T.C.

BİRUNİ ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSİTİTÜSÜ

HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI

İN VİTRO ANTİOKSİDAN UYGULAMASININ SPERM

FONKSİYONLARI ÜZERİNE ETKİSİ

Dilara KONK

DANIŞMAN

Prof. Dr. Tülay İrez

İSTANBUL

2019

I. Beyan

Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına

kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri

akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmasıyla elde edilmeyen

bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine

aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal

edici bir davranışımın olmadığını beyan ederim.

Dilara KONK

iii

II. TEŞEKKÜR

Yüksek Lisans tez çalışmam süresince, bilgi birikimini paylaşan, katkılarını ve

hoşgörüsünü hiçbir zaman esirgemeyen, tezimi hazırlama döneminde deneyimleri,

desteği ve sevgisiyle her zaman yanımda hissettiğim çok değerli hocam Sayın Prof.

Dr.Tülay İREZ’e

Tüm çalışmalarım süresince boyunca yanımda olan, bilgi birikimi ve yardımlarını

esirgemeyen değerli sorumlum Emb.Feridun YAKAR ve çalışma arkadaşım Bio.

Özge MENTEŞE’ye

Yüksek Lisans eğitimimin her aşamasında yardım, hoşgörüsünü ve sabrını

esirgemeyen sevgili arkadaşım Gizem GÜDER ve bölüm arkadaşlarıma

Yüksek Lisans eğitimim sırasında ve tez yazımı sırasında bana gösterdiği hoşgörü

ve sabır ile yaklaşan sevgili eşim Mehmet Emin AKINCI’ya

Her zaman yanımda olan, desteğini her an hissettiren ve üzerimde sonsuz bir emeğe

sahip sevgili annem, sevgili babam ve sevgili abime teşekkürü borç bilirim.

iv

III. İÇİNDEKİLER

İçindekiler Sayfa No

İç Kapak……………………………………………………………………. -

Onay Sayfası ………………………………………………………………. -

I.Beyan…………………………………………………………………….. iii

II.Teşekkür……………………………………………………………….….iv

II.Teşekkür…………………………………………………………….……..v

IV.Simge ve Kısaltmalar Listesi……………………………………….…….viii

V.Tablo listesi…………………………………………………………..…....xi

VI.Şekil listesi…………………………………………………………….....xiii

VII. Resim Listesi…………………………………………………………....xiv

1. Özet ve anahtar kelimeler…………………………………………………..1

2. Abstract………………………………………………………………….….2

3. Giriş ve Amaç……………………………………………………………....3

4. Genel Bilgiler…………………………………………………………..…...5

4.1. Spermin Yapısı……………………………………………………..…...5

4.1.1. Spermatozoon membranı…………………………………….…...…8

4.1.2. Kapasitasyon…………………………………………………..…….9

4.1.3. Erkek İnfertilitesinin Değerlendirilmesi………………………..….10

4.1.4. Semen……………………………………………………………….11

4.1.4.1. Semen Analizi……………………………………….……....12

4.1.4.2. Sperm Hazırlama Yöntemleri…………………………...…....30

4.2. Antioksidanlar……………………………………………...…………...33

4.2.1. Antioksidanların Sınıflandırılması………………………………....34

4.2.2. Antioksidan Savunma Sistemi…………………………………..….35

4.2.3. Sperm Antioksidan Sistemi…………………………………..….….36

4.2.4. Yardımcı Üreme Teknikleri ve Antioksidanlar………………..…...36

v

4.3. Reaktif Oksijen Türleri ……………………..………………………......37

4.3.1. ROS’un Hücresel Substratları………………………………...…....38

4.3.2. İnsan Semeninde ROS’un Kaynağı………………………….….….39

4.3.3. İnsan Semeninde ROS üretim alanları………………………....…..40

4.4. Oksidatif Stres………………………………………………………......40

4.4.1. Oksidatif Stres ve Erkek İnfertilitesi……………………..……..…41

4.5. Glutatyon peroksidaz……………………………………………..….…43

5. Gereç ve Yöntem………………………………………………..………….46

5.1. Kullanılan Gereçler………………..……………………………..…….46

5.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler……………………………………...…47

5.3. Deney Gruplarının Oluşturulması………………………………….…..47

5.4. Semen Toplanması ve Analizi………………………………………....48

5.5. Sperm Boyama Ve Morfoloji Değerlendirilmesi...………………...…48

5.6. Swim Up Yöntemi……………………………………………….....….49

5.7. Glutatyon Peroksidaz (GPX) Hazırlanama Protokolü………...……….49

5.8. Glutatyon Peroksidaz (GPX) Uygulama Protokolü…………...….…...49

5.9. Eosin Y Uygulama Portokolü…………………………………....…….50

5.10. Sperm Sayısı ve Motilite Değerlendirilmesi…………………..…..…50

5.11. İstatiksel Değerlendirmeler…………………………………..……....51

6. Bulgular………………………………………………………………..…..52

6.1. Yaş……………………………………………………...…………..….54

6.2. Semen Volümü………………………………………………….….….54

6.3. Konsantrasyon…………………………………..……………….….…54

6.4. İmmotilite………………………………………………………..….…54

6.5. İleri Hızlı Hareketli (+4) Sperm……………………………….……...55

6.6. Yavaş Hareketli (+3) Sperm…………………………………….….…56

6.7. Yerinde Hareketli (+2) Sperm…………………………………....…...56

6.8. Toplam Motil Sperm Sayısı ( TPMSS)…………….…………..……..57

6.9. Motilite…………………………….………………………..…….…..57

6.10.Vitalite………………………………………………………………..59

7. Tartışma……………………………………………………….….….…....63

8. Sonuç ve Öneriler………………………………………….…………..….68

9. Kaynakça………………………………………………...……………..…69

10. Ekler……………………………………………………………………...81

vi

Ek 2. Gönüllü Olur Formu…………………………………………….…..81

Ek 3. Etik Kurul Onayı……………………………………….……...……84

11. Özgeçmiş…………………………………………………………..……..86

İhtihal Raporu …………………………………………………….…….……87

vii

IV. SİMGELER VE KISALTMALAR

ATP Adenosine Triphosphate

cAMP Siklik Adenozin Monofosfat

CAT Katalaz cm Santimetre CO2 Karbondioksit

dk Dakika

DNA Deoksiribonükleik Asit

FSH Folikül Uyarıcı Hormon

GR Glutatyon Redüktaz

GPX Glutatyon Peroksidaz

GSH Glutatyon

GSSG Glutatyon Disülfit

GST Glutatyon -S Transferaz

HO2 Hidroperoksil radikali

H202 Hidrojen Peroksit

HOS Hipoosmotik Şişme

HOST Hipoosmotik Şişme Testi

ICSI İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu

IUI İntrauterin İnseminasyon

IVF İn Vitro Fertilizasyon(Döllenme)

L Lipid Serbest Radikali

viii

LOO Lipid Peroksit Radikali

ml Mililitre

mm Milimetre

μm Mikrometre

μl Mikrolitre

μg Mikrogram

NAD Nikotinamid Adenin Dinükleotid

NADPH Nikotin amid adenozin di nükleotid fosfat

NADP Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat

O2 Moleküler oksijen

O2

- Süperoksit radikali

ODF Outer Dense Fiber (Yoğun Dış Lifler)

OH-

Hidroksil radikali

PAS Proakrozomal Granüller pH Hidrojenin Gücü

PHGPX Selenoenzim fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz PHSS Hızlı Hareketli Spermatozoon Sayısı

RO Alkoksi radikali ROO Peroksil radikali

ROS Reaktif Oksijen Türevleri

RS Tiyil Radikali

ix

RSO Sülfenil Radikali

RSO2 Tiyil Peroksit Radikali

SOD Süperoksit Dismutaz

UV Ultraviole

YÜT Yardımcı Üreme Teknikleri

WHO Dünya Sağlık Örgütü

ZP Zona Pellusida

°C Santigrat derece

% Yüzde

< Küçük

> Büyük

x

V. TABLO LİSTESİ

Tablo No Tablo Adı Sayfa No

Tablo 1. Semen İçeriğinin Dağılımı…………………………………………..11

Tablo 2. Terminoloji…………………………………….……………….……14

Tablo 3. Semen Analizi Normal Referans Değerleri……………………….…19

Tablo 4. Ros Türlerinin Sınıflandırılması………………………… ……….…38

Tablo 5. GPX Türleri, Özellikleri ve Hücresel Lokalizasyonları………….…..44

Tablo 6. Kullanılan Gereçler, Firma Adı ve Alındığı Ülkeler…………..….…46

Tablo 7 . Kullanılan Kimyasal Maddeler, Firma adı ve Alındığı Ülkeler…..…47

Tablo 8. Semen Örneklerin pH, Viskozite ve Hacim Ortalama Değerleri.…...52

Tablo 9. Normospermik ve Oligospermik Grupların Bazal Değerleri, 1 Saatlik

ve 24 Saatlik GPX Uygulamasının Bazal Değerlere Etkisi…………………………53

Tablo 10. Normospermik Gruba Ait Motilite Verileri………………..………….58

Tablo 11. Oligospermik Gruba Ait Motilite Verileri……………………………59

Tablo 12. Normospermik Gruba Ait Vitalite Verileri…………………………...60

Tablo 13. Oligospermik Gruba Ait Vitalite Verileri………………………….….61

xi

VI. ŞEKİL LİSTESİ

Şekil No Şekil Adı Sayfa No

Şekil 1. Spermatozoon Yapısı ……….…………….……….…….……….…..…6

Şekil 2. Spermin Kuyruk Yapısı ……………………………………..………..….7

Şekil 3. Farklı Sperm Aglütinasyon Derecelerinin Şematik Diyagramı..………..20

Şekil 4. Makler Kamerası İle Konsantrasyon Ölçümü …………………….......24

Şekil 5. Konsantrasyon Ölçümü………………………...……...…………….….24

Şekil 6. Eosin Y ile Boyanmış Spermatozoon……………………….……..…...26

Şekil 7. Hipoozmatik Strese Maruz Bırakılan İnsan Spermatozoasının Morfolojik

Değişiminin Şematik Görünümü…………………………..…...........................…...27

Şekil 8. İnsan Spermatozoasının Normal ve Anormal Formları ………………..29

Şekil 9. Swim- Up Yöntemi………………………….……………….…………31

Şekil 10. Dansite Gradient Santrifüjleme….………………..………….……..…33

Şekil 11. Antioksidanların Sınıflandırılması.………………………………..…..34

Şekil 12. Antioksidan Savunma Sistemi……………………………….….….…35

Şekil 13. ROS’un Sebep Olduğu Hücre Hasarı………………………...……….39

Şekil 14. Oksidatif Stres ve Koşullarının Oluşumu …………………………….41

Şekil 15. Oksidatif Stres ve İnfertilite …………………………………..……...42

Şekil 16. Antioksidan Enzimler ve Reaksiyonları ……………………….………45

Şekil 17. Normospermik Grup Motilite ve Vitalite Değerlerinin

Karşılaştırılması……………………………………………………………………..62

Şekil 18. Oligospermik Grup Motilite ve Vitalite Değerlerinin

Karşılaştırılması……………………………………………………………………..62

xii

RESİM LİSTESİ

Resim No Resim Adı Sayfa No

Resim 1. Spermac Stains ( A, B, C) ve Fiksatif ……………….………..….49

Resim 2. Makler Kamerası …………………………………..………...……51

xiii

1. ÖZET

Antioksidanlar, ROS’un meydana gelişi ve ROS’un sebeb olduğu hasarları

önleyebilen savunma mekanizmalarıdır. Spermatozoa hücreleri plazma

membranlarında poliansatüre yağ ve düşük konsantrasyonlarda sitoplazmalarında

antioksidan savunma enzimleri bulunmaktadır. Bu nedenle spermatozoa hücreleri

ROS’a karşı diğer hücrelere oranla daha fazla hassasiyet gösterir. Antioksidan sistem

ile ROS oluşumu arasında denge vardır. Spermatozoon, oksidatif hasara karşı

DNA’sını iki savunma sistemi ile korumaktadır. Birincisi seminal plazma, ikincisi

DNA’nın paketlenerek düzenlenmesidir. Glutatyon peroksidaz (GPX), seminal

plazma enzimlerindendir. İnsan spermatozoalarında, ROS’u etkisizleştirmek,

azaltılmış glutatyon yoluyla glutatyon peroksidaz\glutatyon redüktaz sistemine

bağlıdır. Bu çalışmada amaç GPX’in in vitro kullanımında sperm motilitesi ve

canlılığı üzerine etkilerinin araştırılmasıdır.

Gereç ve yöntem:Çalışma Bahçelievler MedicalPark Hastanesi IVF merkezine

spermiyogram testi için başvuran, normozoospermi ve oligozoospermi özelliği

gösteren 20’şer erkek olgunun semen örneği üzerinde yapıldı. Mikroskobik ve

morfolojik değerlendirmeler WHO kriterlerine uygun olarak yapıldı. Canlılık

değerlendirmesinde Eosin Y testi uygulandı. İn vitro ortamda 1 ve 24 saat GPX’e

maruz bırakılan semen örnekleri motilite ve vitalite değerlendirilmesi yapıldı ve

örnekler kontrol grubu ile karşılaştırılarak değerlendirildi.Verilerin değerlendirilmesi

Student’s- t Testi ile analizi yapıldı.

Bulgular:Çalışmamızda;1 ve 24 saatlik GPX’ e maruz bırakılan normozoospermik

ve oligozoospermik semen örneklerininin sperm motilitelerinde artış gözlendi.

Vitalitelerinde değişim gözlenmedi. 24 saat GPX e maruz normozoospermi ve

oligozoospermi semen örneklerinin vitalitelerinde düşüş gözlendi.

Tartışma:Çalışmada 1 ve 24 saatlik GPX uygulamasının normozoospermik ve

oligozoospermik gruplar arasında motiliteyi artırıdığını, 24 saatlik GPX

uygulamasının normozoospermik ve oligozoospermik gruplarda vitaliteyi negatif

etkilediği düşünülmüştür. Daha güvenilir sonuçlar elde etmek için;aynı gruplar ve

genel popülasyonda yapılacak büyük ölçekli çalışmalara ihtiyaç olduğu sonucuna

varılmıştır.

Anahtar kelimeler:Antioksidan, glutatyon peroksidaz, infertilite,in vitro,

spermatozoon

1

2.ABTRACT

THE EFFECT OF IN VITRO ANTIOXIDANT APPLICATION ON SPERM

FUNCTIONS

Antioxidants are the defense mechanisms that can prevent the damage caused by

ROS and ROS. Spermatozoa cells have antioxidant defense enzymes in the plasma

membranes of polyunsaturated fat and low concentrations of cytoplasm. Therefore,

spermatozoa cells are more sensitive to ROS than other cells. There is a balance

between the antioxidant system and ROS formation. Spermatozoon protects its DNA

against oxidative damage with two defense systems. The first is the seminal plasma

and the second is the packaging of the DNA. Glutathione peroxidase (GPX) is one of

the seminal plasma enzymes. In human spermatozoa, inactivation of ROS is

dependent on the glutathione peroxidase \ glutathione reductase system through

reduced glutathione. The aim of this study was to investigate the effects of GPX in in

vitro use on sperm motility and viability.

Materials and methods: This study was conducted on a semen sample of 20 male

patients with normozoospermia and oligozoospermia who were admitted to the IVF

center of Bahçelievler Medical Hospital. Microscopic and morphological evaluations

were performed according to WHO 2010 criteria. Eosin Y test was used for viability

evaluation. Semen samples that were exposed to GPX for 1 and 24 hours in vitro

were evaluated for motility and vitality and the samples were evaluated by

comparison with control group. The data were analyzed by Student maruzs- T Test.

Results: In our study, sperm motility of normozoospermic and oligozoospermic

semen samples exposed to 1 and 24 hour GPX was increased. No change in their

vitality. A decrease was observed in the vitalities of the normozoospermia and

oligozoospermia semen samples exposed to GPX for 24 hours.

Discussion: In this study, it was thought that 1-hour and 24-hour GPX application

increased motility among normozoospermic and oligozoospermic groups. In order to

obtain more reliable results, it was concluded that large-scale studies in the same

groups and the general population were needed.

Key words: Antioxidant, glutathione peroxidase, infertility, in vitro, spermatozoon

2

3. GİRİŞ VE AMAÇ

Canlı organizmada değişik metabolik yollar ile serbest radikal üretimi devam

ettiğinden organizma kendini savunmak için meydana toksik ürünlere karşı

antioksidan savunma sistemi geliştirirler (Valko, 2006).

Aşırı ROS üretimi spermatozoa ve seminal plazmanın antioksidan savunma

mekanizmalarını geçen kritik seviyeye ulaşırsa oksidatif strese neden olur (Aitken,

2012). Oksidatif stresin hedefleri lipidler, nükleik asitler, yağlar, proteinler ve diğer

tüm hücre yapı taşlarıdır (Smith et al., 1996). Spermatozoa hücreleri ROS’a karşı

diğer hücrelere göre daha fazla hassasiyet gösterir. Bu hassasiyetin sebebi, plazma

membranlarının yüksek oranda poliansatüre yağ asitleri içeriyor olmasıdır (Aitken,

2012).

Aşırı ROS artışı sperm fonksiyon bozukluğunda önemli rol oynamaktadır. Reaktif

oksijen türlerinin artmış düzeyi ve total enzimatik olmayan antioksidan düzeyindeki

düşme sperm plazma membranında artmış lipid peroksidasyonu ile beraberdir (Smith

et al.,1996).

Lipid peroksidasyonu sperm plazma membranının akıcılığına zarar vererek oosit

füzyonu yeteneği kaybına yol açar. Bazı çalışmalar orta kısım anomalisi ile birlikte

olan lipid peroksidasyonunun, sperm sayısı, sperm motilitesi, akrozom reaksiyonu

zayıflaması ile fertilizasyon kabiliyetinde azalma olduğunu göstermiştir (Sukcharoen

et al., 1996).

Glutatyon peroksidaz (GPX), GSH’ın indirgeyici gücünü kullanarak hidrojen

peroksitin ve doymamış yağlardan meydana gelen organik hidroperoksitlerin

deaktivasyonunu kataliz eder. Peroksitlerin indirgenmesini katalizleyen GPX enzimi,

hücredeki indirgenmiş glutatyonu (GSH) yükseltgenmiş glutatyona (GSSG)

dönüştürmektedir. GPX, glutatyonu hidrojen donör olarak kullanarak hidrojen

peroksiti elimine etmektedir. Bu reaksiyonlar, canlı organizmada oksidatif stresin

zararlı etkilerinden hücresel membranları korumaya yarar (Ursini and Maiorino,

2014). Glutatyon peroksidaz (GPX) sperm gelişiminin ilk aşamalarında aktif halde

bulunur (Arthur, 2000).

3

Glutatyon peroksidaz (GPX) ailesi, farklı dokularda dağılmış ancak türler arasında

farklılık gösteren 8 üyeden oluşmaktadır (Sies et al., 1997). Azaltılmış glutatyon

(GSH) kullanarak H2O2 ve diğer hidroperoksitlerin çıkarılması için gereken

reaksiyonu katalize etmektedir. Hidroperoksitleri uzaklaştırmaya devam etmek için,

oksitlenmiş glutatyonun (GS-SG), indirgeyici ajan olarak NADPH kullanılarak

glutatyon redüktaz (GR) enzimi tarafından GSH'ye düşürülmesi gerekir. Glutatyon

peroksidazlar ayrıca motilite ve sperm kapasitasyonunda yer alan proteinlerde tirozin

nitrasyonunu teşvik eden hücrelere zarar verebilen çok reaktif bir ROS olan ONOO−

'ü de azaltabilir (Sies et al.,1997; Vignini et al., 2006). Spermatozoa için büyük önem

taşıyan selenoprotein fosfolipid hidroperoksit GPX4'ün (PHGPX) varlığı,

mitokondriyal kılıfın normal oluşumu için gerekli olan ve mitokondriyal sarmalda

lokalize edilmiş olan sperm orta kısım protein içeriğinin yaklaşık %50'sini oluşturan

yapısal bir protein olmasıdır (Ursini et al., 1999). Mitokondrial PHGPX (mGPX4)

bulunmayan erkek fareler, vahşi tip hayvanlara göre anormal ve daha az hareketli

spermler ile kısırdır (Imai et al., 2009). İnfertil erkeklerde anormal morfoloji düşük

sperm motilitesi gösterdiği için, normal sperm fonksiyonunu sağlamak için mGPX4'e

olan ihtiyaç da insanlarda gösterilmiştir (Imai et al., 2006). Yapılan çalışmalarda

glultatyonun peroksidazın sperm motilitesini artırıcı bir özelliği olduğu da ortaya

konmuştur (De Lamirende, 2008).

Bu çalışmada glutatyon peroksidaz, normozoospermi ve oligozoospermik gruplara 1

ve 24 saat in vitro ortamda maruz bırakıldı ve motilite ve vitalite parametreleri

üzerinde glutatyon peroksidazın süreye bağlı etkisi olup olmadığını araştırmayı

amaçladık.

4

4. GENEL BİLGİLER

4.1. Spermin Yapısı

Erkek üreme hücresi 1677 tarihinde Johan Hamm ve Leeuwenhook tarafından

mikroskobik olarak gözlemlenmiştir. Ancak Johan Hamm ve Leeuwenhook

spermlerin fertilizasyondaki görevini yanlış anlamışlardır. Johan Hamm ve

Leeuwenhook’a göre spermler kadın üreme yollarında büyüyen minyatür insan

şekilleri idi (Hassa, 2003).

