dipartimento di scienze bio-mediche, sezione fisiologia...
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TIODOL®
VALUTAZIONE DELL’ATTIVITÀ ANTI-INFIAMMATORIA
DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIO-MEDICHE, SEZIONE FISIOLOGIA
Responsabile della ricerca: Prof. V. Cardile Collaboratori: Dott.ssa A.C.E. Graziano
INGREDIENTI IMPIEGATI NELLO STUDIO
Mix (TIODOL COMPLEX, compresse)
Collagene idrolizzato
Zinco gluconato
Condroitina solfato
Metilsulfonilmetano
Vitamina D3
Boswelia
Selenio metionina
Glucosammina solfato
SISTEMI BIOLOGICI UTILIZZATI
Cheratinociti umani NCTC 2544 stimolati con interferon gamma (200 U/ml) e istamina (10-4 M) Condrociti umani primari stimolati con interleuchina 1beta (10 ng/ml)
Cheratinociti? • L’infiammazione può definirsi come la risposta di un
organismo vivente ad agenti (fisici, chimici, biologici) o situazioni che provocano un danno in qualsiasi sede.
• La pelle è continuamente esposta ad un’ampia gamma di attacchi chimici e fisici. La prima barriera protettiva nei confronti degli insulti esterni è costituita dai cheratinociti, le cellule più largamente diffuse nell’epidermide.
• I cheratinociti sono attivamente coinvolti nelle reazioni infiammatorie della pelle mediante l’attivazione dei leucociti e la modulazione delle loro funzioni.
• Durante i processi infiammatori la pelle è infiltrata da linfociti T che possono esercitare effetti citotossici e produrre citochine con funzioni pro-infiammatorie.
La pelle
Effetti pro-infiammatori di interferon-γ sui cheratinociti
Condrociti? rappresentano la componente cellulare della cartilagine
Nei Mammiferi adulti: riveste le superfici articolari costituisce i dischi intervertebrali costituisce dischi e menischi intraarticolari dà sostegno ad alcuni organi dell’apparato respiratorio e al padiglione auricolare
Nei Mammiferi durante lo sviluppo La cartilagine forma il primitivo abbozzo fetale della maggior parte dello scheletro
IL TESSUTO CARTILAGINEO È COSTITUITO DA: CONDROBLASTI CONDROCITI MATRICE EXTRACELLULARE E’ rivestito dal PERICONDRIO (lamina di connettivo fibroso).
Parte sub-pericondrale: condrociti di forma appiattita, raramente raggruppati
Parte interna del tessuto: condrociti sferoidali riuniti in gruppi isogeni o nidi
1
Cartilagine in sezione
P: Pericondrio; C1: Condrociti; C: Condroblasti
La matrice è costituita da: acqua fibre collagene proteoglicani acido ialuronico glicoproteine: condronectina lipidi lipoproteine
Malattie muscolo-scheletriche
Le artropatie infiammatorie e degenerative portano alla comparsa di stress ossidativo-infiammatorio caratterizzato da una distruzione progressiva del
tessuto cartilagineo articolare.
La cartilagine ed i condrociti sono sottoposti ad uno stress meccanico continuo...
Necrosi cellulare sulla superficie
Formazione di “micro-fessure”
Apoptosi
La cellula “implode”
Osteoartrosi
La “lamina splendens” si usura…
...si scheggia...
…si dissolve.
La cartilagine calcificata dà luogo a strutture che vengono definite osteofiti
Con danni “modesti”...
… o “molto” estesi
Pelle
IL-1β (Ι)
Digestione enzimatica
Condrociti
Cartilagine
Cheratinociti NCTC 2544
IFN-γ +
Istamina (I + H)
Utili modelli in vitro che rappresentano situazioni patologiche in vivo
OBIETTIVO 1 Quali concentrazioni utilizzare?
Screening per valutare la citotossicità
Test di metabolizzazione dei sali di tetrazolio MTT
Concentrazioni 10 e 100 ng/ml, 1 e 100 µg/ml, 1mg/ml
MTT E’ un saggio colorimetrico che sfrutta la capacità delle deidrogenasi mitocondriali di scindere l’anello tetrazolico della molecola di MTT (sale di tetrazolio) di colore giallo per dare un sale di formazano violetto. La quantità di formazano prodotta viene misurata allo spettrofotometro ed è proporzionale al numero di cellule vive.
Per poter eseguire il saggio le cellule vengono cresciute su di una
piastra multi-pozzetto e trattate con concentrazioni crescenti della sostanza da analizzare in triplicato per un tempo predeterminato. Al
termine del trattamento, la soluzione contenente l’MTT viene aggiunta alle cellule. Dopo circa tre ore, tempo necessario affinché si formi il sale di formazano, viene misurata l’assorbanza a 550 nm. I
dati così ottenuti vengono normalizzati rispetto al controllo ed utilizzati per costruire le curve dose-risposta.
