disminuido como el 50%. Estos datossugieren que en este caso pudiera haber estabilización de la proteína e inactivación dela enzima (Batard et al.,1997). La inactivación de la actividad enzimática también se hasugerido para la alcánfor 6-hidroxilasa de Sa/v/.a offic/.na//.s (Funk y Croteau, 1993).

Tanto en la respuesta a herida como a aminopirina ocurre una separacióntemporal de 15-20 h entre el máximo del transcrito y la acumulación de la proteína,sugiriendo que también existe una regulación post-transcripcional sobre la Ca4H.

llvIPORTANCIA DE LAS PROTEÍNAS P450 EN LA BIOSÍNTESIS DE LOSMETAB0LITOS SECUNDARIOS

La mportancia de las proteinas P450 vegetales en el metabolismo secundariono sólo radica en el hecho que catalizan pasos metabólicos intermediarios -desde estepunto de vista todas las enzimas son importantes-sino de que los pasos que catalizansuelen ser limitantes para la síntesis de los productos finales respectivos (Cuadro 6).Por ejemplo, sobre-expresando la AOS se provoca un aumento en los nivelesendógenos de ácido jasmónicx) en papa (Harms et al., 1995). En Affib/.dops/.s el dañomecánico, el etefón y el propio ácido jasmónico provocan que el mensajero, elpolipéptido y la actividad de la AOS aumenten y estos aumentos concuerdan con elincremento de los niveles de jasmonato (Laudert y Weiler, 1998). Otro ejemploilustrativo es la participación de las hidroxilasas F3'H y F3'5.H en la biosíntesis de las

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antocianinas. Las antocianinas son flavonoides que confieren color a las flores enalgunas especies. Las diferencias en los patrones de hjdroxilación en las antocianidinasdelfinidina, cianidina y pelargonidina controlan el color de azul a violeta, rojo o rosa, porlo que estas hidroxilasas son las responsables de la coloración (Holton et al., 1993;Tanaka et al.,1998).

La regulación de al menos algunas de estas enzimas se encuentra coordinadacon la regulación de otras enzimas altamente reguladas. La Ca4H muestra una cinéticade respuesta similar a la PAL (Mizutani et al.,1997); similarmente las diterpenoideshidroxilasas de las coníferas se inducen coordinadamente con monoterpén y diterpénciclasas (Funk et al., 1994). En anímales las proteínas P450 biosintéticas tambiénrepresentan puntos claves de control metabólico (Chou et al„ 1996; Cooper et al.,1997; Sadovsky et al., 1995).

Cuadro 6. Ejemplos de proteínas P450 vegetales cuyas actividades parecenrepresentar puntos de control metabólico.

ENZIMA METABOLISMO

Aleno Óxido sinta§a Octadecanoicos Oasmonatos)

Tirosina N-hidroxilasa Glucósidos cianogénicos

t-CinámLco 4-hidroxilasa Fenilpropanoides

Flavonoide 3-hid roxilasa Antocianinas (flavonoides)

flavonoide 3,5-hidroxilasa

Limoneno hidroxilasa Aceites esenciales monoterpénicos

Geraniol 10-hidroxilasa Monoterpenos

Abietadieno hidroxilasa Oleo-resinas (resinas diterpénicas)

Abietad ien ol hidroxílasa

PROTEÍNAS P450 Y BIOSÍNTESIS DE ALCAL0lDES

Al momento se conocen alrededor de 16 enzimas P450 vegetales involucradasen la biosíntesis de las diferentes clases de alcaloides (Cuadro 7).

Algunos pasos metabólicos anteriormente atribuidos a otras clases de enzimashan sido reevaluados y atribuidos a proteinas P450. Por ejemplo, la bíosíntesis dereticulina a partir de tirosina involucra dos hidroxilaciones; éstas habían sido atribuidasa fenol oxidasas pero recientemente Pauli y Kutchan (1998) demostraron en E.ca//.fom/.ca que la hidroxilación de la S-N-metilcoclaurina a S-3'-hidroxicoclaurina esmediada por una proteína P450, la cual denominaron S-N-3-metilcoclaurina 3'-h.idroxilasa (CYPSOB1 ).

La mayoría de las proteínas P450 conocidas que participan en la biosíntesis delos alcaloides son hidroxilasas (Cuadro 8). Todas las que se han identificado hasta el

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momento son C-hidroxilasas y siguen la reacción típica de R-H + NADPH + H+ + 02 i}R-OH + NADP' + H20.

Cuadro 7. Proteínas P450 involucradas en la biosíntesis de los alcaloides.ALCALOIDES ENZIMAS P450 ALCALOIDE

Tetrahidrobonzilisoqui.nolínicosBenzo-fenantridínicosMoriínicos

Berbamunina sintasa Berbamunina

Metil-coclaurina 3'-hídroxilasa S-3`-Hidroxi-N-metilcoclaurina

Queilantifolina sintasa S-Queilantifolina

Estilopina sin(asa S-Estilopina

N-metil estilopina 14-hidroxilasa Protop,na

Protopina 6-hidroxilasa 6-Hidroxiprotopina

Dihidro-sanguinarina 1 O-hidroxilasa Dihidro-quelirubina

Dihidro-quelirubina 12-hidroxilasa Díhidro-macarpina

Canadina sintasa S-Canadina

Salutaridina sintasa Salutaridina

Tebaína demetilasa Neopinona

Codeína demetilasa Moriina

Monoterpón indólicoslniciodelavía(común)SarpaganosAspidorperma

Geraniol/nerol 10-hidroxilasa*Enzímaformadoradelpuente 10-Hidroxigeraniol>Secologanina+EstrLctosidina10-Deoxisarpagina

sarpagano

Vinorina 21 -hidroxilasa Vomilenina

Tabersonina 16-hidroxilasa 16-Hidroxitabersonina

' El 10-mdroxigeraniol, producto de la geraniol 10-hidroxilasa es un monoterpeno. Se incluyen en esta

llsta porque este monoterpeno es preciirsor de la estrictosidina, glucoalcaloide que da lugar a losalcaloides monoterpén indólicos y quinolínicos. NOTA: Las enzimas se presentan agrupadas en elcuadro cuando participan en la misma ruta, por ejemplo las 6 enzimas agrupadas en los alcaloidesbenzo-fenantridínicos sintetizan macarpina a partir de reticulina; las 3 en el grupo de los morfínicosconducen a la retLculina a morfina. En los alcaloides monoterpén indólícos, la geraniol 10-hidroxilasa

participa al inicio de la vía (antes de las bifurcaciones), las 2 siguientes en la síntesis de aimalina y laúltima en la biosintesis de víndolina.

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Además de las hidroxilaciones también participan en demetilaciones y otrasreacciones que sólo se conocen hasta el momento en plantas. como es la formacióndel puente metiléndioxi (2.-OCH3-) y las reacciones de acoplamiento a fenol mediante

puentes C-C o C-O.La biosíntesis de los alcaloides berberina y macarpina involucran

respectivamente una y dos proteínas P450 que forman puentes metilendioxi medianterearreglos intramoleculares. Estas enzimas son la canadina sintasa que sintetizacanadina, precursor de la berberina (Rueffer y Zenk, 1994) y las enzimas queilantifoljnasintasa y estilopina sintasa que sintetizan queilantifolina y estipolina, precursores enruta para la biosíntesis de macarpina (Bauer y Zenk,1991). Este tipo de reacción,originalmente descrita para el metabolismo de los alcaloides, se ha reportadorecientemente también en la vía de biosíntesis de los isoflavonoides pseudobaptígeninay 5-hidroxípseudobaptigenina de CÍ.cer arí.efí.num (Clemens y Barz, 1996).

Cuadro 8. Reacciones mediadas por proteínas P450 en la biosíntesis de losalcaloides.

REACCIÓN ENZ'MA

Hidroxilación

Metil-coclaurina 3'-hidroxilasa,(C-OH)N-Metil estilopina 14-hidroxilasa

Protopina 6-hidroxilasa

Dihidro-sanguinarina 10-hidroxilasa

Dihidro-quelirubina 12-hidroxilasa

Geraniol/nerol 10-hidroxilasa

Enzima formadora del puente sarpagano

Vinorina 21 -hidroxilasa

Tabersonina 16-hidroxila§a

Demetilacjón Tebaína demetilasa, codeína demetilasa

Formación de puente Canadina sintasa, queilantifolina sintasametilendioxl

(2'-OCH3-) estilopina sintasa

Acoplamiento a fenol

Saliitaridina sintasa(C-C)

(C-0) Berbamunina sintasa

En cuanto a la formación de puentes C-C o C-O, se creía que éstos erancatalizados inespecíficamente por fenolasas y peroxidasas. Gerardy y Zenk (1993)demostraron en Papaver somn/.Íerum que una proteína P450 (a la que denominaronsalutaridina sintasa) lleva a cabo la reacción de acoplamiento intramolecular C12-C13de la R-reticulina y la conviehe en salutaridina, intermediario en la síntesis de morfina.Contrario a las reacciones con fenolasas o peroxidasas. la catálisis de la salutaridina es

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estereoespecifica y no acepta como sustratos a la R-norreticulina, la R-coclaurina ni alestereoisómero S-reticulina.

La enzima prototipo del acoplamiento a fenol vía un puente C-O es laberbamunina sintasa (Kraus y Kutchan,1995: Stadler y Zenk,1993). A diferencia de lasalutaridina sintasa, la berbamunina sintasa lleva a cabo un acoplamientointermolecular, uniendo una molécula de R-N-metilcoclaurina y otra de S-N-metilcoclaurina. El dímero resultante es un alcaloide benziltetraisoquinolínico, la (R, S)-bermamunina.

La salutaridina sintasa y la berbamunina sintasa son las únicas enzímasconocidas que realizan reacciones de acoplamiento a fenol en la biosíntesis de losalcaloides. Sin embargo, esta reactividad pudiera ser más frecuente y participartambién en la síntesis de otros alcaloides bisbenzilisoquinolínicos que presentanpuentes C-O, como la tubocurarina (Chou y Kutchan.1998). Adicionalmente, otras víasmetabólicas pueden involucrar enzimas de este tipo. Recientemente se ha propuestoque una sintasa similar participa en la ciclización intramolecular de la benzofenona paradar lugar a la xantona (Peters et al.,1998).

Es posible que el número de proteínas P450 que parti.cipan en la biosíntesis delos alcaloides pudiera ser más grande de lo que actualmente se conoce. En labiosíntesis de los monoterpén indólicos, por ejemplo, se desconoce la enzimología denumerosos pasos enzimáticos. La presencia de múltiples hidroxilaciones en susestructuras (Meijer et al., 1993d) abre la posibilidad de la participación de másproteínas P450 en estas rutas. si bien las reacciones de hidroxilación también puedenser catalizadas por dioxigenasas dependjente de G-cetoglutarato, flavín oxidasas,peroxidasas y enzimas dependiente de 02 y dihidrofumarato (Chou y Kutchan,1998).

La información anteriormente descrita evidencía la importancia de las proteínasP450 en el metabolismo general de las plantas, así como en el metabolismo de losalcaloides. Como se mencionó anteriormente, nuestro interés es estudiar a lamonooxigenasa G10H, enzima que parece ser un punto clave en la biosíntesis de losAMls.

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OBJETIV0 GENERAL

Estudiar la regulación de las enzimas geraniol 10-hidroxilasa y P450 reductasadecatharanthus roseus.

OBJETIVOS ESPEciFICOS

1) Estandarizar las metodologías para cuantificar las actividades de la CPR y de laG10H de raices transformadas de C. roseus.

2) Caracterizar los patrones de las actividades de la G10H y de la CPR durante elciclo de cultivo de las raíces transformadas empleadas como modelo biológico.

3) Determinar si las actividades de la G10H y de CPR de las raíces transformadasde C. mseus aumentan bajo condiciones que se ha reportado provocan unaumento en el contenido de los alcaloides indólicos de esta planta.

4) Caracterizar la especificidad de los antisueros contra la G10H y contra la CPR(donados por las dras. A.H. Meijer e lrene Benveniste respectivamente).ldentificar a estas proteínas en C. roseus.

5) De resultar los antisueros específicos para las proteínas hacia las cuales fuerongenerados, emplearlos para estudiar la regulación de estas proteínas.

MODEL0 BIOLOGICO

Datos de nuestro laboratorio (Ciau-Uitz, 1992) así como de otros grupos(Toivonen et al., 1989) muestran que la raiz de Cafhamníht/s roseus produce unaimportante cantidad de alcaloides indólicos y Lin mayor número de distintos alcaloidesrespecto a otros órganos de la planta. La importancia de este Órgano en cuanto almetabolismo de los alcaloides indólicos no ha sido establecida debido a que la mayoríade los grupos se han dedicado a estudiar la vía en células en suspensión. No se sabesi la regulación de las enzimas involucradas son similares o diferentes a la de lasenzimas de su contraparte aérea o si existen isoenzimas. Adicionalmente, debido a quelas raíces acumulan mayor cantidad de alcaloides se esperaria tuvieran mayoresniveles de actividad de las enzimas claves,1o que facilitaría su estudio y eventualmentesu aislamiento.

Los tejidos vegetales transformados con las bacterias del género Agrobacíert.umestablecen cultivos estables que no requieren de la adición exógena de fitorreguladorespara crecer y constituyen iina fuente continua de material biológico de fácilmanipulación. Estos cultivos son ampliamente usados como modelos para realizardiversos estudios, incluyendo los bioquímicos y los moleculares (Flores et al..1999;Skoog,1994: Coley et al.,1985; Rhodes et al.,1990; Toivonen et al.,1989; Van derHeijden et al.,1989).

Para este estudio se empleó un cultivo de raíces transformadas de C. nDseus.Este cultivo fue establecido en nuestro laboratorio a partir de la infección de las raícesde la planta de C. /oseus con la cepa 1855 de Agrobacíen.um rh/.zogenes (Vázquez-Flota et al.,1994).

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Los resultados obtenidos en este trabajo se presentan en los capítulos 2, 3 y 4.Estos capítulos están redactados en inglés y presentados a manera de artículos.

A continuación se describen brevemente los contenidos de estos capítulos,indicando cual o cuales de los objetivos específicos que sLe plantearon se cumplen encada uno de eHos.

El capítulo 2 (Multiple forms of NADPH: cyt P450 reductase in the Madagascarperiwinkle Caíharaníhus roseus), presenta la identificación de la CPR de C. roseus,empleando un antisuero generado contra la enzima de He//.aníhus Íuberosus (antisuerodonado por la Dra. 1. Benveniste). Este antisuero reconoció a dos proteínas en la-sraíces transformadas de C. mseus. mismas que cruzan con un antisuero generadocontra la CPR de Souum b/.co/or (donado por 8. A. Halkier). Postenormente seanalizaron diferentes Órganos de la planta y en ellos también se observó más de unaproteína inmunoreactiva. El tallo y las raíces presentaron un inmunotipo de CPRs dedos proteínas, de 87 y 84 kDa, mientras que en las flores y en las hojas se encontró uninmunotipo que comprende proteínas de masas moleculares de 78 y 74 kDaaproximadamente, sugiriendo que en C. roseus existen múltiples formas de la enzimaCPR, con posible distribución tejido-específica. En este capitulo se cumplieronparcialmente los objetivos específicos 4 y 5.

En el capítulo 3 (Non-coordinated response of cytochrome P450 dependentgeraniol 10-hydroxylase and NADPH: Cyt c (P450) reductase in Caíhamníhus mseushairy roots under different conditíons) se analizaron los comportamientos de lasactividades de las enzimas G10H y CPR, en raíces transformadas de C. roseus qLiefueron sometidas a diferentes tratamientos que provocan la producción de alcaloidesmonoterpén-indólicos. En algunos tratamientos, como fueron la transferencia a mediode cultivo sin fosfatos o a medio con 8% de sacarosa, las actividades de la G10H y dela CPR aumentaron de manera coordinada. Ccin otros tratamientos (como la adición de100 LiM de ácido abscísico) estas enzimas respondieron de manera diferente una deotra, sugiriendo que sus regulaciones no están siempre ligadas. Este capítulo cumple elobjetivo específico No. 3.

El capítulo 4 (Characterization of polyclonal antibodies against the geraniol 10-hydroxylase from Caíhafflníhus roseL/s), presenta la identificación de la G10H de C.roseus. Como parte de la caracterización del antisuero también se inmLinodetectó a laGIOH en otras plantas que poseen actividad de esta hidroxilasa.

En este capítulo se presentan también los resultados sobre la caracterización delas actMdades de las enzimas GIOH y CPR durante el ciclo de cultivo de las raícestransformadas. Se observó que la actMdad de la CPR está presente durante todo elciclo, pero la actividad de la G10H está presente solo en un corto período. Losresultados de las inmunodetecciones obtenidas empleando los antisueros contra laG10H y contra la CPR son congruentes con los datos de las actividades. En estecapítulo se abarcan los objetivos especificos 2 y 5.

La estandarización de las metodologías para cuantificar las actividades de lasenzimas G10H y CPR, que corresponde al objetivo específico No.1, se presenta en elanexo 1.

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En el anexo 11 se presentan algunos resultados sobre la regulación de lasenzimas CPR y G10H de C. mseus. Se emplearon los antisueros contra la CPR de H.Íuberosus y contra la G10H de C. n)seus, respectivamente. Los aspectos abordados eneste anexo fueron sus distribuciones espaciales en la planta y sus comportamientos enlas raíces transformadas sometidas a diferentes tratamientos.

