gebleicht. VGllig erhalten zeigte sich die mittels Filter lichtgeschiitzte Probe Nr. 4 und die im Dunkel aufbe- wahrte Nr. 5 .

Nach insgesamt 105 Std. Bestrahlung zeigten sich die Proben 1, 2 und 3 sowie 6 (dem Tageslicht ausgesetzt) auderlich vollig weid und total vertalgt. Die Proben 4 und 5 waren noch farberhalten. Wahrend jedoch die im Dunkel verwahrte Probe Nr. 5 vollig frisch erschien, zeigte die filtergeschiitzte Probe Nr. 4 ganz leichten, tal- gigen Geruch.

Da das Filter von Probe 4 nur im Bereich 4000 bis 5000 A, bei einem Schwerpunkt um 4700 A absorbierte und zudem auf natiirliches Tageslicht abgestimmt war, konnte seine Schutzwirkung sehr befrisdigen, und zwar um so mehr, als es die zusatzlich im Violett liegende Emissionslinie 4375 A nicht vollstandig zu absorbieren vermochte. Dazu kommt, dai3 es das weiterhin stark emittierte griine und orange Licht der Leuchtstoff rijhren ungehemmt durchliei3.

Dad die Belichtung mit gelbem Licht nur geringe Wirkung auszuuben vermag, ist nicht nur aus vorstehen- den Versuchen ersichtlich, sondern ihrer Nichtabsorption durch die Fetteigenfarbe zu entnehmen. Rein gelbes Licht ist nur durch direkte Emission von Natriumlicht einerseits oder durch subtraktive Licht-Synthese mit Fil- tern - seien es auch Interferenzfilter, wie sie heute als Ersatz fur Monochromatoren iiblich sind - andererseits zu erzeugen. Die Bestrahlung mit streng gelbem Licht ware dann gleichzusetzen der Bestrahlung durch Schutz- filter-Licht. Wohl aber konnte dem griinen Licht-Anteil eine, wenn auch erst sekundar in Erscheinung tretende Bedeutung zukommen, falls in der Fetteigenfarbe Griin- absorbenten vorhanden sind. DaD dies zumindest teil- weise der Fall sein diirfte. hat bereits H . P. Kaufmann'4 bei der Untersuchung sogenannter .,erfrorener", griin- stichiger Talge ausgesprochen.

Die weitere Verfolgung der Lichteinwirkung auf die Proben ergab ein stetiges Weiterschrciten des Verder- hens. Einige, in den dunklen Schrank gebrachte, ange- bleichte Stucke blichen dort nach langerer Zeit (2 Mon.) erwartungsgemad vollstandig durch ( 1 8 mm tief von der jeweiligen Oberflache her), wahrend die Ursprungs- proben in demselben Schrank sich vollstandig frisch er- hielten und erst nach 4 Mon. die in der Praxis als ,,altes

"Fette u. Seifen 48, 594 [1941].

Premier jus" bezeichnete Beschaffenheit erlangten, wor- unter man den Verlust des frischen, warmen, nud- oder butterahnlichen, leicht tierischen Geruches und Ge- schmacks versteht.

Die Beobachtung, dad mit Fettcrtmes gefullte K o n - d i t o r e i w a r e n , manche G e b a c k e und a n d e r e L e b e n s m i t t e 1 in Schaukasten und Auslagen - auch wenn diese kiinstlich gekuhlt wurden - auffallend rasch verdarben, seifigen Geschmack (bei Kokosfett-Verwen- dung) aufwiesen und ahnliche Veranderungen erlitten, veranlagte zahlreiche gleichartige Versuche, wie sie vor- stehend angefuhrt wurden. Da jedoch die Kriterien dabei erst individuell auf einen einfachen Nenner gebracht werden mussen und sich nicht wie im vorliegenden Falle der carotinhaltigen Fette auf optische Indikation redu- zieren lassen, sind sie an dieser Stelle noch nicht be- schrieben worden.

Zusamrnenfassuiig Es wurde die Wirkung des sichtbaren Lihtes der modernen

Leuchtstoffrohren auf Premier jus untersucht und dabei ge- funden, dai3:

die anbleichende, vertalgende und Autoxydation indizie- rende Wirkung sehr stark ist, etwa der Belichtung durch sonniges Tageslicht der Sommermonate vergleichbar; Ursache dieser Wirkung das neben dem normalen, kon- tinuierlichen Spektrum emittierte violette Licht mit star- ker Linie bei 4375 A ist; diese Linie ausfilterbar ist; die Leuchtstoffrohren wegen dieser violett- und wegen der Hg-Anregung zwangslaufig auch im UV mit 2537A emittierten-Strahlung, trotz geringsten Wattverbrauches, ahnlich einer schwachen Hohensonne wirken, was sich u. a. auch aus dem Ozon-Geruch beim Einschalten der Lam- pen ergibt; die anzunehmende baktericide Wirkung durch Ozonisierung der Luft, bei carotin- und damit Vitamin A-haltigen Fet- ten durch die srhadliche, autoxydationsfordernde Wirkung der Violettstrahlung ubertroffen wird; die Wirkung auf Lebensmittel allgemcin verandernd ist, wenn diese infolge ihrer Eigenfarbe Absorbenten fur vio- lettes, grunes und gelbes Licht sind und Verbindungen ent- halten, die sich fiir Photoreaktionen eignen oder sich dam sensibilisieren lassen; die Eigenfarbe eines auf sichtbare Bestrahlung zu unter- suchenden Korpers maflgebend fur den absorbierbaren Lichtbereich ist und aus ihr bereits weitgehende Schliisse auf die zu erwartenden Effekte gezogen wcrden konnen.