N N +
N N
S
N
C H 3
C H 3
N
N N
N H
S
N C H 3
C H 3
NADH
NAD+
MTT (sale di tetrazolio)
formazano
Saggio colorimetrico basato sul reagente MTT
• Assorbimento delle molecole di MTT da parte delle cellule in esame
•Metabolizzazione dell’MTT a livello mitocondriale da parte degli enzimi deidrogenasi dipendenti da NADH
• Formazione e precipitazione dei cristalli di formazano che sono insolubili in soluzioni acquose
coltura cellulare + MTT
incubazione (3 – 4 ore) a 37° C
misurazione dell’assorbanza dei campioni tramite
ELISA Reader con filtro da 550 nm
solubilizzazione dei sali di formazano
tramite Isopropanolo 0,1N
HCl o DMSO
SAGGIO MTT
RISULTATI MTT
NCTC 2544
Con
trol
Mix
100
ng/
ml
Mix
1 µ
g/m
l
Mix
100
µg/
ml
Mix
1 m
g/m
l
Mix
10
ng/m
l
Col
lage
ne id
roliz
zato
100
ng/
ml
Col
lage
ne id
roliz
zato
1 µ
g/m
l
Col
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zato
100
µg/
ml
Col
lage
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roliz
zato
1 m
g/m
l
Col
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10
ng/m
l
Zinc
o gl
ucon
ato
100
ng/m
l
Zinc
o gl
ucon
ato
1 µg
/ml
Zinc
o gl
ucon
ato
100
µg/m
l
Zinc
o gl
ucon
ato
1 m
g/m
l
Zinc
o gl
ucon
ato
10 n
g/m
l
Con
droi
tina
solfa
to 1
00 n
g/m
l
Con
droi
tina
solfa
to 1
µg/
ml
Con
droi
tina
solfa
to 1
00 µ
g/m
l
Con
droi
tina
solfa
to 1
mg/
ml
Con
droi
tina
solfa
to 1
0 ng
/ml
Met
ilsul
foni
lmet
ano
100
ng/m
l
Met
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foni
lmet
ano
1 µg
/ml
Met
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100
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l
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1 m
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lmet
ano
10 n
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l
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3 10
0 ng
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3 1
µg/m
l
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min
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3 10
0 µg
/ml
Vita
min
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3 1
mg/
ml
Vita
min
a D
3 10
ng/
ml
Bos
wel
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olfa
to 1
00 n
g/m
l B
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sol
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1 µ
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l
Bos
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00 n
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1 µ
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l
Sele
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na 1
00 µ
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l Se
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1 m
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l
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ioni
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00 n
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1 µ
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l
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0
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40
60
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120
l
l
l
l
l
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RISULTATI MTT
Condrociti
Con
trol
Mix
100
ng/
ml
Mix
1 µ
g/m
l
Mix
100
µg/
ml
Mix
1 m
g/m
l
Mix
10
ng/m
l
Col
lage
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roliz
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100
ng/
ml
Col
lage
ne id
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1 µ
g/m
l
Col
lage
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µg/
ml
Col
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1 m
g/m
l
Col
lage
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zato
10
ng/m
l
Zinc
o gl
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ato
100
ng/m
l
Zinc
o gl
ucon
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1 µg
/ml
Zinc
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ucon
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100
µg/m
l
Zinc
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g/m
l
Zinc
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10 n
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l
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droi
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00 n
g/m
l
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ml
Con
droi
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to 1
00 µ
g/m
l
Con
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tina
solfa
to 1
mg/
ml
Con
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tina
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0 ng
/ml
Met
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100
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l
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1 µg
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Met
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100
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l
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1 m
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l
Met
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10 n
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l
Vita
min
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3 10
0 ng
/ml
Vita
min
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3 1
µg/m
l
Vita
min
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3 10
0 µg
/ml
Vita
min
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3 1
mg/
ml
Vita
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3 10
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ml
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l
Glu
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00 µ
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l G
luco
sam
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1 m
g/m
l
Glu
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solfa
to 1
0 ng
/ml
0
20
40
60
80
100
120
l
% o
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bilit
y
CONCLUSIONE 1
Tutte le sostanze sperimentali risultano non tossiche alla concentrazione di 1 µg/ml
OBIETTIVO 2
Determinazione attività anti-infiammatoria su cheratinociti NCTC 2544 e condrociti primari stimolati con citochine pro-infiammatorie
NF-kB (fattore nucleare –kB) COX-2 (cicloossigenasi 2 o prostaglandina-endoperossido sintasi 2) PGE2 (prostaglandine E2) ICAM-1 (molecola di adesione intercellulare) MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) IL-8 (interleuchina 8) iNOS (ossido nitrico sintetasi inducibile) NO (ossido nitrico)
Parametri valutati: NF-kB (fattore nucleare –kB) COX-2 (cicloossigenasi 2 o prostaglandina-endoperossido sintasi 2) PGE2 (prostaglandine E2) ICAM-1 (molecola di adesione intercellulare MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) IL-8 (interleuchina 8) iNOS (ossido nitrico sintetasi inducibile) NO (ossido nitrico)
RISULTATI Western blot
1 µg/ml
NF-kB NCTC 2544
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
CI +
H
I + H +
Mix
I + H +
Collagen
e idrolizz
ato
I + H +
Zinco gl
uconato
I + H +
Condroitin
a solfa
to
I + H +
Metilsu
lfonil
metano
I + H +
Vitamina D
3
I + H +
Boswell
ia so
lfato
I + H +
Selenio
metionina
I + H +
Glucosam
mina solfa
to
A.D
.U.