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CAPITULO 11

Multiple forms of NADPH: Cyt P450 roductasos in tho Madagascar poriwinkloCatharanthus roseus.Blondy 8. Canto-Canché and Víctor M. Loyola-Vargas*. Unidad de BiologíaExperimental. Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, Apdo. Postal 87,Cordemex 97310, Yucatán, México.

This chapter is in preparation to be submifted.

KEY WOF`DS

Cytochrome P450, P450 reductase, glycoproteins, cx)ncanavaline A, hairy roots,Catharanthus roseus.

ABBREVIATIONS

cytochrome (P450) reductase (CPR); geraniol 10-hydroxylase (GI OH).

ABSTRACT

NADPH: Cyt P450 reductase (CPR, E.C.1.6.2.4) is the redox partner of classicalcyt P450-monooxygenases, which have crucial roles in the metabolism of terpenes,alkaloids, flavonoids, phytoalexins etc. lt becomes evident that, contrary to animals andyeast, various CPR isoforms occur in some plants, although their specific physiologicalfunctions are largely unknown. C. n)seus-CPR has been reported as encoded by asingle gene and early papers concerning the C. mseus-CPR protein also reporied asingle CPR polypeptide. The observation of diverse CPRs during purification or byimmunoblot were attributed to proteolytic degradation. We obtained the CPR-immunotype of C roseus roots using two heterologous an{isera directed against theCPR from Somhum bi.oo/or and He/i.aníhus íuóen3sus, respectively. Both antiseradeveloped the same immunogenic profile with two cross-reactive polypeptides. Furtherevaluation of anti-H. Íubemsus's CPR seriim excluded non-specific binding for cross-recognition. Distinct CPR polypeptides probably are not the result of proteolyticdegradation, since increasing protease inhibitor concentra{ion during the extraction andmanipulation of the samples did not affect the occurrence of these two CPR forms.Roots from plants growing in the field showed identical CPR-immunotypes with thoseseen /.n vi.ím, indicating that this immunoprofile actually belongs to C. roseus roots.

The lectin concanavaline A was able to inhibit the CPR activity from C. roseushairy roots; therefore, the distinct polypeptides probably result by post-translationalglycosylation of original polypeptide.

Not only the roots but also the flowers, leaves and the stem showed more than asingle CPR form. The different tissues of the plant showed distinct patterns of CPRpolypeptides, which were reproducible even though they come from tissues of plants

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growing in the field. This opens the possibility of the occurrence of diverse tissue-specific CPRs.

lNTRODUCTloN

NADPH: Cyt P450 reductase (CPR, E.C.1.6.2.4) is a FAD/FMN-contajningprotein occurring in the endoplasmic reticulum membranes of all eukaryotic cells. Thisflavoenzyme seives as an electron transfer from reduced pyridine nucleotides to theheme-thiolate mixed function monooxygenases, cytochrome P450s. Mammals(Simmons et al., 1985) and yeast r/abusaki et al., 1988) have a single CPR, which isresponsible for reducjng the large variety of classical P450s occurring in theseorganisms. Plant cyt P450 group is likely to be enormous and is involved in differentmetabolic pathways of primary importance (Bolwell et al., 1994). At present a largenumber of reactions have been predicted as mediated by P450s on the basis of thesusceptibility to cyt P450 inhibitors, their requirement of reducing equivalents andmolecular oxygen and by the blue light reversible CO inhibition. One of the most currentpractices for identifying P450 enzymes is the comparison of their sequences with knownP450s sequences. This approach overcomes the difficulties in purification due to P450inestability, their low abundance in the tissues and tlie necessity of reconstitution withits redox partner. Following a PCR strategy using primers designed from conserveddomains of P450 proteins, sevei.al cDNAs corresponding to different P450s have beenisolated in the same plant. At least 18 distinct P450 sequences have been isolated fromPefun/.a (Holton et al.,1993),16 from Ca(hamnthus n3seus (Meijer et al.,1993c) and 13full-Iength P450-cDNAs were recently isolated from Amó/.dops/.s tha//.ana (Mizutani et al. ,1998). Therefore, as in the case of animal systems, multiple distinct P450s can occur ina single plant species, even when they can be distributed in different tissues orexpressed under different physiological conditions. Apart from hydroperoxide-utilizingallene oxide synthase (CYP74), all plant P450s known until now are dependent onelectrons to reductively cleave the molecular oxygen to be introduced into the substrate(reviewed in Bolwell et al„ 1994; Chapple,1998; Schuler,1996).

ln contrast to vertebrates, insects and yeast, evidence is accumulating that, atleast in some plants, multiple CPR isoforms or isoenzymes exist. The first repohproposing diverse CPRs in a single plant species was from Benveniste et al. (1989;1991). They purified three CPR foms from He/t.anfhus Íubemsus exhibiting commonimmunogenic features but with different chromatographic behaviors. Each one of theseCPRs was able to reconstitute {lie CPR-dependen( cinnamic acid 4-hydroxylase activity,excluding a proteolytic origjn of the two smaller CPR polypeptides from the largest one.Further evaluation at molecular level also supports the occurrence of CPR isoenzymesjn H. Íubemsus, in which at least two distinct messenger RNAs encoding CPR havebeen isolated (Leso( et al., 1995). Recent data sugge§ts that this feature is notexclusive to He//.aníhus. Conclusive evidence supporting the existence of at least twodistincl, differentially regula{ed CPRencoding genes has been lately reported forAmb/.dops/.s fha//.ana (Mizutani and Ohta,1998; Urban et al.,1997) and Peínose//.numcn.spum (Koopmann et al.,1997).

The Madagascar periwinkle Caíhaffiníhus noseus is an imporlant source ofmedically valuable monoterpene indole alkaloids which are used in the treatment ofhypertension and cancer. For more than two decades it has been known that CPR-

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dependent cyt P450 plays a central role in the biosynthesis of this group of secondarymetabolites (Falkenhagen et al..1995; Meehan and Coscia,1973; St-Pierre and DeLuca, 1995), although, the mechanisms regulating C. roseus.CPR and P450s are notfully understood. CPR from C. mseus has been purified from seedlings (Madyasttia andCoscia,1979) or from a cell suspension culture (Meijer et al„ 1993b). From seedlings,two forms of the CPR (78 and 63 kDa) were observed, and four immunoreactive bands(82, 74, 62 and 56 kDa) from the cell suspension culture cross-reacted with an anti-CPRserum. Except for the largest CPR polypeptide, all the others were interpreted asproteolytic degradation products. Furthermore, C. n?seus CPR seems to be encoded bya single copy gene (Meijer et al., 1993b).

We are interested in understanding the monoterpene indole alkaloid metabolismin C. roseus roots. Current information suggests that the CPR-dependent geraniol 10-hydroxylase enzyme is the first committed step in the biosynthesis of these compounds.

As hairy roots are potentially able to produce all root-derived products, they are apromising model for studying the biosynthesis of secondary metabolites from roots offield-grown plants (Canto-Canché et al..1999; Flores et al.,1999). The C. roseus riairyroot J-1 line produces a profile of indole alkaloids qualitatively similar to the spectrumfrom plant roots grown /.r) v/.vo (Ciau-Uitz et al.,1994; Sáenz-Carbonell et al.,1993),which is why we chose this culture as biological material. Using a polyclonal antiserumdirected against H. Íubemsus€PR, three polypeptides were immunodetected in the J-1culture. The occurrence of the smallest band was influenced by variation in theconcentration of protease inhibitors, indicating that it was generated during themanipulation of the sample. By contrast, the protease inhibitor cocktail had no effect onthe immunodetection of the other two polypeptides.

MATERIAL AND METHODS

Biological material. Caíhamníhus roseus hairy root culture line J-1 waspreviously established by infecting seedling roots with Agmbacfen.um m/.zogenes (Ciau-Uitz et al„ 1994). lt was routinely subcultLired transferring 0.5 g of fresh tissue in 85/2

medium (Gamborg et al.,1968) with the addition of 3% (w/v) siicrose and deprived of

phytohormones. Subcultures were done every two weeks, kept in darkness at 250C andon shakers at 100 rpm.

Preparation of microsomes. The t.issue was frozen with liquid nitrogen andground in a pre-cooled mortar to a fine powder. The flour was mixed with two volumesof extraction buffer, 50 mM Tris. pH 7.5, 300 mM sucrose, 1 mM EDTA, 1 mMdithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulphonylfluoride (PMSF) and 5 Lig ml-1leupeptine and grinding continued until it was thawed. The mixture was then filteredthrough cheesecloth. Large particles such as cell walls and starch grains were removedby centrifuging the filtrate at 1,500 x g for 15 min. The membranes (endomembranesand plasma membrane) were obtained by ultracentrifugation of the supernatant at150,000 x g for 1 h. The pellet -constituting the microsomal fraction-was resuspendedin 50 mM Tris-Hcl buffer, pH 7.5, containing 1 mM EDTA. 20% (v/v) glycerol, 1 mMDTT, 1 mM PMSF and 5 Lig ml-' leupeptine.

55

Enzyme assays. CPR activity was measured according to Lord (1988), using areaction mixture containing 0.5 mM potassium cyanide, 5 ijM antimycin A, 0.15 mM ÍS-NADPH, 50 ijM ferricytochrome c (type 111, from horse heart), in 0.5 M Tris-Hcl (pH 7.5).The reaction was initiated by the addition of microsomal protein (until 30 Lig) andreduction to ferrocytochrome c was monitored spectrophotometrically at 550 nm, at260C, for 3.5 min. A molar absorption coefficient of 21.6 mM-1 cm-1 for horse-heartferrocytochrome c was used.

Geraniol 10-hydroxylase activity was determlned accordjng to Hallahan et al.(1992) and Meijer et al. (1993a) with some modlfications. Briefly, the assay contained50 mM potassium phosphate (pH 7.5),1.2 mM O-NADPH,10 LiM FAD,10 LiM FMN,1.2

mM DTT and 68 pmol [1-3H]-geraniol (1 iJci, American Radíolabeled lnc., cat. ART

428), in a final volume of 25 Hl. The reaction was started with the [1-3H]-geraniol,

conducted at 370C for 10 min. and stopped with 5 ul of 2 M potassium hydroxide andcold 10-hydroxygeraniol (final concentration of 15 mM) was added as carrier. Themixture was then extracted with ethyl acetate and an aliquot of the organic phase wasspotted on a TLC plate. Substrate and product were separated with benzene-acetone-ethyl acetate (2:1 :1, v/v/v) and monoterpenes were visualized with iodine vapor. Theradioactjve band corresponding to 10-hydroxygeraniol was scrapped from the plate andits tritium content was determined by liquid scintillation spectrometry.

lnhibition of the enzyme activities. The capability of the antiserum raisedagainst H. Íuberosus-CPR (Benveniste et al.,1989) to inhibjt the C. roseus-CPR activitywas evaluated indirectly on the CPR-dependent G10H actMty. Microsomes wereincubated for 30 min with the mixture reaction and different amounts of the anti-CPRserum. Reactions were started with [1-3H]-geraniol and the procedure was carried outas described above.

Effect of concanavaline A on /.n y/-fro CPR activity. Microsomes (10 Ligmicrosomal protein) were incubated (1 h) in the presence of diverse quantities (0 -10

ug) of concanavaline A (Con A). Measurements of CPR activity was conducted usingthe incubated samples. ln parallel. microsomes were simultaneously incubated with ConA (10 Hg) and bovine serum albumin or radish peroxidase (10 or 100 Lig each) and thenCPR activity was measured.

SDS-PAGE and immunoblot analysis. Separation of mícrosomal protein wascarried out on 12 % (w/v) denaturing polyacrilamide gels (Laemmli, 1970) using aMiniprotean system (Biorad; separating gel 5 cm long and 0.75 mm thick).Electrophoresis was periormed for 60 min at 100 Volts constant voltage and thenprotein was electrophoretically transferred to a nitrocellulose membrane in Tris-glycine/20°/o methanol transfer buffer for 6 h at 50 Volts. Membrane was blockedovernight with 5% (w/v) non fat milk in phosphate-buffered Nacl (PBS) and then jt wasincubated for 2 h with polyclonal antiserum raised agajnst H. Íuberost/s-CPR or S.b/.co/or-CPR (titer 1:20,000 and 1:5,000 respectively) in PBS-1% (v/v) Tween 20

(TPBS). Non specific antibodies were removed by washing with TPBS (4 times,15 mineach). Goat-anti rabbit lgG conjugated to alkaline phosphatase (GIBCO BRL, cat.19815-018) was used as the secondary antibody (1 :3,000 in TPBS). Membranes wereincubated for 1.5 h at room temperature. After the elimination of excess antibodies,

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immunoreactive proteins were visualized by the usual colorimetric reaction with 4-nitroblue-tetrazolium chloride (NBT) and 5-bromo4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP).

lmmunoblot washing with poriodate. When this treatment was used, thenitrocellulose sheet containing the electrotransferred proteins was blocked as describedabove. The nitrocellulose membrane was exposed to sodium periodate 10% for 75 min.and then washed with 20 mM Tris-Hcl with 1% glycine added (Werck-Reichhart et al„1993; Woodward et al.,1985). The blot was reblocked and immunodetection procedurewas carried out as mentioned.

Protein deteímination. Protein in microsomal preparations was measuredaccording to the procedure described by Peterson (1977), with bovine serum albuminas the standard.

RESULTS

Effect of an heterologous sorum raisod against H. Íubomsus{PR on C.roseus CPF` activity. Geraniol 10-hydroxylase (G10H) is a CPRdependentmonoterpene monooxygenase occurring in C. mseus. The ability of anti-H.Ít/bemsus'sCPR serum to functionally inhibit the corTesponding enzyme of C. mseus was evaluatedindirectly by measuring the effect on G10H activity. As shown in Figure 1, catalysis ofG10H was affected by the antiserum in a concentration-dependent manner, reaching amaximum of 80% of inhibition. GIOH activity was not further inhibited by anti-CPRserum despite raising its concentration in the assay. A control test was carried out inparallel using the pre-immune serum bled from a rabbit before its immunization withCPR. Similar concentrations of protein from pre-immune serum produced no effect onG10H activity.

lmmunor®action with C. /oseus microsomal protoins. Heterologous anti-CPRserum actually inhibits the C. mseus CPR activity since it was able to inhibit the CPR-dependent G10H activity. ln order to identify the CPR from C. mseus roots, themicrosomal protein obtained from J1-hairy root line was subjected to immunoblotanalysis and probed with anti-CPR serum. Surprisingly, not a single, but twodistinguishable immunoreactive polypeptides were recognized by this antiserum (Fig.2(8)). Developed bands sliowed close mobilities in the gel with apparent molecularmasses of 84 and 87 kDa respectively. There was no non-specific reactivity with thepre-immune serum (Fig 2(A)) showing that the antiserum was responsible for the cross-reaction with these distinct polypeptides. To confim this immunoreactive profile,another polyclonal serum raised against other plant CPR was also tested. lmmunoblotsconducted using an antiserum directed against S. bí.co/or-CPR also displayed a pattemof two polypeptides, and the cross-reactive bands corresponded to the samerecognized by serum against H. Íubemsus.s-CPR (Fig. 2(C)). This result demonstratesthat both polypeptides really share some common features with CPR.

Non-specific immunogenic reaction (cross-reactivity) of polyclonal antiserum withplant samples usually results in the recognition of high antigenic glycan side chains onglycoproteins (Werck-Reichhart et al., 1993; Woodward et al„ 1985). We furtheranalyzed whether antigenic sugars, in addition to protein epitopes, contributed to theimmunopattern obtained for CPR of C. mseus. The immunoblot was subjected toperiodate treatment according to the procedure described in Material and Methods.

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Periodate produces chemical oxidation of sugar motifs and eliminates the non-specificcross-reactions produced by them (Werck-Reichhart et al„ 1993). However, even in thiscondition, both proteins were still immunoreactive and they were immunostained (Fig.3), suggesting that epitopes wHch are recognized by the antiserum are of polypeptidicnature.

0 §0 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Ant¡CPR s®rum (pg)

Figure 1. lnhibltory offoct ol antl|H. Íub®rosus€PR) Sorum on GIOH activity. Microsomes (5 ug)were incubated for 30 min at 37°C Ín the presence oÍ antiserum and jts effect on C. n?seus-CPR activitywas Índirectly determined measuríng the residual CPRdependent-GIOH activity Activity is expressed as

a percentage of the control incubations with the buffer, which was 12.8 pKat mg protein-1 (D)` A parallelexperiment was conducted incubating microsomes with serum bled from a rabbít before immunizationwith CPR (.). (0) correspond to another pre-immune serum included as control.

Since the occurrence of two crossreactive proteins is not explained by non-specific recognition of glycan residues. we then explored whether it could be explainedby proteolytic degradation of the largest polypeptide. The inhibitor for thiol and serineproteases, leupeptine, lias been largely used to protect plant P450 proteins due to itseffectiveness. Leupeptine was included in the buffers at a concentration of 5 Hg.ml-1. lnaddition, buffers also contained 1 mM EDTA (for metalo-proteases) and 1 mM PMSF(for thiol proteases). To determine whether the CPR immunopattern varies in relation ofprotease inhibitors, the concentration of leupeptine was increased 10 fold. The profilewith two distinct immunoreactive polypeptides showed no variation when leupeptinewas used at 50 Hg.ml-1 (Fig. 4A, lane 2). The effect of the total exclusion of proteaseinhibitor was also tested. ln this case, three cross-reactive bands were detected (Fig.