Karl Ernst V. Baer, 1827 yılında erkek üreme hücresini küçük bir hayvancığa

benzetmiş ve erkek üreme hücresine spermatozoon adını vermiştir (Hassa, 2003).

64 ile 72 gün arasında süren spermiyogenez olayı sonucu spermiasyon olayıyla

sertoli hücrelerinden ayrılan spermatozoonlar, seminifer tübül lümenine geçerler.

Fonsiyonel olarak olgunlaşmayan spermatozoonlar, mikroskobik olarak

incelendiğinde morfolojik olarak olgun gözlenirler. Spermatozoonlar motilite

yeteneklerini duktus epididimis ve yardımcı bezlerin salgıları ile fertilizasyon

yeteneklerini ise dişi genital kanallarında kapasitasyon olayını tamamlayarak

kazanırlar (Zülfikaroğlu ve ark, 2010).

Olgun bir spermatozoon hücresi, 50-60 μm uzunluğunda, serbest yüzebilen ve aktif

olarak hareket kabiliyetine sahip hücrelerdir (Karagöz, 2002).

Spermatozoon hücresi morfolojik olarak iki ana kısımda incelenir. Bu iki ana kısım

baş ve kuyruktur. Kuyruk bölgesi ise boyun parçası, orta parça, esas parça ve son

parça olmak üzere dört kısımda incelenir (Kahraman, 2008).

5

(Çoruh, 2010)

Şekil 1. Spermatozoon Yapısı

Baş kısmı; olgun spermatozoon hücresinin çekirdeği taşıyan yassı formda bir baş

kısmı bulunur. Olgun spermatozoon hücresinin baş kısmı 4-5 μm uzunluğunda ve

genişliği 2,5- 3,5 μm’dir . Çekirdek baş kısmının büyük bir bölümünü kaplar ve

anteriyör yarısını ise akrozom oluşturur. Akrozom, membranla çevrili, kep şekline

benzeyen bir formda organel olup fertilizasyon için gerekli hidrolitik enzimleri

(hiyaluronidaz, asit fosfatazlar, nöraminidaz ve proteazlar) içermektedir

(Kierszenbaum, 2006; Hassa 2003). Döllenme sırasında salınan akrozomal enzimler,

spermatozoa hücresinin oositi saran zona pellusida ve korona radiatadan geçişini

kolaylaştırır (Kierszenbaum, 2006).

Baş Kısmı

Kuyruk

Son Parça

Orta Kısım

Boyun Sentriyoller

Çekirdek

Akrozom

Mitokondri

Hücre Zarı

Hücre Membranı

Aksiyel filaman sil ve flagellum yapısı için tipik olan 9+2 şeklindeki ışınsal dizilimi olan mikrotübülleri içerir.

Aksiyal Filament

6

Kuyruk kısmı; sperm hücresinin hareket kabiliyetini sağlayan kuyruk kısmıdır.

Kuyruk kısmı uzunluğu 45 μm ve genişliği 0,4-0,5 μm’dir. Spermin kuyruk kısmı

kesintisiz tek parça ve ince bir yapıda olmalı. Sperm kuyruğunda bulunan yapı

aksonemdir ve mikrotübüler ikililerden oluşur bu yapının temel görevi sperm

kuyruğunda hareketi sağlamaktır (Erdemir ve ark., 2011).

Sperm kuyruğu 4 kısımdan oluşmaktadır. Uç kısımdan tabana doğru bu kısımlar; son

parça, esas parça, orta parça ve bağlantı parçasıdır (Kierszenbaum, 2006).

(Amann and Graham, 1993)

Şekil 2.Spermin Kuyruk Yapısı

Sperm bağlantı parçası (Connecting piece); yapı olarak dar bir yapıya sahip olan

sperm bağlantı parçasında bir çift sentriyol bulunur. Distal sentriyol, sperm

kuyruğunun hareketini sağlayan aksoneme kaynaklık yapmaktadır (Kierszenbaum,

2006).

Orta kısım (Middle piece); mitokondri ve yoğun dış fibrillerle sarılı aksonemden

meydana gelmektedir. Aksonem ise dokuz mikrotübül çiftinin iki kat sardığı

mikrotübüler bir yapıdan meydana gelir. Sperm kuyruğunun sertliği disülfit

7

bağlarının yoğun olarak bulunduğu dış fibrillerle sağlanır. Orta kısımda yer alan

mitokondriler hücre enerjisi ve oksidatif metabolizma için gerekli olan ATP

(Adenozin Trifosfat) üretiminden sorumlu enzimleri içerir. Aksonem, elde edilen

kimyasal enerjisi mekanik harekete (motiliteye) dönüştürebilmek için gerekli olan

yapısal proteinler ve enzim kompleksi içerir. Orta kısım kuyruğun sonuna doğru

incelmekte ve esas parçayı birleştiren annulus adı verilen bir yapı ile sonlanmaktadır

(Özdiler ve Aydos, 2000).

Esas parça (Principal piece); fibröz kılıf ile aksonemden meydana gelmektedir.

Terminal yapı ile annulus arasında kalır. Fibröz kılıf, aksonem ile yoğun dış lifleri

(outer dense fiber) sarmaktadır. Yüzeyde uzunlamasına iki kolon ve yarım daire

şeklinde ki yapılardan oluşur. Fibröz kılıf oldukça stabil bir yapıya sahiptir. Bu

stabilitesini yapısında bulunan disülfide borçludur. Bu stabiliteye bağlı olarak

spermatozoon hareketine yardımcı olur. (Kadıoğlu ve ark., 2004).

4.1.1. Spermatozoon membranı

Spermatozoon membranı; lipid, karbonhidrat ve protein yapısındadır. Lipidlerin ana

görevi membran yapısını meydana getirerek stabilizasyonu ve bütünlüğünü korumak,

fonksiyonel olarak olgunlaşmak, akrozom reaksiyonu ve sperm- oosit membran

temasında görev almaktadır. Spermatozoa hücreleri; yüksek miktarda fosfotidil

etanolamin, sfingomiyelin ve fosfotidil kolin içermeketedir. Kolesterol

fosfolipidlerle birlikte spermatozoon membranının bütünlüğünü ve geçirmezliği

sağlamada rol oynar. Spermatozoon membranının yapısında, monosakkaridler

(mannoz, glukoz gibi) ile disakkaridler bulunmaktadır. Esas aminoasit yapısını ise

tirozin, triptofan ve histidin oluşturmaktadır. Spermatozoon hücrelerinin

membranında; spesifik antijenler dışında, hücre - hücre veya hücre - matriks

etkileşimini gerçekleştiren matriks ve nonspesifik proteinlerle beraber,

immünoglobülinler, selektinler, integrinler ve kaderinler gibi adezyon moleküllerinin

de bulunduğu gösterilmektedir (Zülfikaroğlu ve ark., 2010).

Testiküler germ hücrelerinin glikoproteinleri, spermatozoon farklılaşması ve

spermatogenezde sertoli hücreleriyle etkileşimde görev alır. Aynı zamanda

glikokaliks, spermatozoa hücrelerinin dişi immün sistemine karşı korunmasında,

8

akrozom reaksiyonlarının gerçekleşmesinde ve spermatozoonun oositi dölleme

yeteneğinde ana rol oynamaktadır (Alibadi et al., 2013).

4.1.2.Kapasitasyon

Kapasitasyon, sperm hücrelerinin dişi genital kanalı içerisinde fertilizasyon yeteneği

kazanabilmesi için geçirdiği olgunlaşma sürecidir. Bu süreç sağlıklı bir erkek bireyde

yaklaşık 7 saat sürmektedir. Kapasitasyon sürecinin büyük bir bölümü dişi bireyin

fallop tüplerinde gerçekleşmektedir(Sadler, 2005). Kapasitasyon sürecinde rol alan

serin-treonin fosforilasyonunun rolü tam anlaşılamamıştır. Ancak kapasitasyonla

ilgili yapılan çalışmalar sonrasında tirozin fosforilasyonu ve kapasitasyon arasında

bir bağlantı olduğu sonucuna varılmıştır. Hücre faklılaşması ve çoğalmasında görev

alan en büyük düzenleyici prolin tarafından gerçekleşen fosforilasyondur.

Kapasitasyon olayı sperme kolesterol girişine bağlı olan prolin fosforilasyonun

artmasıyla bağlantılıdır (Gedikli ve ark., 2013). Kapasitasyon sırasında endometriyal

hücrelerden salgılan interlökin-6 (IL-6) sperm hücresinin fertilizasyon kabiliyetini

pozitif olarak etkiler ve kapasitasyonu artırıcı rol oynar. IL-6 kapasistasyon artıcı

etkilerini gösterebilmek için sperm hücresinde yer alan IL-6Rα reseptörüne

bağlanmalıdır (Gedikli ve ark., 2013).

Dişi ve erkek genital kanallarında kapasitasyon önleyici faktörler olarak adlandırılan

bazı maddeler bulunmaktadır. Bu faktörlerin esas amacı erken kapasitasyonu

önlemektir. Kapasitasyonu önleyen bu faktörlerden biri kolestroldur. Kolestrol sperm

hareketliliğini azaltır ve kapasitasyonun başlamasını bloke eder. Sonuç olarak

kapasitasyonun başlamasındaki en önemli etken sperm membranında yer alan

kolestrolün bağlanarak dışarıya atılmasıdır. Böylece spermler ancak ampulla

bölgesine ulaştığında fertilizasyon kabiliyetini kazanmış olurlar.

cAMP, G-protein, kalsiyum redoks ve kinaza bağımlı bir süreç olan kapasitasyonun

gerçekleşebilmesi için ortamda enerji kaynaklarının bulunması gerekir. Bu enerji

kaynakları; glikoz, kalsiyum, bikarbonat ve serum albümindir. cAMP kapasitasyon

olayında ikinci haberci olarak rol oynamaktadır. Hücre içerisinde gerçekleşecek olan

kapasitasyondan protein kinaz A sorumludur. Protein kinaz A’nın inhibisyonu

kapasitasyonu engeller. Kapasitasyon olayı gerçekleşirken gözlenen olaylardan biri

de tirozin fosforilasyonunun yükselmesidir. Tirozin fosforilasyonunun

9

yükselmesinde görev alan en önemli enzim cAMP’dir. Reaktif oksijen türleri ve

cAMP’ye bağlı sinyal mekanizması tirozin fosforilizasyonunu başlatır.

Fosforilasyonun başlaması ile birlikte Ca+2 artışı gözlenir. Tirozin ile fosforile olan

proteinler insan sperminde ZP3 için reseptör olarak görev alır. Reseptör olarak görev

alan proteinler akrozomda yer alır ve tirozin kinaz etkinliğini gösterir. Zona pellusida

da bulunan proteinler ile temas ettiğinde tirozin kinaz etkin hale gelir, tirozin

fosforillenir ve fosfotirozin oluşur. Sperm hücresinin membranında yer alan ve

AKAP (A-kinase anchor protein) adı verilen diğer bir protein ise kinazın etkinliğini

göstermekte ve zona pellusida proteinleri için reseptör görevi üstlenmektedir

(Gedikli ve ark., 2013). Spermatozoa hücreleri ile dişi üreme kanallarında bulunan

epitel hücreleri arasında bir etkileşim meydana gelir ve spermatozoa hücresinin

akrozomal bölgesini örten plazma membranı üzerindeki glikoprotein kılıf ve seminal

plazma proteinleri ortadan kaldırılır. Tüm bu gerçekleşen olaylar sonucunda

kapasitasyon sürecini başarıyla tamamlayan bir sperm hücresi korona radiyata

hücrelerini geçerek akrozom reaksiyonunu başlatabilir (Sadler, 2005).

4.1.3. Erkek İnfertilitesinin Değerlendirilmesi

Günümüzde en sık kullanılan infertilite tanımı; en az bir yıllık korunmasız, düzenli

ilişkiye rağmen gebelik elde edilememesi olarak tanımlanmaktadır (Agarwal and

Allamaneni, 2014).

Eskiden infertilite nedenlerinin sadece kadından kaynaklandığı düşünülüyordu.

Dünya Sağlık Örgütü (WHO) bunun üzerine 1993 tarihinde 7273 infertil çift

üzerinde infertilite nedenlerini araştıran bir çalışma yapmıştır. Bu çalışmanın

sonucuna göre toplumun yaklaşık % 15’inde infertilite sorunu gözlenmiş ve infertil

çiftlerin % 41’inde sadece kadın, % 24’ünde sadece erkek, % 24’ünde hem erkek

hem de kadın faktörü birlikte görülmüştür. Geriye kalan oranın ise infertilite nedeni

belirlenememiştir. WHO’ nun yaptığı çalışmalar sonrası erkek infertilitesi tek başına

ve kadın faktörü ile birlikte tüm infertil vakaların yaklaşık yarısını oluşturmaktadır

(WHO, 1993). Erkek infertilitesinin değerlendirilmesi anamnez, fiziksel muayene ve

ejakülatın laboratuvarda incelenmesi basamaklarını kapsamaktadır. Erkek

infertilitesinin değerlendirilmesinde ilk başvurulan yöntem spermiyogram (semen

analizi)’dır (Burrows et al., 2002).

10

4.1.4. Semen

Testiküler, epididimal ve aksesuar bezlerin salgılarının aksine ejakülat vücutta

bulunmamaktadır. Ejakülat, sadece ejakülasyon sırasında, bu organlardan gelen

salgıların birleşmesi sonucu oluşur (Cooper and Yeung, 2010).

Tablo 1. Semen İçeriğinin Dağılımı

Ejakülasyon Öncesi Bulbouretral bezden salgılanan açık renkli

birkaç damla sıvı

Semenin İlk Kısmı Prostat kaynaklı ve spermden sınırlı sıvı

Semenin Orta Kısmı Testis, epididimis ve vas deferens kaynaklı,

spermden çok zengin

Semenin Son Kısmı Seminal vezikül kaynaklı

(Sunderman and Boerner, 1950)

Ejakülasyon ile dışarı atılan; spermatozoonlar, epididimis ve seminal vezikül (%60),

prostat (%30) ve bulboüretral bezlerin (%10) salgılarından oluşan grimsi opak renkli

sıvıdır. Ayrıca yapısında bu salgılara ek olarak prostaglandinler, epitel döküntüleri,

bağ dokusu gezgin hücreleri, yuvarlak hiyalin cisimler, prostat taşları, lipitler,

proteinler ve pigment granülleri içermektedir.

Spermatozoon semenin yanlızca %1’ inde bulunmaktadır. Bu %1’lik kısım dışında

geriye kalanlar erkek genital bezlerinden salgılanan sıvılardır. Bu salgılanan sıvıların

içeriği spermatozoonu beslemek için früktoz, spermatozoonu immotil hale getiren

üretra ve vajina asit ortamını nötrleyen alkalin salgı, spermatozoonun motilitesini

sağlayan ve artıran, tamponlayan tuzlar ve fosfolipitlerdir. Semenin %90’nını su

oluşturur. Ancak bunun yanında pek çok madde de içermektedir. Bu maddelerden

en belirgin olanı enerji kaynağı olarakta kullanılan früktozdur. Bununla birlikte

vitamin C ve inositol gibi vitaminler ile Ca, Zn, Mg, Cu, sülfür gibi iz elementleri de

içermektedir. Prostaglandin konsantrasyonu vücutta en yüksek semende

bulunmaktadır.

11

Ereksiyon sırasında üretrayı kayganlaştıran bulboüretral bezlerin salgılarıdır.

Ejakülasyon başlangıcında asit fosfataz ve sitrik asitten zengin prostat sıvısı, bunun

arkasından duktus deferens ve duktus epididimisin distal kısmındaki kasların

kontraksiyon gücü ile spermiumlar ejakülata katılır. Son olarak ejakülata katılan

salgı, früktoz ve prostaglandinlerden zengin, koyu kıvamlı seminal vezikül salgısıdır

(Çoruh, 2010).

4.1.4.1. Semen Analizi

1677 yılında Van Leeuwenhoek ve Johan Hamm infertiliteye karşı bilimsel bir bakış

açısı oluşturabilmek amacıyla insan sperminin keşfini tamamladıklarını Londra

Royal Akademi’sine bir mektup ile bildirmişlerdir. İnsan sperminin keşfinden sonra

Schirren, sterilite şeklinde tanımlanabilen evlilik durumlarında bu sorunun erkek mi

yoksa kadından mı kaynaklandığını tespit etmek amacıyla mikroskobik inceleme

yapılmasının gerekliliğini ortaya koymuştur. Semen analizi ile ilgili daha bilimsel

yaklaşımlar 19. yüzyılın sonlarına doğru ortaya konulmuştur. Buna göre Lode,

semen sayımını hemositometre ile gerçekleştirmiştir. Lode yaptığı çalışma sonunda,

araştırılan dört erkek olgunun ortalama sperm konsantrasyonunu 68,88x106 olarak

bulmuştur. Bundan sonra 1941 yılında Hotchkiss sperm motilitesinin

değerlendirilmesi üzerine çalışmalar yapmış daha sonraları 1945 yılında Macleod ve

Heim’da sperm motilitesinin değerlendirilmesi için bir derecelendirme sistemi

bildirmiştir. Geliştirilerek elde edilen bu sistem de sperm hareket ve progresif

motiliteleri ayrı ayrı kaydedilerek ileriye doğru olan hareket; 0- 4 arasındaki skala ile

belirtilmiştir. Sonraki dönemler de Belding, günümüzde de kullanılmakta olan semen

analizine katkıda bulunmuştur. Semen analizine göre; spermdeki baş, orta kısım ve

kuyruk defektleri tek tek ya da kombine olarak belirtilmesi gerektiği ifade etmiştir.

Semen analizi ile ilgili yapılan bu çalışmayı 1934 yılında, Williams’ın spermin baş

kısmındaki vakuollerin varlığı ile akrozomu tanımlaması izlemiştir. Semen

analizinde en iyi standardizasyonu sağlamak amacıyla, Dünya Sağlık Örgütü (WHO)

ilk kitapcığını 1980 yılında yayınlamış sonra bunu sırası ile 1987, 1992, 1999 ve

2010 yıllarındaki farklı basımlı kitapcıklar takip etmiştir (Oehninger and Kruger,

2009).

Erkek infertilitesinde sperm yapı bozuklukları ve aksesuar cinsel bez salgı

bozuklukları %35-40 oranında gözlenmektedir. Erkek infertilitesine neden olan diğer

12

etkenler ise, genital traktüste obstrüksiyon ve sperm işlev bozukluklarıdır. İnfertil bir

çiftte ilk olarak araştırmalara semen analizi ile başlanması kabul gören bir

uygulamadır. (Hassa, 2003).

13

Tablo 2. Terminoloji

TERMİNOLOJİ

ASPERMİ Seminal sıvı yokluğu (retrograd ejakülasyon var

veya yok)

ASTENOZOOSPERMİ İleri hareketli spermlerin yüzdesi alt referans

limitinden düşük olması

ASTENOTERATOZOOSPERMİ Hem ileri hareketli spermlerin hemde morfoloji

bakımından normal spermlerin yüzdesinin alt

referans limitinden düşük olması

AZOSPERMİ Ejakülatta hiç spermatozoa bulunmaması

HEMOSPERMİ Ejakülatta eritrosit yüzdesinin alt referans

değerinden yüksek olması

LOKOSPERMİ Ejakülatta eşik değer üstünde lökosit bulunması

NEKROZOOSPERMİ Ejakülatta yüksek miktarda cansız spermler, düşük

miktarda canlı ve bulunması

KRİPTOZOOSPERMİ Taze preparatta sperm olamasına rağmen

santrifüjlenme sonra ejaküllatta sperm gözlenmesi

NORMOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans limitlerine eşit veya yüksek

toplam sperm sayısı, ileriye doğru hareketli ve

morfolojik olarak normal spermatozoon yüzdeleri

OLİGOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans değerlerinden düşük sperm

sayısı

OLİGOASTENOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans değerlerinden düşük sperm

sayısı ve düşük ileri harekeli spermatozoa yüzdesi

OLİGOASTENOTERATOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans limitlerinden düşük toplam

sperm sayısı, hem ileri hem morfolojik olarak düşük

yüzdeli spermler

OLİGOTERATOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans değerlerinden daha düşük

sperm sayısı ve morfolojik olarak alt referans

değerinden düşük yüzdeli spermler

TERATOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans limitinden düşük yüzdeli

14

TERMİNOLOJİ

morfolojik olarak normal spermler

HiPERSPERMİ Semen hacminin 6 ml’den daha fazla olması

HİPOSPERMİ Semen hacminin 1ml’den ve daha az olması

GLOBOSPERMİ Spermatozoada akrozom bulunmaması

(WHO, 2010)

Numune toplama

• Semen numunesinin değişen ortam sıcaklığındaki değişikliklere maruziyetini

minimuma düşürmek, numunenin alınmasıyla semen analizi arasındaki süreyi

kontrol edebilmek için numunenin laboratuar yakınındaki özel bir odada verilmesi

uygundur.

• Semen numunesi minimum iki maksimum yedi günlük cinsel perhizden sonra

alınmalı. Ekstra semen örneği gerekirse, her defasında cinsel perhiz süresi sabit

tutulmalıdır.

