ENZIMOLOGIJAH T T P : / / W W W. S B C S . Q M U L . A C . U K / I U B M B / E N Z Y M E /

DNK polimeraze struktura, funkcija i evolucija

MEHANIZMI ODRŽAVANJA INTEGRITETA GENOMA

Genome Integrity & StructuralBiology Laboratory, NIH

Uvod

Pravilna i tačna replikacija DNK je neophodna da bi se sačuvao integritet genetičke informacije kroz generacije.

Učestalost greške tokom replikacije je niska, 10-10–10-11

Tačnost replikacije se zasniva na dva koncepta

DNK mora da bude intakta što je više moguće.Bez bilo kakvih oštećenja pre procesa replikacije.

Tačnost relikacije koja se izvodi naneoštećenoj DNK ima svoja ograničenja.

Otkriće DNK polimeraze I

1956. godine Artur Kornberg je izolovao prvu polimerazu, a 1959.godine je sa Severno Oha dobio Nobelovu nagradu za fiziologiju imedicinu “za otkriće mehanizma biosinteze DNK”. Istraživanja na DNKPol I su dala osnove za istraživanja strukurnih i biohemijskihmehanizama replikacije DNK.

DNK polimeraza I

Zahteva postojanje prajmera

Aktivna samo u prisustvu matrice

Egzonukleazne aktivnosti u oba smera

Niska proceivnost

Primarna uloga je da popuni pukotine u DNK molekulu koje nastaju tokom replikacije, reparacije i rekombinacije DNK

Mogućnost dopunjavanja aktivnosti između polimeraza koje su izolovane iz evolutivno udaljenih organizama

Bez obzira na raznolikost prokariota i njihovih staništa, sekvenca DNK polimeraze I je ostala

nepromenjena

3D struktura DNK polimeraze I

Tri domena: dlan, palac i prsti

Prsti – dNTP i jednolačana DNK, Palac – dvolančana DNK i Dlan –sadrži katalitički centar i takođe vezuje dNTP

Na C – terminalnom kraju 6 konzervisanih motiva od kojih

3 liče na motive DNK Pol a sisara i označeni su kao motiv A, B i C. A i C – dlan; B – prsti.

Visok stepen aminokselinskih zamena u aktivnom mestu DNK Pol I:

- 3 od 26 aminokiseline neophodne za in vivo funkcionisanje enzima (motiv A Asp610) i (motiv B Arg659 i Lys663)

- zamena 3 od 4 aminokiseline dovodi do promene supstratne specifičnosti enzim (motiv A Ile614, Glu615 i Arg617)

Evolucija aktivnog mesta DNK Pol I

➢ Vrste istog roda imaju gotovo identično aktivno mesto na nukleotidnom

nivou što sugeriše da je brzina evolucije polA gena izuzetno spora.

➢ Izuzetna plastičnost aktivnog mesta

- visoku toleranciju DNK Pol I na visok stepen mutacija sa kojima se sreće i

omogućava generisanje “dobrih” mutacija koje obezbeđuju kratkoročnu

selektivnu prednost.

- postoje mehanizmi za održavanje nukleotidne sekvence tokom evolucije

koji još nisu otkriveni.

Familije DNK polimeraza

Familija A - Pol I, Pol γ, T3, T5 i T7

Familija B – Pol II, Pol α, d, ε, ζ, T4, virusa, arhea

Familija C – Pol III

Familija D – nije dobro okarakterisna, Euryarchaeota

Familija X – Pol b, σ, λ, μ i TdT

Familija Y – TLS polimeraze (Pol η, ι, κ), Rev1, Pol IV, Pol V

Familija RT - retrovirusi, eukariotske telomeraze

DNK polimeraze prokariotaEscherichia coli

DNK polimeraze prokariotaEscherichia coli

Holoenzim DNK polimeraza III E. coli u toku replikacije vodećeg i zaostajućeg lanca

Shema delovanja dnk poli E. coli u nastajanju i sprečavanju grešaka u replikacionoj viljušci

ZAKLJUČAK Pomoćne polimeraze mogu, bar povremeno, da priđu replikativnoj

viljušci i učestvuju u procesu replikacije.

Učestalost greške tokom replikacije zavisi od tipa polimeraze.

