Dirençli Bakteri EnfeksiyonlarındaYeni Yaklaşımlar

M.U. HasdemirMarmara Üniversitesi Tıp Fakültesi

YeniModeller YeniMoleküller

AKG 1‐3 Nisan 2016, Askeri Müze, İstanbul

ProblemBakterilerimiz

CREDirençliPnömok

ok

Cdif.

MRSA

MDR Acineto. 

XDR Mtb.

Dirençveyayılımınıntemelmekanizmaları

• Mutasyon• Rekombinasyon

• Hareketligenetikelementler– ISvetranspozonlar

• Konjugasyon• Transformasyon• Transdüksiyon

Direnç Mekanizmaları

1.Efluks

2a Modifikasyon enzimleri 2b 

İnaktivasyonenzimleri

3.Hedefte değişim

Biofilm, Permeabilite

DirencinYayılımı

Vertikal transfer Horizontal transfer

E. coli (A)

E. coli (A)

E. coli (A)

E. coli (B) P. aeruginosa

K. pneumoniae

DirencinHorizontal Transferi

Transformasyon

Transdüksiyon

Konjugasyon

Direnç genlerinin horizontalyayılımı

Toprak bakterileri arasında insan patojenleriarasında görüldüğü kadar horizontal gen transferigörülmüyor. 

KJ Forsberg, Nature, 2014

Tedavi:Yeni Yaklaşımlar

1 •Nanoteknoloji, NPs

2 •Konak hücre hedefli tedavi

3 •Efluks, QS, FimH inhibitörleri

4 •Neoglikozidler

5 •Peptidomimetikler

6 •Faj Terapisi

7 •Doğal Bileşikler

8 •Kombine tedavi, EK önlemleri

9 •Fekal Transplantasyon

Tedavi:Yeni Yaklaşımlar

10•Probiyotikler

11•Virülans faktörlerineyönelik yaklaşımlar

Tedavi:Yeni Yaklaşımlar

1 •Tüm genom dizileme

2 •Biyosensörler

3 •Proteomik yaklaşımlar

4 •Nanoteknoloji

Tanı:Yeni Yaklaşımlar

Nanoteknoloji‘Bilinen moleküllere

yeni atomvemoleküller

ekleyerek onlaraolağanüstüelektronik ve

manyetik özelliklerkazandırır ’

Nanotechnology Solutions to combat superbugs 2013, Nano Academy

Nanoteknoloji

Nanotechnology solutions to combat superbugs, 2013 Nano Academy

•Henüz direnç yok• İlaçların raf ömürlerinin uzaması•Hedefe özgü aktivite• İlacın lipofilik karakterinde azalma,sudaerimesinde artış•Maliyet etkin•Toksisite düşük• Zamana bağlı ilaç salınımı

Nanoteknoloji:Tedavi

LL Jiang, Inflamm Res 2012/ S Tin, Int J Bio Sci 2009/ AM Fayaz, Nanomedicine 2010/ H Gu, Nano Lett 2008EM Hetrick, ACS Nano 2008/ AJ Friedman, Virulence 2011/ NG Durmus, AdvHealthcare Mater 2013.

•Nano‐hidroksipatit,Vankomisinin hedefe taşınması

•ChitosanNPs+sulfametoksazol,sinerjiP.aeruginosa

•AgNPs +Sefaperazon aktivitesinde artış•AuNPs +Vankomisin

•NOsalan NPs:P.aeruginosa,K.pneumoniae•MRSAbiyofilmine etkin demir oksid NPs(SPION)

KonakHücreHedefli Tedavi Yaklaşımları

• C. burnetii, L. pneumophila, B. abortus, R. conorii• THP‐1 hücre dizileri enfekte ediliyor• 640’dan fazla FDA onaylı antibiyotik olmayan bileşikdeneniyor.

Hedef bölgeler; •G protein ilişkili reseptörler•Hücre içi kalsiyum sinyalizasyonu•Membran kolesterol dağılımı

DM Czyz, et al. Host directed antimicrobial drugs …2014; 5: e01534‐14

Bileşik Özellik Cb Lp Ba Rc EtkiTrifluoperazine Antipsikotik X X X GPCRs/CaLomerizine Antimigren X X X CaBepridil Antianjin X X X CaLoperamide Antidiyarel X X X GPCRs/CaNisoldipine Antihipertansif X X X GPCRs/CaClemastine Antihistaminik X X X GPCRs/CaOrphenadrine Antispazmodik X X GPCRsDesloratadine Antihistaminik X X GPCRs

DM Czyz, et al. Host directed antimicrobial drugs …2014; 5: e01534‐14

Hücredeki fizyolojik, fizikokimyasal değişikliklerpatojenin üremesini inhibe ediyor

Tedavi:Doğal BileşiklerSınıf Örnek bileşik Spektrum Mekanizma?