• Örnek verecek olan kişiye test ile ilgili anlaşılır sözlü ve yazılı bilgilendirme

yapılmalı. Semen örneğinin tümünün toplanmasının önemi anlatılmalı. Kısmı bir

kayıp yaşanması halinde durumun laboratuvar çalışanına bildirilmesi gereği

vurgulanmalıdır.

• Raporda yer alması gereken bilgiler: Kişinin adı-soyadı, yaşı, hastaya ait kod

numarası, cinsel perhiz süresi, numunenin laboratuvara teslim edildiği tarih ve saat,

kısmı bir kayıp yaşanılıp yaşanılmadığı, hastada örnek verme güçlüğü olup olmadığı,

numunenin likefikasyon süresi.

Tanısal veya araştırma amacıyla semenin toplanması;

• Semen örneği mastürbasyon yöntemi temin edilmeli, ejakülat spermatozoa için

toksik olmadığı kanıtlanmış tercihen plastik veya cam steril, geniş çaplı bir ağzı olan

kap içine alınmalıdır.

15

• Ejakülasyondan sonra temin edilen semen örneği değişen ortam sıcaklığına karşı

maruziyeti azaltmak için oda sıcaklığında bekletilmeli.

• Örnek verilecek kabın üzerine hastaya ait bilgiler doğru ve eksiksiz yazılmalı.

• Örneğin likefiye olması için numune kabı 37°C bir sıcaklığı olan inkübatörde

bekletilmeli.

• Hasta kısmi bir kayıp yaşadıysa, özellikle ilk spermden zengin kısım eksikse bu

durum raporda muhakkak bildirilmeli ve testin tekrarı önerilmeli (Kadıoğlu ve ark.,

2011).

Semen analizinde spermin makroskobik incelenmesi

Semen analizi (spermiyogram), örnek likefiye olduktan hemen sonra gözle muayene

ile başlamalıdır. Değişen ortam koşullarının semen kalitesi üzerine olumsuz etkilerini

en aza düşürebilmek için, ejakülasyondan sonra minimum 30 dakika, maksimum 60

dakika içerisinde sperm analizi gerçekleştirilmelidir (Kadıoğlu ve ark.,2011)

Renk ve Koku

Taze ve normal bir semen viskoz, homojen, rengi gri-beyaz ve opaktır. Spermin opak

görünümünde azalma konsantrasyonun az olduğuna işarettir. Sperm konsantrasyonu

yüksek ise rengin beyaz, cinsel perhiz süresinin uzunluğu veya enfeksiyon olması

halinde rengin sarı, ürogenital sistem kanamaları ve spermde eritrosit olması

durumunda semenin kırmızı veya kahverengi renkte olması beklenir. Semen kendine

özgü kestane çiçeği kokusundadır ve bu kokunun nedeninin prostat sıvıları olduğu

düşünülmektedir. Koku,perhiz süresi, enfeksiyona bağlı olarak değişir ve bilgi verir

(Çoruh, 2010).

Likefikasyon

Ejakülasyondan hemen sonra steril sperm toplama kabına alınan semen yarı katı bir

formdadır. Semenin oda sıcaklığında birkaç dakikada likefiye olması beklenir. Bu

sırada semen içerisinde heterojen topakların görülmesi normaldir. Likefikasyon

süresi minimum 15 dakika maksimum 1 saattir. 1 saat içerisinde likefikasyon

gerçekleşmezse bu durum raporda muhakkak bildirilmelidir (Kadığlu ve ark.,2011).

16

Semen Viskozitesi

Likefiye olan semen yavaşça 1,5 mm genişlikli tek kullanımlık steril plastik

pipetlerle al ver şeklinde aspire edilir. Pipet içine çekilen örnek damlamaya

bırakıldığında meydana gelen ipilikçikler gözlenerek semen örneğinin viskozitesi

belirlenir. WHO 2010 kriterlerine göre normal kabul edilen viskozite, semenin

pipetten küçük damlalar halinde damlamasıdır. Başka bir viskozite ölçümüde semen

örneğinin içine steril cam çubuk batırılır. Cam çubuk geri çekildiğinde meydana

gelen iplikçik uzunluğu viskozite hakkında bilgi verir. İplikciğin 2 cm’den uzun

olması viskozitenin normal olmadığı şeklinde kabul edilir. Likefiye olmamış semen

örneğine göre, viskoz semen örneği yapışkan, zaman ile kıvamı değişmeyen ve

esnemeyen bir yapıya sahiptir. Pipetle aspire edilmek istendiğinde yapışkan ve

kitlesine bağlı olduğundan aspire edilmez (Kadıoğlu ve ark., 2011).

Semen Hacmi

Ejakülat hacmini seminal keseden ve prostattan daha düşük oranla bulboüretral

bezler ve epididimden salgılanan sıvılar meydana getirmektedir. Semen analizinin

doğru bir sonuç verebilmesi için hacmin doğru ölçülmesi gerekmektedir. Çünkü

hacim ejakülatta bulunan sperm ve sperm dışı hücrelerin toplam sayısının

hesaplanmasında kullanılmaktadır. Kliniklerde en çok tercih edilen yöntem

piyasadan kolaylıkla temin edilebilecek derecelenmiş konik tüplerdir. Semen örneği

konik tübe eklenerek semen hacmi doğrudan okunabilir.

Hacim ölçülmesinde kullanılan bir diğer yöntem ise;

• Örnek ağırlığı önceden ölçülmüş steril bir kaba alınır.

• Kap semenle birlikte tartılır.

• Kabın ağırlığı çıkarılır.

• Semen yoğunluğunun 1 g/ml olduğunu kabul edilerek örnek ağırlığından hacmi

belirlenir. (Kadıoğlu ve ark., 2011).

17

Semen Ph’sı

Başlıca alkali seminal kese salgısı ile, asidik prostat salgısı ve farklı aksesuar bez

salgılarının pH değerleri arasındaki denge semen pH’sını ifade eder. Semen pH’sı,

tercihen 30 dakika içinde ölçülmelidir. Ancak değişen ortam koşullarının sonuçları

negatif bir etki göstermemesi için pH tayini bir saat içinde mutlaka yapılmış

olmalıdır. Fertil erkeklerin seminal pH’sına ait halen az sayıda referans değer

bulunmaktadır. WHO 2010 kriterlerine göre semenin ideal pH’sı 7.2’dir (Kadıoğlu

ve ark., 2011).

Semen analizinde spermin mikroskobik incelenemsi

Faz kontast mikroskobu, likefiye olmuş taze ejakülatlardan hazırlanan preparatların

incelenmesinde kullanılır. Örnek ilk olarak mikroskop altında X10’luk bir büyütme

altında taranmalı. Bu tarama ile örnekte sperm agregasyonu, sperm aglütinasyonu,

sperm hareketliliği, sperm dışında hücrelerin varlığı (lökositler ve immatür germ

hücreleri) ve izole sperm başları veya kuyrukları değerlendirilir (Kadıoğlu ve ark.,

2011).

Mikroskobik değerlendirmeye başlamadan önce dikkat edilmesi gereken en önemli

faktör örneğin iyice karıştırılmasıdır. Örnek steril plastik pipet ile nazikçe

karıştırılmalı, yüksek hızlı karıştırıcı kullanımından kaçınılmalıdır. Eğer semen iyi

karıştırılmamış ise aynı semen örneğinin iki farklı değerlendirilmesinde farklı

sonuçlar elde edilebilir (Gökçe, 2011).

18

Tablo 3. Semen Analizi Normal Referans Değerleri

Parametreler Değerler

Görünüm Homojen, gri-opak

Ph 7.2- 8.0

Viskozite < 3

Sperm sayısı (Spermatozoa / ml) >15 x 106 ( %95 CI: 12- 16)

Total Sperm Sayısı (Spermatozoa /

ml) > 39 x 106 ( %95 CI: 12- 16)

Total Hareketlilik (progresif +

nonprogresif)

> %40 (%95 CI: 38-42)

Progresif Hareketlilik > %32 (%95 CI: 31-34)

Progresif Hareketli SpermSayısı

(Spermatozoa / ml) 3 x 106

Morfoloji >%4 normal (%95 CI: 3-4)

Vitalite >58 (%95 CI: 55-63)

(WHO, 2010)

Sperm Aglütinasyonu

Aglütinasyon, vital ve motil spermlerin birbirine baş-başa, kuyruk-kuyruğa veya

karışık ve yapışık bir arada bulunması durumudur. WHO 2010 kriterlerine göre

aglütinasyon skalası aşağıda belirtilmiştir:

Grade 1 (İzole): Aglütinasyon başına ayrılmış sperm <10 sperm. Spermlerin çoğu

birbirinden ayrıdır.

Grade 2 (Orta): Aglütinasyon başına 10 ile 50 sperm birbirine yapışık halde görülür.

Grade 3 (Geniş): Aglütinasyon başına 50’ den fazla sperm birbirine yapışıktır, bazı

spermler serbest haldedir

Grade 4 (Bütün): Bütün spermler birbine yapışık haldedir ve bağlantılar arası yoğun

bir şekilde aglütinasyon görülür (Özçınar, 2014).

19

(WHO, 2010).

Şekil 3. Farklı sperm aglütinasyon derecelerinin şematik diyagramı

İlgili Kısım İZOLE ORTA GENİŞ YOĞUN

Baş-Başa

Kıyruk-

Kuyruğa

Kuyruk ucu -

Kuyruk

ucuna

Karışık; baş

başa ve

kuyruk

kuyruğa

Yumaklaşmış

; baş kuyruk

birbirine

karışmış

20

Yuvarlak Hücre ve Lökositlerin Ayrımı

Semende sperm hücresi dışında; ürogenital sistem kaynaklı epitel hücrelerine,

lökositlere, eritrositlere ve immatür germ hücrelerine rastlanabilmektedir. Semende

gözlenen yuvarlak hücreler lökositler ve immatür germ hücreleridir.

Laboratuvarlarda yapılan rutin semen analizinde bu iki hücrenin ayrımında

zorlanılmaktadır. Yuvarlak hücre konsantrasyonu semende 5 milyon/ml’yi geçtiği

zaman lökosit ve immatür germ hücrelerini birbirinden ayırmak gerekir.

WHO’ya göre semende 1 milyon/ml’den fazla lökosit bulunmasını anormal kabul

edilir ve semende lökosit sayısının artması lökospermi olarak adlandırılır. Bu durum

özellikle infetil erkeklerde yaygın görülür ve genel popülasyonda % 10-20’lik bir

yoğunluğa sahiptir. Bununla birlikte, seminal lökositlerin daha düşük

konsantrasyonlarının (0-1 milyon/ml) semende gözlenmesi yaygın bir durumdur ve

enfeksiyon yokluğunda bile rastlanabilir (Rodin et al., 2003; WHO, 2010).

Seminal lökositlerin semen kalitesini etkilediği günümüzde hala tartışılan bir

konudur. Lökospermi durumunda lökositlerin reaktif oksijen türlerini arttırarak

sperm hücresinin motilite ve vitalitesini negatif yönde etkilediği düşünülür. Semende

yüksek oranda lökosit gözlenmesi; genital sistem enfeksiyonu yada inflamasyon

ihtimalini düşündürmeli ve lökositleri immatür germ hücrelerinden ayırmak için özel

testler yapılmalıdır. Bu testler; intraselüler peroksidaz varlığına dayalı testler ve

lökosite spesifik olan antijen testleridir. Semende en sık gözlenen lökosit türü

nötrofillerdir. Nötrofiller intraselüler peroksidaz içerirler. Ortama benzidin ve

hidrojen peroksit ilave edildiğinde lökositler kahverengiye boyanırlar (Aktan, 2011).

LeucoScreen adındaki ticari kit peroksidaz içeren lökositleri kahverengiye boyayarak

ayrımı kolaylaştırır ve pratikte tercih edilmektedir. Bu yöntemle nötrofiller, immatür

germ hücrelerden ve peroksidaz içermeyen diğer lökosit türlerinden ayrılırlar.

Peroksidaz içeren veya içermeyen bütün lökositlerin immatür germ hücrelerden

ayrımı için daha pahalı ve zaman alan immune histokimyasal yöntemler

kullanılabilir. İmmune histokimyasal yönteme göre; lökositlerinin tümü uygun bir

monoklonal antikor ile belirlenmiş kendine özgü antijen olan CD45 içermektedir ve

kırmızı renge boyanırlar (WHO, 2010).

21

Sperm Motilitesi

Sperm hücresinin linner hızlı hareketliliği ile gebelik arasında doğrudan bir ilişki

vardır. Ejakülattaki sperm hareketliliğinin tayini, örneğin likefikasyonundan sonra

tercihen en kısa 30 dakikada, en uzun 60 dakika içerisinde mutlaka değerlendirilmeli.

Böylelikle, ortam ısı değişikliliği, sıvı kaybı (dehidratasyon) ve pH değişimlerinin

sperm hareketliliği üzerindeki negatif etkileri sınırlandırılmış olur.

Spermatozoonun motilite tayini yapılırken, spermatozoon hareketleri 4 gruba ayrılır:

1 ) +4 hareketli spermatozoonlar; düz bir şekilde ileri yönde hızlı hareket ederler.

2 ) +3 hareketli spermatozoonlar; ileri yönde yavaş hareket ederler.

3 ) +2 hareketli spermatozoonlar; bulundukları yerde hareket ederler.

4 ) +1 hareketli spermatozoonlar da oldukları yerde hareketsiz (immotil) halde

durmaktadırlar.

Motilite, hareketlilik anlamına gelir ve +2, +3, +4 hareketli spermatozoonların

toplam oranıdır. Hızlı hareketli spermatozoon sayısı (PHSS) sadece +4 ve +3

hareketli spermatozoonların oranını ifade etmektedir (WHO, 2002).

Ejakülattaki ileri hareketli spermatozoa sayısı; toplam sperm sayısının, ileri hareketli

hücrelerin yüzdesiyle çarpılması ile elde edilmektedir (Kadıoğlu ve ark., 2011).

Spermatozoona hareket enerjisini, orta kısımda yer alan mitokondrilerin ürettiği ATP

enerjisi ve kuyruğun anatomik ve işlevsel olarak sağlıklı olması verir (Kadıoğlu ve

ark., 2011).

Ejakülasyondan 2 saat sonra spermatozoanın %50’sinin hareketlerini devam

ettirmeleri beklenmektedir. Bu değer %30’un altına düşmemesi beklenir. Motilite

tayini özellikle düşük ısılardan etkilendiğinden, semen likefikasyonu süresince

semen örneğinin 37°C’ye ayarlı inkibatörde bekletilmesi, mikroskobik

incelemeninde tercihen ısı ayarlı objektifi bulunan mikroskopta yapılması

önerilmektedir. Hareketsiz her sperm ölü sperm olarak kabul edilmez. Spermatozoa

immotilitesi ile ölü spermatozoa birbirinden farklı kavramlardır (Kadıoğlu ve ark.,

2011).

22

Sperm Sayısı

Ejakülatta ki sperm konsantrasyonu ve toplam sperm sayısı, gebelik ve gebeliğe

kadar geçen süre ile belirleyicidir (Gökçe, 2011).

Semende var olan sperm sayısı, cinsel perhiz süresine ve testis hacmine bağlı olarak

değişiklik göstermektedir. Eğer bir erkeğin ejakülator kanal tıkanıklığı ve uzun bir

cinsel perhiz süresi yoksa total sperm sayısı testis hacmi ile bağlantılıdır. Total sperm

sayısı testis hacmi ile bağlı olması, testislerdeki sperm hücresi üretme kapasitesini

hakkında bilgi verir fakat sperm konsantrasyonu seminal vezikül ve prostat

sekresyonlarıyla seyreltildiği için testis işlevinin değerlendirilmesinde spesifik

değildir (Eliasson, 1975; Handelsman et al., 1984).

Spermatozoon sayısının belirlenmesinde, semenden alınan bir damla örnek ince bir

tabaka halinde, Makler kamerası, hemositometre, lam-lamel arası, Thoma lamı ve

Hoffman sayacında değerlendirilir. WHO kriterlerine göre 15 milyon/ml ve üzeri

olan sperm sayısı normal olarak kabul edilir. Spermatozoon konsantrasyonu

milyon/ml olarak değerlendirilmektedir (WHO, 2002).

Günümüzde spermatozoa sayımı yaygın olarak Makler sayım kamerası kullanılarak

yapılır. Bir damla semen derinliği 10 μm olan Makler kamerasının ortasına

damlatılır, kameranın üzerine her biri 0,1 x 0,1 mm boyutlarında 100 kareden oluşan,

1 mm2

boyutlarında grid camı kapatılır. Böylece, Makler kamerası yardımı ile sabit

hacimde semenin incelenmesi mümkün olur. Grid üzerinde 10 küçük kare sayılır ve

sonuç milyon cinsinden 1 ml’deki spermatozoa sayısını verir (WHO, 2010).

23

(Çoruh, 2010).

Şekil 4. Makler kamerası ile konsantrasyon ölçümü

(Çoruh, 2010)

Şekil 5. Konsantrasyon Ölçümü

24

Spermatozoon Vitalitesi

Ölü spermler ile hareketsiz ama canlı olan spermler birbirinden hücre membranı

varlığı ile ayrılır. Bu ayrımı yapmak klinik açıdan oldukça önemlidir. Çünkü çok az

sperm hareketi olan veya immotil spermleri olan hastalara ICSI tedavisi

uygulayabilmek için spermin canlı olup olmadığının belirlenmesi gerekir (Casper et

al., 1996).

WHO’nun 2010 kriterlerine göre ileri hareketin ≤ 40 olduğu durumlarda canlılık

testinin yapılması önerilmiştir. Spermde canlılık değerlendirilmesi, sperm

hücrelerinin dış ortamdan negatif olarak etkilenmemesi için en kısa 30 dakika veya

ejakülasyondan sonraki en uzun 60 dakika içerisinde mutlaka değerlendirilmeli.

Hastalara uygulanacak tedavinin kararında spermlerin canlı olup olmadığı oldukça

önemlidir. Spermde ki hareketli sperm sayısı ve sperm canlılığı ile birlikte

değerlendirilmesi önerilmektedir. Hareketsiz olarak gözlenen ancak canlı olan sperm

sayısının fazla olmasının sebebi kuyruktaki yapısal defektler olabilir. Spermlerin

hem ölü hem de hareketsiz spermlerin sayıca fazla olması epididimal bir patolojinin

göstergesidir (Gökçe, 2011).

WHO canlılık değerlendirilmesinde normal membran bütünlüğü olan spermlerin alt

referans sınır değerini 1999 kriterlerin de % 75 olarak bildirmiş, 2010 kriterlerinde

çalışmaya katılan örneklerin % 95 güven aralığı 55-63 olduğu için % 58’e

düşürmüştür. 2010 kriterlerin de canlılık belirlemek için 1106 semen örneğinde

eosin-nigrosin yöntemi kullanılmıştır. Canlılık belirlemede bu yöntemden başka

Eosin-Y ve hipoosmotik şişme (HOS) yöntemleride kullanılmaktadır (Chiles and

Schlegel, 2015).

Eosin-Y; pratik bir yoldur ancak lam lamel arası taze hazırlanan örnekler olduğu için

saklanamazlar. Ölü olan sperm hücrelerin membranları hasarlı olduğu için hücre

içine boya girişi olur ve ölü hücreler pembe renkte boyanırlarken, canlı hücreler

boyanmayarak ayırt edilir (WHO, 2010).

25

(Doğan, 2008)

Şekil 6. Eosin Y ile Boyanmış Spermatozoon

Eosin pozitif (ölü spermatozoon) ( ), Eosin negatif (vital spermatozoon)

( ).

Eosin-Nigrosin; Eosin Y’den farklı olarak arka planda kontrastı arttırarak sperm

başlarının daha kolay ayırt edilmesini sağlamak için nigrosin kullanılmaktadır.

Eosin-Nigrosin ile boyanan örnekler uzun yıllar saklanabilirler. Eosin-Y boyamada

olduğu gibi ölü sperm hücreleri pembe boyanırken, canlı hücreler boyanmazlar

(WHO, 2010).

Hipoosmotik şişme testi (HOST); ICSI yönteminde canlı sperm seçerken, sperm

boyanmasından kaçınılır ve bu test tercih edilir. Sağlam membranı olan sperm

hücreleri canlıdır ve hipoosmotik bir ortama konduğunda şişmesi ve sıvı membran

boyunca taşındıkça kıvrılması beklenir (WHO, 2010).

26

(WHO, 2010)

Şekil 7. Hipoozmatik Strese Maruz Bırakılan İnsan Spermatozoasının Morfolojik

Değişiminin Şematik Görünümü

Spermatozoon Morfolojisi

Semen analizinin en önemli basamaklarından biri olan morfolojik değerlendirme,

spermin yapısal özelliklerini ortaya koyar. Normal ya da anormal yapıya sahip olan

sperm hücresinin yapısal özelliklerinin değerlendirilmesinde; faz kontrast

mikroskobu, ışık mikroskobu, elektron mikroskobu ve çeşitli boyama teknikleri

kullanılmaktadır (Aydos, 2007). Morfoloji değerlendirilmesinde kullanılan

boyalardan başlıcaları Papanicolaou, Shorr ve DiffQuick boyalarıdır. Bu boyalarla

baş akrozomal bölge açık mavi, postakrozomal bölge koyu maviye boyanır. Orta

kısım kırmızıya, kuyruk kısmı mavi veya kırmızıya yakın bir renge boyanır. Başın

arka kısmı veya orta kısımda bulunan sitoplazmik artıklar Papanicolaou boyası ile

pembe yada kırmızı, Shorr boyası ile kırmızı ile turuncu arası bir renge boyanır.