Pol III nema tendenciju da proces sinteze novih lanca prepusti drugim polimerazama osim u određenim situacijama. Najverovatnije prva za to je Pol II.

Pol IV i Pol V moraju da se takmiče sa Pol II za ovu aktivnost i to prevashodno na zaostajućem lancu.

t je ključni faktor koji detektuje zastoj Pol III i omogućava njenu eventualnu zamenu drugom Pol koja nastavlja sintezu.

Sve napred rečeno daje odgovor na pitanje zašto je vernost replikacije u wt ćelijama nekoliko puta veća na zaostajućem nego na vodećem lancu.

Familije DNK polimeraza

Familija A - Pol I, Pol γ, T3, T5 i T7

Familija B – Pol II, Pol α, d, ε, ζ, T4, virusa, arhea

Familija C – Pol III

Familija D – nije dobro okarakterisna, Euryarchaeota

Familija X – Pol b, σ, λ, μ i TdT

Familija Y – TLS polimeraze (Pol η, ι, κ), Rev1, Pol IV, Pol V

Familija RT - retrovirusi, eukariotske telomeraze

Jedna DNK polimeraza – više funkcijaJedan događaj sinteza DNK –učešće više DNK polimeraza

POLIMERAZNA subjedinica idruge funkcionalne subjedinice

Aktivno mesto veoma konzervisano tokom evolucije

❖ 5’-3’ polimerazna aktivnost

❖ nema egzonukleaznu aktivnost

❖ niska procesivnost

❖ započinje sintezu DNK sintetišući

prajmer i kratak lanac DNK

❖ B familija

Glavna karakteristika svih DNK polimeraza je njihovanesposobnost da sintetišu lanac DNK de novo.

Arezi and Kuchta, Trends Biochem. Sci. 2000

49kDa subjedinica-počinje sintezu DNK de novo-katalitički centar primaze

70-90kDa (B) subjedinica-nema enzimsku aktivnost-uključena u regulaciju inicijacije replikacije

58kDa i 49kDa subjedinice-formiraju heterodimer primaze i tada je njena aktivnost max

180kDa subjedinica-elongacija početnog prajmeraod najmanje 8-12 nukleotida koji Polαprodužuje sa još ~20 nukleotida

Arezi and Kuchta, Trends Biochem. Sci. 2000

➢DNK pol α igra značajnu ulogu u koordinisanju replikacije, DNK reparacije i kontrolnim tačkama ćelijskog ciklusa

➢Kinaze zavisne od ćelijskog ciklusa fosforilišu i na taj način regulišu aktivnost DNK pol α tokom ćelijskog ciklusa

- Dva domena na polipeptidnom lancu od 39kDa:

31kDa domen (DNK polimerazna aktivnost)

8kDa domen ( dRPase za uklanjanje fosfata sa 5‘-kraja)

-Tri aspartata u aktivnom mestu su uključena u trasfer dNMP isto kao i kodDNK Pol I prokariota.

- Učestvuje u procesu isecanja baza tokom reparacije kod sisara:

short patch BER - (zamena jednog nukleotida) Pol β

long patch BER - (zamena nekoliko nukleotida, 2-13) Pol δ i Pol ε

Replikacija i reparacija mitohondrijalne DNK

Bailey and Doherty, Bioche. Soc. Trans. 2017

Mitohondrijska DNK čoveka. Shematski dijagram 16,6 kb dugog cirkularnog dvolančanog molekula mtDNK, gde spoljašnjikrug predstavlja teški lanac, a unutrašnji krug laki lanac. Prikazani su geni koji kodiraju komponente mitohondrijskog

respiratornog lanca: MTND1-6, MTCOI-II, MTATP6 i 8, MTCYB; geni za dve rRNK (zeleni boksevi) i geni za 22 tRNK (crveni kružići). Prikazana je i kratka trolančana struktura: D-petlja. (Chinnery and Hudson, British Medical bulletin, 2013.)

Heterotrimer, Polimerazna 5’-3’ aktivnost, Egzonukleazna 3’-5’ aktivnost, Reparacija- katalitička γA subjedinica (POLG1)- γB subjedinica (POLG2) – homodimerni pomoćni protein

Replikacija i reparacija mitohondrijske DNK

Szymanski et al., EMBO J, 2015.