Kateşin Epigallocatechine gallate

Gr+ ve ‐ HM

Alkoloid Piperin Gr+ Efluks inhibisyonuFenolik Reveratol Antifungal HM proteinleriTanninler Tannik asit S. aureus, B. 

cereus, L. monocytogenes, S. enterica, C. jejuni

Mikrobiyal adezin vehücre transport protein inaktivasyonu

Kumarin Novobiyosin Gr+, H. influenzae, N. meningitidis

DNA giraz inhibitörü

Fekal Transplantasyon

‘Theinfusionofdonorfeceswassignificantlymoreeffectiveforthetreatmentof

recurrentC.difficileinfectionthantheuseofvancomycin’

Ev Nood, et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile.  NEJM, 2013; 368:407‐15  

Peptidomimetikler

• Prokaryotik membrana seçici toksisite• DNAile interfereolma?Dezavantaj• Proteolize aşırı duyarlı• Tedavi için ihtiyaç duyulan dozunyüksekliği (toksisite)

• Üretim maliyeti

PeptidomimetiklerProteolize dirençli peptidlerLys‐Leu /klotho (KL)– (KLAKLAK)2• K.pneumoniae 75ug/mL• Fungisidal aktiviteBrilacidin• S.aureus,E.faecium ve E.coli FazIIPolyphor

• P. aeruginosa

FimH inhibitörleriÜropatojenik E.coliTip1pili,FimH – Mannoz reseptörleriFimH inhibitörleriMannozid türevleri /a‐D‐mannoz rezidüleri

Cusumano ve ark.,altı FimH inhibitörü deniyor

GS Tillotson, F1000Prime Rep 2013 / CK Cusumano, Sci Transl Med 2011

Pilus‐denetimli biyofilm oluşumu önleniyorSXTetkinliği artıyor

QSYaklaşımlarıPseudomonasaeruginosa• Genekspresyonunun koordine eden kimyasal

sinyalizasyon molekülleri – N‐AHL,AIP• MultipleVirulenceFactorRegulator(MvfR)• Antranilik asit türevleriYeni ilaç hedefleriAHL‐ degradeeden enzimlerMvfR regülonunun farmakolojik inhibisyonufarelerde P.aeruginosa virulansını belirginazaltıyor

GS Tillotson, F1000Prime Rep 2013 / B Lesic, PLoS Pathog 2007/ VC Kalia, Biotechnology Advances 2013

Efluks inhibitörleri

• Verapamil(Memeli hücrelerinde)• Rezerpin• 5’‐methoxyhydnocarpine• Phenylalanyl‐arginyl‐β‐naphthylamide (PAβN)• 1‐(naphthylmethyl)‐piperazine (NMP)

M Askoura, 2011 / GP Tegos 2011 / O Lomovskaya 2001

Efluks inhibitörleri

• Pharmacophore generationof2_substitutedbenzothiazoles asAdeABC effluxpumpinhibitorsinA.baumannii

SARandQSAREnvironmantal Research,2014

• Bindingsitefeatyre descriptionof2‐substitutedbenzothiazoles aspotentialAcrAB‐TolC effluxpumpinhibitorsinE.coli

SARandQSAREnvironmantal Research,2015;26:853‐71

Faj tedavisi

Twort 1915,d’Herelle 1917Faj ve faj profilaksisiDoğu Avrupa’da klinik uygulamadaEsas olarak litik fajlar

P.aruginosa enfeksiyonlarının fajla tedavsiSüpüratif enfeksiyonlarİYE

J Soothill / S Kim Appl Environ Microbiol 2012 / JM Budzik, J Bacteriol 2004 / ME Zegans, J Bacteriol 2009

Faj tedavisi

Genetik olarak modifiye edilmiş fajlar• Filamentöz fajlar• Bakteri lizisine yol açmadığından endoksin

denetimli patolojiyi engeller• DMS3lizojenik fazla enfekte P.aeruginosa

PA14kökeninde biyofilm oluşumuengelleniyor

• PA1Ø fajla egfeksiyon

J Soothill / S Kim Appl Environ Microbiol 2012 / JM Budzik, J Bacteriol 2004 / ME Zegans, J Bacteriol 2009

Neoglikozidler

• AAC‐toleran aminoglikozid – Plazomicin(Achaogen,US)

• ESBL/karbapenemaz üretenEnterobacteriaceae

GTAdirençli izolatlardaPlazomicin etkinliği

MIC90 1ug/mLMIC50 2ug/mL

SASPjectPhico Therapeutics‐UKSmallacid‐solublespor proteini ‐ SASPHedef bakteri DNA’sı SASP’ın letal enjeksiyonuMRSAintra‐nazal dekolonizasyon – Faz ItamamlandıP.aeruginosa,E.coli,K.pneumoniae

Direnç Tanımlamada YeniYaklaşımlar

Nanoteknoloji:Direnç Saptama

B Lam, Nat Commun. 2001/YH Nguyen, Scientific Reports/A Engstrom, PlosOne, 2013.