Papanicolaou boyama yöntemi sperm ve diğer hücrelerin iyi boyanmasını sağlar.

Shorr boyama yöntemi normal formlu spermler için Papanicolaou boyamasına

benzer sonuçlar verir. Klinik laboratuarlarda özellikle gün içerisinde sonuç

verilebilmesinden dolayı kullanışlı kabul edilen DiffQuick boyama yöntemidir.

DiffQuick boyama yöntemi zemini çok fazla boyamaması sebebiyle Papanicolaou

boyaması kadar kaliteli sonuçlar vermez. Boyanmış preparatlar immersiyon yağı

kullanılarak X100’lük objektifte değerlendirilir (Gökçe, 2011).

27

Normal Sperm Morfolojisinin Sınıflandırılması

WHO, sperm morfolojisini değerlendirirken bir spermin normal mi yoksa anormal

mi olduğunu belirlemek için Kruger’in kesin ölçütlerini kullanmayı önermektedir

(Hassa, 2003).

Spermlerin morfolojik olarak normal olup olmadığını değerlendirirken sperm baş,

boyun, kuyruk bölgesi değerlendirilir.

Bir sperm hücresi; baş, boyun, orta kısım, ana kısım ve son kısımdan meydana

gelir. Son kısım ışık mikroskobu ile görülemediği için, sperm hücresi baş, boyun ve

kuyruktan oluştuğu kabul edilir. Sperm hücresinin normal olarak kabul edilebilmesi

için bu parçaların belirli kriterleri sağlaması gerekir.

Baş bölgesi düzgün, sınırları belirli ve oval şekilli olmalı. Akrozom bölgesi başın

%40-70’ini kaplamalı ve sınırları belli olmalıdır. Akrozom bölgesi vakuol

içermemeli, var olan vakuol sperm başının %20’sinden fazlasını kaplamamalıdır.

Post akrozomal bölge herhangi bir şekilde vakuol olmamalıdır.

Orta kısım sperm başı uzunluğunda, sınırları belirli ve ince yapılı olmalıdır. Orta

parçanın ana eksen ile sperm başının ana ekseni aynı hizada bulunmalıdır.

Ana kısım, yaklaşık 45 μm uzunluğunda, orta parçadan ince ve uzunluğu boyunca

genişliği değişmemelidir. Kuyruk kırık olmadığı sürece kendi üzerinde veya halka

şeklinde kıvrılıyor olması normaldir (Kadıoğlu ve ark., 2011).

Anormal sperm morfolojisinin sınıflandırılması

Ejakülattaki spermatozoonlar çeşitli anomaliler içermektedir. Anormal morfolojili

sperm sayısının artmasının sebebi defektif spermatogenez ve epididim patolojileridir.

Morfolojik defektler genellikle karma defektlerdir. Anormal sperm hücreleri anomali

tiplerine bağlı olarak düşük fertilizasyon oranı ve kötü embriyo gelişimi

sonuçlanırlar. Morfolojik olarak normal kabul edilmeyen spermlerin DNA’sıda

normal olmayabilir. Anormal morfolojinin sebebi, artan DNA parçalanma süreci,

28

yapısal kromozom anormallikleri, immature kromatin ve anöploidi insidansında artış

olabilir. Bu nedenle, sperm kuyruğu morfolojik olarak önemli olmasına rağmen,

başın şekli özellikle vurgulanmıştır (Kadıoğlu ve ark., 2011).

Baş defektleri; büyük, küçük, sivri şeklinde, akrozom içermemesi veya irregular

akrozomal dağılım gözlenmesi, vakuoller içermesi ve bunların çeşitliliği.

Boyun ve orta parça defektleri; orta parçanın baş kısmına simetrik bağlanmaması,

aynı hizada bulunmaması, kalın veya düzensiz, kıvrılmış ve kırık olması, normal

kabul edilemeyecek ölçüde ince veya bu defektlerin çeşitliliği.

Ana parça defektleri; çok sayıda kırık bulunması, normal kabul edilmeyecek

şekilde kısa veya kalın olması, keskin kıvrımlar içermesi, sarmal veya bu defektlerin

çeşitliliği (Kadıoğlu ve ark., 2011).

(Kadıoğlu ve ark., 2011).

Şekil 8. İnsan Spermatozoasının Normal ve Anormal Formları

29

4.1.4.2. Sperm Hazırlama Yöntemleri

Direkt yüzdürme tekniği (Swim-up)

Yüzdürme (swim-up) tekniği, spermlerin seminal plazmadan dışarı, kültür medyumu

içinde yüzme yeteneklerine göre seçilmesidir. Yüzdürme tekniğine başlamadan önce

örnek seyreltilmemelidir ve santrifüjlenmemelidir. Özellikle santrifüjleme işlemi

sperm membran hasarına neden olabilir (Aitken and Clarkson, 1988). Swim up

tekniği motil spermlerin ayrılmasında tercih edilmektedir (Mortimer, 1994). Likefiye

olan semen örneği üzerine kültür medyumu yayılarak swim up yöntemi uygulanır. 1

saat inkübe edilen örnekte bulunan motil spermlerin kültür medyumuna yüzmesi

beklenir. Bu yöntem IVF ve ICSI işlemi için çok fazla tercih edilmemektedir.

Motiliteye gore seçilim yapan bir tekniktir (WHO, 2010).

Direk Yüzdürme Tekniği Uygulama Prosedürü

1. Semen örneği tek kullanımlık steril bir pipetle nazikçe karıştırılır.

2. Steril 15 ml’lik konik santrifüj tübüne 1 ml semen eklenir ve semen örneği rahatsız

edilmeden üzerine 1,2 ml kültür medyumu eklenir. Alternatif olarak kültür medyum

altına dikkatle semen pipetlenebilir.

3. Semen-kültür medyumunun oluşturduğu ara yüzey alanını genişletmek amacıyla,

tüp yatay düzlemle 45 derecelik bir açı yapacak şekilde eğilir, 37°C’lik inkübatörde

1 saat bekletilir.

4. İnkübasyondan sonra tüp nazikçe dik konuma getirilir ve kültür medyumu

pelletten ayrılır. Bu kısım +4 ve +3 hareketli sperm hücrelerini içerir.

5. Bu kısım, kültür medyumunun 1,5–2,0 ml’siyle seyreltilir.

6. 300–500 g’de 5 dakika boyunca santrifüjlenir ve üst faz pellet rahatsız edilmeden

atılır.

7. Sperm konsantrasyonu, toplam motilite ve ileri hareketli sperm sayısını

değerlendirmek amacıyla, 0,5 ml kültür medyumu içinde sperm pelleti yeniden

süspansiyon haline getirilir.

30

8. Teşhis, tedavi ve araştırma amacıyla testlerde doğrudan işlenmemiş örnekler

kullanılabilir (WHO, 2010).

(Beydola et. al., 2013).

Şekil 9. Swim-up Tekniği

Kesintili dansite gradyanları (Gradient Yöntemi)

Kesintili dansite gradyanları; kaliteli sperm seçilimi, sperm hücrelerini diğer

hücrelerden ve hücre döküntülerden ayırt edilmesi için kullanılan sperm yıkama

yöntemidir. Swim up yöntemine göre daha tutarlı sonuçlar verir. Klinikte IVF ve

ICSI işlemlerinde gradient yöntemi tercih edilir.

Gradient yöntemi, seminal plazmanın yoğunluk gradyanlarına göre

santrifüjlenmesini kullanır. Gradient yönteminde piyasadan kolaylıkla temin

edilebilecek kolloidal silika kaplı silan içeren kültür medyumu kullanılmaktadır.

Kullanılan bu medyum hücreleri yoğunlukları bakımından ayrıştırır. Motil sperm

hücreleri gradyan materyalini aşarak konik tübün dip kısmında bir pellet meydana

getirir. Kliniklerde yaygın olarak iki aşamalı dansite gradyanı tercih edilir. Bu iki

aşamalı dansite gradyanın üst kısmında % 45 ‘lik katman alt kısmında % 90’lık

katman tercih edilir. Gradient yöntemi kullanılarak hazırlanan sperm preparatları;

31

hücre döküntülerini, immatür germ hücrelerini, kontamine edici lökositleri,

dejeneratif germ hücrelerini ayırır. Geriye +4 ve +3 hareketli spermler ile morfolojik

olarak normal kabul edilen spermler kalır.

Ejakülatın işlenmesi için uygun dansite gradyanları hazırlamak için piyasada pek çok

ticari ürün bulunmaktadır. Bu ürünler üretici firmanın önerdiği şekilde

kullanılmalıdır. Firmanın belirttiği prosedürlerin dışına çıkılmamasına dikkat

edilmelidir. Dansite gradyan medyumlarının genel özellikleri, yapısal olarak düşük

osmolaliteye sahip olmaları, göreceli yüksek moleküler kitleli bileşenleri içerdiği

için, çoğunlukla dişi üreme yolu sıvılarına benzer izoozmotik bir kültür

medyumunda hazırlanması önerilmektedir (WHO, 2010; Beydola et. al.,2013 ).

Gradient Yöntemi Prosedürü

1. 1 ml % 45 dansite gradyan medyumunu 1 ml % 90 dansite gradyan medyumu

üzerine yayarak 15 ml’lik konik tüp içerisinde dansite gradyan medyumu hazırlanır.

2. Semen örneği tek kullanımlık steril bir pipetle nazikçe karıştırılır

3. Dansite gradyan medyumu üzerine 1 ml semeni yerleştirip 20 dakika 300–400

g’de santrifüjlenir. Gerektiği durumlarda bir semen örneği için için birden fazla

sayıda tüp kullanılabilir.

4. Santrifüjleme işlemininden sonra sperm pelleti rahatsız edilmeden üst fazın çoğu

atılır.

5. Yavaşça pipetlenerek (kontamine edici dansite gradyan medyumunun dışarı

alınmasına yardımcı olmak için), 5 ml takviyeli medyum içinde sperm pelleti

yeniden süspansiyon haline getirilir ve 5 dakika 200 g’de santrifüjlenir.

6. Yıkama işlemini tekrarlanır.

7. Meydana gelen son pellet takviyeli kültür medyumu içinde yavaşça pipetlenir ve

süspansiyon haline getirilir.

8. Son olarak motilite ve konsantrasyon tayini gereçekleştirilir (WHO, 2010;

Beydola et. al.,2013).

32

(Beydola et. al.,2013).

Şekil 10. Dansite gradient santrifüjleme

4.2 Antioksidanlar

Antioksidanlar, yükseltgenebilen substratlara oranla daha düşük derişimlerde,

substratın prooksidanlarla (reaktif oksijen türleri, serbest radikaller ve azot türleri)

başlatılan oksidasyonu önemli ölçüde geciktirebilir ve engelleyebilirler. Böylelikle

meydana gelebilecek doku hasarının önüne geçebilirler. Prooksidanların hedefinde

lipitler, proteinler ve nükleik asitler vardır. Prooksidanlar oksidatif hasara sebep

olarak çeşitli patolojik olaylara ve hastalıklara sebeb olabilecek toksik maddelerdir.

Antioksidanlar, prooksidanların harabiyetini en aza indirebilmek için bu maddeleri

düşük toksiteli ve toksik olmayan maddelere dönüştürebilmektedirler (Cao and Prior,

1999).

33

4.2.1. Antioksidanların Sınıflandırılması

(Ugar, 2016)

Şekil 11. Antioksidanların Sınıflandırılması

Antioksidanlar, yapılarına göre enzimatik ve enzimatik olmayanlar olmak üzere 2

grupta sınıflandırılırlar.

Enzimatik olmayan antioksidanlar eksojendirler ve birçoğu dışarıdan diyetle

alınırlar. Bunlar; albumin, glutatyon, askorbik asid, tokoferol, karoten, koenzim Q10,

lutein, ürik asid, bilirubin, flavonoidler ve birçok polifenolik bileşiklerdir.

Enzimatik antioksidanlar, endojendirler ve antioksidan savunma sisteminde görev

almaktadırlar. SOD, GPX, GSSG-Red ve CAT gibi enzimleri içerirler (Sroka and

Crsowski, 2003).

34

4.2.2. Antioksidan Savunma Sistemi

Antioksidan savunma sistemi veya kısaca antioksidanların ana görevi oksidan

moleküllerin oluşturduğu hasarı etkisiz hale getirmektir. Organizmalarda, birçok

farklı endojen enzimatik antioksidan, hem hücre içi hem de hücre dışı ortamda

bulunmaktadır. Glutatyon peroksidaz (GPX), katalaz (CAT), glutatyon redüktaz

(GR), süperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon-S-transferaz (GST) bunlara örnek

olarak verilebilir. Antioksidan enzimler, ROS’un zararlı etkilerine karşı geliştirilen

antioksidan savunma sisteminin en önemli parçasıdırlar. Antioksidan savunma

sistemi hücrelere zarar veren reaktif oksijen türlerini etkili şekilde süpürerek düşük

toksiteli veya toksik olmayan ürünlere dönüştürebilmektedirler. Böylece organizma

reaktif oksijen türlerinden etkilenmez. Bu reaktif bileşiklerin varlığı, sağlıklı bir

yaşam için antioksidan enzimleri önemli kılar. Biyolojik yapılarda mevcut olan

enzimatik antioksidanlar çeşitli reaktif oksijen türlerinin (•OH, O2.- ve H2O2)

süpürücüleri olarak bilinirler. Ayrıca SOD, GPX, GSSG-Red ve CAT gibi

antioksidan enzimler, çeşitli hastalıkların tanısı ve tedavisinde de önemli rol oynarlar

(Cao and Prior,1998).

(Ugar, 2016)

Şekil 12 . Antioksidan Savunma Sistemi

35

4.2.3. Sperm antioksidan sistemi

Spermatozoon ve seminal plazma, oksidatif stresin neden olduğu harabiyete karşı

etkili ve koruyucu ve önleyici antioksidan savunma mekanizmalarına sahiptir.

Seminal plazma; süperoksit dismutaz, katalaz ve glutatyon peroksidaz gibi yüksek

molekül ağırlıklı enzimatik antioksidanları içermektedir. Seminal plazmada bulunan

enzimlerin eksikliği sperm DNA hasarına ve erkek infertilitesine sebebiyet verdiği

yapılan çalışmalarla ortaya konulmuştur (Karadağ ve Kendirici, 2013).

Son yıllarda yapılan çalışmalarda antioksidan savunma mekanizmasının sperm

hücrelerini ROS üreten anormal sperm hücrelerine karşı koruduğu, lökositler

tarafından üretilen ROS’u temizlediği, DNA kırılmalarının önüne geçtiğini, sigara

içen erkeklerin semen kalitesini yükselttiğini , soğuğun sperm hücreleri üzerinde

gösterdiği etkisini azalttığı, erken sperm matürasyonunun önlediğini ve sperm

hücrelerini destekleyerek yardımcı üreme tekniklerinin başarısını arttırdığı

gözlenmiştir. Seminal plazmada süperoksit dismutaz, katalaz, glutatyon peroksidaz

ve glutatyon redüktaza ilaveten askorbat, ürat, vitamin E, piruvat, glutatyon,

albumin, vitamin A, ubikinol ve hipotaurin gibi enzimatik olmayan antioksidanlar

yer almaktadır (Demirtaş ve Üntan, 2011).

4.2.4. Yardımcı üreme teknikleri ve antioksidanlar

Oksidatif stresin neden olduğu DNA hasarı, yardımcı üreme teknikleri (YÜT)

açısından büyük öneme sahiptir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda yardımcı üreme

teknikleri için hazırlan spermlerin hazırlanmasında yapılan hatalar sonucu yüksek

miktarda ROS meydana geldiği gözlenmiştir (Agarwal et al.,1994). Yardımcı üreme

tekniklerinde kullanılmak üzere seçilen sperm hücresi genellikle oksidatif strese

maruz kalmış bir ortamdan gelmektedir. Seçilen bu sperm hücrelerinin DNA’ları

hasarlıdır. İntrauterin inseminasyon (IUI) ve in vitro fertilizasyon (IVF) sonrası bu

hasarlar nedeniyle endişe duyulmaz çünkü sperm plazma membranına olan kollateral

peroksidatif hasar, DNA’sı hasarlı spermin fertilizasyonunu engellemektedir. Ancak

intrastoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI); bu doğal bariyerin aşıldığı ve hasarlı bir

DNA’ya sahip sperm hücresinin doğrudan oositin içine enjekte edilen bir tekniktir.

Yardımcı üreme tekniklerinin her basamağında ROS üretimi gerçekleşebilmektedir.

IVF sonrasında ROS’un fertilizasyon üzerinde anlamlı etkisi vardır. IVF öncesinde

36

semen örneklerinde ROS seviyesinin ölçümü, IVF’nin sonucunu tahminde oldukça

önemlidir. Kültür ortamındaki yüksek ROS seviyesi ICSI’de düşük fertilizasyon,

kötü embriyo gelişimi, düşük bölünme oranı, yüksek embriyo fragmantasyonu ve

düşük blastokist oranı ile ilişkili iken IVF’de değildir, ancak hem ICSI’de hem

IVF’de düşük gebelik oranları ile ilişkilidir. YÜT in vitro antioksidan eklenmesi ile

daha başarılı olmaktadır. H2O2’nin artan konsantrasyonlarında blastokist gelişim

oranında doz bağımlı bir düşüş gözlenmiştir. Klinikte YÜT sistemlerinde kültür

ortamına vitamin E, vitamin C, sistein, taurin ve hipotaurin gibi antioksidanlar

eklenerek embriyonun ROS ile savaşma kabiliyetinin arttırılması amaçlanır

(Demirtaş ve Üntan, 2011).

4.3. Reaktif Oksijen Türleri

Oksijen tüm canlılar için vazgeçilemez bir elementtir. Oksijen; hidrojen, karbon,

azot ve kükürt ile birlikte organik moleküllerin temel yapısını meydana

getirmektedirler. Aerobik canlılar yaşamlarını sürdürebilmek için moleküler oksijene

ihtiyaçları vardır, anaerobik canlılar ise büyüme ve çoğalmaları için oksijene ihtiyaç

duymamaktadırlar. Anaerobik canlılarda ki oksijenin toksik etkisinin nedeni,

oksijenden kaynaklanan bazı reaktif oksijen türlerin biyolojik molekülleri

oksitlemeleri ve bu reaktif oksijen türlerine karşı anaerobik canlılarda bir savunma

mekanizmasının bulunmamasıdır. Oksijen sadece anaerobik türlerde değil, yaşamları

için moleküler oksijene gereksinim duyan canlılarda da toksik etki göstermektedir.

Günümüzde oksijenin canlılar üzerinde gösterdiği toksik etki “oksijen radikalleri”

olarak tanımlanmaktadır. Oksijen radikalleri, oksijenin vücuttaki metabolizması

sırasında oluşan reaktif türlerden kaynaklandığı bilinmektedir (Guttridge et al.,1998).

Reaktif Oksijen Türleri (ROS), radikal olmayan bileşikler ve serbest radikaller

olmak üzere iki grupta incelenir.

37

Tablo 4. Ros Türlerinin Sınıflandırılması

Radikal Olmayan Bileşikler Serbest Radikaller

Hidrojen peroksit Süperoksit anyon radikali

Organik peroksit Hidroksil radikali

Singlet Oksijen Peroksil radikali

(Özveren, 2015)

4.3.1. ROS ‘un hücresel substratları

Serbest radikallerin zararlı etkilerine karşı en çok hassasiyet gösteren biyomoleküller

lipidlerdir. Lipidlerin hücre membranlarında yer alan kolesterol ve doymamış yağ

serbest radikaller ile rahatlıkla reaksiyon gösterip, lipit peroksidasyonu meydana

getirir. Hücre membranlarında bulunan lipit serbest radikalleri (L•) ve lipit peroksit

radikallerinin (LOO•) meydana gelişi, reaktif oksijen türlerinin neden olduğu hücre

hasarının önemli bir sonucu kabul edilir. Serbest radikallerin neden olduğu lipit

peroksidasyonuna nonenzimatik lipit peroksidasyonu da denmektedir. Nonenzimatik

lipit peroksidasyonu fagositik hücrelerin uyarılması, fosfolipaz ve protein kinazın

aktivasyonuna sebep olmaktadır. Böylece plazma membranından arşidonik asidin

serbestleşmesi sonucu serbest radikal üretimine, enzimatik lipit peroksidasyonu

denmektedir (Doğan, 2008).

Proteinler serbest radikallerin zararlı etkilerine karşı lipitlere oranla daha az

hassasiyet gösterirler. Proteinlerin serbest radikal harabiyetinden etkilenme derecesi

amino asit dizilimlerine bağlıdır. Doymamış bağ ve kükürt içeren triptofan, tirozin,

fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi amino asitlere sahip proteinler serbest

radikallerden rahatlıkla etkilenirler (Silva, 2006).

Nükleik Asitler ve DNA, iyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA'yı

etkileyerek hücre mutasyonuna, apoptozise ve hücre nekrozuna sebeb olurlar.

Hidroksil radikali (OH•) deoksiriboz ve bazlarla rahatlıkla reaksiyona girer ve

38

hücresel değişikliklere yol açar. Hidrojen peroksit (H2O2) aktive olmuş

nötrofillerden meydana gelmektedir ve membranlardan rahatça geçer ve hücre

çekirdeğine ulaşır. Sonunda DNA kalıcı oksidatif hasara uğrar. Eğer hidroksil

radikalleri DNA'ya yakın bir bölgede meydana gelirse, purin ve pirimidin bazlarına

karşı negatif bir etki göstererek mutasyonlara ve hücre ölümüne neden olurlar.