RISULTATI Western blot
1 µg/ml
COX-2 NCTC 2544
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
2
CI +
H
I + H +
Mix
I + H +
Collagen
e idro
lizza
to
I + H +
Zinco
glucona
to
I + H +
Condroitin
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to
I + H +
Metilsu
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I + H +
Vitamina
D3
I + H +
Boswell
ia so
lfato
I + H +
Selenio
meti
onina
I + H +
Glucosa
mmina solfa
to
A.D.
U.
RISULTATI ELISA
1 µg/ml
PGE2 NCTC 2544
02468
101214161820
CI +
H
I + H + M
ix
I + H + Colla
gene idroliz
zato
I + H + Zinco
gluconato
I + H + Condroitin
a solfa
to
I + H + M
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I + H + Bosw
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to
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io meti
onina
I + H + G
lucosammina s
olfato
pg/m
l
RISULTATI Western blot
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
CI +
H
I + H +
Mix
I + H +
Collagen
e idrolizz
ato
I + H +
Zinco gl
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I + H +
Condroitin
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Metilsu
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Vitamina D
3
I + H +
Boswell
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I + H +
Selenio
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Glucosam
mina solfa
to
A.D
.U.
1 µg/ml
ICAM-1 NCTC 2544
RISULTATI ELISA
1 µg/ml
MCP-1 NCTC 2254
05
1015202530
CI +
H
I + H + M
ix
I + H + Colla
gene idroliz
zato
I + H + Zinco
gluconato
I + H + Condroitin
a solfa
to
I + H + M
etilsulf
onilmeta
no
I + H + Vita
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I + H + Bosw
ellia solfa
to
I + H + Selen
io meti
onina
I + H + G
lucosammina s
olfato
pg/m
l
RISULTATI ELISA
1 µg/ml
IL-8 NCTC 2254
0
5
10
15
20
25
CI +
H
I + H
+ Mix
I + H
+ Colla
gene i
droli
zzato
I + H
+ Zin
co gluc
onato
I + H
+ Cond
roitin
a solfa
to
I + H
+ Meti
lsulfo
nilmeta
no
I + H
+ Vita
mina D
3
I + H
+ Bosw
ellia
solfa
to
I + H
+ Sele
nio m
etionina
I + H
+ Gluc
osammina s
olfato
pg/m
l
RISULTATI Western blot
1 µg/ml
iNOS
NCTC 2544
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
CI +
H
I + H +
Mix
I + H +
Collagen
e idrolizz
ato
I + H +
Zinco gl
uconato
I + H +
Condroitin
a solfa
to
I + H +
Metilsu
lfonil
metano
I + H +
Vitamina D
3
I + H +
Boswell
ia so
lfato
I + H +
Selenio
metionina
I + H +
Glucosam
mina solfa
to
A.D.
U.
RISULTATI Reazione di Griess
1 µg/ml
NCTC 2254 NO release
0
5
10
15
20
CI +
H
I + H + M
ix
I + H + C
ollagen
e idrolizz
ato
I + H + Z
inco glu
conato
I + H + C
ondroitin
a solfa
to
I + H + M
etilsu
lfonil
metano
I + H + V
itamina D
3
I + H + B
oswelli
a solfa
to
I + H + S
elenio m
etionina
I + H + G
lucosam
mina solfa
to
NO ( µ
M)
RISULTATI Western blot
1 µg/ml
NF-kB Condrociti
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
C
IL-1beta
10 ng/m
lI+Mix
I+ colla
gene
idro
lizza
to
I+ zinco
glucon
ato
I+condro
tin solf
ato
I+ meti
lsulfo
nilmeta
no
i+Vitamina
D3
I+ Bos
wellia
solfato
I+ gluco
sammina s
olfato
I+ Se meti
onina
A.D
.U.