Mutacije POLG gena dovode do brojnih poremećaja. Sve kopije mitohondrijske DNK kod čoveka vode poreklo od majke.

Replikacija i reparacija mitohondrijalne DNK

Shematski prikaz humanog mtDNK replizoma.Hudson and Chinnery, Human Mol Gen, 2006.

Dva predložena modela replikacije mtDNK:- Model asinhrone replikacije tj.

asinhrone zamene lanaca- Dvosmerni model replikacije spojenih

lanacaOdvija se u svim fazama ćlijskog ciklusa –relaksirana replikacija

POLRMT – primaza mitohondrija

PrimPol – nova eukatiotskaprimaza/polimeraza, jedro i mitohondrije,nije esencijalan protein

http://www.kerchner.com/mtdnachart.htm

http://www.norwaydna.no/mtdna_en/

Alpers sindromDečije miocerebrohepatopatijeDominanten i recesivne oftalmoplegijeNeuropatije

▪ kompleks od četiri subjedinice (heterodimer)

▪ 5’-3’ polimerazna i 3’-5’ egzonukleazna aktivnost

▪ katalitička aktivnost zavisi od PCNA

▪ visoka procesivnost i tačnost

▪ replikacija i reparacija

(isecanje nukleotida,

“mismatch”, TLS)

C terminalni domen katalitičke subjedinice

- neophodan i dovoljan za funkcionisanje

- senzor replikacije, Zn2+ prstići (koordiniše transkripcioni odgovor, odgovor ćelije

na blokiranje replikacije i oštećenje DNK tokom S faze ćelijskog ciklusa)

- nije odgovorna za proveru kontrolnih tačka u S fazi (DNK polimeraza α-primaza)

▪ kompleks od četiri subjedinice

▪ 5’-3’ polimerazna i 3’-5’ egzonukleazna aktivnost

▪ visoka procesivnost i tačnost

▪ replikacija i reparacija

Replikativna viljuška28 godina kasnije

A. Model iz 1990. godineB. Trenutno važeći model

Pavlova & Scherbakova, Mutat. Res. 2011

Rezultati eksperimenata sa mutantima Pol δ i Pol ε koji nisu imali egzonukleaznu aktivnost

✓ Obe polimeraze su uključene u replikaciju✓ Sinergisički efekat njihove egzonukleazne aktivnosti✓Mora da postoji neki mehanizam po kome se određuje koja polimerazareplikuje određeni lanac DNK molekula

Rezultati eksperimenata sa mutantima Pol δ i Pol ε za seleciju baza

✓ Pol δ popravlja greške koje napravi Pol α✓ Pol ε uključena u replikaciju vodećeg lanca✓ Pol α i Pol δ sintetišu zaostajući lanac, a Pol ε sintetiše vodeći lanac.

Replikativna viljuška 28 godina kasnijeŠta se ne slaže u u modelu jedna polimeraza jedan lanac DNK

❖ Kada je deletiran gen za Pol ε, Pol δ može da je zameni, ali ne i obrnuto

❖ Kada je inaktivirana egzonukleazna aktivnost Pol δ znatno se povećava stopa mutacija u genomu, ali ne kada se naprave analogne mutacije u Polε

❖ Pol δ i Pol ε imaju afinitet ka istom tipu grešaka koje nastaju pri replikaciji (u tom slučaju bi smo imali aditivni efekat njihove aktivnosti)

❖ Pojava lezija na matrici regrutuje TLS polimeraze, a u tome učestvuje Pol δ i to na oba lanca

❖ in vitro eksperimenti su pokazali da je Pol δ efikasnija od Pol ε

Pavlova & Scherbakova, Mutat. Res. 2011

Autonomous ReplicationSequence

Pavlova & Scherbakova, Mutat. Res. 2011

❖ Kada je inaktivirana egzonukleazna aktivnost Pol δ znatnose povećava stopa mutacija u genomu

❖ Pol δ i Pol ε imaju afinitet ka istom tipu grešaka koje nastajupri replikaciji

❖ U korelaciji je sa starim modelom da su obe polimeraze angažovane u replikaciji na odvojenim lancima, ali se to dešava samo u domenu starta replikacije

❖ U replikaciji genoma učestvuju i TLS polimeraze, sa posebnim osvrtom na ulogu Pol ζ

Četvrta polimeraza iz B familije

Jezgro od dve subjedinice koje su u asocijaciji sa Rev 1 proteinom:

Rev3 katalitička polimerazna subjedinica

Rev7 subjedinica (povećava katalitičku aktivnost polimeraze)

nema egzonukleaznu aktivnost

Transleziona sinteza DNK

Najverovatnije četvrta polimeraza u replikativnoj viljušci čije je uključivanje u proces replikacije ograničeno i veoma dobro kontrolisano.