Karbonhidratlar; serbest radikallerin karbonhidratlarla olan etkileşimi sonrası çeşitli

ürünler meydana gelir ve bu ürünler patolojik süreçlerde önemli rol oynarlar (Silva,

2006)

(Ugar, 2016)

Şekil 13. Ros’un Sebep Olduğu Hücre Hasarı

4.3.2 . İnsan semeninde ROS’un kaynağı

Canlı hücreler hayatlarının devamı için nasıl oksijene gereksinim duyuyor ise,

serbest oksijen radikalleri de hücresel faaliyetlerini sürdürebilmek için oksijene

gerek duyarlar. Buna karşı oksijen yıkım ürünü olan reaktif oksijen türleri hücre

yaşamını olumsuz etkilemektedir. Her ejakülatın ROS ile kontamine olduğu da

varsayılmaktadır (De Lamirande and Gagnıon,1995).

Ejakülatta ROS’un iki kaynağı bulunmaktadır; immatür spermatozoa ile

lökositlerdir. Lökosit, ejakülatta primer ROS kaynağı olarak bilinmektedir. Büyük

bir bölümü nötrofiller ve makrofajlardan meydana gelen lökositler, aşırı ROS üretimi

39

sebebiyle sperm hücrelerinde gözlenebilen defektlerle doğrudan ilişkilidir.

Spermatozoanın ROS üretimi daha çok sitoplazmik damlacıkların sızmasıyla

sonuçlanan, spermatogenez sırasında meydana gelen bir defektle gerçekleşmektedir.

İmmatür spermatozoon ve ROS üretimi arasında, sperm kalitesini negatif olarak

etkileyen güçlü bir pozitif korelasyon gözlenmektedir (Karadağ ve Kendirici, 2013).

4.3.3. İnsan semeninde ROS üretim alanları

ROS üretimi insan semeninde iki ana alanda gerçekleşir. Bu alanlar mitokondri ve

sperm plazma membranıdır. Mitokondrinin, solunumun güç merkezi olması

sebebiyle ROS üretiminin önemli bir bölümü, NAD bağımlı oksidoredüktaz aracılığı

ile mitokondride meydana gelir. Bununla birlikte, sperm plazma membranı, ROS

üretimini NADP bağımlı oksidaz sistemi ile gerçekleştirir (Karadağ ve Kendirici,

2013)

4.4. Oksidatif Stres

Aerobik canlılar yaşamsal faaliyetlerini sürdürebilmek için oksijene gereksinim

duyarlar. Hücrede pek çok reaksiyona uğrayan oksijen suya dönüşerek kendisi için

gerekli olan enerjiyi elde eder. Ancak bu süreçte oksijenin %2-3’ü suya dönüşmeyip

oksijen kaynaklı radikallere dönüşür (Gürdöl ve Ademoğlu, 2010).

Oksijen, insan vücudun da solunum zinciri içinde süperoksit anyon radikali, singlet

oksijen, hidroksil radikali vb. türevlerini meydana getirir. ROS, normal hücre

fonksiyonları esnasında tüm aerobik organizmalar tarafından oluşturulmakta olup

miktarlarındaki artma veya antioksidan savunmadaki azalma oksidatif stres olarak

tanımlanır (Cnubben et al.,2001).

40

(Ugar, 2016; Sikka et al., 2004)

Şekil 14. Oksidatif Stres ve Koşullarının Oluşumu

4.4.1. Oksidatif Stres Ve Erkek İnfertilitesi

1943 yılında İskoç androlog John MacLeod yaptığı çalışma ile oksidatif stresin erkek

infertilitesi üzerine olan katkısını gözlemlemiş ve oksidatif stres üzerinde durulmaya

başlanmıştır. John MacLeod yaptığı bu çalışma, aerobik koşullarda inkübe edilmiş

insan spermazoonların motilitesinin katalaz eklenmesi ile arttığını göstermiştir

(Aitken and Krausz, 2001).

İnsan üreme sisteminde reaktif oksijen türleri üretimi ve bunları temizleyen

antioksidan sistem arasında bir denge vardır. Böyle bir denge sonucu reaktif oksijen

türleri minimum seviyede tutulur ve bu seviye sperm kapasitasyonu, akrozom

reaksiyonu ve sperm-oosit füzyonu gibi normal sperm fonksiyonlarının

düzenlenmesi için gereklidir (Özveren, 2015).

Oksidatif stres altında replikasyon ve onarım mekanizmaları bozulmakta, özellikle

DNA polimeraz enzimi, hidrojen peroksitten olumsuz bir şekilde etkilenmektedir.

Anormal kromatin paketlenmesi, artan ROS seviyesi ve apoptosis ile DNA hasarı

meydana gelir (Karatağ ve Kendirici, 2013). Yapılan çalışmalarda infertil erkeklerin

%25- %40’ının semeninde ROS seviyesinin yüksek olduğu gözlemlenmiş ve bunun

da spermatozoon motilitesi ile morfolojisini negatif yönde etkilediği gösterilmiştir.

İmmatür spermatozoonlar tarafından üretilen ROS’un matür spermatozoonlar

41

üzerinde oksidatif hasar yapabileceği ve bunun infertilite nedeni olabileceği

düşünülmektedir (Doğan, 2008).

Oksidatif stres varikosel, kronik prostatit gibi ürolojik patolojilerde gelişebilir.

Sperm fonksiyonları üzerine olan patolojide rol oynayabilir. Günümüzde infertil

erkeklerin %25 ile %40' ında semende yüksek miktarda reaktif oksijen türlerine

rastlanması bu konuya olan ilgiyi artırmaktadır (Özveren, 2015).

(Sikka et al., 2004)

Şekil 15. Oksidatif Stres ve İnfertilite

42

4.5. Glutatyon Peroksidaz

Glutatyon peroksidaz (GPX) 80 kDa ağırlığında, selenyum içeren tetramerik yapıda

olan bir peroksidaz enzimidir. GPX genel olarak sitozolde bulunmaktadır (Mates et

al., 1999).

1957 yılında Mills tarafından GPX kırmızı kan hücrelerinde tanımlamış ve GPX’in

hemoglobini oksidatif hasara karşı koruduğunu göstermiştir (Mills, 1957; Ursini et

al, 1985).

GPX seloenzim grubunda bir enzimdir, biyosentezinde selenyuma ihtiyaç vardır.

Enzimin her alt ünitesi bir selenosistein bileşiğini içermektedir. Bu nedenle,

selenyumun diyet ile alınması antioksidan enzim savunması için önemlidir

(Falandysz, 2008).

GPX aktivitesi azaldığında radyoaktif selenyumun GPX aktivitesiyle birlikte azaldığı

belirtilmiştir (Rotruck et al., 1973).

Glutatyon peroksidaz (GPX) iki adet substrata sahiptir; bunlardan biri redüklenmiş

glutatyon, diğeri ise peroksitlerdir (Rotruck et. al., 1973).

GPX, GSH’ın indirgeyici gücünü kullanarak hidrojen peroksitin ve doymamış

yağlardan meydana gelen organik hidroperoksitlerin deaktivasyonunu kataliz eder.

Peroksitlerin indirgenmesini katalizleyen GPX enzimi, hücredeki indirgenmiş

glutatyonu (GSH) yükseltgenmiş glutatyona (GSSG) dönüştürmektedir. GPX

glutatyonu hidrojen donör olarak kullanarak hidrojen peroksiti elimine etmektedir.

Bu reaksiyonlar, canlı organizmada oksidatif stresin zararlı etkilerinden hücresel

membranları korumaya yarar (Ursini and Maiorino,2014).

Bugüne kadar yapılan çalışmalarda canlı organizmasında 8 adet GPX var olduğu

bildirilmiştir ve çoğu farklı hücre tiplerinde görülen selenoproteinler (SecGPxs)

olarak adlandırılmıştır. Bunlardan sadece GPX4, GPX7 ve GPX8 monomerik

yapıdadır. Diğerleri tetrametrik yapıdadırlar (Ursini and Maiorino, 2014).

43

Tablo 5. GPX Türleri, Özellikleri ve Hücresel Lokalizasyonları

GPX1 GPX2 GPX3 GPX4 GPX5

Orijinal adı cGSH-Px GSH-Px-GI pGSH-Px PH-GSH-Px ep-GSH-Px

MEP24

Genel adı

Cellular

GPX

Gastro-

intestinal GPX

Plasma

GPX

Phospho-

hydroperoxid

e GPX

Epididymal

GPX

Bulunduğu

türleri

İnsan,

sıçan, fare,

at

insan, sıçan,

fare

insan,

sıçan, fare

insan, sıçan,

fare, domuz

insan,

fare,sıçan,

domuz, köpek,

maymun ve

boğa

Etkilediği

doku ve

hüceler

Akciğer,

böbrek

mide,

ince bağırsak

böbrek,

akciğer

testis,

spermatozoa

epididimis,

spermatozoa

Hücresel

lokalizasyonu

Cytosolic

mitochondria Cytosolic Secreted/

cytosolic

Membrane-

bound

(mitochondria

)

Secreted

membrane-

bound

(Drvet, 2006).

GPX, selenyum bağlı ve selenyum bağlı olmayan iki formda bulunabilir. Selenyum

bağlı grup, hidrojen peroksit ve diğer organik peroksitleri indirgeyen dört üyeden

meydana gelir. Bunlar GSH-Px1 (cGSH-Px), GSH-Px2 (GSH-Px-GI), GSH-Px3

(pGSH-Px) ve GSH- Px4 (PH-GSH-Px)’dür (Imai and Nakagawa, 2003).

GPX1 veya hücresel GPX (cGSH-Px), bütün hücrelerde bulunan, tetramerik yapıda

sitozolik bir enzimdir. GPX1, organik hidroperoksitler ve H2O2’e karşı aktiftir.

GPX1, germ hücrelerinde çok daha az olmakla birlikte, incelenen tüm dokularda

rastlanmıştır (Ursini and Maiorino, 2014).

GPX2 veya gastrointestinal GSH-Px (GSH-Px-GI) insanlarda karaciğer ve

gastrointestinal kanalda bulunurken böbrek, kalp ve akciğerde bulunmamaktadır.

44

Hidrojenperoksit veya yağ asidi hidroperoksitlerini hızla indirgerken fosfolipid

hidroperoksitleri indirgemezler (Imai and Nakagawa, 2003).

GPX3 veya plazma GSH-Px (pGSH-Px), plazmanın en önemli GSH-Px3 kaynağı

olan böbreklerde bulunur ve özellikle proksimal tübüllerin epitel hücrelerinde önemli

miktarda bulunmaktadır (Ursini and Maiorino).

GPX4 veya fosfolipit GSH-Px (PH-GSH-Px), sitozol, mitokondri ve hücre zarında

bulunmaktadır. Enzim fosfolipid hidroperoksitlerini alkollere indirgeyerek en önemli

antioksidan biri olan E vitamini eksikliğinde, membranı peroksidasyona karşı

savunmaktadır . Selenyum bağımsız GPX enzimi ise sadece lipid peroksitlerin

metabolizmasından sorumludur (Ugar, 2016).

(Ugar, 2016)

Şekil 16. Antioksidan Enzimler ve Reaksiyonları.

45

5. GEREÇ VE YÖNTEM

5.1. Kullanılan Gereçler

Tablo 6. Kullanılan Gereçler, Firma Adı ve Alındığı Ülkeler Kullanılan Malzemeler Firma Adı Alındığı Ülkeler

1 Falcon konik dipli tüp15ml B.D.Bioscinces USA

2 Falcon plastik pipet 1-2ml. B.D.Bioscinces USA

3 Falcon steril sperm toplama kabı B.D.Bioscinces USA

4 Laminar Flow ITM Danimarka

5 Işık mikroskopu Nikon Japan

6 Santrifuge Thermo Scientific USA

7 Herause Heracell 240 inkübatör Thermo Scientific USA

8 Buzdolabı Arçelik Türkiye

9 Pipet ucu 5-100 µl EppendorfGmbh Almanya

10 200 µl pipetör EppendorfGmbh Almanya

11 10 µl pipetör EppendorfGmbh Almanya

12 Steril mikro filtre GVS USA

13 Vortex Mixer Finepcr Kore

14 Makler kamerası SefiMedical İsrail

15 Lam

IsoLab.Gmbh Almanya

16 Lamel

IsoLab.Gmbh Almanya

17 Eldiven

Beybi Türkiye

18 Parafilm Bemis USA

46

19 Şale

20 Kronometre

21 10ml cam pipet

5.2. Kullanılan Kimyasal Malzemeler

Tablo 7. Kullanılan Kimyasal Maddeler, Firma Adı ve Alındığı Ülkeler

Kullanılan Malzemeler Firma Adı Alındığı Ülkeler

1 Spermac boyama Ferti Pro NV Belçika

2 Oil Vitrolife İsveç

3 G-IVF sperm yıkma medyumu Vitrolife İsveç

4 Glutathione Peroxdiase from bovine

erythrocytes

Sigma USA

5 Eosin Y Merck USA

6 İmmersiyon Yağı Merck Millipor Almanya

5.3.Deney Gruplarının Oluşturulması

Normozoospermi ve oligozoospermi olan semen örneklerinden elde edilen 21-41

yaş aralığındaki olgular çalışmaya dahil edildi. Bu çalışmada yer alan normospermi

erkek grubunun %50 motilite, 15 milyon üzeri sperm ve en az %4 Kruger’ e göre

normal morfoloji gösteren , oligospermi erkek grubunun , spermatozoon sayısının

15 milyonun altı ve olan spermler değerlendirildi. Yaş, sigara kullanımı , meslek

etkileri, ilaç kullanımı gibi özellikler dikkate alınmadı. Rutin morfolojik

preparatlarda üçlü boyamaları kullandığımız taktirde çekirdek , akrozom ve boyun

kuyruk kısmında bariz değişikleri belirlemekteyiz. Ayrıca rutin tedavilerde

spermiyogram testi haricinde aşılama ve mikroenjeksiyon uygulamalarında

47

hazırlanan spermatozoon morfolojileri değerlendirilmemektedir. Çalışmamıza dahil

edilen her örneğin bazal değerleri dikkate alınmıştır.

5.4. Semen Toplanması Ve Analizi

Semen örneği, 2 - 7 günlük cinsel perhizle spermiyogram testi amacıyla kliniğe gelen

hastalardan, hastanın ad ve soyadının, yaşının, yazılı olduğu steril plastik kaplara,

mastürbasyon yöntemi ile alındı. Semenin alındığı tarih ve saat not edildi. 30 dakika

boyunca oda ısısında likefiye olması beklendi. Cinsel perhiz süresi, viskosite, hacim,

renk ve semene ait likefaksiyon zamanı rapora not edildi. Spermatozoon sayısını

belirlemek üzere Makler sayma kamerası kullanıldı. Makler sayma kamerası küçük

bir damla semen örneği konuldu. Işık mikroskobunda x20’lik bir büyütme ile toplam

spermatozoon sayısı ve progresif hareketli, immotil spermatozoon sayısı ile motilite

değerlendirmesi yapıldı.

5.5. Sperm Boyama Ve Morfoloji Değerlendirilmesi

Morfolojik değerlendirme için bir lama bir damla semen örneğinden damlatıldı.

Damlatılan semenin miktarı spermatozoa sayısına bağlı olarak ayarlandı. İkinci bir

lam yardımı ile bu damla slayt üzerine yayılıp hava ile kurutuldu. Spermac boyama

(Ferti Pro NV, Industriepark Noord, Belçika) yöntemi ile boyandı.

Lam üzerine yayılıp kurutulan preparatlar, fiksatif solüsyonunda 10 dk bekletildi.

Fiksatif su ile arıtıldıktan sonra suyu süzülerek sırayla A ve B (Ferti Pro NV,

Industriepark Noord., Belçika) solüsyonlarından 1,5 dakika, C solüsyonunda 30

saniye bekletilerek boyama işlemi yapıldı. Kuruması için beklendi x100 büyütmede

immersiyon yağı kullanılarak incelendi. Morfoloji değerlendirilirken 100

spermatozoon dikkate alındı. Gözlenen her anomali ayrı ayrı not edildi.

48

Resim 1. Spermac Stains(A,B,C) ve Fiksatif

5.6. Swim Up Yöntemi

Normozoospermi ve oligozoospermi grupların ait sperm parametreleri (sayı,

hareketlilik, progresyon, morfoloji, aglütinasyon ve yuvarlak hücre) Makler

kamerasında ile değerlendirildikten sonra 15 ml Falcon yuvarlak dipli tüplere

eklenir üzerine 2 ml sperm hazırlama medyumu (G-IVF™ PLUS ) eklenir.

Hazırlanan tüp 37°C’de %5 CO2 ve %95 nem içeren Herause Heracell 240

inkübatörde 30-60 dk 45° açı ile inkübe edilir. Alttaki semene dokunmadan üstteki

medyum aspire edilir ve 5 ml sperm yıkama medyumu ilave edilip karıştırılır. 300g-

600g kuvvetinde santrifüjlenir. Santrifüjleme işleminden sonra süpernatant atılır.

5.7. Glutatyon Peroksidaz (GPX) Hazırlanama Protokolü

Glutatyon peroksidaz (Glutathione Peroxdiase from bovine erythrocytes, Sigma)

0.63mg solid -20 de saklanan üründür. GPX albümin içeren 10ml uygun medyumda

çözülür. Çözüldükten sonra vortex ile karıştırılır. Elde edilen medyum 33mm steril

mikro filtre(Steril Abluo Syrine Filtresb) ile filtrelendi. 0.5ml’lik 20 adet steril

tüplere stoklanıp, tüp ağızları parafilm ile kapatıldı. -20 de saklandı.

5.8.Glutatyon Peroksidaz (GPX) Uygulama Protokolü

Glutatyon peroksidaz seminal plazmada 1318 mU/ml ile 1600 mU/ml arasında

bulunmaktadır (Tavilani et. al, 2008). Çalışmamızda 1500 mU/ml GPX eklenmiştir.

Bu doz Tavilani ve ark.(2008) çalışmalarına göre belirlenmiştir.

49

Örnekler 1 ve 24 saat 37°C’de %5 CO2 ve %95 nem içeren Herause Heracell 240

inkübatörde 30-60 dk 45° açı ile inkübe edildi. İnkübasyondan sonra motilite ve

vitalite değerlendirmeleri yapıldı.

5.9. Eosin Y Uygulama Protokolü

Canlılık değerlendirmesi için kullanılan Eosin Y (Merck Eosin Y) uygulama protokü,

5 g/l Eosin Y solüsyonu, 9 g/l sulu sodyum klorid solüsyonu içine alınır. Bir damla

taze semen 1 damla Eosin Y solüsyonu ile lam üzerinde karıştırılır. 30 sn. sonra X40

büyütmede ışık mikroskobu altında incelenir. Canlı hücreler boyanmazken ölü

hücreler kırmızıya boyanır. Canlılık değerlendirmesi yapılırken 100 spermatozoon

dikkate alındı.

5.10. Sperm sayısı ve motilitesinin değerlendirilmesi

Semen örneklerindeki sperm sayısını ve motilitesini belirlemek için standart manuel

teknikler (WHO laboratory manual 2010) kullanıldı. Makler sayım kamarasına

(Resim. 2) 10 μl semen koyulduktan sonra kamera ataçmanlı ışık mikroskobuna

yerleştirilerek X20 objektif büyütmesinde sperm sayısı ve motilitesi değerlendirildi.

Motilite bakımından spermler hızlı ileri hareketli, yavaş ileri hareketli ve hareketsiz

sperm olmak üzere üç ayrı hareketlilik kategorisine göre gruplandırıldı.

Spermatozoon konsantrasyonu, motilite ve morfolojisi için standart manuel teknikler

uygulandı. Motilite ve konsantrasyon ışık mikroskobunda X20 büyütmede WHO

(World Health Organization) kriterlerine göre en az 100 spermatozoon sayılarak

yapıldı. Makler sayma kamarasına semen koyularak ve X20 büyütme altında 10 kare

sayılarak konsantrasyon ve motilite belirlendi.

50

Resim 2. Makler Kamerası

5.11. İstatiksel Değerlendirmeler

Üzerinde durulan özellikler için tanımlayıcı istatistikler; Ortalama, Standart Sapma,

Minimum ve Maksimum değer olarak ifade edildi. Bu özellikler bakımından sürekli

değişkenlerin iki grup ortalama karşılaştırması için Student’s t testi ve varsayımları

oluşmayan değişkenlerin grup karşılaştırmaları için Mann Whitney U testleri

kullanıldı. Tekrarlamalı gruplar arası ortalama karşılaştırmalarında Tekrarlamalı

ANOVA testi (Repeated ANOVA) testi uygulandı. Hipotezlerimiz çift yönlü olup

p≤0,05 olduğunda sonuç önemli olarak kabul edildi. Değerlendirmeler R

programında yapıldı.

51

6. BULGULAR

Çalışmamızda 40 gönüllüden alınmış olan normozoospermi (sayı 15 milyonun

üzerinde, motilite %40 ve üzerinde, morfoloji >4 ) ve oligozoospermi (sayı 15

milyon ve altı) semen örnekleri değerlendirmeye alındı. Bu iki gruba ait

spermatozoonlar glutatyon peroksidaz (GPX) ile muamele edidi. Spermatozoonlar

farklı maruziyet sürelerinde 1 saat (n=40) ve 24 saat (n=40) sonra motilite ve

vitalite açısından değerlendirildi.