RISULTATI Western blot
1 µg/ml
COX-2 Condrociti
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
2
C
IL-1b
eta 10
ng/ml
I+Mix
I+ co
llage
ne idroliz
zato
I+ zin
co gl
uconato
I+con
drotin so
lfato
I+ meti
lsulfo
nilmeta
no
i+Vita
mina D3
I+ Bosw
ellia
solfa
to
I+ gluco
sammina
solfa
to
I+ Se m
etion
ina
A.D.
U.
RISULTATI ELISA
1 µg/ml
PGE2 Condrociti
02468
101214161820
C
IL-1b
eta 10
ng/ml
I+Mix
I+coll
agen
e idro
lizza
to
I+ zin
co gl
uconato
I+con
drotin so
lfato
I+meti
lsulfo
nilmeta
no
I+Vita
mina D3
I+ Bosw
ellia
solfa
to
I+ gluco
sammina
solfa
to
I+ Se m
etion
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pg/m
l
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
C
IL-1beta
10 ng/m
l
I + M
ix
I + Coll
agene i
drolizzat
o
I + Zi
nco gluco
nato
I + Con
droitina so
lfato
I + M
etilsu
lfonilm
etano
I + Vita
mina D3
I + Bos
wellia
solfa
to
I + Sele
nio meti
onina
I + Gluco
sammina
solfa
to
A.D.
U.
RISULTATI Western blot
1 µg/ml
ICAM-1 Condrociti
RISULTATI ELISA
1 µg/ml
MCP-1 Condrociti
05
101520253035
C
IL-1b
eta 10
ng/ml
I+Mix
I+coll
agen
e idr
olizz
ato
I+ zin
co gl
uconato
I+con
drotin
solfa
to
I+meti
lsulfo
nilmeta
no
I+Vita
mina D3
I+ Bosw
ellia
solfa
to
I+ gluco
sammina
solfa
to
I+ Se m
etion
ina
pg/m
l
RISULTATI ELISA
1 µg/ml
IL-8 Condrociti
0
5
10
15
20
25
30
C
IL-1b
eta 10
ng/ml
I+Mix
I+ co
llage
ne idroliz
zato
I+ zin
co gl
uconato
I+con
drotin so
lfato
I+ meti
lsulfo
nilmeta
no
i+Vita
mina D3
I+ Bosw
ellia
solfa
to
I+ gluco
sammina
solfa
to
I+ Se m
etion
ina
pg/m
l
RISULTATI Western blot
1 µg/ml
iNOS Condrociti
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
C
IL-1beta
10 ng/m
l
I + M
ix
I + Coll
agene i
drolizzat
o
I + Zi
nco gluco
nato
I + Con
droitina so
lfato
I + M
etilsu
lfonilm
etano
I + Vita
mina D3
I + Bos
wellia
solfa
to
I + Sele
nio meti
onina
I + Gluco
sammina
solfa
to
A.D
.U.
RISULTATI Reazione di Griess
1 µg/ml
NO release Condrociti
0
5
10
15
C
IL-1beta
10 ng/m
lI+Mix
I+ colla
g idro
l
I+ zinco
glucon
ato
I+condrotin
solfato
I+ meti
lsulfo
nilmeta
no
I+Vitamina
D3
I+ Boswell
ia solf
ato
I+ gluco
sammina s
olfato
NO ( µ
M)
Tiodol (Mix)
CONCLUSIONI
NCTC 2544 +
Interferon gamma e istamina
Condrociti +
IL-1beta
Anti-
NF-kB COX-2 PGE2 ICAM-1 MCP-1 IL-8 iNOS NO
o Anti-infiammatorio
TIODOL Collagene
Modifiche della Cartilagine delle articolazioni dopo 3 mesi (sezione dei tessuti*)
Progressione senza Tiodol Collagene
Progressione con Tiodol Collagene
* Oesser S et al. (2007) Osteoarthritis Cartilage 15: C61-C62, 94
TIODOL Collagene
TIODOL COLLAGENE® e rigenerazione dei tessuti della cartilagene nell’uomo
Giorno 1 Settimana24 Settimana 48
Cartilagine danneggiata Cartilagine sana
Tiod
ol®
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TIODOL Collagene
Significativo incremento della densità dei proteoglicani rilavata con metodiche che utilizzano la fluorescenza