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4A. lane 3), two of them corresponding to polypeptides immunodetected .in the otherimmunoblots. A new band probably results as proteolytic product from some of the otherpolypeptides. A band of similar mobility was visualized in the fractions of solubleproteins prepared with protease inhibitors-free buffers (Fig. 48). lt seemed tocorrespond to the membrane anchor-free CPR protein.

ABC

kDa135.0 r81.0 >

41.9 >

31.4 +

18.0 r

6.9>

Figur® 2. lmmunoblot analysi3 of CPR in C. n)8ous. Hairy roots were extracted in the presence ofEDTA 1 mM, PMSF 1 mM and 5 Lig ml -1 leiipeptine. Microsomal protein (70 Hg/ lane) from the 150,000x g pellet was separated by SDS-PAGE on 12% gels, transferred to a nitrocellulose membrane andprobed with the preimmune serum obtained from blood of a rabbit before the immunization withH fubemsus's-CPR (A), with polyclonal anti- H tubon?sus's CPR serum (8) or a polyclonal antiserumraised against CPR from Somnum Ó/co/or (C). Dilution of each antiserum was 1:20,000 and 15,000respectively Pre-immune serum was diluted 1.20,000 Experiment was done by triplicate.

To prevent proteolytic degradation during extraction, samples were also ground

under liquid nitrogen, and hot (950C) SDS-PAGE Laemmli-sample buffer (Laemmli,1970) was added to the frozen flour. The extract was then boiled for 10 min andcentrifuged at 1,500. x g for 15 min. lmmunoblots conducted using the supernatantshowed an identical pattern of two forms of CPRs (data not shown), indicating that thesecond form of CPR is not produced during the preparation of samples. These resultsstrongly support the natural occurrence of two distinct forms of CPRs in C. n]seus roots.lmmunoblot analysis of roots from field-grown plants also showed two forms of CPR(Fig. 5A, lane 1). Therefore C. mseus roots contain two forms of CPRs, with apparentmol. masses of 84 and 87 kDa.

59

AB

kDa

135.0 >

81.0 >

41.9 >

31.4 >

18.0 >

6.9>

Figur® 3. Immunological detection of CPR in C. roset/s. Microsomes from C. roset/s hairy roots (70

ug) were subiected to electrophoresis on a 12% discontinuous SDS-PAGE gel and transferred to anjtrocellulose sheet Before cross-recognition with the antlserum the blot was submitted to soclium

periodate treatment (8). Panel A, control blot, Ímmunodetected as routinely done. Experiment was doneby tríplicate.

kDa135.0

81.0

41.9

31.4

18.0

123

Figure 4. Effect o. protease inhibitors on th® profile of C. roseus-polypeptides cross-reacting wjthan antisorum raised against the CPR. Grinding and re-suspending buffers used for preparation ofmícrosomes contain EDTA 1 mM, PMSF 1 mM and 1 mM DTT The protease inhibitor leupeptine was

added at 5 Hg ml -1 (Iane 1), or 50 Hg ml -1 (lane 2). Leupeptine-free buffer was used in lhe preparationof microsomes analyzed in lane 3 Figure 8 corresponds to analysis of supernatant obtained at 150,000 x

g. In this case the buffer con(ajns no leupeptine. Experiment was done by duplicate

60

Comparison of different tissues. Leaves, flowers and stems of plants grown .inthe field were extracted with buffer containing 50 L.g.ml-1 leupeptine. Microsomal proteinwas electrophoresed and blotted to detect CPR protein. ln leaves, stem and flowers, asin roots, not a single but at least two d.istinct polypeptides reacted with the anti-CPRserum (Fig. 58). Similar to roots, a pattern with two cross-reactive polypept.ides withapparent molecular masses of 84 and 87 kDa was found in the stem. A distinct profile ofCPRs was found in leaves and flowers ln these tissues, polypeptides cross-reactingw.ith the antiserum were of higher mobility. Therefore two different immunotypes werefound in C. roseus. Stem and roots showed a profile of "high molecular masses orlarge"-CPR forms and leaves and flowers have an immunopattern of "low molecularmasses or small"-CPR forms.

12

Figure 5. lmmunoblot analy§is of tlssues from C. mseus fieldiirown planb. Panel A, roots (lane 1)and hairy roots (Iar¢ 2). Panel 8, Iane 1, flower§, lane 2, stem, Iane 3, leaves Tissues were harvestedfrom plants grown in the field and microsomes were prepared by grinding and re-suspending the buffers

with the addim of EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM and leupeptine 50 Hg mrl. Experiment wasdone by triplicate`

lnhibition of CPR activity by concanavaline A. To explore whethertranslational modification by glycosylation could be occurring w'ith C. roseus CPR, weanalyzed the effect of the mannose-glucose-binding lectin, Concanavaline A, on theCPR activity. After incubation of the microsomal proteins with the lectin, the CPR activitywas dramatically inhibited. More than 50% diminution was produced when lectin was

61

present at 19.2 nM and the activity was totally abolished when lectin was increased at192 nM (Table 1) The effect of Concanavaline A not only was dependent on theconcentration of lectin, but it was also dependent on the incubation time wíth theConcanavaline A Ninety six nM of Concanavaline A produced 62% inhibition wheni'ncubation was carried out for 30 min, but with this amount of lectin, the activity wasdecreased 86% when incubation was for 60 min. Likewise, 192 nM lectin producedcomplete inhi`bition after 60 min but a residual activi.ty of 19°/o was measured after 30min of incubation Control experiments carried out incubating the lectin-free microsomes

for 30 or 60 min at 370C showed the same activity as samples without incubation (Table1), indicati.ng that the loss of acti.vity was not produced by the incubation itself. Similar orhigher (15 fold) amctunts of bovine serum albumin (BSA) were not able to interiere withCPR activity ldentical results were also found using radish peroxidase (Table 2, bottomtable), implying the disturbance on CPR catalysis was a specific effect produced by thelectin.

Tabl: 1. Fffect of Concanavaline A on C, roseus-CPR activity. Dose-dependentand time incubation[uDatlon-qepenaent lnnlDltory errect.

Concanavali.ne A (nM) 30 mln 60 mininhibitíon iJnhib,tjon

(%) (%)

0 0 0

19.2 34 60

48 - 73

96 62 86

192 81 100

dependent -

Microsomal protein (10 Hg)was incubated with Concanavaline A in Tris-Hcl 25 mM, Nacl 015 mM,

Cac12 1 mM, Mgc12 0.5 mM, pH 7 5 lncubation was conducted at 37°C for 30 or 60 mín, and then CPR

activity was quantified using cylochrome c as substrate, according (o the methodology descrtbed inMaterial and Methods. Lectin-free CPR activiv was set at 100%.

To determine whether the effect of lectin on CPR activity is reversible, acomparable experiment was conducted incubating simultaneously the microsomalprotein with lectin and glycoproteins (BSA and HRP) (Table 2). BSA was able tointerfere with CPR actívity inhibition produced by the lectin. When BSA was added at303 nM, only 14% of the CPR activity was recovered. However, when it was used at3.03 HM BSA actually prevented the inhibition on the CPR activity. As previously

pointed out, BSA alone produced no effect on CPR activity Protection of CPR activityby BSA can be explained by the interaction of lectin with BSA

62

Table 2. Effect of glycoproteins on C. roseus-CPR activity inhibition byConcanavanine A

Microsomal pr

Treatment Ac''v'tv (%) lnhLbition(°/o)

oncanavaline A

Control 100

+ 192 nM Concanavaline A 0 100

+ 192 nM Concanavaline A +454nMDeroxldase 0 100

+ 192 nM Concanavaline A +454uMDeroxidase 35 65

+ 192 nM Concanavaline A +303nMbovineserumalbumin 14 86

+ 192 nM Concanavaline A +3.03uMbovineserumalbumin 93 7

Treatment ActMty (%) lnhíbition (%)

No addition 100 nd

+ 454 nM oeroxidase 100 r\d

+ 4.54 uM peroxidase 98 nd

+ 303 nM bovine serum albumin 100 nd

+ 3 03 LLM bovine serum albumin too nd

tein (10 pg) was smultaneously incubated for 1 h a( 37°C with 192 nM Cand different amounts of bovme serum albumin or horse radish peroxidase, and CPR actMty wasdetermined Bottom table corre§pond to the contro s in which ttie effect of some glycoproteins, in the

absence of Concanavaline A, were evaluated on CPR activity nd, not detected.lnthecaseofhorseradishperoxidase(HRP)nointerference was observed

when it was used at 454 nM However, at 4.54 LiM HRP produced a recovery of 35% ofCPR activity. As with BSA, peroxidase alone had no effect on CPR activlty (Table 2),

suggesting both proteins no interact directly with CPR or its substrate.63

DISCUssloN

lmmunoblots of C. mseus hairy roots showed two electrophoretically distinctpolypeptides cross-reacting with an antiserum directed against a plant CPR. A numberof control experiments show that both polypeptides are actually related to the CPRenzyme.

First, as the pre-immune serum was not able to inhibit CPR catalysis, at least oneof these polypeptides has to be a CPR. Second, as no reaction was observed with thepre-immune serum, then antibodies occurring in the antiserum are responsible forcross-recognition of these polypeptides. Third, other antisera against other plant's CPRalso produced the same immunopattern, thus ruling out the possibility that one of theimmuno-detectable signals would be a particular cross-reaction to one of these anti-CPR sera.

Multiplicity of CPR polypeptides have been found previously in C. roseus but theywere attributed to proteolytic degradation of one large protein. ln the present report,isolation of microsomes either with or without protease inhibitors suggests that bothpolypeptides occur naturally in the tissue. The extraction of proteins under denaturingcoÍ`ditions with boiling Laemmli buffer (whi.ch inactivates proteases) confirmed that noneof these polypeptides was produced during sample preparation.

Furthermore, immunoblot analysis of roots from field-growing plants alsoindicates that C. mseus roots contain two electrophoretically distinct CPR forms.Analysis of leaves, stem and flowers of C. roseus plants growing in the field revealed amore complex polymorphism of CPR forms, comprising two immuiiotypes. Stem androots share a similar profile with "large" CPR forms, whereas leaves and flowers show adistinct pattern of "small" CPR forms.

Occurrence of multiple CPR forms in C. noseus is not an exceptional fact. Thepresence of multiple CPRs has been reported in Jerusalem artichoke (Benveniste et al.,1991), parsley (Koopmann et al„ 1997) and Arab/.c/ops/.s (Mizutani and Ohta, 1998;Urban et al„ 1997). Probably other plants also contain diverse CPRs, on the basis ofthe multiplicity of CPR peaks observed during purification, as found in petunia (Mentinget al.,1994), or by the number of immuno-detectable bands on immunoblot, as in sweetpotato (Fujita et al.,1985) and mung bean (Shet et al.,1993).

According to Meijer et al., (1993b), CPR is encoded by a single gene in C.Joseus. The discrepancy between a single gene and the number of immuno-reactivepolypeptides detected in the present work could be explained by post-translationalmodification of the original polypeptide. Glycosy!ation of CPR has been demonstrated inmung bean (Shet et al.,1993), Jerusalem artichoke (Lesot et al.,1995) and tobacco(lmaishi et al.,1995) and it was suggested for parsley-CPRs (Koopmann et al.,1997)and Arabidopsis-CPRs (Mizutani and Ohta,1998). We explored this possibility for C.roseus-CPRs and found that Concanavaline A Ínhibits CPR activity, implying that C.mseus-CPR could also be a glycosylated protein.

The physiological relevance of plant CPR-glycosylation remains to bedetermined, but it has been suggested that it could be involved in subcellular targeting(Lesot et al ,1995). The enzyme G10H occurring in C. roseus is one of the first P450-containing proteins identified in plants, and jts dependency of CPR is well established

64

(Madyastha et al.,1976; Meijer et al.,1993b). Interestingly, G10H is located in vacuolesrather than in the endoplasmic reticulum, as the bulk of P450s (Madyastha et al.,1977).These apparent contradictory facts could be explained if a vacuolar-CPR exists in C.rosem However, no information indicating vacuolar localization of C. roseus-CPR isavailable at present. lmmunolocalization of C. roseus-CPRs or carefully isolation ofintact, endomembranes free-vacuoles could help to solve this question.

Knowledge about the physiological meaning of multiple CPRs in plants is stmlacking. At present there are only few repohs about poss.ible functions of the differentCPR forms. In Jerusalem artichoke, for example, three CPR forms have been identifiedand they showed differential expression after wounding (Lesot et al..1995). ln addition.in parsley (Koopmann et al.,1997) and in Arabi.dops/.s (Mizutani and Ohta,1998) twodistinct CPR-genes have been found. ln both plants the two CPR-genes are expressedin all tissues, but only one of them is responsive to different stress conditions. Thesefindings suggest that some plant-CPR-isofoíms could be committed to mechanisms ofdefense and others could ha`/e a housekeeping role. To date we do not have anyinformation regarding the physiolog.ical functions of several CPR forms in Caíham"roseus, but there is a possibility that they can partic.ipate in the metabolism deriveringelectrons to d.ifferent P450s, which also can be under tissue-specific regulation. Forexample, the tabersonine 16-hydroxylase -which .is involved .in the biosynthesis of theAsp/.dospema alkaloid, vindoline-is abundant in leaves but poorly present in roots andabsent in the stem (St-Pierre and De Luca,1995). By contrast, G10H activity was foundto be higher in roots than in the aerial parts (Meijer et al.,1993d). Therefore, some ofthe CPR forms occurring in the leaves could be supplying electrons to tabersonine 16-hydroxylase while some of the root-related CPR forms couW be supporting the GIOHactivity. Another possibility, as mentioned before, is differential subcellular locations ofCPRs which could be interacting with particular P450s

Much remains to be leamed about C. roseus-P450s and -CPRs. Ava.ilability ofspecific antibodies and specific probes are necessary to distinguish their tissueexpression patterns, the.ir subcellular compartmentations, their possible cross-interactions, the mechanisms governing their regulation, etc. ln addition, because of the

. complexity of C. roseus-P450s] this plant is a promising model for improving ourfundamental understanding of plant P450s.

Acknow/edgmenís. This research was supported by the Consejo Nacional deCienciayTecnolog`adeM,éxico(CONACYT,GrantNo.225135-54023N)B.B.C.C.wassupported by a CONACYT studentship (fellowship No. 88210). The authors arespecially grateful to Dr. lrene Benveniste from CNRS-Institut de Biologie Moleculairedes Plantes, Strasbourg, France, for her generous gift of ant.iserum against He//.aníhusfubemsus-CPR, and also with Dr. Barbara Ann Halkier from the Plant Biochem.istry lab„Royal Veterinary and Agricultural Un.iversity, Copenhagen, Denmark, for the antiserumagainst Sorghum b/.co/or-CPR.

65

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68

goraniol 10-roseus hairy

CAPITULO 111

Non.oordinated response of cylochrome P450dependen.hydroxylase and NADPH: Cy{ c (P450) reductase in Calharanmr-Óóts u-nder different conditions.

E,xopned,YmeBn,a,Cacn::i:oandceh:nvaensi,gavci,3tnorc,:nt,fiTcoayoá:-vyaurg:tsá'n,Xn,dpad87:eco:áo:omg::97310, Yucatán, México.

Thischapterwaspublished.inPhyton(2000)66:183-190.

ABSTRACT

To obtain basic information about the regulation of the enzyme•L^ L.^h-`,.,^r ^f thi< f>n7vme and its redox partner -the NADPH:the behav.iorofthisenzymeancHtsieuu^tjcii„" ...v .... _. _ . `was examined in Caíharanfhus roseus haiv roots subjected to various treatments. For

::¥::a,g:fn:hr:,:er:rdeuacttT::t#ansomc:rnec:::gornes:::nt¡::oáteótEerT::#Ses,:,eeremoebasn#this finding is discussed.

KEY WORDS

:o::s:hé:Th:r:n4f#,s::::::o,1o-hydroxy,ase,monooxygenase,P4"reduc-ha,"

ABBREVIATIONS

fpe4r33)or,e,d:-á:g:oí#S;,,:::oHt,érgeAnDe::doc,:oafkhaTOT%i#,%(sccrs,:4a5c:!,,cA"BOAC,hrome

lNTRODUCTloN

CytochromeP450isactuallyalargefamilyofheme-thiolateproteinsoccurringin

;;cTr,¡í:s:::g¡T:s,¡,hy::n:;tts#:,n#;e,s:¡§c:t:s;:,,aD:#:e:b,Vh:o:£e:;:a:3¡:s#sSpecificplantP450sareinvolvedinthebiosynthesisofaplethoraofsubstancessuchasphenylpropanoids,gibberelins,brassinosteroids,iasrmmacid,alkaloids,pigments,tse:R:reer:,1Pghg"6il:le¿:nt;,,;,:!feoarcrt:v::::re::ed,ast::eb,:oi#:t::éldg,::;s:h:R3'e,,n`ciugdsé

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:;d5r°oxy::::Fessho:e:P'tceon:heeJrat,C:gh:yatai#:c`SemeFheat:Ps°tc#`°u?,i,Zep'aAtDpPÍ5:;

69

geraniol 10-hydroxylase,Cyt c (P450) reductase-

reductively cleave and activate mo'ecular oxygen; one atom i.s introduced into {he

;ásst,rai;e`cTr-oHn'saf::mth#hpeHr:reet|Sanr:fde::eeddttoocw"at:|ágube,nguFÁCDh,[tgN9-::n|:í:,,::reductase, the cn P450 reductase (CPR, E.C.1.6.2.4). Interacti.on with this redoxpartner is an obligatory requi.rement for biologi.cal function of au classical P450 mono-oxygenases.

