dna - estructura y conformación

Blgo. Carlos A. Fernández [email protected]

Setiembre, 2007

mailto:[email protected]

Blgo. Carlos A. Fernández M.

Estructura del DNA


• Polinucleótido producido por la polimerización de desoxirribonucleótidos

Grupo Fosfato + β – D - desoxirribofuranosa + Base nitrogenada

Desoxirribonucleósido

Desoxirribonucleótido


• Bases Nitrogenadas: Bases Púricas

Adenina Guanina


• Bases Nitrogenadas: Bases Pirimídicas

Timina Citosina


• Azúcar (Pentosa)

β – D - desoxirribofuranosa


• Grupo fosfato

O

O

O OP


• Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos (presentes en el DNA)

Base Nucleósido (Base+Pentosa)

Nucleótido(Nucleósido+Fosfato)

Abreviatura

Guanina Desoxiguanosina Desoxiguanosina monofosfato dGMP

Adenina Desoxiadenina Desoxiadenina monofosfato dAMP

Citosina Desoxicitidina Desoxicitidina monofosfato dCMP

Timina Desoxitimidina Desoxitimidina monofosfato dTMP


• Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos (presentes en el DNA)

Por consenso general el Nucleótido adquiere el nombre de la base nitrogenada que le dio origen


• Modelo de la Doble Hélice de Watson y Crick

Watson y yo hemos encontrado el

secreto de la vida


• El modelo de la doble hélice de Watson y Crick Los polímeros de

DNA están constituidos por dos cadenas de nucleótidos unidos en forma lineal por enlaces fosfodiester los cuales corren en direcciones opuestas (antiparalelas).


• El modelo de la doble hélice de Watson y Crick Cada nucleótido se encuentra en un plano perpendicular al de la cadena

polinucleotídica.


• El modelo de la doble hélice de Watson y Crick La composición de bases de DNA sigue las reglas de Chargaff (Cantidad

de Purinas = Cantidad de Pirimidinas).

A G C T

Homo sapiens 0.29 0.18 0.18 0.31

Bos taurus 0.26 0.24 0.23 0.27

Sacharomyces cerevisiae 0.30 0.18 0.15 0.29

Mycobacterium sp 0.12 0.28 0.26 0.11

• Composición de las bases nucleotídicas en el DNA de algunas especies


• El modelo de la doble hélice de Watson y Crick

• Reglas de Chargaff

1. La relación purinas/pirimidinas es igual a 1

Es decir, A+G = C+T

2. En todos los DNA estudiados, la proporción molar de A es igual a la de T, y la de G igual a la de C.

Es decir, A = T y G = C



Las fotografías del análisis de difracción de rayos X de la sal de DNA con alto contenido de agua indican que la molécula tiene una estructura helicoidal doble (las cadenas giran alrededor de una línea central imaginaria)


• El modelo de la doble hélice de Watson y Crick Las dos cadenas se encuentran apareadas por uniones de

hidrógeno establecidas entre los pares de bases



Propiedades de los enlaces tipo puente de hidrógeno

Son económicos (energéticamente hablando). Son lo suficientemente fuertes para mantener la estructura de la doble

hélice pero lo suficientemente débiles para romperse determinados momentos (replicación).

Confieren un estado dinámico de la estructura (horquillas) Son altamente direccionales, discriminan entre las distintas pares de

bases.


Los puentes de hidrógeno son altamente direccionales.


Guanina Citosina

Configuración tridimensional de los enlaces puente de hidrógeno


Adenina Timina

Configuración tridimensional de los enlaces puente de hidrógeno


• Fuerzas que determinan la conformación polinucleotídica Los polinucleótidos tienden a formar hélices, lo que les

permite conciliar las fuerzas de interacción moleculares, distribuyéndolas a intervalos regulares.

Las Interacciones hidrófobas entre los anillos de las bases y fuerzas de Van Der Walls (Resultado de la diferencia entre interacciones dipolo y las fuerzas de dispersión de London) producen una conformación apilada (Staking).


Las repulsiones entre los grupos fosfato cargados negativamente producen cierta rigidez en la estructura las cuales, en condiciones fisiológicas, se ven estabilizadas por la cantidad de cationes (Mg2+) presentes en la solución.

• Fuerzas que determinan la conformación polinucleotídica


Puede formar enlaces que conectan dos moléculas. Dichos enlaces (llamados enlaces fosfodiéster) son sumamente estables

aunque pueden ser rotos facilmente mediante hidrólisis enzimática (Principio de conservación).

La carga negativa (debido a un Oxígeno ionizado) protege frente a ataques nucleofílicos.

La ionización negativa total mantiene a los nucleótidos y al mismo DNA dentro de las membranas biológicas.

¿Por qué fosfatos?




La formación de puentes de hidrógeno cooperativos altamente direccionales asegura una estabilidad relativa además de un estado dinámico.


• Variaciones conformacionales del DNA

Se producen por cambios en los grupos pentosa-fosfato de la cadena polinucleotídica.

Variación entre la conformación anti y syn del ángulo de enlace entre las bases nitrogenadas y la pentosa.

Inclinación, giro o giro en hélice de los bares de bases de los nucleótidos.