Tablo 8. Semen Örneklerin pH, Viskozite ve Hacim Ortalama Değerleri

DEĞERLENDİRME

Normal Değerler

(WHO laboratory

manual 2010 )

Normozoospermi

Hasta Grubu

Oligozoospermi

Hasta Grubu

pH 7.2-8 7.3 7.3

Viskozite + ++ ++

Hacim 2-6 ml 3.2ml 2.9ml

Normozoospermi hasta grubu ile oligozoospermi hasta grubu semen analizleri WHO

laboratory manual 2010 kriterlerine göre yapıldı. Hasta semen örneklerinde motilite

ve morfoloji değerlendirmeleri öncesi yapılan pH, viskozite ve hacim incelemelerine

ait ortalama değerler Tablo 8’de verildi.

52

Tablo 9. Normospermik ve Oligospermik Grupların Bazal Değerleri ve 1 Saatlik ve

24 Saatlik GPX Uygulamasının Bazal Değerlere Etkisi

Gruplar

Normospermik Grup

Oligospermik Grup t* p

Mean (Medya

n)

SD Mean (Medyan

)

SD

Yaş 31,50 5,206 33,20 4,862 1,067 ,293 Semen Volüm 3,250 1,070 2,925 ,8472 1,065 ,294 Konsantrasyon 38,30 16,25 9,20 3,318 7,849 <0,001 Hareketsiz sperm (%)

47,25 3,462 72,00 12,07 -8,812 <0,001

+4 hareketli sperm(%)

8,30 2,736 3,25 2,197 6,436 <0,001

+3 hareketli sperm(%)

31,65 6,580 16,35 8,940 6,164 <0,001

+2 hareketli sperm(%)

13,30 7,987 8,40 5,295 2,287 0,028

TPMS (%) 9,932 (8,820)

6,703 ,9045 (0,810)

0,760 (5.00)** <0,001***

1saatlik GPX uygulaması sonrası hareketsiz sperm(%)

7,70 (5,00)

7,313 22,75 (18,50)

16,22 83,00** 0,001***

1saatlik GPX uygulaması sonrası +4 hareketli sperm(%)

39,25 (35,00)

21,02 23,0 (15,50)

20,72 103,0** 0,008***

1saatlik GPX uygulaması sonrası +3 hareketli sperm(%)

38,95 12,32 38,95 13,34 0,000 1,000

1saatlik GPX uygulaması sonrası +2 hareketli sperm(%)

13,60 8,678 15,25 8,472 0,608 0,547

1 saatlik GPX uygulaması sonrası TPMS (%)

52,39 (34,80)

45,64 6,41 (3,85)

6,840 23,00** <0,001***

24saatlik GPX uygulaması sonrası hareketsiz sperm(%)

37,80 16,56 59,30 18,79 -3,840 <0,001

24saatlik GPX uygulaması sonrası +4 hareketli sperm(%)

8,85 (7,00)

9,416 4,05 (4,00)

4,571 93,5** 0,003***

24saatlik GPX uygulaması sonrası +3 hareketli sperm(%)

34,00 12,33 19,00 12,86 3,766 0,001

24saatlik GPX uygulaması sonrası +2 hareketli sperm(%)

18,80 9,070 17,65 6,706 0,456 0,651

24 saatlik GPX uygulaması sonrası TPMS (%)

11,02 (8,40)

9,2993 1,005 (0,84)

1,1232 7,00** <0,001***

*Student t test ** Mann Whitney U değeri *** Mann Whitney p değeri

53

6.1. Yaş

Spermiyogram testi amacıyla Medicalpark Bahçelievler Hastanesi Tüp Bebek

Merkezine başvuran hastaların yaş ortalamaları normozoospermi grupta 31.5 (±5.2)

iken, oligozoospermi grupta 33.2 (±4.8) ‘dir . Normozoospermi ve oligozoospermi

gruplar arasında istatiksel bir fark yoktur (p>0.05).

6.2. Semen Volümü

Semen volümü, normozoospermi grupta oligozoospermi gruba göre daha yüksektir

(3.25±1.06; 2.92±0.8). Normozoospermi ve oligozoospermi grupların semen volumü

karşılaştırması için yapılan istatiksel test sonrası normozoospermi ve oligozoospermi

gruplar arasında arasında istatiksel bir fark olmadığı bulunmuştur (p>0.05).

6.3. Sperm Konsantrasyonu

Sperm konsantrasyonları (milyon/ml), normozoospermi grupta ortalama

38.30(±16.245), oligozoospermi grupta ortalama 9.20(±3.318)’dir. Normozoospermi

ve oligozoospermi grupların konsantrasyonlarının karşılaştırılması için yapılan

istatiksel test sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının

konsantrasyonunun birbirinden farklı olduğu sonucuna varılmıştır (p<0.05).

Normozoospermi grubun konsanstrasyon değeri oligozoospermi grubun

konsantrasyon değerinden daha yüksektir.

6.4. İmmotilite

İmmotilite ortalaması normozoospermi grupta 47.25(±3.62), oligozoospermi grupta

72(±12.074) idi. Normozoospermi ve oligozoospermi grupların immotilitelerinin

karşılaştırılması için yapılan istatistik testi sonrasında normozoospermi ve

oligozoospermi gruplarının immotilitelerinin arasında anlamlı bir fark vardır.

Oligozoospermi gruba ait veriler normozoospermi gruba göre daha yüksektir

(p<0.05). 1 saatlik GPX uygulaması sonucu gruplar arasında immotilitede gözle

görünür bir düşüş gözlendi. Grupların ortalamaları normozoospermi grupta

7.70(±7.313), oligozoospermi grupta ise 22.75(±16.222) idi. Normozoospermi ve

oligozoospermi grupların immotilitelerinin karşılaştırılması için yapılan test

54

sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının immotilitelerinin

arasında anlamlı bir fark vardır. İstatiksel olarak oligozoospermi gruba ait veriler

normozoospermi gruba göre daha daha yüksektir (p<0.05). 24 saatlik GPX

uygulaması sonucu normozoospermi grubun ortalaması 37.8(±16.555),

oligozoospermi gruba ait ortalama 59.3(±18.79) idi. Normozoospermi ve

oligozoospermi grupların immotilitelerinin karşılaştırılması için yapılan test

sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının immotilitelerinin

arasında anlamlı bir fark vardır. Oligozoospermi gruba ait veriler normozoospermi

gruba göre daha yüksektir (p<0.05).

6.5. İleri Hızlı Hareketli (+4) Sperm

+4 hareketli ileri hızlı sperm sayısı normozoospermi grupta 8.30(±2.736),

oligozoospermi grupta ortalama 3.25(±2.197) idi. Grupları istatiksel olarak

değerlendirdiğimizde %95 güvenle grupların varyansları homojendir.

Normozoospermi ve oligozoospermi grupların +4 hareketli sperm sayısı

karşılaştırılması sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +4

hareketli sperm sayısı arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait

veriler oligozoospermi gruba ait verilerden daha yüksektir (p<0.05). 1 saatlik GPX

uygulaması sonucu normozoospermi gruba ait ortalama 39.25(±21.021)

oligozoospermi gruba ait ortalama 23.05(±20.715) idi. Normozoospermi ve

oligozoospermi grupların +4 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması için yapılan test

sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +4 hareketli sperm sayısı

arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait veriler oligozoospermi

gruba ait verilerden daha yüksektir (p<0.05). 24 saatlik GPX uygulaması sonucu

normozoospermi gruba ait ortalama 8.85(±9.416), oligozoospermi gruba ait ortalama

4.05(±4.571) idi. Normozoospermi ve oligozoospermi grupların +4 hareketli sperm

sayısı karşılaştırılması sonrası normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +4

hareketli sperm sayısı arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait

veriler oligozoospermi gruba ait verilerden daha yüksektir (p<0.05).

55

6.6. Yavaş Hareketli (+3) Sperm

+3 Yavaş hareketli sperm sayısının normozoospermi grup ortalaması 31.65(±6.58),

oligozoospermi grup ortalaması 16.35(±8.94) idi. Grupları kendi aralarında istatiksel

olarak değerlendirdiğimizde %95 güvenle normozoospermi ve oligozoospermi

grupların varyansları homojendir. Normozoospermi ve oligozoospermi grupların +3

hareketli sperm sayısı karşılaştırılması için yapılan istatistik testi sonrasında

normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +3 hareketli sperm sayısı arasında

anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait veriler oligozoospermi gruba ait

verilerden daha yüksektir (p<0.05). 1 saatlik GPX uygulaması sonucu, yavaş

hareketli sperm sayısının normozoospermi grup ortalaması 38.95(±12.318),

oligozoospermi grupta ortalama 38.9 (±13.336) idi. Normozoospermi ve

oligozoospermi grupların +3 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması için yapılan test

sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +3 hareketli sperm sayısı

arasında anlamlı bir fark yoktur (p>0.05). 24 saatlik GPX uygulaması sonucu, yavaş

hareketli sperm sayısının normozoospermi grup ortalaması 34(±12.329),

oligozoospermi grupta ortalama 19(±12.855) idi. Normozoospermi ve

oligozoospermi grupların +3 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması için yapılan

istatiksel test sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +3 hareketli

sperm sayısı arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait veriler

oligozoospermi gruba ait verilerden daha yüksektir (p<0.05).

6.7. Yerinde Hareketli (+2) Sperm

+2 yerinde hareketli sperm sayısının normozoospermi grup ortalaması 13.3(±7.987),

oligozoospermi grup ortalaması 8.4(±5.295) idi. Normozoospermi ve oligozoospermi

grupların +2 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması için yapılan istatiksel test

sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +2 hareketli sperm sayısı

arasında anlamlı bir fark vardır (p0.05). 1 saatlik GPX uygulaması sonucu yerinde

hareketli sperm sayısının , normozoospermi grup ortalaması 13.6(±8.678).

Oligozoospermi gruba ait ortalama 15.25(±8.472) idi. Normozoospermi ve

oligozoospermi grupların +2 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması sonrası

normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +2 hareketli sperm sayısı arasında

anlamlı bir fark yoktur (p>0.05). 24 saatlik GPX uygulaması sonucu yerinde

hareketli sperm sayısının , normozoospermi grup ortalaması 18.8(±9.07),

56

oligozoospermi gruba ait ortalama 17.65(±6.706) idi. Normozoospermi ve

oligozoospermi grupların +2 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması sonrasında

normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +2 hareketli sperm sayısı arasında

anlamlı bir fark yoktur (p>0.05).

6.8. Toplam motil sperm sayıları (TPMSS)

Toplam motil sperm sayıları (TPMSS) ortalamaları normozoospermi grupta

9.9345(±6,70371)milyon, oligozoospermi grupta 0.9045(±0,75998) milyon olarak

hesaplandı. Normozoospermi ve oligozoospermi grupların toplam motil sperm

sayıları karşılaştırılması sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının

toplam motil sperm sayıları arasında anlamlı bir fark vardır (p<0.05). 1 saatlik GPX

uygulaması sonucu toplam motil sperm sayıları ortalamaları normozoospermi grupta

52.39(±45.63793)milyon, oligozoospermi grupta 6.4163(±6.84036)milyon idi.

Normozoospermi ve oligozoospermi grupların toplam motil sperm sayıları

karşılaştırılması sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının toplam

motil sperm sayıları arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait

değerler oligozoospermi gruba göre daha yüksektir (p<0.05). 24 saatlik GPX

uygulaması sonucu toplam motil sperm sayıları ortalamaları normozoospermi grupta

11.063(±9.29911) milyon, oligozoospermi grupta 1.005(±1.12313)milyon olarak

hesaplandı. Normozoospermi ve oligozoospermi grupların toplam motil sperm

sayıları karşılaştırılması sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının

toplam motil sperm sayıları arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba

ait değerler oligozoospermi gruba göre daha yüksektir (p<0.05).

6.9. Motilite

Tekrarlamalı ANOVA Testi (Repeated ANOVA Test) ile normospermik ve

oligospermik grupların motilitelerinin kontrol grubu motilitesi, 1 saatlik GPX

uygulama sonrası motilite ve 24 saatlik GPX uygulama sonrası motilite değerleri

analiz edildi. Fark önemli bulundu (p < 0.001). İleri analiz yöntemi ( Pairwise

Comparisons) ile devam edildi. Hangi grupta farklılık olduğu belirlendi. Sonuçlar

Tablo 10 ve Tablo 11’ de verildi.

57

Tablo 10. Normospermik Gruba Ait Motilite Verileri

Gruplar Ortalama Standart Hata

%95 güven aralığında Alt Sınır Üst Sınır

I. Normospermik Grup Motilitesi

53,250 ,624 51,945 54,555

II. 1 saatlik GPX Uygulama Sonrası Normospermik Grup Motilitesi

92,300

1,635

88,877

95,723

III. 24 saatlik GPX Uygulama Sonrası Normospermik Grup Motilitesi

62,200

3,702

54,452

69,948

Pairwise Comparisons

Grupların karşılaştırılması

Ortalama Fark Standart Hata p

I-II -39,050 1.850 <0,001

I-III -8,950

3.870

<0,001

II-III -30.100

3.010

<0,001

58

Tablo 11. Oligospermik Gruba Ait Motilite Verileri

Gruplar Ortalama Standart Hata

%95 güven aralığında Alt Sınır Üst Sınır

I Oligospermik Grup Motilitesi

28,000 2,700 22,349 33,651

II 1 saatlik GPX Uygulama Sonrası Oligospermik Grup Motilitesi

77,250

3,627

69,658

84,842

III 24 saatlik GPX Uygulama Sonrası Oligospermik Grup Motilitesi

40,700

4,202

31,906

49,494

Pairwise Comparisons

Grupların Karşılaştırılması

Ortalama Fark Standart Hata p

I-II -49,250 3,485 <0,001

I-III -12,700

4,108

<0,018

II-III 36,550

3.061

<0,001

6.10. Vitalite

Tekrarlamalı ANOVA Testi (Repeated ANOVA Test) ile normospermik ve

oligospermik grupların vitaliteleri kontrol grubu vitalitesi, 1 saatlik GPX uygulama

sonrası vitalite ve 24 saatlik GPX uygulama sonrası vitalite değerleri analiz edildi.

Fark önemli bulundu (p < 0.001). İleri analiz yöntemi ( Pairwise Comparisons) ile

devam edildi. Hangi grupta farklılık olduğu belirlendi. Sonuçlar Tablo 12 ve Tablo

13’ de verildi.

59

Tablo 12. Normospermik Gruba Ait Vitalite Verileri

Gruplar Ortalama Standart Hata

%95 güven aralığında Alt Sınır Üst Sınır

I Normospermik Grup Vitalitesi

89,450 1,923 85,425 93,475

II 1 saatlik GPX Uygulama Sonrası Normospermik Grup Vitalitesi

89,450

1,923

85,425

93,475

III 24 saatlik GPX Uygulama Sonrası Normospermik Grup Vitalitesi

77,300

2,089

72,928

81,672

Pairwise Comparisons

Grupların Karşılaştırılması

Ortalama Fark Standart Hata p

I-II 0,000 - -

I-III 12,150 1,415 <0,001

II-III -12,150 3.061 <0,001

60

Tablo 13. Oligospermik Gruba Ait Vitalite Verileri

Gruplar Ortalama Standart Hata

%95 güven aralığında Alt Sınır Üst Sınır

I Oligospermik Grup Vitalitesi

80,400 2,884 74,364 86,436

II 1 saatlik GPX Uygulama Sonrası Oligospermik Grup Vitalitesi

80,400

2,884

74,364

86,436

III 24 saatlik GPX Uygulama Sonrası Oligospermik Grup Vitalitesi

66,900

4,942

56,556

77,244

Pairwise Comparisons

Grupların Karşılaştırılması

Ortalama Fark Standart Hata p

I-II 0,000 - -

I-III 13,500

2,587

<0,001

II-III -13,500

2,587

<0,001

61

Şekil 17. Normospermik Grup Motilite ve Vitalite Değerlerinin Karşılaştırılması

Şekil 18. Oligospermik Grup Motilite ve Vitalite Değerlerinin Karşılaştırılması

62

7.TARTIŞMA

Erkek infertilitesine sebep olan varikosel, kriptorşidizm, enfeksiyonlar, tıkayıcı

lezyonlar, kistik fibrozis, travma ve tümörler gibi bilinen sebeplerin dışında son

dönemde ilgi çeken bir yeni infertilite sebebi eklenmiştir; oksidatif stres. Vücuttaki

antioksidanlar ve serbest oksijen radikalleri arasındaki dengesizlik sonucu ortaya

çıkan oksidatif stres, spermlere zarar verir ve infertiliteye sebep olabilmektedir

(Purvis, 1992).

İnfertilite sebebiyle başvuran çiftler üremeye yardımcı tekniklere yönelmektedirler.

Bunlardan günümüzde en çok tercih edilenleri IUI, IVF ve ICSI yöntemleridir

(ASRM, 2011). Klasik IVF, çocuk sahibi olmak isteyen pek çok çift için etkili bir

tedavi yöntemidir ancak şiddetli erkek faktörünün sebep olduğu vakalarda etkili

değildir (Wilkes et al, 2009). Böyle durumlarda bireyin spermatozoonunun direkt

oosit içine enjekte edildiği ICSI tekniği uygulanmaktadır. Bu tekniğe rağmen, halen

ICSI sikluslarının % 1-5’i başarısızlıkla sonuçlanmaktadır. Bu başarısız sonuçlar

bilim adamlarını döllenme oranlarını arttırmaya yönelik pek çok tedavi yoluna

sevketmiştir (Nasr- Esfahani et al., 2010). Erkek infertilitesinde kalıcı iyileşmenin

sağlanması amacıyla spesifik medikal ve cerrahi tedaviler uygulanabilmektedir

(Özveren, 2015).

Yapılan son çalışmalara kadar reaktif oksijen türlerinin insan spermatozoası üzerinde

toksik olduğu düşünülmekteydi fakat elimizde düşük miktarda ROS’un

spermatozoanın fertilizasyonu gerçekleştirebilmesi için gerekli olduğuna dair veriler

bulunmaktadır (Aitken, 1999). Düşük miktardaki ROS’un fertilizasyon, akrozom

reaksiyonu, hiperaktivasyon, motilite ve kapasitasyon için gerekli olduğu

gösterilmiştir (Agarwal et al., 2004). Süperoksit (O2-) ile hidrojen peroksit (H2O2)

son derecede reaktif olan, yakındaki moleküllerle etkileşime girebilen ve hücre

organellerinde oksidatif stres hasarına sebebiyet veren oksijen metabolitleridir

(Coyle and Kader, 2007). Spermatozoonun eser miktarda hidrojen peroksitte

bekletilmesi ile sperm kapasitasyonu, hiperaktivasyonu, akrozom reaksiyonu ve

oosit füzyonunu uyarmaktadır (Aitken, 1995). Süperoksit anyonu da kapasitasyon ve

akrozom reaksiyonunu arttırmaktadır (Griveou et al., 1995).

63

ROS; radikal (hidroksil iyonu, süperoksit, NO, peroksil) ve radikal olmayan (ozon,

tekli oksijen, lipit peroksit, hidrojen peroksit) molekülleri içeren geniş bir dağılım

gösterir. Reaktif nitrojen metabolitleri (nitröz oksit, peroksinitrit, nitroksil iyonu)

serbest nitrojen metabolitleridir ve ROS’un alt sınıfı oldukları düşünülür (Darley-

Usmar et al., 1995). NO’nun normal sperm üzerine hem hareketi hem de zona

birleşmesini engelleyen zararlı etkileri ortaya konmuştur (Wu et al., 2004).

Her ejakulatın ROS ile kontamine olduğu varsayılmaktadır (Aitken, 1995).

Sitoplazmik damlacıklar, düşük sperm kalitesi ve artmış ROS miktarı arasındaki

bağlantıyı ortaya koyar. Hatalı spermiyogenezin sonucu meydana gelen yapılar,

ROS’un esas kaynağı olduğu bilinmektedir (Gomez et al., 1996). Muhtemelen

sitozolik bir enzim olan glukoz-6- fosfat dehidrojenaz vasıtasıyla, sitoplazmik

kalıntılar ve artmış ROS üretimi paralellik göstermektedir (Aitken, 1999). Oksidatif

stresin neden olduğu harabiyetin derecesi; ROS miktarı, ROS maruziyet süresi ve

diğer birtakım hücre dışı faktörlere bağlıdır.

Yağlar sperm plazma zarında doymamış yağ asitleri şeklinde bulunduran ve

oksidasyondan en fazla etkilenen biyomoleküllerdir. Artmış ROS seviyeleri, azalmış

sperm motilitesi ile ilgili bulunmuştur ancak tam mekanizması anlaşılamamıştır

(Agarwal et al., 1994). Bir hipoteze göre, H2O2 hücre membranını geçmekte ve daha

sonra spermatozoa tarafından ROS üretimini arttırmak için elektron kaynağı olarak

NADPH oksidaz olarak bilinen enzim sistemi tarafından kullanılacak olan

NADPH’nin hücre içinde elde edilmesini sağlayan heksoz monofosfat şantı yolu ile

glukoz-6-fosfat dehidrojenaz gibi bazı vital enzimlerin işlevini engellemektedir

(Aitken et al., 1997). Bir diğer hipotez ise aksonemal proteinlerin fosforilasyonunda

ve sperm hareketliliğinde azalma ile sonuçlanan bir dizi olaya dayanır ki, her ikisi de

sperm-oosit füzyonunda gerekli olan membran akışkanlığında azalmaya neden

olmaktadır (De Lamirande, 1992).