Mechanisms regulating mammalian P450s have been extensi.vely studi.ed i.n thelastthreedecades(GonzalezandNebert.1990)ControlofmammalianP450sismainlyat transcriptional level bw they are also modulated post-transcriptionally, traslationallyand po§t-traslationally, by protein stabilizatjon or degradatjon (Porter and Coon 1991,.Saimmaime et al , 1999 In contrast, regulation of plan{ P450s tias been studied only

Le::;t'fyacfotBpr:uS:hnta':,;okunnodT:gth,:trapn,:nétca|,pígg:.aLr:s:r,a::C:,,P,t,T£,;y,,,nhde:g:cíd::

Spu::f,nest:,n:,Sg¡;,'ee,,,c,,t:,::i,,;rkoaThh,::gai,:t,ogrs7(Douhteateat,á,|,9,995ó79hpt:,heágae,n,a|ftgagc7Í(Saimmai.me et aL 1991), light (Ohta et al.,1997; St-Pierre and De Luca,1995) andheavy metals (Funk and Croteau, 1993). They can also be regulated by thedevelopmental state of the plan{ (Pelletier and Shi.rley, 1996). lnformation aboutregulatov mechanisms other than transcripti.onal control is not yet avai.lable for plantP450s.Considerableeffofthasbeenspentonthestudyofplantc*P450s:muchlessis

::ocw„n;e4g5aordr,engguE|::;::5copr#ecgt:,sa:,omn,dbuu,ta,Lodnépaennddemn:sáfweoar5hh:tsh::cásn:;:,tftewrstudies have simultaneously analyzed both proteins.

Geranid 10-hydroxylase (GIOH, E.C.1.14.14), a classical P450 hydroxylase,which calalyzes the C-10 mono-oxygenation of geraniol to 10-hydroxygeraniol. amelabo%enrioufetomonoterpeneindolealkalojds(MIAs)biosynthesis(MadyasthaetaL 1976; Meehan and Coscia, 1973). Many MIAs are used in medicine;pharmacologically, the most important of these are vincristir® and vinblastine, twopotentcytostati.csusedasanti.leukemicagents.lns{udiescarriedout/.nv/.fnoonculturesof apocynaceous plants G" catalyze the first commi.tted step in MIA biosynthesis(Meijer.1993;Meijeretal.,1993a;Schieletal.,1987).Noalkaloidswereproducedin/.nvhculturelineswheretheG10Hactivityhadnotbeendetected,evenwhenotherkeybiosynthelic enzymes were present. When these cultures were transferred to MIAsinducti.on media, both G10H acti.vity and de novo production of MIAs were detected(Meijer, 1993; Meijer et al.,1993a). In addition, factors, which i.ncrease or decreaseG10H actMty produce an equivalent effect on MIAs production (Schid et al , 1987)AlthoughG10HwasoneofthefirstP450mono-oxygenasesidentifiedinplants.preciseknowledgeofikregulationislacking.Thispaperreportsanexami.nati.onofG10HandCPRactivities(inparallel)inhaivrootsofCafharanfhusroseus(Apocynaceae)uponvariouslrea(menbcreditedwi.thsti.mulatingMIAaccumulati.oninC.roseus(Knoblochetal.,1981; Schiel et al.,1987; Vázquez-Flota et al„ 1994).

MATERIALS & METHODS

Bteog.dñficga,r=gs,.wr:,`ah,.AHqar%a'gtoe,n,,,Jnme#,7W^ansanprev,,\o'uLS_,_ye_s_`a-P"shedby,nfect,ngcn)semseed"roo{swithAgrobacfen.mrií.zogenes(Vázquez-Flotaetal.,1994).The

70

Jl line was maintained by .inoculating 0.5 g of fresh tissue in 100 ml of sterile.phytoregulator-free Gamborg's 85/2 medium (Gamborg et al..1968) plus 3% sucrose.Subcultures, carr.ied out every 14 days were kept in darkness on shakers at 100 rpmand 25oC. Roots on day 24 or day 30 of the culture cycle were treated independentwwith 5 LiM zeatine, m " abscis.ic acid, 0.1% macerozirne, haw strength P-free 85mediumorhalfstrength85mediumwith8%sucrose.AHtreatmenüwereconductedintriplicate. In addition, an Aspergi.//us n/.ger homogenate (1.8 mg glucose/ml medium)was applied in two flasks of 24 day-old root cultures. Roots on 3% sucrose mediiimwereharvested96haftertreatment;thoseon8%sucrosewereharvestedafter7days.Harvested tissue was frozen .in liquid N2 and ground in a mortar. The resultant powderwas mixed w.ith 50 mM Tris, 1 mM EDTA at pH 7.5, w.ith 1 mM dithiotre.ithol (DTT), 1mM phenylmethylsulphony fluoride (PMSF) and 5 ug/ml leupeptine. The extract wasfiltered through cheesecloth and centrifuged at 1,500 x g for 15 mim The supernatantwasrecoveredandcentrifugedat150,000xgfor60min.Themicrosomalfractionwasresuspended in 50 mM Tris buffer, pH 7.5, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 ug/ml leupept.ineand 20% (v/v) glycerol (Hallahan et al„ 1992).

GIOHassay.G10HwasassayedasreportedbyHallahanetal.,(HallahanetaL1992) and Meijer et al., (1993a) with some mod.ifications. Briefly, the reaction mixtureconta.ined 50 mM potassium phosphate, pH 7.5,1.2 mM B-NADPH, m uM FAD,10 tiMFMN,1.2 mM DTT and 68 pmols [1-3H|-geraniol (1 Lic0 in a final volume of 25 ul. After5-10 min, the reaction was stopped with 5 tJl of 2 M potass.ium hydroxide. Cold 10-hydroxygeraniol was added (to a final concentration of 15 mM) as carr.ier.Monoterpeneswereextractedwithethylacetateandanaliquotspo"onaTLCplate.Authentic standards of monoterpenes were also spotted on the chromatoplates anddeveloped with benzene-acetone-ethyl acetate (2" v/v/v). Monoterpenes werevisualized with iodine vapor the radioactive band corresponding to 10-hydroxygeraniolwasscrapedfromtheplateand.itstritiumcontentwasdeterminedbyliquidscint.illat.ionspectrometry.

CPR a§say. CPR activ.ity was assayeo usiHg uii ti,v, ,.„ v,.v_..._. _ _art.ificial substrate. The reduction to ferro-cytochrome c was determinedspectrophotometricallyat550nminthepresenceof0.15mMl}-NADPH,0.5mMKCNand 5 uM antimycin A (Lord,1988), in a final volume of 500 Lil. A molar absorptmcoefficient of 21.6 mM-i cm.i was used to calculate the concentration of reducedcytochrome c.

Protein determination. Protein content was estimated by the Peterson.s (1977)assay.

RESULTS

Figure 1 shows G10H and CPR responses to treatments applied on 24|]ay-oldJlcultiires.CPRactivitywasenhancedbyautreatments,exceptzeatine,whichhadnoeffect (Fig. 1A). Different degrees of change in CPR actMV were observed withd.ifferenttreatments.Withfungushomogenate,macerozyiTwandP-freemediummodestincrements 50 -75% over the control, were obta.ined. Higher increments (enhanced to250%) were produced by ABA or 8% sucrose. lnterest.ingly, no identical behavior was

71

assayed using 50 LiM ferri-cytochrome c asJ_L_-_:__^

found with G10H activity, whi.ch increased either on P-free medium or on 8% sucrose(Fig.18). Although CPR actvity increased 157% by adding ABA and 72°/o with thefungal homogenate, these treatments had no effect on G10H activity. Moreover, whilezeati'ne produced no change in CPR activi.ty, it i.nhibited G10H activity by 50%.However, as wjth CPR, m highest increment in G10H activity (200°/o) was observedwith the 8% sucrose medium.

Treatments

Flguro 1. Chanoes in tho aclivitios of NADPH cyt P450 reducta§o (CPR) and geraniol 10.hydroxylase (GIOH) from " C. mso% J1-hairy roots upon different lreatments. The experiment

;eaast,nceo.ng.ctt:fn:fner2,4odBa5y,2ooj-ecdu,';umreá:j::vaetdm:,tsh:gB,|::o:s:reM,Aó,,o;.omuaTe:.b;cts:?,aMC:d`,azis,5e,u,:alkaloid induction medíum (85 /2 medium plus 8% sucrose) and F, fungus homogenate addition

(equivalent to 1 8 mg mH glucose). Except lM, wmch was harvested 7 days after transfer, aw treatmentswereharvestedafter96hActivitiesofcontrols(C)were132nKatmgprotein-]forCPRandt319pKat

mg protein-1 for G10H. The results represent the mean of lhree independen( expei-merits, excep(elícitation wm fungus homogenate wmch was carried out in duplicate Error bars represent the standarddevjations. Significance level, P < 0.05.

In experimenk assessed on day 30 of the culture cycle, the highest activityincrements of CPR activityresulted from addi.ng ABA or 8°/o sucrose (Fig 2A) and wi.thP-free or with 8% sucrose for GIOH acti.vjty (Fig. 28). Both activities were greatlyenhanced wi.th 8% sucrose, as observed before, though the pattem of response of J-1roots was similar, but not identi.cal. in 24 or 30-day cultures; zeatine had no effect onCPRactivityonthe24-daycultures,butWenhanceditby87%in30-dayoldhawroots.likewi.se,0.1°/omacerozyme,whichliadnoeffectonGIOHactivi.tyonday24,i.nhibitedthisactivitybyamodestbutsigni.ficant20%onday30(Figs.18&28).

72

Figm 2. Changes in the aclivities of NADPH cW P450 roducú# (CPR) and goranid 10-hydroxylase(G10H)fromtheC.rosei/sJ1.hai~rootsupondiffomm{roatmen®.Theexperimem

:eaast,::,n.dpu,c::adnsof:r::g:y2r:oé_d::;urdeesórí:::,:fe:;sosapphp:::tsTeMr:ottyoí&oa£¥oz::Sec,:Lcdí#mzÁs¡eru%alkaloidinducmmedium(85/2mediumpliB8%sucrose)ExceptlM,whichwasharvested7daysaftertransfer,aHtreatmentswereharvestedafter96hActivitiesotcontrols(C)were1.58nKatmgprotein-1forCPR and H 93 pKat mg prow for GIOH, respect.vely The results represent the mean of threeindependentexperimentsErrorbarsrepresentthestandarddeviations.Significarmlevel,P<0.05.

To distinguish the response pattern of CPR and G10H activit.ies in the W line,therelationshipbetweenthechangesoftheseactivitieswasestimated(calculatedovertheirrespectivecontrols):itwasgreaterthanunwformostofthetreatments,indicatngtahpa:,,:::na:::,tJy-;S,::r:nrteesrg:tl:;V,;,ttahnenG:ooolsa:t:t:yéuaáJ`eecat:td,1othse%S3tu::á:eeatoT:ontÉ

starvatiom both activit.ies were affected in a similar manner in roots cultivated for 24 or30 days, the relat.ionships were close to un.ity (Fig. 3).

DISCUSSION

OnlyafewstudieshaveexaminedthebehaviorofaP450-enzymeinparallelwithCPR, and the reports are controvers.ial. While CPR is induced by factoB which inducecWP450,(Benvenisteetal.,1977;Fujitaetal.,1982;Lesotetal„1990).Loerwaldetal.(1996)reporinochangesinchickpeaCPRact.ivitysubjectedtofunguselicitationorwi{haddedMnc12,althoughbothtreatmentsinducecWP450inthisplant.SimilarüAlanietal.(1990)foundCPRactMtyduringgeminationofcastorbeaneventhoughc*P450was undetectable. ln the H line we observed coordinated responses (CPFVGIOH

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relati.onship close to uni.t» as weH as uncoordinated behavior, depending on thestimulus used. Moreover, the same factor could produce li.ftb or no effect on theseenzymaticactivitiesdependingontheageofthetissue.Thisisnotsurprising,becauseage is an jmportant factor in determini.ng the responses of tissues and plants (Aerts etal., 1994). H seems that respon§es of CPR and P450 to a specific condition i.s notun versal. H may vary from plant to plant. Furthermore, it may depend on the tissueanalyzed and its specific physiological status, whi.ch could explain previously reporteddiscrepancies in the regulation of CPR/cyt P450.

Fh3.RatmofCPIVG10Hresponsos(oachwithregardloltscontrol)inC.roseushairyrootsat

iíegtamyecn¥!t::::e(¿e#e?eanAe,')i33duata3b°scq:,%::,'Ír2:S5(;'#hz'e:t:nne:').pS,UtFj::!:rdt:°B:'/ff2e:eend',uC:ndde¡;'r?vnesdofphosphorousM,0"/omacerozimeandIM.transfertoalkaloidinductionmedium(85/2mediumplus

8% sucrose)

ln " JI line CPR activity was generally more responsive than GIOH (Fig. 3). Apossible explanation i.s the occurrence of rapi.d i.nactivation of G10H by sometreatments, for example ABA or zeatine. Recently, protein inactivati.on has beensuggested for the Jerusalem artichoke's P450 dependentúans-cinnamate 4-hydroxylase effect upon treatments producing oxidative stress (Batard et al., 1997).However, G10H activity of crude microsomes was largely stable for at least m monthsat -80°C (data not shown).

Several treatments enhanced CPR activity but not Gm activity in the JI line,suggesting that in C. roseus CPR may have physiological functions other than thereducti.on of GIOH. There are two reports of multiple P450 cDNA clone§ in theApocynaceae (Mei.jer et al.,1993b; Vetter et al.,1992). Although none of these cloneshave been identified as GIOH, many of them increase wi{h conditions, which enhance

74

MIA prodiiction. Therefore, an alternative explanation for the "excess" of CPR actMtywould be its interaction with other classical P450s probably occurring in C. mseus roots.Since CPR .is assayed with non-authentic substrates, contributions to cyt c reduction byother membrane-bound, antimycin A-resistant reductases (Moller et al., 1995) cannotbe ruled out.

At present much rema.ins to be leamed about regulatm of plant cyt P450complexes.FormostofthecDNAproductsthatencodeplantP450s,"physiologicalfp|:::'°pn4S5oasrearset`:v:|:E:ewnAVL:,aabq,tt';'°o?'thvees#owchaen#Pc°aí'teoso,8'::Cnt:£:#orsfpuehchfi:Cr

exploration of the mechanisms governing plant P450s.

Acknow/edgments. This research was supported by the Consejo Nacional de

Súepnpc::eydTbeycna°í%%aw8:,#rx::°¿Co°NNAAc?¥T.Ng:a%t8¥:o22w5:3t::#°;?cN)L:bBe.t?.%.a:ta:for supplying the A. n/.ger culture used in this paper. The authors thank Dr. TeresaHernández and Dr. Felipe Vázquez for the revision of the manuscript.

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77

CAPITUL0 IV

Characterization of a polyclonal antiserum against the monoterpenemonooxygenase, geraniol 10-hydroxylase from Cafharanfhus roseus

Canto-Canché Blondy 8. 1, A. H. Meijer2, G. Collu3, R. Verpoorte2 and Loyola-Vargas

V. M. 1 1Centro de lnvestigación Cientifica de Yucatán, Unidad de BiologíaExperimental, A.P. 87, Cordemex 97310, Yucatán, México. 2 lnstitute of Molecular PlantSciences, Clusius lab., Wassenaarseweg 64, 2333 AL, Leiden, The Netheriands.3Leiden lnstitute of Chemistry, Gorlaeus Laboratories. Leiden University: Einsteinweg

55/ P.0. Box 9502 2300RA, Leiden The Netherlands.

This chapter is in preparation to be submitted.

KEY WORDS

Cytochrome P450, geraniol 10-hydroxylase, monooxygenase, P450 reductase, hairyroo\s, Catharanthus roseus.