Die chemische Bestimmung von Vitamin D in Lebensmitteln und pharmazeutischen Produkten*

Zlon Dr. W. W o d s a k

Am der ChemiJchela wid Lebensmittel-Untersuchungsanstalt dcs Hygaenischen Instituts der Stadt Hamburg

Uber chemische Bestimmungsmethoden fur D-Vitamine ist in den letzten 15 Jahren vie1 gearbeitet worden, doch ist man bei dem Bemuhen. einen Ersatz fiir die um- stan,dlichen und kostspieligen biologischen Methoden zu finden, nur langsam vorwarts gekommen. Im folgenden sol1 keine luckenlose Aufzahlung der neueren Unter- suchungen gegeben, sondern vielmehr iiber diese nur so- weit berichtet werden, wie eigene Erfahrungen dariiber vorliegen.

'$ Vortrag anla8lich der DGF-Vortragstagung 1952 in Dussel- dorf am 8. Oktober 1952, Fachgruppe V.

118

Die wesentlichen Schwierigkeiten der chemischen Be- stimmung der D-Vitamine liegen in der Schaffung eines gcnugend empfindlichen und reproduzierbaren Reagen- zes sowie in der Entfernung der storenden Sterine und anderer Begleitstoffe der D-Vitamine.

Die A n t i m o n t r i c h l o r i d - L o s u n g ist vielfach va- riiert worden. Die gebrauchlichste diirfte diejenige von C. H . NieEd, W . C . Russel und A. Zimmerli sein'. Sie hat jedoch den Nachteil, d d sie hochstens 3 Wochen haltbar ist und fur jede neu hergestellte Charge eine neue Eichkurvc aufgestellt -~

J. biol. Chemistry 136, 73 [1940].

FETTE UND SEIFEN 55.Jahrg. Nr.2 1953

werden mui3. Das Chloroform ist in besonderer Reinheit zu verwenden und nur 24 Std. haltbar. Die Reaktion der D-Vita- mine mit SbC1, verlauft bekanntlich vie1 langsamer als mit Vitamin A. Die Losung wird deshalb leicht triibe. Um das zu verhindern, empfahl als erster A. FujiLa2 einen Zusatz von Essigsaureanhydrid. C. H . Nield, W. C. Russel und A. Zim- merli erreichten dies durch Zugabe von Acetylchlorid. Durch diese Zusatze werden aber nicht nur die Reaktionsgeschwin- digkeiten, sondern auch die Extinktionskoeffizienten ganz wesentlich erhoht. Bei einer reinen Vitamin D-Losung wird nach Zusatz von 2 Tropfen Essigsaureanhydrid bei 25O C das Maximum der Extinktion nach 1.5 Min. erreicht. Nach Fr. H o k 3 betragt E ;:i fur SbCl, allein etwa 630, fur SbC1, unter Zusatz von 2 Tropfen Essigsaureanhydrid etwa 1160, fur SbCI, und Acetylchlorid nach eigenen Versuchen 1650 ( n a h 1. Green 1820). Die von B. de Witt und M . X . Sulli- van empfohlene Verwendung von Wthylenchlorid als Lo- sungsmittel fur SbCl, schien uns eher nachteilig, da sie oft zu Verfarbungen fuhrt, die von schwer entfernbaren Verun- ieinigungen des Athylenchlorids herruhrten.

W. Diemair und G. Manderscheid 5 und G. Mandeischeid li

benutzten eine SbC1,-Guajacol-Losung und erwarmten nach Zusatz dieses Reagenzes 10 Min. im Wasserbad auf 60°C. Wir versuchten, diese Methode, die als besonders spezifisch empfohlen wird, fur die Bestimmung der D-Vitamine in be- strahlten Hefen, in bestrahlter Milch und in Lebertran anzu- wenden. Die Reaktion ist jedoch nicht sehr empfindlich; erst mit S o y Vitamin D ist eine sichere Messung im Pzdfrich- Photometer moglich. E :i wurde von uns rnit 180 bestimmt, von den Autoren mit 190. Wir stellten mit reinem Vitamin D, eine Eichkurve auf, die aber nur in einem relativ kurzen Bereich von etwa 50 bis lOOy eine Gerade darstellte.

