DNA Replication

DNA Replication II

Replicazione e ricombinazione del DNA

La replicazione semiconservativa Tre modelli proposti per la replicazione del DNA

La replicazione è semiconservativa: ogni frammento di DNA serve da stampo per la sintesi di una nuova molecola di DNA

Esperimento di Meselson e Stahl - centrifugazione in gradiente di densità all’equilibrio per distinguere DNA contenente 14N pesante e DNA 15N più leggero

DEFINIZIONI e TERMINOLOGIA:

Replicone= unità di replicazione con propria origine di replicazione. Origine di replicazione=zona specifica del cromosoma dove le doppia elica si denatura in singoli filamenti, esponendo le basi per la sintesi di nuove eliche. Bolla di replicazione:regione del cromosoma dove il DNA è a singole elica e dal quale la replicazione procede in modo bidirezionale.

Le modalità di replicazione 1. La replicazione teta

Comune in E.Coli e in altri organismi con DNA circolare

2. La replicazione a circolo rotante

Comune in alcuni virus e nel fattore F di E.coli

3. La replicazione lineare negli eucarioti Requisiti per la replicazione: -stampo di DNA a singolo filamento -substrati da assemblare nel filamento di neoformazione -enzimi e altre proteine che “leggono” lo stampo e assemblano i substrati

La direzione della replicazione

La sintesi del DNA è continua su un filamento di DNA stampo e discontinua sull’altro

Modello teta Modello circolo rotante Replicazione lineare

La replicazione del DNA batterico - L’INIZIO In E.coli la replicazione ha inizio quando le proteine iniziatrici si legano a oriC, l’origine di replicazione, provocando lo svolgimento di un breve tratto di DNA.

- LO SVOLGIMENTO La DNA elicasi svolge il DNA legandosi al filamento ritardato che funge da stampo a livello di ogni forcella di replicazione e muovendosi in direzione 5’ 3’ lungo il filamento.

- GLI INNESCHI e L’ALLUNGAMENTO La primasi sintetizza brevi tratti nucleotidici di RNA, fornendo un gruppo 3’-OH a cui la DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi di DNA.

DNA Polymerase III The "real" polymerase in E. coli

•  At least 10 different subunits •  "Core" enzyme has three subunits - α, ε, and θ •  Alpha subunit is polymerase •  Epsilon subunit is 3'-exonuclease •  Theta function is unknown •  The beta subunit dimer forms a ring around

DNA •  Enormous processivity - 5 million bases!

DNA Polymerase I Replication occurs 5' to 3'

•  Nucleotides are added at the 3'-end of the strand •  Pol I catalyzes about 20 cycles of polymerization before the

new strand dissociates from template •  20 cycles constitutes moderate "processivity" •  Pol I from E. coli is 928 aa (109 kD) monomer •  In addition to 5'-3' polymerase, it also has 3'-5' exonuclease

and 5'-3' exonuclease activities

- La DNA LIGASI La DNA ligasi chiude l’interruzione lasciata dalla DNA polimerasi I nello scheletro di zucchero-fosfato dopo che quest’ultima ha aggiunto il nucleotide finale.

- LA FORCELLA DI REPLICAZIONE

Modello di replicazione del DNA in E.coli:

le due unità della DNA pol III sono connesse e il filamento ritardato che funge da stampo forma un anello tale che la replicazione possa avere luogo sui due filamenti di DNA antiparalleli.

- LA FEDELTA’ DELLA REPLICAZIONE DEL DNA -selezione dei nucleotidi -correzione di bozze -riparazione dei malappaiamenti

Other Proteins That Assist DNA Replication

•  Helicase, topoisomerase, single-strand binding protein

Table 16.1

La replicazione del DNA negli eucarioti

Microfotografia elettronica di DNA eucariotico durante il processo della replicazione: il DNA neosintetizzato è già coperto da nucleosomi

Polimerasi nei Procarioti I Procarioti possiedono cinque tipi di DNA Polimerasi:

• DNA Polimerasi I: implicata nella riparazione del DNA e nella rimozione degli inneschi dei frammenti di Okazaki. Possiede attività esonucleasica sia in direzione 5'->3', sia in direzione 3'->5' • DNA Polimerasi II: indotta da danni al DNA per riparazione incline all'errore (error-prone). Ha attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica 3'->5' • DNA Polimerasi III: l'enzima principale per la replicazione, con attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica (nella correzione di bozze, o proofreading) 3'->5'. Attiva sia nella sintesi del filamento leading, sia in quella dei frammenti di Okazaki. • DNA Polimerasi IV-V: anch'esse coinvolte nella riparazione incline all'errore

Polimerasi negli Eucarioti

Le Polimerasi degli Eucarioti sono costituite invece da:

• DNA Polimerasi α: è una primasi (enzima che sintetizza i primer di RNA) e procede inoltre all'allungamento dei primer con alcune centinaia di deossiribonucleotidi.

• DNA Polimerasi δ: l'enzima principale della replicazione eucariotica. Sintetizza sia il filamento leading, sia il filamento lagging. Riempie inoltre le interruzioni tra i frammenti di Okazaki.

• DNA Polimerasi β: coinvolta nella riparazione del DNA

• DNA Polimerasi γ: replica il DNA mitocondriale

• DNA Polimerasi ε: stessa funzione della Polimerasi δ.

Prokaryotes Eukaryotes 5 polymerases (I, II, III, IV,V) 5 polymerases--α,β,γ,δ,ε I--excision repair, removal of RNA primers α--polymerization

II-repair β--repair γ--mitochondrial

III-main enzyme δ-main enzyme IV,V-repair, special conditions ε--unknown polymerases also exonucleases not all exonucleases 1 Origin of replication many origins

Okazaki fragments 1000-2000 nuc. Okazaki fragments 150-200 nuc.

no proteins on DNA histones

Tipo di organismo Nome scientifico Ripetizione telomerica (direzione 5' -> 3')

Vertebrati Homo sapiens, Mus musculus, Xenopus laevis TTAGGG

Funghi Neurospora crassa, Physarum, Didymium TTAGGG

Protisti Dictyostelium discoideum AG(1-8) Kinetoplastea (protozoi) Trypanosoma, Crithidia TTAGGG

protozoi ciliati

Tetrahymena, Glaucoma TTGGGG Paramecium TTGGG(T/G)

Oxytricha, Stylonychia, Euplotes TTTTGGGG

Apicomplexa Plasmodium TTAGGG(T/C) Piante superiori Arabidopsis thaliana TTTAGGG Alghe verdi Chlamydomonas TTTTAGGG Insetti Bombyx mori TTAGG Anellidi Ascaris lumbricoides TTAGGC Lieviti a scissione binaria Schizosaccharomyces pombe TTAC(A)(C)G(1-8)

Lieviti gemmanti

Saccharomyces cerevisiae TGTGGGTGTGGTG (da stampo RNA) o G(2-3)(TG)(1-6)T (sequenza consenso)

Candida glabrata GGGGTCTGGGTGCTG Candida albicans GGTGTACGGATGTCTAACTTCTT

Candida tropicalis GGTGTA[C/A]GGATGTCACGATCATT

Candida maltosa GGTGTACGGATGCAGACTCGCTT

Candida guillermondii GGTGTAC

Candida pseudotropicalis GGTGTACGGATTTGATTAGTTATGT

Kluyveromyces lactis GGTGTACGGATTTGATTAGGTATGT

Modello di Holliday:rottura singolo filamento

Rot

tura

dop

pio

fila

men

to