ABBREVIATIONS

Geraniol 10-hydroxylase (G 10H)., cytochrome (P450) reductase (CPR); avocado relatedP450 protein (ARP); Í-cinnamic acid 4-hydroxylase (CA4H).

lNTRODUCTION

Monoterpene indole alkaloids (MIAs) comprise a large class of naturalcompounds occurr'ing in a few plant families. The Apocynaceae Cafharanthus mseusproduces more than 100 alkaloids and many of them have pharmacological value. MIAbiosynthesis involves condensation of tryptam.ine (the decarboxylated product fromtryptophan, step med.iated by the enzyme tryptophan decarboxilase or TDC) and theiridoid secologanine -coming from mevalonate by a not totally elucidated route.Condensation of tryptamine and secologanine is catalyzed by the enzyme strictosidinesynthase (SS), forming the glycoalkaloid strictosidine, the universal precursor of all MIA.An apparent yield-limiting enzyme in the TIAs biosynthesis is geraniol 10-hydroxylase(G10H), which catalyzes the C-10 oxygenation of geraniol producing the 10-hydroxygeraniol, a metabolite í.n roufe to secologanine. For its requirements of NADPHand molecular oxygen, this enzyme was classified as a P450 protein. Although G10Hwas one of the first plant monooxygenases identified as P450 (Meehan and Coscia,1973), very little is yet known about this enzyme, particularly regarding the mechanismswhich govern its regulation, contrasting with other major enzymes of MIAs biosynthesis.Plant P450s had been more elusive to work than mammals P450s because .in plantsthey occur sometimes in negligible amount, thev are rapidly inactivated duringextraction and multiple compounds could interfere .\ the assays (Bolwell et al.,1994).Using different approaches several groups had aft `rupted to clone the cDNA encodingG10H unsuccessfLilly (Mangold et al.,1994; Meijer et al„ 1993b; Vetter et al.,1992).Recently it was proposed that one cDNA clone from Nepeta could codify for GIOH

79

(Clark et al.,1997) but it still remains to be definitívely established G10H has beenpurifíed from a C. roseus ceH suspension cullure (Meiier et al ,1993a) ln the presentpaper we repori for first time the characterization of a polyclonal serum raised againstthe purified G10H polypeptide Anti-G10H lgGs was able to abolish the G10H actívityand also to recognize the G10H polypeptide from not only C. roseus but also fromothers plants producing MIAs, establishing its usefulness as a bíochemical tool to studyG10H regulation.

Considerable effoh has been invested on understanding -and eventuallymani`pulating-metabolism of C. roseus from aerial parts (St-Pierre et al ,1998) sincedimeric alkaloids vincristine and vinblastine -used as antileukemíc-are produced in theleaves. With this purpose, cell suspension cultures have been used as model Muchless in known about indole alkaloid metabolism in the lower parts of the plant and verylittle is known in particular about indole alkaloid anabolism in roots, in spile that tissueconlain more -quantitative and qualitatively-MIAs than stem and leaves, from which ceHsuspension arrives (Toivonen,1993; Vázquez-Flota et al„ 1994). C. roseus roots arethe industríal source of ajmalícine, which is used as antihypertensive, as anxiolytic andto increase transiently the blood flow to the braín. Since root cultures from di.fferentplants resemble very weH the natural products occurring in roots /.n fhe p/anía, it hasbeen proposed that these organized cultures represent a good model to analyze themetabolism of plant roots (Flores,1992, Flores and Medina-Bolívar,1995). ln addition,regarding C. roseus cultures, comparison of different /.n v/.Íro cultures indicates that rootcultures produce more indole alkaloid than cell suspension, callus and tumors

(Monforte-González, unpublíshed results), so, it Ís reasonable to predict that enzymeswhich are Ínvolved in indole alkaloid biosynthesis could be more expressed (or moreactive) in roots than in other cultures, making easier the characterizati.on of theseenzymes. Since Agrobacrewm rhyzogenes-transformed roots (hairy roots) producesimilar spectrum of alkaloids than non-transformed roots (Toivonen et al„ 1989), thís Ísa good source to study " indole metabolism in C. roseus roots. Furthermore, the hairyroots grow faster than non-transformed roots and, whereas normal root requiresexogenous phytorregulators in the media (which sometimes have a negative effect onsecondary metabolism), the hairy root growth is independent of exogenousphytohormones Therefore, C roseus hairy roots are a promising model to study plantmetabolism of C roseus roots. Results about inítial characterization of G10H from a C.roseus root line are reported.

MATERIALS AND METHODS

Anliserum production. The geraniol 10-hydroxylase was previously purifiedfrom C. roseus cell cultures grown on alkaloid production medium. On the basis ofelectrophoretic analysis n was determined that the protein preparation was híghlyhomogeneous (Me" et al.,1993a). The purifíed protein was resuspended in 20 mMpotassium phosphate buffer (pH 7.7) containing 15°/o (v/v) glycerol,1 mM EDTA, 0.1mM DTT and 5 % (v/v) Renex 690 and was heated at 800C during 15 min. Thedenaturated proteín (100 Hg) in complete Freund's adjuvant was used to immunize NewZealand white rabbits. Two subsequent booster injections of the denaturated protein

(100 Lig each booster) Ín incomplete Freund's adjuvant were done at 2 weeks intervals.

80

The immune serum was collected from the ear vein 1-2 weeks after each boosterinjection.

Plant material and growth conditions. C. roseus hairy roots culture (line J-1)was previously established in our laboratory (Vázquez-Flota et al..1994). This culturewas rutinarily maintained in 100 ml of half strength hormones-free 85 basal medium,

containing 3°/o (w/v) sucrose. The transformed root line was grown in 250 mlErlenmeyer flasks and subcultured every two weeks by inoculating 0.5 g of the fresh

tissue. The root culture was incubated at 250C in the dark, on an orbital shaker at 100rpm.

Membrane preparation. Tissue was harvested, frozen and ground in a mortaruntil fine flour was obtained. The flour was mixed with 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5added with 1 mM dithiotreithol (DTT), 1 mM phenyl-methyl-sulphonil-fluoride (PMSF)and 5 Lig/ml leupeptine. The extract was filter through a cheesecloth and centrifuged at1,500 x g during 15 min. The supernatant was recovered and centr.ifuged at 150,000 x gduring 60 min. The microsomal fraction was resuspended .in 50 mM Tris pH 7.5, 1 mMDTT, 1 mM PMSF, 5 Lig/ml leupeptine and 20% (v/v) glycerol. Microsomes from /.n v/.ÍroRaphanus sat/.vus (Medina-Lara,1997) and A///.um cepa (Payró de la Cruz, unpublishedresults) non-transformed roots were kindly provided by J. Ek-Dzib (unpublished data).These microsomes were prepared as described above.

Protein content. Microsomal protein content was determinate by Peterson assay(1977) using BSA as a standard.

Assay of enzyme activities. Geraniol-10-hydroxylase was assayed in 50 mM

potassium phosphate pH 7.5,1.2 mM P-NADPH,10 HM FAD,10 LiM FMN,1.2 mM DTT

y 68 pmoles [1-3H]-geraniol (1 Hci) in a final volume of 25 Hl. The assay was run for 5-10 minutes and stopped with the addition of 5 Lil of KOH 2 M. As a carrier, cold 10-hidroxygeraniol was added to a final concentration of 15 mM. Monoterpenes wereextracted with ethyl acetate and an aliquot spotted on a TLC plate. Geraniol and 10-hydroxygeraniol standards were spotted on the plate, which was developed withbenzene-acetone-ethyl acetate (2..1 : 1, v/v/v). Monoterpenes were visualized with iodinevapor. The radioactive band corresponding to 10-hydroxygeraniol was scrapped fromthe plate and its tritium content was determinate by liquid scintillation spectrometry.

Test of ability of different P450 antisera to inhibit the G10H activity. Thegeraniol-free reaction mixture was incubated during 20 min at room temperature withdifferent volumes of the antisera (0-8 Hl). The polyclonal P450 antisera tested were: th.emonospecific anti-tc4H (WercklReichhart et al„ 1993) raised against fmns+cinnamicacid 4-hydroxylase from He//.anfhus fuberost/s and anti-ARP1 (O'Keefe and Leto,1989)which was raised against a P450 polypeptide from Persea amer/.cana.

A preimmune serum (bled before immunization with G10H) was included as

control. After incubation with the sera, the [1-3H]-geraniol was added and the assay wasrun as above. The inhibition by each antiserum was estimated comparmg with G10HactMty determined on a serum-free assay.

Asaay of CPR. NADPH: Cytochrome c (P450) reductase activity was measuredin 0.5 M Tris-Hcl pH 7.5, 0.5 mM potassium cianide, 5 tiM antimycin A. 0.15 mM P-

81

NADPH and 50 HM ferri-cytochrome c in a final volume of 500 Hl. The actívíty wasstarted by protein addition and measured duríng 5 min at 550 nm. A molar absorption

coefficient of 21.6 mM-1 cm-1 was used to calculate the concentratíon of reducedcytochrome c.

SDS-PAGE and immunoblotting. The microsomal proteins were separated on a12% SDS-polyacrilamide gel as described by Laemmli (1970) using an electrophoresiscell. After electrophoresis, proteins were electrotransfered to a nitrocellulose membraneat 50 V for 4 h in transfer buffer. Membranes were blocked in 5% (w/v) non fat milk in 10mM sodium pho§phate, 9% (w/v) NacI, pH 7.4 (PBS) and then incubated withantiserum for 2 h at room temperature Antíserum against G10H was diluted 1 :2,500 inPBS-0 1 % (v/v) Tween 20. CA4H and ARP-1 antisera were diluted 1 :5,000 and 1 :2,500in PBS-0.1% (v/v) Tween 20, respectively. In order to prevent cross-reaction byanti.genic sugars, the blots were submitted to periodate washing beforeimmunodetection (Werck-Reichhart et al„ 1993, Woodward et al., 1985). Goat anti-rabbit lgG coniugated to alkaline phosphatase was used as secondary antíbody (dilution1: 3,000 in PBS-0.1% Tween 20). The blots were developed by using 4-nitroblue-tetrazolium chloride (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) assubstrates.

RESULTS

Production of polyclonal antibodies against G10H. Cyt P450-dependentmonooxygenase was previously purified from C, roseL/s cell cultures (Meijer et al„1993b). On SDS-PAGE the homogeneous preparation showed a single band with amolecular weíght of 56 kDa; this protein was reconstituted with C. n?seus NADPH: CytP450 reductase and a C. roseus lipid extract. The reconstituted complex was able tohydroxylate the iridoid-monoterpene geraniol and its c/.s-isomer nerol, confirming itsidentity as G10H (Meijer et al.,1993a). A rabbit antiserum was raised against a heat-denatured sample of this preparation. A weak antiserum was recovered; a dilution of1 :1000 was necessary for the immunodetection of the putative G10H in the samples ofdifferent steps of purification (Meijer, 1993).

Cross-reactivity of antisera directed against denatured microsomal C.roseus hairy root proteins. The ability of the antiserum to recognize the protein fromcrude microsomes C. roseus hairy roots was investigated. Despite different dilutionswere used (from 1.1,000 to 1,10,000), a tipical background was observed in the top ofthe blot However, the putative GIOH protein (~56.5 kDa) was easily recognized (Figure1(8)). This molecular weight is similar to that reported previously for G10H of C. roseuscell suspensi.on (Meijer et a.,1993a). Control experiment was performed using G10H-preimmune serum (Figure 1 (A)), in which immunodetection of C. roset/s hairy rootproteins was negative.

82

kDa81.0

41.9

31.4

18.0

6.9

kDa81.0

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31.4

18.0

6.9

Figure 1. lmmunoreaction of the G10H antiserum with C. roseus hairy root protoins. ln the panel Athe arrow indicates the putative GIOH protein (56 5 kDa). Panel 8 shows the result using the preimmuneserum obtained before immunization with GIOH Experiment was done by triplicate

Effect of anti-G10H and others anti-plant P450s on /.n y/-fro G10H activity. Todetermine if the protein recognized by the antiserum is the G10H, the ability of thisserum to inhibit the G10H catalytic activity was assayed. Microsomal proteins from C.roseus hairy roots were incubated with different amounts of the non-purifiedconventional antiserum. No effect of the antibody was observed when 200 Lig or less ofthe serum protein were added (Figure 2). However higher amount of the antiserum (600

Hg of serum protein) were able to cause a 70°/o inhibition of the G10H activity.

To exclude the possibility that inhibition of G10H activity was due to non-specific

(artifactual) effect by the high concentration of antiserum protein used, the effect ofdifferent preimmune sera -G10H-preimmune serum, commercial preimmune serum(Zymed, cat. 01-6101) and a preimmune serum obtained bleeding rabbits beforeimmunization with pure TDC (lslas-Fores et al„ in preparation)-on the monooxygenaseactivity was tested Neither of these preimmune sera was able -at the same or higherprotein concentration than that used from the G10H antiserum-to inhibit the 10-hydroxygeraniol formation (Figure 2). Results are compatible with no immunodetection of C.roseus hairy proteins by the G-10H preimmune serum. Therefore we conclude thatinmbition of G10H activity by the antiserum was provoked by anti-G10H lgGs.

83

0 200 400 600 800 1000 1200

Proteln (Hg)

Figure 2. Eff®ct of diff®r®nt plant P450 anti-s®ra on tho g®raniol lo-hydroxylase (G10H) activity olC, rosoi/s hairy roots. The microsomal protein (2 LLg) was incubated with different amounts of serumprotein during 20 min at room temperature. The enzymatic reaction was started by the addition of .H-geraniol and the GIOH activity was assayed quantifying the .H-10 hydroxygeraniol formed. The

3:raT:á-9,:Toíe'nahh?i::o,na:,a.Sb.Cda'Fnu',:::de;3:',T:ean:;:?eo/o(ih,ea:::iá'yo.Te(a.s,u::t,_:ÁZ:;`,in,`':::iTTR#(0) commercial pre-immune serum (Zymed, cat 01-6101) and (H) a pre-immune serum (beforeimmunization with pure tryptophan decarboxylase, lslas-Flores et al., in preparation).

We further investigated whether similar concentrations of others antisera againstothers plant P450s are able to interfer with the GIOH catalysis. The antisera used werethe monospecific anti-CA4H (Werck-Reichhart et al„ 1993) raised against the CA4H(CYP73A1 ) from He//.aníhus Íuberosus and anti-ARP1 (O'Keefe and Leto,1989) thatwas generated against a P450 polypeptide (CYP71A1) from Persea amen.cana. Fromthese two conventional sera, anti-ARpl was not able to abolish the monooxygenation ofthe geraniol in any degree but anti-CA4H serum decreased Í.n vt.Ím 10-hydroxygeraniolformation (Figure 2). lntnguishly, although this antiserum was originally raised againstCA4H rather than G10H, it interfered with Í.n vt.Íro G10H activity at lower serum proteinconcentration (200 Hg or less) than anti-G10H itself. When higher serum protein of eachantisera was used (~380 Lig), more inhibition of G10H activity by the anti-G10H wasobserved.

Cross-roactivity of antic10H §erum with plants-naturally lackjng G10H.Since CA4H antiserum showed an inhibitory effect on the G10H enzyme activity,

84

inhibition of this monooxygenase with antj-G10H and the cross-reaction with a protein of

predicted mol mass may not be enough arguments to establish that this antíserumrecognizes specifically this Cyt P450-dependent enzyme, particulariy because cyt P450family comprises a large number of proteins exhibiting a narrow range of molecularmass. Thus, we have yet to cc)nfirm the specificity of this antiserum, that's why we usedthe G10H antiserum against plants-naturally lacking geraniol 10-hydroxylase activity.We tested with two /.r) v/.Íro non-transformed root cultures, Raphanus saí/.vus and A///.umcepa, in whjch the G10H actMty has not been detected (data non shown). As shown infigure 3 (lane 2 and 3) the antibody did not recognize proteins either in R. saí/.vus or inA. cepa. The microsomal proteins from C. roseus hairy roots were included as positivecontrol (Figure 3, lane 1). Whereas anti-GIOH does not cross-reacted with microsomalproteíns from R. saí/.vus and A. cepa, these species had positive cross-reaction with thepolyclonal antibodies against ARP-1 and anti-CA4H. Unspecific binding with anti-CA4Hand anti-ARpl was apparently high, even if the primary antisera were diluted, or usingmore detergent in the blot-washing buffer or pretreating the blot with periodate (data notshown). lt is unlikely that all recognized proteins would be related with P450s, butresults suggest the presence of some P450s in Raphanus and A/Í.um, wh/.ch are notcross-reacting with anti-G10H. Then, it is reasonable to conclude that the polypeptiderecognized at 56.5 kDa in C. roseus is actually the G10H.

Relatedness of C. roseus's and other Apocynaceae's G10Hs. The nextquestion was whether the polyclonal serum against G10H could identify this enzyme inothers plants genera others than Caíhafflníhus. Thus, we decide to explore if thegeraniol 10-hydroxylases from other plants-producing monoterpene indole alkaloids isantigenically cross-reacting with this antiserum. Several Í.n vi.Íro cell suspension cultures•inc,lud.ing Cinchona ledgeriana, Rauwolfia selowii, and Tabemaemontana divarica were

screened for their G10H actMty. They showed large differences in their G10H activities.ln particular the /.n v/.Íro culture of the Rubiaceae C. /edgen.ana, the G10H was notdetected at any point of the culture cycle. ln contrast, with the Apocynaceae cultures ofRauwo/f/.a se//ow/./. and Tabemaemoníana d/.van`ca, 10-hydroxygeraniol was positivelyrecovered in the /.n v/.Íro assays. Their maximum specific activities of G10H weremeasured at day 2 and 10 of the culture cycle respectively, and it corresponded to 45

pKat mg of microsomal protein-1 for R. se/ow/./. and 20 pKat mg of microsomal protein-1for 7-. d/.van.ca. A cell suspension culture of C. roseus was monitored as well. Thisshowed the largest GIOH activity between this set of cell suspension cultures. A

maximum of 200 pKat. mg of microsomal protein-1 was determined at day 6. Theimmunoblot assays showed an immunoreactive polypeptide at ~ 56.7 kDa in R. se/owÍ.Í..C. roseus and 7-. d/.var/.ca (Figure 4). However, the intensity of the bands differed ineach case. An apparent positive correlation was observed between the G10H activitymeasured Í.n v/.Íro and the cross-reactive band developed in each sample. Caíhamníhusroseus showed the strongest signal, followed by R. se/ow/.i. and then by T. dí.van.ca. TheCÍ.nchona /edgen.ana culture, in which G10H activity was lacked, showed no afflnity forthe anti-G10H serum.