Član Y familije eukariotskih DNK polimeraza

Ima ubikvitin-vezujući domen za interakciju sa PCNA

C-terminalni domen (AK 1130-1251) za interakciju u kompleksu Rev3-Rev7 i sa drugim translezionim polimerazama

Hoolog UmuC kod E.coli (Pol IV) Johanson et al., PNAS 1999

Eubacteria – familija C DNK polimeraza

Archaea/Eukarya – familija B DNK polimeraza

Zn prsti na C – terminusu Pol ε homologi Zn prstima Pol II i polimeraza izD familije

Hipoteza da je arhea predak eukariota kodirao tri DNK polimeraze, dve zasebne B familije i D familiju polimeraza.

Inaktivirani Pol-Exo domen Pol ε je esencijalan za život ćelije što ukazuje na neku njegovu još ne otkrivenu funkciju.

(a) – Pol α*, (b) - Pol ε, - Pol δ*; * - esencijalneU familju B spada jos i Pol ζ ali ona ne učestvuje u replikaciji već u translezionoj sintezi.

Klasična struktura eukariotskihpolimeraza iz B familije :N---Exo-Pol---Zn---C

Jezgro DNK Pol ε – Pol2, je protein dugačak preko 2000 AK što je znatnoduze od drugih navedenih polimeraza

Zapaža se umetak između katalitičkihdomena i terminalnih Zn-prstiju po dužini sličan exo-pol modulu.

Analiza neokarakterisanog međudomena

Heterotetramer Pol ε[Krioskopska EM, 20 Å]

„Site-directed“ i deleciona mutagenezakatalitickog exo-pol modula na N krajupokazala je da on nije esencijalan za vijabilnost. Ono sto je jako iznenađujuće, je da ako se iste metode primene na međudomen, doznajemo da on jeste esencijalan.Dalje je analizirana sekundarna struktura i pokazano je da prvih 1200 AK na N krajugrade klasičan polimerazni domen što je iočekivano. Ono što nije ocekivano je da narednih ~1000 takođe grade polimeraznidomen.BLAST analiza je pokazala da druga polimerazna jedinica poseduju najveći stepen homologije sa bakterijalnim B DNK Pol (DNK Pol II, Photbacterium profundum, 90%).

Analiza sekvence

Konzervirani egzonukleazni i polimerazni domeni kod aktivnih polimeraza B familije poređeni sa neaktivnim C domenom Pol ε.Motivi koji su sastavni deo aktivnog centra su obeleženi sa Exo I-III odnosno Region I-III za Exo odnosno Pol domene. Ostaci katalitičkih AK su označeni sa #, i primećujemo da su to najkonzerviraniji regioni, ali da nisu konzervirani kod posmatranog međudomena.To nam govori da taj domen zapravo nije katalitički aktivan. Jedini motiv koji je konzervisan je „DIE“ motiv u exo domenu, zbog čega ova jedinica verovatno zadržava sposobnost vezivanja jona metala.

Tahirov et al., Biology Direct, 2009.

Male subjednice kompleksa DNK Pol

Još jedna esencijalna komponenta Pol ε je njena mala subjedinica DPB2 za koju je pokazano da je ona derivat exo domena arhealne DNK Pol iz familije D, ipokazano je da je i ona neaktivna.Dolazimo do zaključka da su obeesencijalne subjedinice Pol ε neaktivne, što nam govori o tome kako postoji selekcionipritisak da se iskoriste i neaktivne formeenzima odnosno da one steknu noveuloge. Najverovatnije da ove subjediniceučestvuju u formiranju kompleksa.