Yapılan çalışmalarda antioksidan savunma sisteminin sperm hücrelerini ROS üreten

anormal sperm hücrelerinden koruduğunu, lökositlerin ortaya çıkardığı ROS’u

temizlediği, DNA kırılmalarının önüne geçtiğini, sigara içenlerde semen kalitesini

gözle görülür bir iyileşme sağladığı, soğuğun sperm hücresine olan zararlı etkisini

azalttığı, erken sperm olgunlaşmasını önüne geçtiğini ve sperm hücrelerini

destekleyerek yardımla üreme tekniklerinin başarısını arttırdığı gösterilmiştir.

64

Seminal plazmada süperoksit dismutaz, katalaz, glutatyon peroksidaz ve glutatyon

redüktaza ilaveten askorbat, ürat, vitamin E, piruvat, glutatyon, albumin, vitamin A,

ubikinol ve hipotaurin gibi enzimatik olmayan antioksidanlar vardır.

Son yıllarda infertilite üzerine yoğunlaşan çalışmalar, herhangi bir neden tespit

edilemeyen idiyopatik infertilitede serbest oksijen radikallerinin önemi bir rolü

olduğunu göstermiştir (Alkan et al., 1997). Bu konu popüler bir konudur ve ayrıntılı

olarak ele alınmaya başlanmıştır. Glutatyon peroksidazın sperm parametrelerine

etkisini gözlemlemek için in vivo ve in vitro çalışmalar yapılmaktadır .

Bu çalışma Bahçelievler Medical Park Hastanesi Tüp Bebek Merkezine

spermiyogram testi için başvuran, normozoospermi ve oligozoospermi 20’şer,

toplam 40 gönüllü erkek vakaya ait semen örneği üzerinde yapıldı. Mikroskobik

incelemeler ve morfolojik değerlendirmeler WHO kriterlerine uygun olarak yapıldı.

Canlılık değerlendirmesi için Eosin Y testi uygulandı. İn vitro ortamda 1 saat ve 24

saat glutatyon peroksidaz’a (GPX) maruz bırakılan semen örnekleri motilite ve

vitalite değişimlerinin değerlendirilmesini amaçladık ve bu örnekler kontrol grubu ile

karşılaştırılarak değerlendirilmiştir .

Safarinejad ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada glutatyon peroksidaz enziminin

kofaktörü olan eser element selenyumu N-asetil sistein ile kombine olarak alan

infertil erkeklerde FSH düşmüş, ve tüm sperm parametreleri ile birlikte testosteron

ve inhibin B yükseldiği gözlenmiştir (Safarinejad et al., 2009).

Yaptığımız çalışmamızda elde ettiğimiz veriler doğrultusunda oligozoospermi ve

normozoospermili hasta gruplarında 1 saatlik ve GPX uygulaması sonucu motilitede

istatiksel bir artış gözlenmiştir. 24 saatlik GPX uygulaması sonucu normozoospermi

ve oligozoospermili hasta gruplarının motiliteleri kontrol grubu ile

karşılaştırıldığında istatiksel bir artış gözlenmiştir.

Imai ve arkadaşları spermatozoa üzerinde immünoblotlama analizi

gerçekleştirmişlerdir. Yapılan çalışmada insan spermatozoasında GPX4’e

rastlanmıştır. Spermatozoanın orta kısmında GPX4’e ait floresan gözlenmiştir.

GPX’e bağlı spermatozoanın mitokondrisinde lokalize olan markerlarla

özdeşleşmiştir. Imai ve arkadaşlarının Kitasaito Üniversitesinde yaptığı çalışmaya 31

65

fertil, 73 infertil gönüllü çalışmaya katılmıştır. 31 fertil erkekten 23’ü

normozoospermi, 7’si astenozoospermi, 1’i oligozoospermi tanısı konmuştur.

73 infertil bireyden 18’ü normozoospermi, 23’si astenozoospermi, 7’si

oligozoospermi ve 25’ine oligoastenozoospermi tanısı konmuştur.

31 fertil örnekten alınan spermatozoon örnekleri incelenmiş ancak bir kusur

gözlenememiştir. 73 infertil gönüllüden 7 oligozoospermi infertil bireyin

sonuçlarında çarpıcı bir sonuçla karşılaşmışlardır. Bu 7 infertil bireye ait

spermatozoon örneklerinde GPX4 seviyesinde düşüş ve mitokondri sayısında azalma

gözlenmiştir (Imai, 2003).

Garolla ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada memeli spermatozoasında, ATP’nin ana

kaynağı olan mitokondrinin dış zarı kapsül adı verilen keratin bir yapı ile sarılıdır.

Bu yapının ana bileşeni selenoenzim fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidazdır

(PHGPX). Glutatyon peroksidaz ailesinin bu monomerik üyesi özellikle testiste

bulunması, sperm mitokondrial kapsülü oluşturması ve spermatogenezde rol

oynamaktadır. PHGPX (GPX4)’in düşük aktivitesi in vitro inkübasyon sırasında ileri

hareketli sperm sayısının düştüğünü göstermektedir. Garolla ve arkadaşlarının 30

astenozoospermili hastalar üzerinde yaptığı 3 aylık çalışmada PHGPX’in sperm

sayısı, morfoloji ve vitalitede bir değişim göstermediğini gözlememişlerdir (Garolla

et al., 2005).

Yaptığımız çalışmada elde ettiğimiz veriler doğrultusunda normozoospermi’li ve

oligozoopermi’li hasta gruplarında 1 saatlik GPX uygulaması sonucu vitalitede bir

değişim gözlenmezken 24 saatlik GPX uygulaması sonucu normozoospermi ve

oligozoospermi hasta gruplarının vitalitesinde istatiksel bir değişim gözlendi .

Ülkemizde yapılan çalışmada Taşdemir ve arkadaşlarının dondurulmuş boğa sperma

kalitesi değişik antioksidanların etkisini incelemişlerdir. Taşdemir ve arkadaşları

ejakülatları 5 eşit parçaya ayırdı ve milimetrede 15x106 spermatozoa olacak şekilde

ayırmışlardır. Spermalar otomatik sperma dondurma makinasında -196 °C ‘de sıvı

nitrojende dondurulmuştur. Dondurulan sperma hücreleri 37 °C’de 30 sn’de

çözülerek plazma membran bütünlüğü yanı sıra sperma hareketi değerlendirilmiştir.

Biyokimyasal analizler ve ölçümler için ticari kitler kullanılmıştır.Yapılan çalışmalar

doğrultusunda GPX’in boğa spermaları üzerinde herhangi bir pozitif etkisi olmadığı

gözlenmiştir (Taşdemir ve ark., 2014).

66

Tavilani ve arkadaşlarının 2008 de yaptıkları bir çalışmada seminal plazma

antioksidan enzim aktivitelerinin normospermik ve astenospermik hastalarda

değerlendirmişler ve lipid peroksidasyonu ile her iki grupta karşılaştırmışlardır. Bu

çalışmada seminal plazma katalaz (CAT), süperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon

peroksidaz (GPX) aktivitesi ile lipid peroksidasyonu belirteci olan MDA arasındaki

ilişki incelenmiştir.Normospermik örneklerde seminal plazma antioksidan enzimleri

ile total MDA miktarı arasında pozitif korelasyon bulunurken, astenospermik

örneklerde sadece SOD ve CAT aktivitesi ile MDA korelasyonu bulunmuştur

(Tavilani et al., 2008). Araştırıcılar normospermik ve astenospermik olguların GPX

aktivitesinin de benzer olduğunu göstermişlerdir.

Tomar ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada infertile kişilerde semen antioksidan

sistemi araştırılmış ve normal kişilerle karşılaştırılmıştır (Tomar et al., 2017).

Oligospermik ve astenospermik kişiler arasında seminal antioksidan enzimler ile

MDA ilişkisine bakılmıştır. Astenospermik hastalarda seminal antioksidan enzim

düzeylerinde azalma görünürken MDA konsantrasyonununun arttığı gözlenmiştir.

Bu durum normo ve oligospermik olgularda görülmemiştir. Özetle seminal plazma

GPX’in oligo ve normospermik olgularda farklı olmadığı gösterilmiştir.

GPX’lerin ROS'a karşı korunmalara katkısı, insan spermatozoasında, kemirgenlerin

aksine, insan spermatozoalarında, testislerin veya seminal plazma GPX2, GPX3'ün

ve GPX5'in bulunmadığından ve GPX4'ün olgunlaşmamış olarak çözünmez ve

enzimatik olarak inaktif olması nedeniyle sınırlı olduğu ileri sürülmektedir (Crisol et

al., 2012). Çalışmamızda elde ettiğimiz veriler ışığında GPX ‘in normo ve

oligospermik örneklerde inkübasyon süresi ile sınırlı bir etki yaptığı görülmüştür.

Çalışmanın hücresel düzeydeki etkilerinin ayrıca incelenmesi gerektiği

düşünülmektedir.

67

8. SONUÇLAR VE ÖNERİLER

• Yaptığımız çalışmada spermler üzerinde 1 saatlik GPX uygulamasının

sperm vitalitesi üzerinde herhangi bir etkisi olmadığı sonucuna varıldı.

• 24 saatlik GPX uygulamasının oligozoospermi ve normozoospermi

gruplarında sperm vitalitesi üzerinde olumsuz bir etkisi olduğu sonucuna varıldı.

• 1 saatlik ve 24 saatlik GPX uygulanması sonucu hem normozoospermi hem

de oligozoospermi gruplarında sperm motilitesini arttırdığı sonucuna varıldı.

• 24 saatlik GPX uygulamasının hem normozoospermi hemde oligozoospermi

gruplarında progresif motilite üzerinde negatif bir etkisi olduğu sonucuna varıldı.

Elde etmiş olduğumuz bulguların 1 ve 24 saatlik GPX uygulamasının sperm

motilitesini artırdığı ancak bireysel farklılıkların açıklanabilmesi için vaka sayılarının

artırılarak klinik anlamda da katkı sağlanabilmesi amacıyla ileri çalışmalarla

genişletilmesi gerektiğini söyleyebiliriz.

68

9. KAYNAKÇA

Agarwal, A., Ikemoto, I., Loughlin, K.R. (1994), Relationship of sperm parameters

with levels of reactive oxygen species in semen specimens. Journal of Urology, 152,

107-110.

Agawa, Y. (1996), Overexpression of phospholipid hydroperoxide glutathione

peroxidase suppressed cell death due to oxidative damage in rat basophile leukemia

cells (RBL-2H3). Biochemical and Biophysical Research Communications, 222,

432– 438.

Agarwal, A., Nallella, K.P., Allamaneni, S.S., Said, T.M. (2004), Role of

antioxidants in treatment of male infertility: An overview of the literature. Reprod

Biomed Online, 8, 616-27.

Agarwal, A., Allamaneni, S.S. (2011), Free radicals and male reproduction. Journal

of the Indian Medical Association, 109(3), 184-7.

Aitken, R.J. (1999), The Amoroso Lecture. The human spermatozoon-a cell in

crisis?. Journal of reproduction and fertility,115, 1-7.

Aitken, R.J., Clarkson, J.S. (1988), Significance of reactive oxygen species and

antioxidants in defining the efficacy of sperm preparation techniques. Journal of

Andrology, 9(6), 367-76.

Aitken, R.J. (1995), Free radicals, lipid peroxidation and sperm function.

Reproduction, Fertility and Development,7, 659-68.

Aitken, R.J., Fisher, H.M., Fulton, N., Gomez, E., Knox, W., Lewis, B. (1997),

Reactive oxygen species generation by human spermatozoa is induced by exogenous

NADPH and inhibited by the flavoprotein inhibitors diphenylene iodonium and

quinacrine. Molecular Reproduction and Development, 47, 468-82.

Akkuş, M. Embriyolojiye giriş ve tarihçe. Dicle Üniversitesi. Erişim tarihi:

05.09.2018.http://www.dicle.edu.tr/Contents/6f518fce-fda0-4da1-8c35-

2d2bd119279f.pdf.

69

Alkan, I., Şimşek, F., Haklar, G., et al. (1997), Reactive oxygen species productıon

by the spermatozoa of patients with idiopathic infetility: Realitionship to seminal

plazma antioxidants. Journal of Urology, 157, 140-143.

Aksoy, Y. (2002), Antioksidan metabolizmada glutatyonun rolü. Türk Klinik Tıp

Bilimleri Dergisi, 22, 442-446.

Aktan, G. (2011), WHO-2010 kriterlerine göre semen parametreleri neler değişti?.

Uroturk, doğu_anadolu_mayıs_sunum_pdf.

Aliabadi, E., Karimi, F., Talaei- Khozani, T. (2013), Effects of L-carnitine and

pentoxifylline on carbohydrate distribution of mouse testicular sperm membrane. The

Iranian Journal of Medical Sciences, 38 (2), 107-115.

Arthur, J.R. (2000), The Glutathione Peroxidases. Cellular and Molecular Life

Sciences, 57, 1825-1835.

Aydos K.,(2007), Temel Üroloji Kitabı. İçinde: Erkek infertilitesi. Anafarta K,

Bedük Y, Arkan N, (eds.), Ankara: Güneş Tıp Kitabevi, Üçüncü baskı, s: 989.

Aytekin Y, Solakoğlu S. (Çev.) (2009), Temel Histoloji Text&Atlas, Junqueira, L.C.,

Carneiro J., İstanbul: Nobel Tıp Kitapevi.

Beydola, T., Sharma, R.K., Lee, W., Agarwal, A. (2013), Male Infertility Practice.

In: Sperm preparation and selection techniques.Rizk B, Aziz N, Agarwal A. (eds.),

New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers, s: 244-251.

Bozhan, N. (2017), Bazı Schıff bazlarının Saccharomyces cerevisiae Kültür

Ortamlarında Bazı Biyokimyasal Parametreler Üzerine Etkileri, Yüksek Lisans Tezi,

Bitlis Eren Üniversitesi ve Fırat Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji

Anabilim Dalı, Bitlis, (Danışman: Doç. Dr. Ayşe Dilek ÖZŞAHİN KİREÇCİ).

Burrows, P.J., Schepterman, C.G., Lipshultz, L.I. (2002), Comprehensive office

evaluation in the newmillennium. Urologic Clinics of North America, 29, 873-894.

70

Büyükuslu, N., Yiğitbaşı, T. (2015), Reaktif Oksijen Türleri ve Obezite Oksidatif

Stres MÜSBED, 5,197-203.

Cao, G., Prior, R.L. (1998), Comparison of different analytical methods for assesing

total antioxidant capacity of human serum. Clinical Chemistry, 44, 1309-1315.

Cao, G., Prior, R.L. (1999), In vivo antioxidant capacity: Comperison of different

analytical methods. Free Radical Biology & Medicine, 27, 1173-1181.

Casper, R.F., Meriano, J.S., Jarvi, K.A., Cowen, L., Lucato, M.L. (1996), The

hypoosmotic swelling test for selection of viable sperm for intracytoplasmic sperm

ınjection in men with complete asthenozoospermia. Fertility and Sterility, 65, 972.

Chiles, K.A., Schlegel, PN. (2015). What do semen parameters mean? How to define

a normal semen analysis. Archives Of Andrology, 4(2), 1-4.

Cnubben, N.H.P., Rietjens, I.M.C.M., Wortelboer, H., Van Zanden, J., Van

Bladeren, P.J. (2001), The interplay of glutathione related processes in antioxidant

defense. Environmental Toxicology and Pharmacology, 10, 141-152.

Cooper, T.G., Yeung, C.H. (2010), Physiology of Sperm Maturation and

Fertilization. In: Nieschlag E, Behre HM, Nieschlag S, (eds). Springer-Verlag Berlin

Heidelberg, s:61-85.

Coyle, C.H., Kader, K.N. (2007), Mechanisms of H2O2-induced oxidative stress in

endothelial cells exposed to physiologic shear stress. ASAIO J, 53, 17-22.

Crisol, L., Matorras, R., Aspichueta, F., Expósito, A., Hernández, M.L., Ruiz-Larrea,

M.B., Mendoza, R., Ruiz-Sanz, J.I. (2012), Glutathione peroxidase activity in

seminal plasma and its relationship to classical sperm parameters and in vitro

fertilization-intracytoplasmic sperm injection outcome. Fertil Steril. 97(4), 852-7.

Çayla, E. (2011), Hayvan ve bitkilerde oksidatif stres ile antioksidanlar. Tıp

Araştırmaları Dergisi, 9(1), 73-83.

Çoruh, D. (2010). Cep Telefonu Kulanımının In Vitro Düzeyde Bazı Sperm

Parametrelerine Etkileri, Yüksek Lisans Tezi, Selçuk Üniveristesi, Sağlık Bilimleri

71

Enstitüsü, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Konya, (Danışman: Prof. Dr.

Selçuk DUMAN).

Dağdeviren, A., Müftüoğlu, F.S., Karabay, G. (Çev.) (2009), Renkli Histoloji Atlası.

Gartner L.P., Hiatt J.L., Color Atlas of Histology, Ankara: Güneş Tıp Kitapevi.

Darley-Usmar, V., Wiseman, H., Halliwell, B.(1995). Nitric oxide and oxygen

radicals: a question of balance. FEBS Letters ,369,131-135.

Davet, J.R. (2006), The antioxidant glutathioneione proxydase family and

spermatozoa: A complex story. Molecular and Cellular Endocrinology, 250, 70-79.

De Lamirande, E., Gagnon, C. (1992), Reactive oxygen species and human

spermatozoa. II. Depletion of adenosine triphosphate plays an important role in the

inhibition of sperm motility. Journal of Andrology, 13, 379-386.

De Lamirande, E., Gagnon, C. (1995), Impact of reactive oxygen specieson

spermatozoa: A balancing act between beneficial and detrimental effects. Hum

Reprod, 10, 15-21.

De Lamirande, E., O’Flaherty,C. (2008), Sperm activation: Role of reactive oxygen

species and kinases. Biochimica et Biophysica ActaProteins and Proteomics,

1784(1), 106–115.

Delilbaşı, L., Balaban, B., Ayaş, B. (2001), Gametler Fertilizasyon ve Embriyoner

Gelişim. 1. baskı. İstanbul: Serono Yayınları, s: 50-51.

Demirtaş, A., Üntan İ. (2011), Seminal sıvı ve spermde oksidatif stres ve

antioksidanlar. Türk Üroloji Seminerleri, 2, 26-27.

Doğan, Ş. (2008), Seminal Plazmada Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) Sperm DNA

Fragmantasyonu ve Apopitozu Sürecinde İnfertiliteye Olan Etkisinin

Değerlendirilmesi. Yüksek Lisans Tezi, Dokuz Eylül Üniversitesi, Sağlık Bilimleri

Enstitüsü, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, İzmir, (Danışman: Yrd. Doç.Dr.

Çetin PEKÇETİN).

Elder, K., Dale, B. (2000), In vitro fertilization. 2.Baskı, Cambridge:Cambridge

University Press., s: 27-151

72

Eliasson, R. (1975), Analysis of semen. In: Progress in infertility. Behrman S.J,

Kistner R.W, (eds.), İkinci baskı, New York : Little Brown,s: 691-713.

Erdemir, F., Fırat, F., Gençten, Y. (2011), Sperm morfolojisinin değerlendirilmesi ve

klinik önemi. Türk Üroloji Seminerleri, 2, 11-7.

Eşrefoğlu, M. (2004), Genel ve Özel Histoloji. 1.baskı, Malatya: Pelikan Yayıncılık.

Falandysz, W. (2004), Chemotherapy associated oxidative stress: Impact on

chemotherapeutic effectiveness. Integr Cancer Ther, 3(4), 294-300.

Garolla, A., Maiorino, M., Roverato, A., Roveri, A., Ursini, F., Foresta, C. (2005),

Oral carnitine supplementation ıncreases sperm motility in asthenozoospermic men

with normal sperm phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase levels.

Fertility and Sterility, 83, 355-361.

Gedikli, S., Özbek, E., Demirci, T. (2013), Fertilizasyonun Moleküler Temeli. Van

Tıp Dergisi, 20(4), 294-301.

Giannottasio, A., Rosa, De M., Smeroglia, R., Zarrilli, S., Cimmino, A., Rosario Di.,

B., Ruggiero, R., Colao, A., Lombardi, G. (2002), Glutathione Peroxidase (GPX)

activity in seminal plasma of healthy and infertile males. Journal of

Endocrinological Investigation, 25, 983-986.

Gomez, E., Buckingham, D.W., Brindle, J., Lanzafame, F., Irvine, D.S., Aitken, R.J.

(1996), Development of an image analysis system to monitor the retention of residual

cytoplasm by human spermatozoa: Correlation with biochemical markers of the

cytoplasmic space, oxidative stress and sperm function. J Androl, 17, 276-87.

Griveau, J.F., Dumont, E., Renard, P., Callegari, J.P., Le Lannou, D. (1995),

Reactive oxygen species, lipid peroxidation and enzymatic defence systems in

human spermatozoa. The Journal of Reproduction and Fertility ,103, 17-26.