85

kDa i 2 3

+ 56.5

Figui.® 3. lmmunoreaction of G10H antiserum with protoins of different plant sources. Themicrosomal protein (70 Hg) was resolved on 12°/o (w/v) SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulosemembrane The sample§ analyzed were. C. Roseus (lane 1), non-transformed R. Saí/vus roots (lane 2)and non-transformed A. Cepa roots (lane 3) The arrow indicates the putative G10H protein. Experimentwas done by triplicate.

Goraniol 10-hydroxylase and NADPH: P450 reductase from Catharanfhusroseus hairy roots. Because anti-G10H serum showed the ability to recognize theG10H in C. roseus and others Apocynaceae, this antiserum represents an importantbiochemical tool to study the regulation of thls P450 enzyme. G10H activity wasmonitored during growth of the C. noseus hairy root Jl line, a stable root culture thataccumulates indole alkaloids, particularly ajmalicine, catharanthine and yohimbine(Vázquez-Flota et al.,1994; lslas-Flores et al.,1994; Moreno-Valenzuela et al.,1998).G10H activity was almost undetectable at beginning of the culture cycle and then it rose

at 8-9 pKat mg microsomal protein-1 from day 6 to day 12 (Figure 5). A maximum peak

of 26 pKat mg microsomal protein-1 was registered at day 15, when the culture is atmiddle of the logarithmic groMh phase. This highly short maximum period of GIOHactivity was reproducible thought different subcultures. lmmediately after, themonooxygenase activity decreased dramatically at half and maintained this level duringthe next two weeks. When the stationary phase was reached, no G10H activity could bedetected anymore. Since the NADPH: Cyt c (P450) reductase, the redox partner, isessential for G10H-catalysed reaction, its activity was also quantified during the culturecycle of the Jl line. Whereas G10H activity was related to the growing phase in the JIline, this culture showed a constitutive activity of NADPH: Cyt c (P450) reductase; itraised gradually at the same degree as the microsomal protein and thus, its specificactivity was practically constant during all culture cycle, at about 1.5 nKat.mg

microsomal protein-1. Likewise, when microsomal protein decreased after day 30,NADPH Cyt c (P450) reductase activity declined with similar kinetics. To evaluate thebehavior of G10H and P450 reductase polypeptides in the Jl culture, immunoblotsassays were carried out with highly contrasting G10H activity samples. Microsomalprotein from hairy roots with 15 and 40 days of culture were independently challenged

86

with anti-NADPH: Cyt c (P450) reductase or anti-GIOH sera. With regard to P450reductase, its polypeptide was positively visualized both in roots at logarithmic phase asin roots at stationary phase (Figure 68). ln the corresponding blots probed with anti-GIOH, no GIOH polypeptide occurrence was observed in Jl roots at 40 days of theculture cycle but it was detected in the culture with 15 days (Figure 6A). Therefore,detection of G10H and P450 reductase polypeptides showed a good correlation withtheir activities in respective samples. ldentical results were determined in othersamples: always G10H activity could be detected, the putative G10H polypeptide wasvisualized; P450 reductase had been measured and immunodetected in all C. roseussamples analyzed at the moment (data not shown). These results suggest that thereductase is constitutive in Jl roots or a constant synthesis-degradation processcontrols it, whereas the GIOH -polypeptide and activity-seems to be under temporalregulation. These initial data suggest that regulation of 10-hydroxigeraniol synthesiscould lie on G10H rather than on the reductase control.

DISCUSSION

Geraniol 10-hydroxylase seems to be a committed step in /.ndo/e a/ka/o/.dbiosynthesis. Despite a considerable effort had be invested to understand how thisenzyme is controlled, information about the mechanisms which regulate G10H are notavailable at present. G10H was previously purified as a homogeneous protein with 56kDa (Meijer et al.,1993a). Results described in th'is paper show for first time that theantiserum raised against this enzyme cross-reacted with a C. mseus cell suspensionpolypeptide banded at mol mass expected, suggesting it is useful to identify G10Hpolypeptide on immunoblots.

To characterize this antiserum we carried out immunochemical studies using thisanti-G10H and others anti-plant P450s for immunoblot and for immunotitrationexperiments. ln immunotritation analysis the anti-G10H showed a potent inhibition ofG10H activity from C. roseus hairy root microsomes. A number of preimmune sera werenot able to interiere with the enzymatic activity, indicating that inhibition with antiserumwas specifically caused by anti-G10H lgGs. Despite physiological function of avocado-ripening related protein (ARP1, CYP71A1) is still unknown (D. P. 0`Keefe. personalcommunication) it is though that ARpl is closely related with G10H because ARpl isable to bind geraniol or nerol in a specific manner (Hallahan et al„ 1992) and anti-ARPIstrongly cross-reacts specifically with a 50 kDa polypeptide from N. racemosa, a plant-containing G10H (Hallahan et al.,1994). However, no inhibition of G10H activity was

produced with anti-ARpl even at high concentrations. Likewise, no inhibition on nerolhydroxylation by avocado microsomes has been previously described for anti-ARP1.which was interpreted as a consequence of using denaturated ARpl to produce theantiserum (Hallahan et al.,1992).

87

+ 56.5

Flguro 4. lmmunor®action of microsomal propai.ations (70 tig prot®in. lane-') from differont plantswith th® anti.GIOH serum. Lanes 1-3 corresponde to the Apocynaceae plants C. Íoseus (1 ), R. se/owt.i.(2) and 7-. mon!anae (3). Lanes 4 and 5 corresponde to the rubiaceae plants C. /edger/ana and f?.Í/.ncío/t/m, respectively Lane 6 to the Caprifoliaceae W. síyr/.aca. A sample of C. mseus hairy root (J-1 )`^/as included for comparison (lane 7). The arrow indicates the G10H protein.

lt is important to emphaslze that anti-GIOH was raised against denaturatedG10H and this antiserum could interfere with G10H activity at similar concentrationsthan used for anti-ARP1. Similarly, an antiserum directed against denatured sorghumP450TyR was able to abolish almost 60°/o of the N-hydroxylase (Sibbesen et al.,1994).Therefore, although the antigen status (native or denaturated form) already contributeson the ability of antibodies to inhibit the enzyme activities (Werck-Reichhart et al.,1993)there should be another unidentified reasons for these antibodies-P450s interactions.On the contrary, antibodies raised against CA4H (CYP73A) -which catalyzes themonooxygenation of fffins-cinnamic acíd, a compound non-structurally related withgeraniol or nerol-interiered significatively with the G10H activity. Effects of anti-CA4HlgGs on non-CA4H activities have been reported in both directions. No inhibition onJerusalem artichoke's lauric acid hydroxylase, 7-ethoxycoumarin deetylase and 7-ethoxyresorufin deetylase activities were produced by anti-CA4H (Gabriac et al„ 1991 )but it interfered with 3.9-dihydroxypterocarpan 6a-hydroxylase from soybean (Kochs etal.,1992). lt is not fully understood why an antibody interieres with an enzymatíc activitywhile it fails to interiere with others; epitopes recognized that are inhibitory to catalyticactivity are not yet characterized. Some plant P450s are glycosylated (Kochs et al„1992) opening the possibility that glycan side chains could contribute, in addition to

protein epitopes, to antigenic relatedness among P450s.

88

10 20 30

Time (days)

Figuro 5. NADPH :cyt c (PJ50) reductase (.) and geraniol lo-hydroxylase (^) activitios from C.Joseus hairy roots measured through a culture cycle. The reductase actMty was measured followingthe reduction of cnochrome c at 550 nm. The hydroxylase activity was assayed using [1-3H]-geraniol a§substrate, as described in Materials and Methods.

ln immunoblot analysis for C. roseus microsomes it was possible to identify across-reactive polypeptide, with an apparent molecular mass of 56.5 kDa, compatible ingeneral Wth P450s size (Schuler,1996), and particularly with G10H mol wt (Meijer etal., 1993a). The polyclonal sera anti-ARpl and anti-CA4H developed proteins withsimilar -but not identical- sizes (data not shown). These results indicate that multipleP450s could be occurring in C. roseus roots. The distinct immunopatterns obtained witheach antiserum suggest that antisera recognize different. discrete motifs that could bedifferentially distributed in different P450s.

89

12

Figuro 6. Wostorn blol of G10H (panol A) and NADPH :cyt C (P450) reductaso (panel 8) from C.msous hairy roots. ln both cases the samples were prepared from hairy roots 15 days (lane 1) and 40day§ old (lane 2) of the culture cycle. Each lane was loaded with 70 Hg of microsomal protein. Experimentwas done by triplicate.

To confirm or to refuse the identity of 56.5 kDa cross-reacted with anti-G10H asthis monoterpene hydroxylase, plants naturally lacking GIOH were immunoscreened. lnA. cepa and R. saí/.vus roots no G10H activity was detected even usíng an excess ofmicrosomes or incubating the assay for longer times. No immunoreaction with anti-G10H was observed neither in A. cepa nor in R. saí/.vus. Likewise, no cross-reactivesignal was observable with a cell suspension culture of Rub/.a Í/.ncfomm, which does noproduce indole alkaloids but it accumulates large amounts of anthraquinones (Poulsenand Verpoor[e,1992); and in wmch no G10H activity could be detected. Anti-CA4Hserum immunoi.ected with microsomal proteins from these non-Apocynaceous species.ln the case of R. saíí.ws, anti-CA4H cross-reacted with a -70 kDa protein. Although thismolecular mass is higher than the repor[ed for typical P450 proteins, it has beenreported that this antiserum recognized a protein with similar molecular mass in twospecies of Ch/ore//a (Thies et al.,1996). A number of polypeptides were recognized byanti-CA4H in A. cepa. Although it is unlikely that all cross-reacted polypeptides belongto P450s, it is possible that some of them would be. Cross-reactivity of these non-Apocynaceous species with anti-CA4H was not surprising because CA4H (belongs tctCYP73A family) is ubiquitous in the plant kingdom (Werck-Reichhart et al.,1993). Withanti-ARpl two proteins of ~64 and ~70 kDa were recognized both in A. cepa and in R.saí/.vus. These results confirm differences in immunological characteristics betweenanti-ARpl and anti-G10H. The non-specific cross-reaction observed with anti-CA4Hand anti-ARpl probably is due to the high amount of microsomal protein used forimmunoblots, in spite of using stringent washing conditions. Antigenic glycan sidechajns could still remain after the periodate treatment (Kochs et al.,1992). ln others

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reports the use of these antisera on heterologous cross-reaction had shown nounspecific binding; in these cases much less protein than the one used by us wasexamined (Werck-Reichhart et al.,1993; Hallahan et al.,1994). However, we requiredto overload the gel with microsomal protein in order to immunodetec G10H, reflectingthe low abundance of G10H protein or the weak reactivity of anti-G10H lgGs. or both.

lnterestingly. antiGIOH cross-reacted with a ~56.5 kDa polypeptide fromTaberr}aemonlana d/.var/.ca and Rauwo/fia seper)Í/.na, two Apocynaceous plants-producing indole alkaloids. No immunoreactive polypeptide was visualized in C/.nchonasample, in concordance w.ith the absence of G10H activity in it. Cell suspens.ion culturesof C/.nchona usually produce very low or no alkaloids; attempts to detect GIOH and TDCactivities in these cultures had also failed (Verpoorte et al.,1993).

Alkaloid derived from strictosidine not only occurs in Apocynaceae family but theyare also produced by some Logan/.aceae (as Gardner/.a, Mosfue and some species of-St-hñ:;:;ors):-ñ;iiáááaé-(ascirrichone),pnd..Nyss.acege_,(_C_3r£Tgth.S.:^a.^a.C^u^m!:a±_a^)x:h£e

last two producing quinoline alkaloids. In all of these plants the existence of G10H .isexpected. ln addition, G10H .is present in some members of the Capn.fo//.aceae family(as Loni.cem) and in the Nepeta genera (fam. Lam/.aceae). Since DNA sequences forGIOHs are yet no available, phylogenic relatedness between G10Hs remains to beelucidated. It should be very interesting to determine whether G10H from these plantscross-reacts with anti-C. roseus GIOH serum. Present results led to the suggestion thatG10Hs from different plant sources may share common structural features. Thisantiserum could be used to explore new plant species. D.ifferences in signal intensity inthe present examined samples probably result from the differences in abundance ofG10H in them, rather than differential antigenicity strength, albeit this fact can not berule out. Contrasting with our results, some anti-plant P450s sera fail to showinterspecies immunocrossreactivities. even against orthologous enzymes (Higashi et al. ,1985; Lau et al„ 1993).

Using this polyclonal anti-G10H lgGs we initiated the study of G10H regulation.We compared activities and polypeptides behavior of G10H and P450 reductase in a C.roseus hairy root line (J-1 ). An apparent relationship between detection of G10H activityand occurrence of G10H polypeptide arose. This suggests a regulating mechanism ofsynthesis-degradation on this monooxygenase. This proposal for G10H is alsosupported by our observations conducted on others Apocynaceous plants. When G10Hwas detectable, G10H polypeptide was observable, and viceversa. Regard.ingconstitutive P450 reductase presence -furthermore in an active form-in J-1 may be itsfunctional interaction with others P450s occurring in C. roseus (Meijer et al., 1993b).

ln conclusion, anti-G10H serum described in this study is the first available toolwith which to study the regulation of this monoterpene hydroxylase. J-1 culture is apromising model to study C. roseus root metabolism because it is a stable cultureproducing indole alkaloids mainly ajmalicine, catharanthine and yohimbine (lslas-Floreset al..1994; Moreno-Valenzuela et al„ 1998; Sáenz-Carbonell et al.,1993) resemblingC. roseus roots /.n p/anfa. A number of elicitors lead J-1 to increase its indole alkaloid

production (Vázquez-Flota et al., 1994). More detailed studies of some conditions hadshown that tryptophan decarboxylase (Moreno-Valenzuela et al., 1998; Moreno-Valenzuela et al.. 1999), strictosidine synthase, and 3-hydroxy-3-methyl glutarylcoenzyme A reductase (Moreno-Valenzue:j et al.,1998) are also altered. Experiments

91

are currently being done to investigate activiti.es and protein content behaviors of G10Hand P450 reductase in J-1 culture upon elicjtation.

Acknow/edgmenís. This research was supported by the Consejo Nacional deCiencia y Tecnología de México (CONAcyT, grant No. 225135-54023N). B.B.C.C wassLipported by a CONAcyT studentship (fellowship No. 88210). The authors are speciallygrateful to Dr. Daniéle Werck-Reichhan from the National de la Recherche Scientifique(Strasbourg, France) and Dr. Daniel P. O'Keefe from E. 1. Dupont de Nemours andCompany (Wilmington, DE) for their generous gift of trans-cinnamic 4-hydroxylase andARP-1 anlisera, respecti.vely. We thank Q.F.B. Jose W. Ek-Dzib for providingmicrosomal protein prepara{ions from /.n v/.fro R.saf/'ws and A. cepa non-transformedroot cultures.

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CAPITULO V

DISCUSIÓN GENEIUL

En los mamíferos las proteinas P450 clásicas reciben los electrones delNAD(P)H mediante la misma P450 reductasa. Como esta caracteristica es igual enotros grupos filogenéticamente distantes (hongos y levaduras), se esperaba que asifuera también en las plantas. Sin embargo, Fujita y Asahi (1985) purificaron enCerafocysfi.s ffmbri.afa 3 polipéptidos con característ.icas de P450 reductasa. Asi mismo,la Dra. lrene Benveniste y su grupo han propuesto por más de 10 años que enHe//.anfhus tuberosus existen múltiples CPRs, pero sus resultados fueron vistos conmucha reserva. Durante la década pasada otros grupos de trabajo han reportadotambién la detecc.ión de múltiples CPRs, ya sea durante el proceso de purificación omediante la inmunodetección con antisueros. En Vi.gna mdi.aía se purificaron einmunodetectaron al menos 2 polipéptidos, de 82 y 76 kDa respectivamente (Shet etal.,1993). En otros sistemas vegetales también se han reportado múltiples CPRs, peroen todos los casos se interpretaban como productos de degradación o ariificiosexperimentales. Analizando raíces transformadas de C. msew inmunodetectamoshasta 3 polipéptidos, de 87, 84 y sO kDa respectivamente. El polipéptm de menormasa molecular se detecta en los extractos libres de inhibidores de proteasas, peronunca cuando se emplea 50 Hg de leupeptina/ml de amortiguador. La presun(a CPR de80 kDa también se inmunodetecta en la fracción de proteína soluble, preparada enausencia de inhibidores de proteasas. Estos datos sugieren que este polipéptido es elresultado de una proteólisis parcial de la CPR, que además provoca su disociación dela membrana. En las inmunodetecciones realizadas no se puede apreciar cual de lasotras 2 proteínas está dando origen a la proteína de 80 kDa; el dominbtransmembranal de la CPR de animales tiene una masa entre 6-8 kDa, lo que señala alpéptido de 87 kDa como candidato.