SCC(Solution‐basedcircuitchip)• İYEetkeni duyarlı ve dirençli E.coli’leri ayırteder

Mikrosensör +peptid nükleik asitNanoELIwell•MDR‐TbtanısıPadlockproblar +manyetik nanoparçacıklar•Rifampsin dirençli Tbtanısı

Nanoteknoloji:Direnç Saptama

Fan Z. Chemistry, 2013/ MS Mannoor, Nat Commun/CA Strassert, Chem Int Ed 2009/G Longo, Nature Nanotechnology 2009

•Demir‐manyetik korlu altın plazmonik kaplınanopartikül

•Grafen+Odoranin‐HP peptid bazlı nanosensör

•Nanokristal +Yeşil floresan boya

•Nanomekanik tanımlama

Biyosensörler:Çevre /GıdamaddelerininAntibakteriyel kontaminasyonu

Reder‐Christ K, Bendas G. Biosensor applications in the field of antibiotic (2011)

Direnç Saptama:Proteomik yöntemler

Çoklu sistemlerde direncin kantitatif araştırılması

Yüksek çözünürlüklü proteomikler• Jel‐bazlı metodlar• Jelsiz metodlar•Hedefe yönelik metodlar

AJ Park, FEMS Microbiology Reviews 2015

Direnç tanımlama:Dizileme

Patojengenomudizileme

EMRSA‐15  alt klonuyayılımı

Projenitörklona göredört kat hızlıüreme

MTG Holden, et al. Genome Research 2013; 23: 653‐64

Alanlar

• İlaç geliştirmek• Gereksiz antibiyotik kullanımını azaltmak• Enfeksiyon kontrolunu güçlendirmek• Çok daha hızlı tanı yöntemleri geliştirmek

• Direnç gelişim dinamiklerini daha iyi anlamak

Persistenceofsulphonamide resistance…..UKdespitenationalrestriciton inprescription

• 1991 sulfonamid reçetesi 320000 % 39,7

• 1999 7000 % 46

• sulI, sulII Dihidropteorat sentaz formarı kodlarlar

• sulII’ye bağlı direnç 1991 %26,7

1999 %36,5

VI Enne, DM Livermore, et al. Lancet 2001; 357: 1325‐28

Yorum

1• Duyarlıların hakim olması için daha zamana ihtiyaçolması

2• Telafi edici mutasyonlarla dirençli bakterilerinduyarlılar kadar fitness olması

3• İnsan dışı sülfanamid kullanımı

4• Sulfonamid direnç genlerinin diğer direnç genleriile birlikte taşınması

VI Enne, DM Livermore, et al. Lancet 2001; 357: 1325‐28

Antibiyotik direnci ‐ Bakteriyel ‘Fitness’

JL Martinez et al. Proc R Soc B 2009; 276: 2521‐30.

• Antibiyotik yok ‐ duyarlı popülasyon hakimolurBazı direnç mutasyonlarında ise• Antibiyotik olmasa dadirençliler dominant• Hatta telafi edici mutasyonlarla ‘fitness’larınıarttırarak duyarlıların seviyesine getirebilirler

Sonuç, Budirençli mutantlar antibiyotikyokluğunda daduyarlılara üstünlük

sağlamış olurlar

Fitnesscost‐ Direnç İlişkisi‘sulII geninin çokludirenç plazmidi ile

taşındığını bulmamız, diğer antibioytiklerin

kullanımınınsulfonamid

reçetelenmesindekikısıtlamaya rağmen

dirence yol açabileceğigörüşümüzü

desteklemektedir’  

VI Enne, DM Livermore, et al. Lancet 2001; 357: 1325‐28

Direnci Tersine ÇevirmekMümkünmü?1.Gerçek;Antibiyotik kullanımını sınırlamayladirenç kolayca yok olmuyor2.Gerçek;Kombine (Ab+SDM inhibitörü)ilaçlariçin debu geçerli• İnhibitör dirençli bakterinin avantajını

nötralize eder• Ama dirence karşı bir seleksiyon yapmaz

M Baym, Science 2016

‘Çok ve yanlış antibiyotik kullanımı’‘İnsan‐dışı antibiyotik kullanımı’

?

Dirençli organizmaların seçilimi‘Darwinian’ Evrim Teorisinin mükemmel bir 

örneği

Direncin seçici avantajının üstesinden gelecek bir strateji gerekli

Çoklu İlaç Stratejisi• Tek ilaç kullanımı ile herzaman direncin

seçici avantajı söz konusu

M Baym, Science 2016

SPESİFİK İLAÇ KOMBİNASYONLARI

A ilacı B’nin etkisini kısmen süprese edebilir

A’ya direnç mutasyonu B’nin etkin olmasını sağlar

Sonuç;Direnç mutasyonu bir dezavantajhaline geldi

A1

A2

Mutasyon

1‐İlaçetkileşimleri

2‐İlaçetkileşimleri

A1

A2

Mutasyon

A1

SİNERJİ

A2

Sonuç• Eldeki antibiyotiklerimizi daha etkin kullanmaküzere deçalışmalar yapmak

• Direnç determinantlarının ve dinamiklerinin dahaiyi bilmek

• Hızlı direnç tanı yöntemleri geliştirmek• Mikrobiyotayı korumka• Patojen ve hastabazlı yaklaşımlar geliştirmek• Tedavi süresinin kısaltılması için çalışmalaryapmak

• İlaç geliştirmek üzere kamu‐özel sektör işbirliği

Teşekkürler