73

Gutteridge, J.M.C., Rowley, D.A., Halliwell, B. (1981), Superoxide dependent

formation of hydroxyl radicals in the presence of iron salts. Biochemical Journal,

199,263-265.

Güçtaş, A.Ö. (2006), Bilgisayar Destekli Semen Analiz Sistemi (CASA) İle Yapılan

Sperm Morfolojisi İncelemelerinin Tekrarlanabilirliği, Değişken Analizleri ve

Laboratuar İçi Manuel Yöntemle Karşılaştırılması. Uzmanlık Tezi, Sağlık Bakanlığı

Taksim Eğitim Ve Araştırma Hastanesi, İstanbul, (Danışmanlar: Doç. Dr. H. Mete

ÇEK ve Op. Dr. Muammer AYDIN).

Gümüş, B., Uyanık, B.S., Lekili, M., Yiğitoğlu, M.R., Temeltaş, G., Büyüksu, C.

(2001), Varikoselli hastaların semen plazmasında antioksidan seviyesi, Türk Uroloji

Dergisi. 27(1), 73-76.

Gürdöl, F., Ademoğlu, E. (2010), Biyokimya. 1. Baskı, İstanbul: Nobel Tıp

Kitabevleri, s:829-836.

Hassa, H. (2003), İnfertil Olgulara Klinik Yaklaşım ve IVF Laboratuar

Uygulamaları. 1. Baskı, Eskişehir: Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Yayınları, s:

127-165.

Handelsman, D.J., Conway, A.J., Boylan, I.M., Turtle, J.R. (1984), Testiküler

function in potential sperm donors: Normal ranges and the effects of smoking and

varicocele. International Journal of Andrology, 7, 369-382.

Hill, J.A., Cohen, J., Anderson, DJ. (1989), The effects of lymphokines and

monokines on human sperm fertilizing ability in the zona free hamster egg

penetration test. American Journal Of Obstetrics And Gynecology,160, 1154-1159.

Hull, M.G., Willams, J.A., Ray, B., Mc Laughlin, E.A., Akande, V.A., Ford, W.C.

(1998), The contribution of subtle oocyte or sperm dysfunction affecting fertilization

in endometriosis-associated or unexplained infertility: a controlled comparison with

tubal infertilitiy and use of donor spermatozoa. Human Reprod, 13, 1825-1830.

74

Imai, H., Nakagawa, Y. (2003), Biological significance of phospholipid

hydroperoxide glutathione peroxidase (Phgpx, Gpx4) in mammalian cells. Free

Radical Biology &Medicine, 34, 145-169.

Imai,H., Hakkaku,N., Iwamoto R., Jyunko S., Toshiyuki S., Tojima Y., Konishi K.,

et al. (2009), Depletion of selenoprotein GPx4 in spermatocytes causes male

infertility in mice. Journal of Biological Chemistry, 284(47), 32522–32532.

Junqueira, L.C., Carneiro, J., Kelley, R.O. (1993), Temel Histoloji . İçinde: Erkek

Üreme Sistemi. Aytekin Y, Solakoğlu S, Ahıshalı B,(eds.), İstanbul: Barış Kitapevi.

Kadıoğlu, A., Çayan, S., Semenci, B., Orhan, İ.(2004), Erkek Reprodüktif Sistem

Hastalıkları ve Tedavisi. 1. Baskı, İstanbul: İstanbul Medikal Yayıncılık, s: 91-102.

Kadıoğlu, A., Kendirci, M., Aktan, G., Yaman, Ö., Çayan, S. (2011), WHO

Laboratuar El Kitabi. İçinde: İnsan Semeninin İncelenmesi Ve İşlemlerden

Geçirilmesi. Türk Üroloji Derneği, ISBN:978-975-00112-4-5.

Kahraman, S. (2008), Erkeklerde Kan Ve Seminal Plazmada Kurşun Ve Kadmiyum

Düzeylerini Parametreleri Üzerine Etkileri, Tıpda Uzmanlık Tezi, Eskişehir

Osmangazi Üniversitesi, Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kadın

Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı, Eskişehir, (Danışman: Prof. Dr. Atilla

YILDIRIM).

Karadağ, T., Kendirici, M. (2013), Erkek infertilitesinde antioksidan tedavinin yeri.

Erkek Üreme Sağlığı, 55, 263-264.

Karaöz, E. (2002), Özel Histoloji. SDÜ Yayın No: 29, Isparta :SDÜ Basımevi.

Keskin, M.Z., Budak, S., İlbey, Y.Ö. (2016), İdiopatik erkek infertilitesi güncel

medikal tedavi yaklaşımı. Androloji Bülteni, 18(64), 40-43.

Kierszenbaum, A.L. (2006), Histoloji ve Hücre Biyolojisi, Patolojiye Giriş. In:

Üreme Sistemi. Demir R,( Eds.), Ankara: Palme Yayıncılık, s531-564.

Konukoğlu, D., Akçay, T. (1995), Glutatyon metabolizması ve klinik önemi. Türk

Klinik Tıp Bilimleri, 15, 214-218.

75

Koyuncu, H. (2011), Methods for the determination of sperm DNA damage. Turk

Urol Sem, 2, 18-23.

Krausz, C.S., Gervasi, G., Forti, G., Baldi, E. (1994), Effect of platelet activating

factor on motility and acrosome reaction of human spermatozoa. Human

Reproduction, 9(3), 471-476.

Kumar, R. (2002), Oxidative stress associated DNA damage in testis of mice:

Induction of abnormal sperms and effects on fertility. Mutat Res, 513(1-2), 103-11.

Lecture Fertilization, Erişim Tarihi: 30.09.2017:

https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Lecture-Fertilization.

Lenzi, A., Culasso, F., Gandini, L., Lombardo, F., Dondero, F .(1993), Placebo-

controlled, double-blind, cross-over trial of glutathione therapy in male infertility.

Human Reproduction, 8, 1657–1662.

Mates, J.M., Perez-Gomez, C., De Castro, I.N. (1999), Antioxidant enzymes and

human diseases. Clinical Biochemistry, 32, 595-603.

Meister A.(1995), Glutathione Metabolism. Methods in Enzymology, 251, 3-7.

Moore, K.L., Persaud, T.V.N. (2009), Klinik Yönleriyle İnsan Embriyolojisi. In:

İnsan Gelişiminin Başlangıcı. Dalcık H, Yıldırım M,(eds.), İstanbul:Nobel Tıp

Kitapevi.

Mortimer, D. (1994), Sperm recovery techniques to maximize fertilizing capacity.

Reprod Fertil Def, 6, 25-31.

Nasr- Esfahani M.H., Deemeh M.R., Tavalaee M. (2010), Artificial oocyte activation

and intracytoplasmic sperm injection. Fertil steril, 94(2), 520-526.

Oehninger, S.C., Kruger, T.F.(2009), Erkek İnfertilitesi Teşhis ve Tedavi. Kilciler

M,(Çev. Eds.), İstanbul: Habitat Matbaası, s:1-240.

Ovalle, W.K., Nahirney, P.C.(2009),Netter Temel Histoloji. In: Erkek Üreme

Sistemi. Müftüoğlu S, Kaymaz F, Atilla P, (Çev. Eds.), Ankara: Güneş Tıp Kitapevi,

76

s:377-398.

Özçınar, E. (2014), Semen Analizi: 2010 Dünya Sağlık Örgütü Kriterlerine Göre

Spermiyogram. İzmir Üniversitesi Tıp Dergisi, 1, 48-51.

Özdiler, E., Aydos, K. (2000), Klinik Androloji. 1. Baskı, Ankara,:Ankara

Üniversitesi Basımevi, s: 253-284.

Özveren, H. (2015), İdiopatik İnfertil Hastalarda Semen ve Kan Plazmasında

Malondialdehit- Katalaz- Glutatyon Peroksidaz – Süperoksit Dismutaz Düzeyi ve

Semen Parametleri İle İlişkisi. Uzmanlık Tezi, Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp

Fakültesi, Üroloji Anabilim Dalı, Van, (Danışman: Dr. Mustafa GÜNEŞ).

Pelit, E.S., Katı, B., Akın, Y.,Yeni, E. (2017), Çevresel stres faktörlerinin sperm

hücreleri üzerine etkisi, Androloji Bülteni, 19(2), 61-64.

Purvis, K., Christiansen, E. (1992), Male infertility: Current concepts. Ann Med, 24,

258-72

Rodin, D.M., Larone, D., Goldstein, M.(2003), Relationship Between Semen

cultures, leukospermia and semen analysis in men undergoing fertility evaluation.

Fertil Steril, 8, 1555-1558.

Ross, M.H., Pawlina, W. (2011), Histology: A Text and Atlas: with Correlated Cell

and Molecular Biology. In: Male Reproductive System. Philadelphia:Lippincott

Williams & Wilkins, 6. Baskı, s: 788-802.

Rotruck, J.T., Pope, A.L., Ganther, H.E., Swanson, A.B., Hafeman, D.G., Hoekstra,

W.G. (1973), Selenium: Biochemical role as a component of glutathione peroxidase.

Science, 179, 588-590.

Sadler, T.W.(2005),Langman’s Medikal Embriyoloji. 9. BaskıAnkara: Palme

Yayıncılık,s: 7-38.

Safarinejad, M.R., Safarinejad, S. (2009), Efficacy of selenium and/or N-acetyl-

cysteine for improving semen parameters in infertile men: A double-blind, placebo

controlled, randomized study. J Urol, 181,741-51.

77

Sharlip, I.D., Jarow, J.P., Belker, A.M., Lipshultz, L.I., Sigman, M., Thomas, A.J.,

Schlegel, P.N., Howards, S.S., Nehra, A., Damewood, M.D., Overstreet, J.W.,

Sadovsky, R. (2002), Best practice policies for male infertility. Fertil Steril, 77,

873.

Sies, H., Sharov,V.S., Klotz,L., Briviba, K.(1997), Glutathione peroxidase protects

against peroxynitrite-mediated oxidations: A new function for selenoproteins as

peroxynitrite reductase. Journal of Biological Chemistry, 272(44), 27812–27817.

Sikka, S.C., Rajasekaran, M., Hellstrom, W.J. (1995), Role of oxidative stress and

antioxidants in the male infertility. Jornal Of Andrology, 16, 464-468.

Sikka, C.S. (2004), Role of Oxidative stress and antioxidants in andrology and

assisted reproductive technology. Jornal Of Andrology, 25, 1.

Silva, P.F.N., Physiology of peroxidation processes in mammalian sperm. Erişim

Tarihi:(15.07.2018),http://igitur-archive.library.uu.nl/dissertations/2006-0710-

200029/full.pdf. 2006,Utrecht University.

Smith, R., Vantman, D., Ponce, J., Escobar, J., Lissi, E. (1996), Total antioxidant

capacity of human seminal plasma. Hum Reprod, 11, 1655-1660.

Sukcharoen, N., Keith, J.,Irvine, D.S.,Aitken, R.J. (1996), Prediction of the in vitro

fertilizasyon(IVF) potential of humanspermatozoa usıng sperm function tests: Teh

effect of the delay between testing and IVF. Hum Reprod, 11, 1030-1034.

Sunderman, W.F., Boerner, F.(1950), Normal Values in Clinical Medicine, In:

Seminal fluid. 1. Baskı. Philadelphia: WB Saunders Company, s:385.

Sroka, Z., Cisowski, W. ( 2003), Hydrogen peroxide scavenging, antioxidant and

anti-radicalactivity of some phenolic acids. Food and Chemical Toxicology, 41, 753-

758.

Şener G., Yeğen B. (2009), İskemi Reperfüzyon Hasarı. Klinik Gelişim Dergisi, 22,

5-11

78

Taşdemir, U., Tuncer, B.P., Büyükleblebici, S., Özgürtaş, T., Durmaz, E.,

Büyükleblebici, O. (2014), Effects of various antioxidants on cryopreserved bull

sperm quality. Kafkas Üniveristesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 20(2), 253-258.

Tavilani, H., Goodarzi, M.T.,Vaisi-raygani, A., Salimi, S., HassanzadehT.

(2008), Activity of antioxidant enzymes in seminal plasma and their relationship

with lipid peroxidation of spermatozoa. International Braz J Urol, 34 (4), 485-491.

Ugar M. (2016), Glutatyon Peroksidaz Aktivite Ölçümü İçin Yeni Bir

Spektrofotometrik Yöntem Geliştirilmesi, Yüksek Lisans Tezi, İstanbul Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, İstanbul, Danışman:Doç. Dr.

Mustafa Özyürek).

Ursini, F., Maiorino, M., Gregolin, C. (1985), The seleoenzyme phospholipid

hydroperoxide glutathione peroxidase. Biochimica et Biophysica Acta, 839, 62-70.

Ursini,F., Heim,S., Kiess M., Maiorino M. (1999), Dual function of the

selenoprotein PHGPx during sperm maturation. Science, 285(5432), 1393–1396.

Ursini, F., Maiorino, M. (2014), Glutathione Peroxidase, Reference Module in

Biomedical Sciences, Encyclopedia of Biological Chemistry, 399-404.

Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M.T., Mazur, M. (2007), Telser Free

radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. J Int

J Biochem Cell Biol, 39(1), 44-84.

Vignini, A., Nanetti, L., Buldreghini, E., Moroni, C., Ricciardo – Lamonica, G.,

Mantero, F., Boscaro, M., Mazzanti, L., Balercia G. (2006), The production of

peroxynitrite by human spermatozoa may affect sperm motility through the

formation of protein nitrotyrosine. Fertil Steril, 85(4), 947-53.

79

Wilkes, S., Chinn D.J., Murdoch A., Rubin G.(2009).Epidemiology and management

of infertility: a population-based study in UK primary care. Fam Pract, 26(4), 269-

247.

World Health Organization (WHO) (1993), WHO Manuel For Standarized

Investigation and Diagnosis Of The Infertile Couple, 7. Baskı, Cambridge:

Cambridge University Press.

World Health Organisation (WHO) (2002), Laboratuar El Kitabı. In: İnsan semen

ve sperm sevikal mukus etkileşimi değerlendirilmesi. Günalp S, (Eds.), Ankara: Tıp

Teknik Kitapevi.

World Health Organisation (WHO) (2010), WHO Laboratory Manual for the

Examination and Processing of Human Semen, 5. Baskı, Geneva: World Health

Organization.

Wu, T.P., Huang, B.M., Tsai, H.C., Lui, M.C., Liu, M.Y. (2004), Effects of nitric

oxide on human spermatozoa activity, fertilization and mouse embryonic

development. Arch Androl, 50, 173-9.

Zülfikaroğlu, G., Özgür H., Polat S. (2010), Kapasitasyonun Moleküler Temelleri.

Arşiv Kaynak Tarama Dergisi, 19(1), 12-21.

80

10.EKLER

EK 1. Gönüllü Olur Formu

BİRUNİ ÜNİVERSİTESİ

“ GİRİŞİMSEL OLMAYAN KLİNİK ARAŞTIRMALAR”

İÇİN BİLGİLENDİRİLMİŞ GÖNÜLLÜ OLUR FORMU

ARAŞTIRMA PROJESİNİN ADI: İn vitro antioksidan uygulamasının sperm

fonksiyonları üzerine etkisi

Sizi “İn vitro antioksidan uygulamasının sperm fonksiyonları üzerine etkisi”

başlıklı bir araştırmaya davet ediyoruz. Bu araştırmaya katılıp katılmama kararını

vermeden önce, araştırmanın neden ve nasıl yapıldığını bilmeniz gerekmektedir. Bu

nedenle bu nedenle bu formun okunup anlaşılması büyük önem taşımaktadır.

Aşağıdaki bilgileri dikkatlice okumak için zaman ayırınız. Eğer anlamadığınız ve

sizin için açık olmayan şeyler varsa, ya da daha fazla bilgi isterseniz bize sorunuz.

Bu anket çalışmasına katılmak tamamen gönüllülük esasına dayanmaktadır.

Çalışmaya katılmama hakkına sahipsiniz. Anketi yanıtlamanız, araştırmaya

katılım için onam verdiğiniz biçiminde yorumlanacaktır Size verilen anket

formlarındaki soruları yanıtlarken kimsenin baskısı veya telkini altında olmayın. Bu

formlardan elde edilecek bilgiler tamamen araştırma amacı ile kullanılacaktır.

Sorumlu Araştırmacı : Prof. Dr. Tülay İREZ

Yardımcı Araştırmacı : Bio. Dilara KONK

Çalışmanın Amacı nedir; bendan başka kaç kişi bu çalışmaya katılacak?

Sizi davet ettiğiniz çalışmanın amacı, antioksidan (vücudumuzda halihazırda

bulunduğu gibi beslenme ile de alabildiğimiz bir kimyasal maddedir.) olarak bilinen

glutatyonun, insan vücudu dışındaki koşullarda sperm hücrelerine pozitif ya da

negatif bir olup olmadığı incelenmektedir. Spermiyogram tahlili amacıyla vermiş

81

olduğunuz örnek değerlendirilip, çalışılıp ve sonuçlandırıldıktan sonra arda kalan

örnek tıbbi atığa atılıp imha edilecekken sizin izninizle örneğiniz araştırma için

kullanılacak ve sonrasında imha edilecektir. Örneğiniz değerlendirilme sonrası

kalan materyaliyle çalışılması planlandığı için sizin sağlık durumumunuz ve

spermiyogram analizinize herhangi bir negatif etkisi olmayacaktır. Çalışmanın

ortalama 2 ay sürmesini ve yaklaşık 40 kişinin katılması planlanmaktadır.

Bu çalışmaya katılmanın maliyeti nedir?

Bu çalışmaya katılmanız halinde hem araştırmacı hemde siz hiçbir maddi sorumluluk

altına girmeyeceksiniz.

Kişisel bilgilerim nasıl kullanılacak ?

Araştırma sorumlusu, kişisel bilgilerinizi, araştırmayı ve istatiksel analizleri

yürütmek için kullanılacaktır ancak kişisel bilgileriniz gizli tutulacaktır. Yanlızca

gereği halinde, sizinle ilgili bilgileri etik kurullar ya da resmi makamlar inceleyebilir.

Çalışma sonuçları çalışma bitiminde resmi yanlıca bu araştırmada olmak üzere tıbbi

literatürde yayınlabilcektir ancak kimliğiniz kesinlikle açıklanmayacaktır.

DAHA FAZLA BİLGİ İÇİN KİME BAŞVURABİLİRİM ?

Çalışma ile ilgili ek bir bilgiye ihtiyaç duyduğunuzda lütfen aşağıdaki kişi ile

iletişime geçiniz

ADI: Dilara KONK GÖREVİ : ARAŞTIRMA SORUMLUSU

TELEFON: 05374041816

Medical Park Bahçelievler Tüp Bebek Bölümü’nde Biyolog Dilara Konk tarafından

tıbbi bir araştırma yapılacağı belirtilerek bu araştırma ile ilgili yukarıdaki bilgiler

bana aktarıldı ve ilgili metni okudum. Bu bilgilerden sonra böyle bir araştırmaya

“katılımcı” olarak davet edildim.

Araştırmaya katılmam konusunda hiçbir zorlayıcı davranışla karşılaşmadım. Eğer

katılmayı reddersem, bu durumun tıbbi bakımıma ve hekim ile olan ilişkime

herhangi bir zarar getirmeyeceğinide biliyorum. Araştırmanın yürütülmesi sırasında

herhangi bir neden göstermeden araştırmadan çekilebilirim. ( Ancak araştırmacıları

zor durumda bırakmamak için araştırmadan çekileceğimi önceden bildirmemin

82

uygun olacağı bilincindeyim.) Ayrıca tıbbi durumuma herhangi bir zarar verilmemesi

koşuluyla araştırmacı tarafından araştırma dışı da tutulabilirim.

Araştırma için yapılacak harcamalarla ilgili herhangi bir parasal sorumluluk altına

girmiyorum. Bana da bir ödeme yapılmayacaktır.

Araştırmadan elde edilen benimle ilgili kişisel bilgilerin gizliliğinin korunacağını

biliyorum.

Araştırma uygulamasından kaynaklanan nedenlerle meydana gelebilecek herhangi

bir sağlık sorunumun ortaya çıkması halinde, her türlü tıbbi müdahalenin sağlanacağı

konusunda gerekli güvence verildi. ( Bu tıbbi müdahalelerle ilgili olarak da parasal

bir yük altına girmeyeceğim.)

Araştırma sırasında bir sorun ile karşılaştığımda ; Bio. Dilara KONK’ u

05374041816 nolu telefondan arayabileceğimi biliyorum.

Bana yapılan tüm açıklamaları ayrıntıyla anlamış bulunmaktayım. Bu koşullarla söz

konusu klinik araştırmaya kendi rızamla, hiçbir baskı ve zorlama olmaksızın

gönülülük içerisinde katılmayı kabul ediyorum.

KATILIMCI

ADI SOYADI:

TELEFON

İMZA:

83

Ek 2. Etik Kurul Onayı

84

85

11.ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı: Dilara Konk

Doğum Tarihi ve Yeri : 10.12.1992 / İstanbul

Mail Adresi: dilarakonk@gmail.com

Unvanı: Biyolog

Öğrenim Durumu: Lisans

Derece Okul Adı ve Bölümü Mezuniyet Yılı 2.92 Eskişehir Osmangazi Üniversitesi /

Biyoloji Bölümü 2014

Beşiktaş Etiler Lisesi / Sayısal 2010 50. Yıl Süheyla Artam İ.Ö.O 2006

86

87