Las proteínas de 87 y 84 kDa fueron siempre visualizadas en lasinmunodetecciones, independientemente de la presencia o ausencia de inhibidores deproteasas, lo qim sugiere que el origen de la proteína de 84 kDa no es la degradaciónproteolitica de la proteína de 87 kDa. Una posibilidad es que el antisuero estiivieracruzando de manera inespecifica con residuos de carbohidrato, un problema frecuenteen la inmunodetección de proteinas de membrana. Esta posib.ilidad fue exploradasometiendo las inmunoréplicas a lavados con peryodato de sodio. Este reactivo oxida alos carbohidratos y permite únicamente la interacción de los anticuerpos con antígenosde naturaleza peptídica (Werck-Reichhah et al., 1993; Woodward et al., 1985). Aúnbajo las condiciones oxidantes del peryodato, el antisuero contra la CPR continuóinmunodetectando a las proteinas de 87 y 84 kDa. Se exploró si estas dos proteinasson reconocidas por otro ant.isuero generado contra una CPR vegetal. Se compararó lainmunodetección obtenida empleando el suero anti-CPR de H. fuberosus con otraobtenida empleando un suero generado contra la CPR de SomhL/m Ó/.co/or (Halkier yMoller,1991). En ambos casos se reconocieron las mismas proteínas, de 87 y 84 kDa,lo que indica que ambas proteínas de las raices de C. rosem son CPRs. En otrosÓrganos de la planta también se visualizaron dos CPRs. El tallo presentó tambiénCPRs de 87 y 80 kDa, pero las hojas y la flor presentaron CPRs de aproximadamente78 y 74 kDa, lo que aumenta las CPRs de C. roseus al menos a cuatro.

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EI ADNc correspondiente a la CPR de C. mseus fue el primero en ser clonadoen las plantas y de acuerdo a Meijer et al. (1993b), la CPR de C. roseus es codificadapor un solo gen. Estos autores mencionan que obtuvieron la clona genómica, pero almomento la secuencia de ésta no ha sido reportada. Meijer et al. (1993b) mencionan lapresencia de al menos un intrón. el cual contiene un sitio de restricción para la enzimaH/.n d///, por lo que la multiplicidad de CPRs pudiera ser debido a que el ARN seaprocesado de diferentes maneras. También existe la posibilidad de que ocurranmodificaciones post-transcripcionales de la proteína.

Al momento se han clonado también las CPRs de V. mdí.aía, H. Íubemsus, P.

?orinfferuT.,. E.. ca.IifoTica, Pe_rp_eris stolonifera, Petroselinum crispum, A. thaiiana y N.Íabacum. Mizutani y Ohta (1998) compararon algunas de las secuencjas conocidas yencontraron que con base en las longitudes de los extremos amino se forman dospoblacjones de CPRs. Un grupo con el extremo amino "corto" (que concuerda con eltamaño de la CPR de levadura y de rata) y el otro grupo con el extremo amino .'largo".La CPR de C. roseus queda en este segundo grupo. En este mjsmo grupo quedan lasCPRs de A. Íha//.ana y de ~. Íabacum. Yamada et al„ (1998) analizaron el extremoamino terminal de la CPR de tabaco mediante un progi.ama que pemite predecir lalocalización de la proteína y determinaron que si el polipéti.do iniciara en la metioninanúmero uno se localizaría en el retículo endoplásmico y si iniciara en la metioninanúmero 14 se localizaría en el cloroplasto. Si se observa la secuencia reportada porMeijer et al. (1993b), la CPR de C. mseus tiene también una metionina-1 y unametionina-14 (Meijer et al., 1993b), lo que abre la posibi.lidad de que ocurrieraprocesamiento diferencial y que los productos tuvieran diferentes localizaciones en lacélula. No todas las secuencias conocidas de CPRs vegetales presentan más de unametionína, pero pudiera ser una característica común en muchas plantas. En H.fuberosus se presenta una metionina-1, una metionina-11 y una metionina-15 en suextremo amino terminal.

Con base en el ADNc completo de la CPR de C. roseus se predice una masamolecular de 78,958 Da (Meijer et al., 1993b). En el presente trabajo se encontraronCPRs de aproximadamente 74, 78, 84 y 87 kDa. Alguna de las CPRs de menor tamañodebe corresponder al polipéptido original. Las CPRs de 84 y 87 kDa posiblemente seanresultado de modificaciones postraduccionales Se sabe que la CPR de H. ÍuberosLÍs(Lesot et al.,1995), la de V. nac//.a(a (Shet et al.,1993) y la de N. Íabacum (lmaishi et al.,1995) están glucosiladas. Nuestros resultados con las raíces transformadas de C.noseus sugieren que al menos alguna de las CPRs de esta planta también estáglucosilada, pues su actividad enzimátíca es inhibida por la lectina concanavalína A. Sila concentración de la lectina en los ensayos /n v/.fno es suficiente, ésta es capaz deabatir la actividad hasta hacerla indetectable, lo que sugiere que en las raíces la CPRfuncional está glucosilada. Con base en este resultado los probables sitios deinteracción de la lectina con la CPR son varios, pues la actividad de la CPR puede serinterfenda en cualquier punto de la ruta de los electrones (NADpm> FAD> FMNi>proteína P450 o sustrato artificial).

En varias publicaciones se ha sugerido que la CPR vegetal está presentetambién en la membrana plasmática, aunque en mucho menor cantidad que en retículoendoplásmico (Donaldson y Luster,1991; Kjellbom et al.,1985; Larsson et al„ 1987;Rubinstein y Luster,1993). Mediante el empleo de la técnica de 2 fases con dextran T-

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500 y polietilén glicol 3350 obtuvimos membrana plasmática de las células de las raíces/.n v/.Íro de C. roseus. De acuerdo a la serie de actividades ensayadas comomarcadores enzimáticos las preparaciones de plasmalema eran de alta pureza. Estaspreparaciones estaban libres incluso de actividad de la G10H, pero se detectó actividadde CPR. Los niveles de actividad fueron de casi 3 Órdenes de magnitud menores de losdetectados en la fracción microsomal cruda (datos no presentados), lo que coincide conlos resultados reportados en otras fuentes vegetales (Kjellbom et al.,1985; Larsson etal„ 1987; Rubinstein y Luster, 1993). La reducción de citocromo c con la proteína

plasmática muestra preferencia por el NADPH y esta reducción es detectada enpresencia de antimicina A. Estas características hacen suponer la presencia de unaCPR en esta membrana (Figura 1), si bien no se puede descartar la posibilidad de laexistencia de reductasas diferentes a la CPR que sean insensibles a este compuesto(Moller et al., 1995), o que exista aún una contaminación ligera por retículoendoplásmico.

La proteina G10H de C. noseus tiene una localización inusual para las proteínasP450, pues se encuentra en el tonoplasto (Madyastha et al.,1977) en lugar del retículoendoplásmico. Esta enzima es definitivamente dependiente de la actividad de la CPR,por lo que se espera que C. n)seüs posea también una CPR tonoplástica. Las múltiplesCPRs observadas en C. roseLÍs pudieran tener diferentes localizaciones subcelulares(Figura 1). Durante el desarrollo del presente trabajo se intentaron aislar las diferentesmembranas mediante centrifugación en gradientes de sacarosa y se deteminóactividad de CPR en todas las fracciones (datos no presentados). Congruente con loesperado, la mayor cant.idad de la actividad de CPR se recuperó en la fraccióncorrespondiente a retículo endoplásmico, pero la frecuencia de contaminación cruzadaimpidió poder relacionar la actividad de CPR con el tonoplasto o con algiina otramembrana.

Es muy claro que en el reino vegetal existe una gran cantidad de diferentesproteínas P450 (en el sentido que catalizan diferentes reacciones). Sin embargo, esmuy poco lo que se sabe de su regulación. En algunos sistemas vegetales se hareportado que la reductasa no responde a factores que .inducen a las proteinas P450(Loerwald et al.,1996), mientras que otros reportes indican una respuesta coordinada(Benveniste et al.,1977; Fujita et al..1982; Lesot et al.,1990). En nuestro trabajo secompararon las actividades de la G10H y de la CPR de raíces transfomadas de C.roseus que fueron sometidas a la presencia de zeatina, ABA, 8% de sacarosa,macerozima y medio sin fosfato, se observó que en algunos casos, como con 8% desacarosa, ambas actMdades aumentaron en grados semejantes; sin embargo, en otroscasos la actividad de reductasa aumentó mientras que la actividad de G10H semantuvo igual o disminuyó. Estos datos sugieren que aún en una misma planta larespuesta del compleio P450 depende del estímulo al que la planta esté siendosometida. Los estimulos que provocan un aumento de la CPR, pero no de la G10H,pudieran estar "encendiendo" vías metabólicas que involucraran proteinas P450diferentes a la GIOH. En C. roseus se han reportado alrededor de 16 secuencias quecodifican para proteinas P450 (Meijer et al..1993c); algunas de estas pro{einas P450participan también en la síntesis de los AMls (St-Pierre y De Luca. 1995). Otraposibilidad es que la respuesta de la G10H y de la CPR siguiera diferentes cursostemporales y que al evaluar únicamente en un determinado momento pareciera que laG10H no responde a algiinos de los tratamientos aplicados. Durante la germinación de

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ricino, por ejemplo, tanto la CPR como las proteínas P450 presentan aumentos en sucontenido, con periiles similares, pero no idénticos. La CPR está presente mástempranamente y su presencia permanece durante más tiempo, en comparación conlas proteínas P450 (Alani et al„ 1990). De manera similar, en A. Íha//.ana la CPR y laCa4H son inducidas por daño mecánico y por luz, pero la CPR es inducida horas antesque la Ca4H (Mizutani y Ohta,1998).

También pudiera ocurrir que el curso temporal. aún para una misma enzima,fuera diferente en fiinción del tratamjento aplicado. Mizutani y Ohta (1998) encontraronque la expresión de la CPR de A. Íha//.ana se Índuce más fuerte y rápidamente condaño mecánico que con luz, si bien con esta última su respuesta se mantiene durantemás tiempo. Estas diferentes posibilidades pueden explicar las diferentes respuestasde la CPR y de la GIOH de las raíces de C. roseus.

Figura 1. Esquema propuosto de la localización de las(Madyastha et al.. 1977 y en el presente trabajo).

A pe§ar de que se conocen más devegetales, en la mayoría de los casos noespecíficamente. Aún cuando las funcionesobservado que en general las proteínas

proteínas P450 y de la CPR do C. mseus

100 secuencias de proteínas P450se sabe que reacciones catalizanfisiológicas se desconocen se ha

P450 vegetales son induciblestranscripcionalmente, como se sabe para sus análogas de anrmales. Con excepción dela Ca4H (Batard et al..1997) no se ha determinado si las proteínas P450 de plantasestán reguladas a nivel traduccional o post-traduccional, en parte porque para lamayoría de los casos no se cuenta con anticuerpos específicos.

La actividad de la GIOH parece ser clave para la síntesis de los AMls, pues losfaclores que modulan su actividad afectan similarmente la producción de estoscompuestos. A pesar de los esfuerzos de varios grupos de investigación hasta ahorano se cuenta con una sonda que permita reconocer específicamente a la GIOH (Clarket al.,1997; Mangold et al.,1994; Mei.jer et al.,1993c) y tampoco se ha reporlado ladisponibilidad de anticuerpos específicos que reconozcan a esta monooxigenasa.

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La G10H fue purificada a homogeneidad de células en suspensión de C. roseus(Meijer et al.,1993a), y se generó un suero convencional contra la proteína aislada(Meijer,1993). La caracterización inicial de este antisuero indicó un elevado grado deinespecificidad, obteniéndose inmunorevelados que parecerían tinciones de proteínatotal (Meijer, comunicación personal). En el presente trabajo se lograron establecer lascondicioiies de inmunodetección que permitieron reconocer en las raícestransformadas de C. roseus a una proteína con una masa molecular de 56-57 kDa, lacual es congruente con la masa molecular de 56 kDa reportada por Meijer et al.(1993a). La incubación de este antisuero con la proteína microsomal de las raíces deC. roseus mostró que los anticuerpos presentes son capaces de inhibir la actividad deG10H, mientras que el suero preinmune no mostró efecto alguno; sin embargo, unsuero anti-Ca4H también mostró capacidad inhibitoria. La especificidad del suero anti-G10H quedó demostrada analizando muestras de microsomas totales provenientes dediferentes plantas, unas que si poseen actividad de G10H y otras que carecen de estaactividad enzimática. En las especies en las que no se ha logrado medir actividadenzimática de GIOH el antisuero contra la G10H no reconoció a ninguna proteina,mientras que los antisueros contra las proteínas P450, Ca4H y ARP-1 dieron reacciónpositiva. Cuando se analizaron especies de plantas que si presentan en algúnmomento actividad de la enzima G10H, el antisuero reconoció a la proteína en aquellasmuestras donde se había detectado actividad. Lo mismo se observó con muestras deC. roseus: el aritisuero reaccionó con muestras con actividad y no reconoció a laproteína cuando la actividad estuvo ausente. Todos estos datos confirman que elantisuero reconoce específicamente a la geraniol 10-h.idroxilasa.

Hasta donde sabemos éste es el único antisuero que ha sido generado contra laG10H, por lo que el haber establecido las condiciones técnicas para su uso eninmunodetecciones y haber demostrado su especificidad contra esta proteína resultaimportante para poder emplearlo como herramienta bioquímica en el estLidio de estaenzima.

Utilizando estos anticuerpos hemos iniciado el estudio de la regulación de laG10H. En las raíces transformadas de C. roseus se determinó que la presencia de laG10H coincide con la presencia de la actMdad; no se observó ningún caso en dondese inmunodetectara a la proteína y no se midiera la actividad, o viceversa, sugiriendoque al menos en condiciones normales de cultivo, Ia G10H es regulada mediantesíntesis-degradación de la proteína. La ausencia tanto de la actividad como de laproteína G10H durante las fases de retardamiento y estacionaria del ciclo decrecimiento sugiere que la GIOH de las raíces transformadas de C. mseus es reguladatemporalmente. Los resultados sobre la actividad de esta enzima y del contenido de laproteina en los diferentes órganos de la planta sugieren también una regulación tejidoespecífica. Por el contrario, Ia enzima CPR estuvo presente durante todas las etapasdel ciclo de cultivo (al menos determinando la actividad con citocromo c como sustratoartificial). De manera similar, la actividad de la enzima CPR asi como las proteínasinmunoreactivas con el suero anti-CPR, fueron detectadas en todos los órganosanalizados de la planta C. roseus, por lo que es probable que en el tejido, Ia regulaciónde la hidroxilación del geraniol dependa directamente sobre la G10H, y ésta se sinteticecuando se requiere 10-hidroxigeraniol. Sin embargo, no se tienen datos sobre lasconcentraciones endógenas de este diol.

99

Los resultados de las inmunodetecciones en las raíces expuestas a diversostratamientos indican que los contenidos de las proteínas G10H y CPR siguen el mismocompor(amiento que el de las actividades enzimáticas respectivas. Esta es unaevidencia adicional que apoya el hecho de que la regulación de las enzimas CPR yGI OH no está estrictamente coordinada.

A pesar de la multiplicidad de CPRs (al menos dos en las raíces de C. mseus),no se puede descartar que únicamente una de estas proteínas sea fisiológicamenteactiva o que sólo una de ellas interactúe i.n vt.vo con la GIOH. En lasinmunodetecciones en los diferentes órganos se observó que la presencia de laproteína G10H (en el tallo y en las raíces) coincidió con la presencia de las CPRs de 87y 84 kDa; por el contrario, en las flores y las hojas, en las que se detectaron dospresLintas CPRs de masas moleculares de 78 y 74 kDa, no contuvieron a la proteínaG10H, por lo que alguna (o las dos) CPRs de 87 y 84 kDa deben ser las que reducen ala G10H /.n vÍ.vo.

El estudio de la regulación de esta importante enzima de la biosíntesis de losAMls es un campo prácticamente virgen. Los anticuerpos caracterizados en el presentetrabajo pueden permitir responder algunas preguntas básicas sobre la regulacíón deesta proteína.

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102

CAPITUL0 Vl

PERSPECTIVAS

El presente trabajo deja abiertos algunos tópicos interesantes:

1. Los datos mostrados en esta tesis sugieren que la CPR es una glucoproteína,pero no se sabe qué tipos de carbohidratos contienen. El empleo deendoglucosidasas F y H piiede ayudar a determinar qué clases de glucósidosestán presentes, lo cual permitiría tener indicios del compartimiento subcelularque participa en el proceso de glucosilación (retículo endoplásmico o aparato deGolgi).

2. Aparentemente en C. roseus varios compartimentos subcelulares poseenactividad de CPR. El hecho que la actividad de reductasa plasmática searesistente a antimjcina A y específica para NADPH sugiere que se trata de unaCPR (datos no presentados). Faltan otros datos que confirmen la existencia deCPR en la membrana plasmática de C. mseus. Por ejemplo, se tiene queinmunolocalizar a las CPRs de C. roseus y determinar su distribución dentro dela célula. También tendrá que determinarse si la reductasa plasmática es capazde reducir enzimas P450 clásicas.