Poreklo neaktivnog exo-pol domena?Kada prepoznamo ovakav motiv u proteinu, da se slične jedinice nalaze jedna uz drugu, očekujemo da je to produkt tandemske duplikacije gena. Medjutim, pokazalo se da je neaktivnapolimerazna jedinica dosta sličnija nekim drugim polimerazama iz familije B (konkretnobakterijskim), nego aktivnoj polimeraznoj jedinici uz koju se nalazi. Štaviše, aktivna polimeraznajedinica Pol ε se po konzerviranim blokovima razlikuje od inaktivne jedinice kao i svih drugih B polimeraza po prisustvu nekoliko dodatnih unikatnih inserata.

Shema konzerviranih i specifičnih inserata u najkonzerviranije delove katalitičkihdomena polimeraza B familije. Tahirov et al., Biology Direct, 2009.

Poreklo Zn-prstiju eukariotskih polimeraza

Uporedjivanjem sekvenci Zn-prstiju utvrđeno je da Zn-prstiPol ε pokazaju mnogo veću homologiju sa arhealnim Pol iz D familije nego sa ostalimeukariotskim Pol. To daljesvedoči o filogenetskojudaljenosti ove polimeraze.

Tahirov et al., Biology Direct, 2009.

To nam svedoči o komplikovanijem evolutivnom scenariju, za koji je potrebno još dokaza.

Pomoću ovakvih informacija o homologijikonstruisano je filogenetsko stablo, u kome se

primećuje da je neaktivna polimerazna jedinicaPol ε povezana sa drugim aktivnim polimerazama,

ali bliže od njih sa bakterijskim B DNK polimerazama, dok je aktivna polimerazna

jedinica slabo povezana sa svima njima, i da je blisko povezana sa glavnim arhealnim B DNK

polimerazama.

Filogenetsko stablo DNK Pol B familije

Korišćenjem konzerviranih blokova dobijenih nakon poređenja Exo-Pol domena konstruisano je filogenetsko stablo. Neaktivni C domen Pol ε ima x. Zn finger 2* označava različitu verziju kod Pol ε.

Tahirov et al.,Biology Direct,2009.

Eukariotska B familija polimeraza vodi poreklo od dve evolutivno udaljene B familije Archaea, jedna je dala Pol

ε, druga je najverovatnije predak Pol α, Pol δ i Pol ζ

Najverovatniji evolutivni scenario

Pre-Pol αδζ najverovatnije vodi poreklood minornih arhealnih B DNK polimeraza. Duplikacijom idiversifikacijom ove pre-Pol su nastalePol α, δ, i ζ. S druge strane, pre-Pol ε, koja sadrži samo aktivnu polimeraznujedinicu, vodi poreklo od majorniharhealnih DNK pol. Svoju inaktivnujedinicu stekla je najverovatnije od nekebakterijske B DNK polimeraze, na šta ukazuje njena homologija. Najviše smisla ima da to budu polimeraze alfa-proteobakterija, koje su učestvovale u eukariogenezi (mitohondrije).

Predačke arhealne polimeraze

Male subjedinice vode poreklo od arhealnih DNK pol D, odnosnoporedstavljaju njihove inaktiviraneegzonukleazne domene. Od D DNK Pol nasleđeni su i C-terminalni Zn-prsti.Dakle, znamo da je poslednji arhealnizajednički predak morao nositi baremdve vrste B DNK Pol i jednu vrstu D DNK Pol, kao i da su njegove B DNK Pol u nekom trenutku primile Zn-prsteod D DNK Pol, što još nije nadjeno nikod jedne arhee. Približavanje ovakvomdokazu bi bio sledeći korak u razumevanju evolucije eukariotskihpolimeraza.

DNK POLIMERAZE I NJIHOVA BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA

Aschenbrenner and Marx., Curr. Opin. Biotech. 2017

DNK POLIMERAZE I NJIHOVA BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA

➢Veliki napredak u biotehnologiji je povezan sa otkrićemrazličitih DNK polimeraza

➢Posledično i dalje postoji potreba za DNK polimerazamaodređenih karakteristika

➢Sofisticirane metode za selekciju enzima značajno pomažu

➢Dodatne modifikacije metodama genetičkog inženjerstva

➢ Identifikacija i karakterizacija novih DNK polimerazabakterija, arhea i virusa

Teme za prezentacije- Primena DNK polimeraza

- DNK polimeraze Archea

- DNK polimeraza α – primaza

- Reverzne transkriptaze – virusa

- Reverzne transkriptaze – eukariota

- Mitohondrijska genetika