Variación en la inclinación y giro de las bases nitrogenadas


DNA tipo A


• Doble hélice plectonémica y dextrógira

• Planos de bases oblicuos respecto al eje de la doble hélica

• Propio de RNAs en doble hélice, o de híbridos DNA-RNA

• Más ancha y corta que DNA-B


DNA tipo Z


• Doble hélice plectonémica y levógira

• Zonas de secuencia alternante -GCGC-

• Conformación de G es syn- en lugar de anti-

• Más estrecha y larga que DNA-B



A B Z

Grosor 2.6 2.4 1.8Giro Dextro Dextro LevoBases/vuelta 11 10.4 12P.de rosca 2.5 3.4 4.5Inclinación del plano 19º 1º 9ºde las bases

Cuadro Resumen de las Características de los distintos tipos conformacionales


• Desnaturalización del DNA

Se llama así al proceso de transición entre la forma de doble hélice apilada y el ovillo estadístico.



Se puede lograr provocando cambios en la temperatura, pH o agregando sustancias desnaturalizantes.

Tº

Rotura de los enlaces puente de hidrógeno

pH

Cambio en la ionización de los componentes

Agentes DN

Bloqueo de los enlaces puente de hidrógeno



Efecto hipercrómico de la Desnaturalización del DNA


• Renaturalización del DNA

Se produce mediante la llamada autoasociación por complementariedad.

Es dependiente de la concentración. Se favorece por la presencia de secuencias repetitivas

frecuentes. Inversamente proporcional a la complejidad del genoma.


• Hibridación del DNA

Se basa en la capacidad de autoasociación por complementariedad.

Es necesaria una relación elevada de complementariedad.

Es dependiente de la concentración.


Útil para los siguientes propósitos:

1. Determinación de si una cierta secuencia de DNA se presenta más de una vez en un determinado genoma.

2. Demostración de la existencia de relación genética o evolutiva entre organismos presentes.

3. Determinación del número de genes transcritos en un mRNA particular.

4. Determinación de la localización de una secuencia de DNA (Sonda).



Hibridación del DNA



1. Se desnaturaliza el DNA a hibridar2. Se inmovilizan las monohebras resultantes mediante fijación a un

polímero adecuado.3. Dichas monohebras se montan en una columna cromatográfica.4. Se hace pasar monohebras de DNA marcado radioactivamente (Timina

tritiada).

Procedimiento

*La velocidad de reasociación es proporcional a la que la radioactividad queda retenida en la columna cromatográfica.


Factores que afectan la estabilidad del híbrido

a) Número de pares GC v/s pares AT

A mayor número de puentes de hidrógeno,

mayor estabilidad

• 3 puentes de H entre G y C

• 2 puentes de H entre A y T



b) Grado de complementariedad

Menor complementariedad de basesMenos enlaces de H formadosMenor estabilidad



c) Largo de las hebras

– Mayor largo de las hebras (cDNAs) >200pb

más enlaces de H

mayor estabilidad del híbrido.

– Menor largo de las hebras (oligos) <50pb

Mayor especificidad

Menor probalidad de hibridación cruzada



d) Concentración de sal en la solución

• Cationes monovalentes (Na+) o divalentes (Mg++)

• Las cargas negativas de los grupos fosfato se repelen unas a otras.

• Los iones positivos en solución reducen la repulsión electrostática entre las hebras.



e) Temperatura

• Mayor Tº aumenta la energía cinética de las hebras y desestabiliza la estructura de los ácidos nucleicos.

las hebras se separan.


• Uso de Sondas de DNA

Las sondas de ácido nucleico son poderosas herramientas aportadas por la biotecnología que se

emplean tanto en la investigación básica como en el campo

diagnóstico. La posibilidad de utilizarlas con el fin de detectar diversos agentes patógenos, sea en el ser humano, en plantas o

animales, ya ha tenido importantes repercusiones económicas.


Sondas de DNA



Se pueden clasificar las sondas en :

• "calientes" cuando se utiliza productos radiactivos• "frías” cuando no se utilizan productos radioactivos



Autorradiografía

* Isotopos Radioactivos tanto de emisión alfa como beta: tritio, fósforo-32, azufre-35 o iodo-125

ADN

Isotopo radioactivo

Sondas “calientes”



Sondas “frías”

1. Enzimas (peroxidasa o fosfatasa que llevan a cabo una reacción detectable )

2. Marcadores de afinidad (biotina o digoxigenina, que se van a unir posteriormente a otra molécula)

3. Moléculas Quimioluminiscentes Y Fluorescentes (que producen luz y puede excitar una película fotográfica).


Sondas “frías”


Souther Blot


• Southren blot


FISH


• Citogenética moderna: FISH


Tipos de Estructuras del DNA


• Tipos de estructuras del DNA

Los rasgos estructurales varían según el origen y función del DNA.

Los DNA difieren en:

• Tamaño• Conformación• Topología


• Diferencias en Tamaño

• El tamaño de un DNA puede ser expresado en:

Número de pares de basesPeso molecularLongitud de las hebrasMasa real del DNA



Virus

Miles de pares de bases

Bacterias

Millones de pares de bases

Animales

Miles de Millones de pares de bases



• El tamaño del DNA tiende a aumentar con la complejidad de la función celular.

• El tamaño del DNA no siempre refleja mayor complejidad celular.

El aumento de secuencias repetitivas aumenta el tamaño pero no la complejidad del genoma.


• Formas de determinar el Tamaño de un DNA

• Centrifugación en equilibrio• Microscopía electrónica• Electroforesis en gel


Gra

diente de den

sidad

• Centrifugación en equilibrio

• La anchura de las bandas en equilibrio es proporcional a la masa molecular

DNACentrifugación

Formación de bandas en el lugar de

equilibrio entre la densidad del DNA y el

medio externo


• Microscopía electrónica

• Se mide el largo de la hebra• El tamaño se obtiene usando patrones conocidos de

masa por unidad.

+ + =DNA visible al

microscopio

Cubierta de proteína Película de metal


Conformaciones del DNA


Continuará…

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