3. Se puede emplear el antisuero contra la G10H para estudiar la regulación de laG10H en las raíces de C. roseus expuestas a diferentes condiciones adversas,analizando a la GIOH (actividad enzimática y contenido de proteina) en cursostemporales y en fLinción de dosis-respuesta. Bajo estas diferentes condicionesse podría comparar con el comportamiento de las CPRs, la proteína P450 Ca4H(también presente en C. roseus), así como con otras enzimas que parlicipan enel metabolismo de los AMls y con enzimas involucradas en la síntesis de otrosmetabolitos secundarios, para entender si la G10H está o no coordinadamenteregulada con otras enzimas.

4. Analizar en plántulas de C. noseus si la G10H y la CPR están reguladas temporaly espacialmente.

5. Comparar a las G10Hs de diferentes fuentes vegetales, particularmente con la delas Lon/.ceras. Este género de plantas se caracteriza por acumular secologanina.

6. Un punto importante que no se ha logrado hasta el momento es la obtención delgen de ia GioH. Desde ei punto de vista biotecnoiógico, ia sobreéxpresión deeste gen pudiera proveer de líneas celulares o plantas sobreproductoras deAMls. Los anticuerpos caracterizados en el presente trabajo podrian serempleados para tratar de clonar el ADNc de la G10H.

7. Al momento no se conoce la secuencia de aminoácidos de la proteína G10H unaopción para ello es purificar esta proteína de C. mseus. Si se obtuviera lasecuencia de aminoácidos, se podrían diseñar sondas específicas quepermitieran clonar al gen de la G10H.

103

Anexo 1

Metodologías empleadas para cuantificar las actividades /.n yi.fro de las enzimasgeraniol 10-hidroxilasa y NADPH: Cit c (P450) reductasa de Caíharanlhus roseus.

ENSAYO DE ACTIVIDAD DE LA NADPH: Cit c (P450) reductasa (CPR)

Para medir la actMdad de la enzima CPR se empleó como sustrato artificial alcitocromo c (tipo 111, de corazón de caballo) y se siguió la metodología reportada porLord (1988), con modificaciones.

Los microsomas crudos son una mezcla compleja de membranas. Para mediradecuadamente a la CPR se incluyeron los compuestos cianuro de potasioantimicina, los cuales son inhibidores de las enzimas mitocondriales cit c oxidasaNADH: cit c reductasa que interferirían en el ensayo oxidando el ferrocitocromo ccontribuyendo a la reducción del ferricitocromo c, respectivamente.

Brevemente, el ensayo consitió de una mezcla de reacción compuesta de 0.5 Mde Tris-Hcl, pH 7.5, 0.5 mM de cianuro de potasio, 5 LiM de antimicina, 50 HM deferricitocromo c, 0.15 mM de NADPH y el extracto proteico (menos de 30 Hg de

proteína), en un volumen final de 500 Ltl. La reducción del ferri-citocromo c a ferro-citocromo c se midió siguiendo el aumento de la absorbancia a 550 nm, a intervalos de15 s durante 3.5 min.

ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE LA Geraniol 10-hidroxilasa (G10H)

lLa actividad de la G10H fue medida de acuerdo a Hallahan et al. (1992) y Meijeret al. (1993) con modificaciones. Brevemente. la actividad de la G10H se midió en 50

Tr#3:fa5:Tdey%tapsL°ó,::d7e5[.3|.2cH.#:nTo??ip:¿Í)°e:Mund:oFf:::°f,:aYg:55M#'La reacción se inició adicionando los microsomas (1-10 Hg de proteína). El ensayo sellevó a a cabo durante 5-10 min a 37°C y la reacción se detuvo por alcalinización con 5

Hl de KOH 2 M. Se adicionó hidroxigeraniol frío como acarreador (hasta unaconcentración final de 15 mM). Los terpenos fueron extraídos con 200 Lil de acetato deetilo. El sustrato y el producto de la reacción se separaron por cromatografía de placafina, empleando el sistema de disolventes benceno:acetona:acetato de etilo (2:1:1).Los terpenos se revelaron con vapores de yodo y la banda correspondiente alhidroxigenaniol se raspó y se adicionó a 5 ml de llquido de centelleo para cuantificar laradiactividad.

105

RESULTADOS

ENSAYO DE ACTIVIDAD DE LA CPR

Para construír la curva de calibración del ferrocitocromo c, el ferricitocromo c fuereducido empleando ascorbato de sodio. En la Figura 1 se presenta la curva decalibración del ferrocitocromo c. Las mediciones se realizaron a 26°C, en una\ celda de

#€,s#af::c2Tg:amn#,ocmA,paeT,:fae,%setoussga;:;as:a::[c,:,ró,:nc::;2:,dendt:€:oecf:nmc¿Ó:reducido durante los ensayos de actividad de la enzlma CPR .

0 5 10 15 20 25

citocromo c reducido (nmoles)

Figura 1. D®teminsción del co®ficiento de extinción molar del forro€itocromo c. El ferricitocromo cfue reducido químicamente empleando ascorbato de sodío.

La FigLira 2 corresponde a la estandarización de la cantidad de proteínamicrosomal necesaria para cuantificar adecuadamente a la CPR en C. roseus. Comose observa en esta figura, la reducción del ferricitocromo c es lineal al principio de losensayos y luego deja de aumentar de manera proporcional. El momento en que lapendiente se inclina depende de la cantidad de proteína usada en el ensayo. Laactividad específica calculada dLirante el primer minuto de reacción (momento en quela mayoría de las pendientes aún son lineales) son: para 1.3 LLg de proteína, 2.05 nKat.

106

::P:::-t'.ípyar:a6ra5H296d:gpr3tee¡::¿tíeí:an,K:t3Hgn£;:t-tL§arparo]t.9HÉs::Púr,:,t:íana;aí.:ens{ittasubestimada en este momento, pero calculada en los primeros 15 s de la reacción, laactividad específica para esta reacción fue de 1.9 nKat. tig prot-'. Para evitarsubestimar la actMdad de la CPR se decldió emplear menos de 30 Hg de proteínamicrosomal y medir la reducción del ferricitocromo c a intervalos de 15 s.

El ensayo de la actividad de la CPR fue validado probando si la reducción delferricitocromo c es inhibidc) con el ácido p-cloromercuribenzoico (pCMB) (Madyastha yCoscia, 1976). Como se observa en la figura 2, el resultado fue congruente con loesperado.

ENSAYO DE ACTIVIDAD DE LA GIOH

Para cuantificar la cantidad del [3H-C1]-hidroxigeraniol formado durante elensayo, éste se extrae de la mezcla de reacción con un disolvente, en este caso, conacetato de etilo. Sin embargo, al mismo tiempo se extrae el sustrato. El geraniol (G) yel hidroxigeraniol (HG) se separaron por cromatografía de capa fina empleando unsistema de disolventes compuesto de benceno: acetona: acetato de etilo (2:1 :1 ).

En las metodologías reportadas para medlr a la GIOH el extracto orgánico esevaporado totalmente y postenormente resuspendido en un volumen pequeño, para su

::á:s:sdpeorHár:rToatpoagr:af:3c,:nn,,znaure,:trroeccuapseor,a:,róenv':eF[3'i-8f]r-aHcá'óÉ|aHdécl:,noaamdoesmá:de funcionar como acarreador funcionó también como indicador (permitió visualizarlodespués de revelar las placas), evitando la necesidad de concentrar las muestras. Estamodificación acorta significativamente el tiempo del ensayo. pues dependiendo delnúmero de muestras, el paso de evaporación puede llevarse a cabo en vanas horas.

Para visualizar a los monoterpenos se probaron varias técnicas reportadas comoson la inmersión en ácido fosfomolibdico, el asperjado con solución ácida de vainillinay el revelado con vapores de yodo. La primera se descartó porque resultó una tincióndestriictiva; la segunda dio una coloración azul permanente que interfirió de maneraimportante con la cuantificación de la radiactividad, provocando el apagamiento de laseñal (o "quenching"). Por ello seleccionamos el revelado con los vapores de yodo, elcual es una tinción no permanente, por lo que no provocó interierencia con la lecturade la radiactividad. Después del revelado la banda correspondiente al HG se marcócon lápiz y se esperó a que el color desapareciera. La banda se raspó de la placa y seadicionó a la mezcla de centelleo, para la cuantificación de la radiactividad. La Figura 3muestra los resultados sobre la estandarización de la cantidad de proteína microsomaly del tiempo de reacción necesarios para medir adecuadamente la actividad de laG10H. Como puede observarse, con las condiciones empleadas en este ensayo laactividad fue lineal durante los primeros 10 min cuando se usó hasta 7 Lig de proteínamicrosomal. A los 15 min de reacción la can{idad de [3H-C1]-HG fue similar alrecuperado a los 10 min, por lo que la actividad específica disminuyó drásticamente.Para evitar subestimar la actividad de la G10H se decidió medir su actividad a los 5 o10 min de reacción y empleando menos de 10 Hg de proteina microsomal.

107

• 1-3Hg^ 6.5Hg

0 13ug26L`g

0 26ug.1mMpCMB

•,0,®,

• JJ/JJ,\f),

•o/ JL JL

1\

0 50 100 150 200 250 300

Tiempo (s)

Figura 2. Validación del ensayo do actividad de la CPR. El ensayo se realizó empleando diferentescantidades de proteína microsomal (obtenida a 1500,000 X g) procedente de las raíces transformadas deC. roseus.

El ensayo de la actividad de la G10H se validó usando diferentes tratamíentosque inhiben su actividad (Cuadro 1). El monóxido de carbono, por ejemplo, se une algrLipo hemo de las mono-oxigenasas P450, evitando que estas enzimas puedan unir aloxígeno molecular. Cuando se burbujeó CO a la mezcla de reacción la formación deHG disminuyó en un 86%. El p-CMB inhibe a la CPR y por lo tanto se espera quetambién inhiba la actividad de la G10H. En presencia de éste compuesto lahidroxilación del geraniol disminuyó en un 96°/o. El cit c, el cual compite por loselectrones que transfiere la CPR a la G10H, también intefflrió en la reacción.

En el ensayo realizado sin proteína o cuando se adicionó la solución de paroantes de iniciar la reacción (tiempo cero) no se detectó la actividad. Todos estosresultados confirman que la hi.droxilación del geraniol está siendo medi.ada por unaenzima mono-oxigenasa.

108

Cuadro 1. Validación del ensayo de actividad de la enzima geraniol IO-hidroxilasaempleando compuestos que interfieren con la actividad de las mono-oxigenasas

Te

CONDICIÓN % DE INHIBICION RESPECTO AL

el

CONTROL

Burbu'eo de Monóxido de carbono 86JAdición de p-CMB (0.6 mM)

96

Adición de cit c (30 HM) 86

Calentamiento de la proteina98microsomal 90°C 10 min

ambién se incluyó un control empleando protelna desnaturalizada térmicamente La actividad ennsayo control fue de 13 26 pKat. mg prot -' 109

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0

Tiempo (min)

0 5 10 15 20 25 30

Proteína microsomal (Hg)

Figura 3. Eslandarización del liompo de reacción adocuado (panel A) y do la canlidad do proteínariocosana (panel 8) para cuan{ificar la actividad de la enzima GIOH. En ambos paneles (.)corresponde a la cantidad de hidíoxigeraniol formado durante el ensayo y (0) corresponde a la actMdadespecífica.

110

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111

Anexo 11Geraniol10-hidroxilasayNADPH:citc(P450) reductasa de C. roseus.

A contínuación se presentan algunos resultados obtenidos sobre la regulaciónd e las enzima G10H y CPR de C. noseL/s los cuales no fueron inclujdos en los capítu OS

de los resultados, pero que resultan interesantes para conocer mejor a estas enzimas.

REGULACIÓN ESPACIAL

Con el fin de obtener información sobre la distribución de las enzimas G10H yCPR en C. roseus se midieron sus actividades en diferentes órganos de la planta. Laactividad de la enzima CPR fue detectada en todos los órganos analizados (Cuadro 1),congruente con el resultado d el inmunoblot de las CPRs en los órganos de la planta C.roseus (capitulo 2, Figura 5). Por el contrario, la actividad de la G10H fue casiindetectable en las hojas y en las flores, estando solamente de manera clara en el ta 0y en las raíces.Cuadro1.Actividades de las enzimas G10H y CPR en diferentes órganos de la

pl anta C. roseus.

P

ÓRGAN0 DE LA CPR G10H

a

PLANTA(nKat. ma prot-1) (PKat. mq prot-1)

Hojas 2.8 ± 0.25 0.23 ± 0.007

Tallo 3.8 ± 0.27 11.7 ± 0.64

Flores 1.4 ± 0.12 0.35 ± 0.03

Raices 0.95 ± 0.05 8.6 ± 0.46

Cuando se analizaron estas muestras usando el antisuero contra la GIOHroteína G10H fue inmunodetectada en el tallo y en las raíces, pero no en las hojas y

en las flores (Figura 1), lo cual es compatible con los datos de la actividad de estamono-oxigenasa. Estos resu tados sugieren que la distribución espacial de la G10H estejido-específica, mientras que la CPR está presente en todos los órganos. Sinembargo, no puede descartarse una regulación tempora y que la G10H esté presentee n las hojas y en las flores en otros momentos del desarrollo, o que se induzca enéstos Órganos bajo condiciones de estrés.113

§ vssb:Sb .~BL .<ffN*

G10H

Ca4H

lJ-.

Figura 1. Inmunodetección de la G10H en diferentes órganos de la planta C. roseus (panelsupei.ior). En la par(e inferior se presenta la inmunodetección de la probable Ca4H de C roseus. Ca4Hes una proteína P450 que participa en la biosíntesis de los compuestos fenLlpropanoides, y es ubicua enlas plantas. En cada carril se aplicó 70 LLg de proteína microsomal.

La presencia aparentemente ubicua de la CPR en la planta C. roseus (aúncuando la G10H esté ausente) puede ser debido a su requerimiento por otras enzimasP450. Se hicieron también inmunoblots empleando el antisuero contra la enzima P450f{inámico 4-hidroxilasa (Ca4H). A diferencia del antisuero contra la G10H, el antisuerocontra la Ca4H reconoció múltiples proteínas en C. roseus, pero por sus masasmoleculares es improbable que todas sean proteínas P450 (dato no presentado). Enbase a la masa molecular reportada para la Ca4H de C. roseus (Benveniste et al.,1989), en la Figura 1 se presenta la inmunodetección de la probable Ca4H. Comopuede observarse la distribución de esta proteína fue diferente a la distribución de laG10H. Sin embargo. se requiere identificar contundentemente a la Ca4H de C. roseus.

RESPUESTA DE LAS PROTEÍNAS CPR Y G10H EN RAÍCES TRANSFORMADASSOIVIETIDAS A DIFERENTES TRATAMIENTOS.

Con el fin de determinar si las proteínas CPR y G10H se inducen con lostratamientos a los que se sometieron las raíces transformadas para analizar elcomportamiento de las respectivas actMdades (capítulo 3), se exploró si era posibleinmunodetectar a estas proteínas en las alícuotas almacenadas. Cabe mencionar queestas muestras fueron almacenadas ininterrumpidamente a -86°C duranteaproximadamente casi 3 años. En la Figura 2 se presenta el resultado obtenído.

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Figura 2. lnmunodotección de la GIOH y do la CPR on raTc®s ti.ansformadas de C. ros®us quefueron sometidas a diferentes tratamlentos. Los carriles con las leyendas -fosfato y 8% de sacarosase refieren a la transferencia de las ralces a medio de cultivo sin fosfato y a medio de cultivo con 8% desacarosa, respectivamente. En los otros casos los compuestos se adicionaron directamente al cultivo. Entodos los casos las ralces se encontraban en el día 24 del cjclo de cultivo al iniciar el tratamiento y secosecharon a las 96 h, excepto con el tratamiento con sacarosa que fue cosechado a los 7 días . En cadacarrLI Se aplicó 70 LLg de proteína microsomal

Tanto la G10H como las CPRs fueron visualizadas en los inmunoblots. Similar alcomportamiento de las actividades cuantificadas en estas condiciones (capítulo 3), laproteína CPR parece inducirse con todos los tratamientos, aunque en diferentesgrados. Por el contrario, la cantidad de la proteína G10H es visualmente similar a la delcontrol en la mayoría de los casos, pero se induce cuando las raíces son transferidas amedio de cultivo sin fosfato o a medio de cultivo con 8°/o de sacarosa. También la CPRparece inducirse de manera importante en estas condiciones, lo que sugiere que enestos tratamientos la inducción de estas proteinas tiene un fin metabólico común.

La inducción de la CPR que ocurre cuando la proteína G10H no aumenta puedeser explicada por el papel central que juega esta reductasa en el metabolismo mediadopor diversas proteínas P450. De acuerdo a la literatura, C. roseus posee al menos 16protelnas P450 (Meijer et al.1993).

REFERENCIAS

Benvenlst® 1„ A. Lesot, M. P. Hasenfratz and F, Durst (1989). lmmunochemical characterization ofNADPHcytochrome PJ50 reductase from jerusalem anichoke and other higher planG, B/.ocAem. J., 259.847-853

Meijer A. H., E. Souer, R. Vorpoorto and J. H. C. Hoge (1993). lsolation of cytochrome P450 cDNAclones from the higher plant Caíharaníhus mseus by a PCR strategy, P/an( Mo/, B/o/., 22: 379-383.

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