New insights into allosteric mechanisms from trapping unstable protein conformations in silica gels

Cristiano Viappiani, Stefano Bettati, Stefano Bruno, Luca Ronda, Stefania Abbruzzetti, Andrea Mozzarelli, and William

A. Eaton

PNAS 101(2004) 14414-14419

Dipresentasikan oleh:Anastasia Riany (10503008)Anna Sanawati (10503058)

Pendahuluan

Mekanisme Monod-Wyman-Changeux (MWC)

Pengikatan oksigen oleh hemoglobin kooperatif

Perubahan afinitas oksigen

Tujuan

Menentukan kinetika pengikatan ligan dan

kesetimbangan hemoglobin yang diperangkap

silika gel dalam struktur kuartener T atau R

Hemoglobin

Heme ; globin

Tetramer

Metalo protein

C2952H4664N812O832S8Fe4

Terdapat dalam sel darah merah

Skema Stuktur Hemoglobin

Perubahan konformasi kuartener R dan T rotasi 15

Proses pengikatan dan pelepasan O2

Mekansime kooperatif

Melalui perubahan konfomasi sterik

Kurva pengikatan oksigen sigmoid

Kurva Pengikatan O2

Dari penelitian Mozzarelli, et.al., 1997 diketahui pengikatan hemoglobin terhadap O2 dalam gel dan kristal non kooperatif

Penyiapan Sampel

T- : Hepes/EDTA + tetrametil ortosilikat Deoksigenasi dengan menyemprotkan

helium selama 90 menit Deoksihemoglobin, Hepes, natrium

ditionin, EDTA Gelifikasi selama 10 menit

T+ : Allosterik efektor : inositol heksafosfat,

bezafibrat, ion klorida

Efektor Hemoglobin

Inositol heksafosfat Asam phitat C6H18O24P6

Bezafibrate C19H20NClO4

Pengukuran Kesetimbangan dan Kinetika

Kurva pengikatan O2 diukur dengan mikrospektrofotometer dan elektroda O2

Studi kinetik, Q-swicthed Nd : YAG laser (Ar+) pada 532 nm

untuk fotolisis Fotodioda untuk deteksi

Kinetika Pengikatan Kembali Ligan (1)

Pada R gel, terdapat 2 fasa : 100 ns dan 100 µs

Pada T+ gel, terdapat 1 fasa : 10 ms

Kinetika Pengikatan Kembali Ligan (2)

Pada setiap kondisi, fraksi utama pada struktur kuartener T mempunyai kinetika seperti struktur kuartener R

Hasil Geminasi pada T- gel

Pada saat kejenuhan awal 100% ada kenaikan amplitudo

Pada kejenuhan awal 50% tidak ada perubahan

Eksperimen Pengikatan O2 pada Kesetimbangan

Pada T- gel, afinitas meningkat karena terjadi perubahan struktur tersier t-r, tetapi struktur kuartener tetap T

Eksperimen fotolisis CO

Pada T+ gel, subunit yang berikatan dengan CO berada pada konformasi t

Pada T- gel, pengikatan CO mengubah beberapa fraksi subunit menjadi korfomasi r

Setelah fotodisosiasi, konformasi subunit r tetap

Simulasi Kinetika pada Kesetimbangan

Disosiasi oksigen lebih cepat daripada disosiasi CO

O2CO

Kesimpulan

Adanya subunit sejenis R dalam struktur tersier T

Menjelaskan sifat kesetimbangan dan kinetika hemoglobin dalam kristal, larutan, dan gel

Saran : Mengaplikasikan model TTS