Fur die R e i n i g u n g d e s V i t a m i n D und die A b - t r e n n u n g s t o r e n d e r B e g l e i t s t o f f e bei der Be- stimmung in Tranen, bestrahlter Milch und dgl. geben W. Diemair und G . Manderscheid ein chromatographisches Ver- fahren mit Aluminiumoxyd (stand. n. Br.) an, iiber dessen Aktivitatsgrad keine naheren Angaben vorliegen. Das Vita- min D wird in Losung in Petrolather auf die Saule gegeben und rnit Petrolather nachgewaschen. wobei nur Begleitstoffe entfernt werden sollen. Es zeigte sich jedoch, dai3 das Vita- min D bei schwach aktiviertem Aluminiumoxyd schon mit den ersten Anteilen des Petrolathers eluiert wurde. Bei starker aktiviertem Aluminiumoxyd wurden merkliche Mengen des Vitamin D zerstort, auch wenn die Losung mit Stickstoff herausgedriidd wurde. Die Vitamin D-Bestimmung in he- strahlten Hefen und Tranen ergab auch nach dieser chromato- graphischen Reinigung immer noch nicht die grune Farbe des reinen Vitamin D, sondern eine mehr rotlich-violette Farbung. In den Minuten bis zur Erreichung des Maximums der Extink- tion fie1 aui3erdem besonders bei der Analyse von Tranen oder bestrahlter Milch eine Veranderung der Farbtonung der mit dem Reagens versetzten Testlosung auf, die eine Ablesung eischwerte. Wahrscheinlich geht in dieser kurzen Zeit bereits eine Reaktion mit einem bei der Chromatographie nicht ent- fernten Hemmstoff vor sich, die die Entwicklung der Farbe der Vitamin D-Reaktion, besonders die der Vitamin D3- Reaktion iiberdeckt. Die Herstellung des richtig aktivierf en Aluminiumoxyds 1st daher fur diese Methode von aui3erster Wichtigkeit.

Die Abtrennung der die Vitamin D-Bestimmung storenden Begleitstoffe ist schwierig, jedoch notwendig, da die bei der Bestrahlung von Ergosterin oder 7-Dehydrocholesterin neben den D-Vitaminen entstehenden Stsrine die Bestimmung des Vitamin D stark storen. Extrakte aus bestrahlter Hefe z. B. geben mit SbC1, in Chloroform eine rotliche Farbung statt

* J. biol. Chemistry 146, 1 [1942].

4 Ind. Engng. Chem., Anal. Ed. 18, 117 [1946]. Private Mitteilung.

Z . analyt. Chem. 129, 154, 2.54 [1949]. Sudd. Molkereiztg. 70, 1416 [1949].

des gelbbraunen Farbtones von reinem Vitamin D,. Vor allem aber erhalt man ohne ausreichende Reinigung kein Maximum der Extinktion. Diese nimmt vielmehr standig zu und andert dabei den Farbton nach violett, bis eine Trubung der Losung ein weiteres Ablesen unmoglich macht. Bei reinen Vitamin D-Losungen wird das Maximum der Extinktion bei 25oC in 5.5 Min. erreicht, ohne dai3 eine Verschiebung der Farbung beobachtet wird.

Von den bis jetzt bekannt gewordenen Reagentien fur die Bestimmung der D-Vitamine griindet sich keines auf Umsetzungen nach exakt stochiometrischen Verhaltnis- sen. /. Green’ berichtete wohl als erster uber Versuche, die D-Vitamine mit J o d t r i c h 1 o r i d zu titrieren. Das Molekiil der D-Vitamine enthalt e in System von drei konjugierten Doppelbindungen im Sterinkern; das Vita- min D2 besitzt aui3erdem eine Doppelbindung in der Seitenkette, die aber nur in Ausnahmefallen reagiert. W e n n die Reaktion rnit JCl, quantitativ u n d stijchiome- tiisch verlauft, mui3 die Reaktionsgleichung lauten:

’D3’ + 2 JCI, -+ ’DYCI, + 52

Die Reaktion besteht also in einer Addition von Chlor- Ionen an die konjugierten Doppelbindungen des Vita- min D , wobei Jod frei wird. Die Menge des abgespal- tenen Jods wird durch Messung der optischen Dichte der Losung bei 5 1 8 m p bestimmt. Dann wird weitere JCl,- Liisung zugesetzt u n d die Messung der optischen Dichte wiederholt. Die Ti t ra t ion ist beendet, wenn man fest- gestellt hat , mit welcher Menge von JC1,-Losung die Jod- Abspaltung am starksten ist. Bei einem Oberschui3 an Reagens wird die Losung wieder unter Bildung von JCl entfarbt. Die Ti t ra t ion ist nur in unpolaren Losungs- mitteln, z. B. in Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, miiglich. In starker polaren Lijsungsmitteln, e twa in Aceton, entsteht keine Farbung.

Der Vorteil dieser Methode liegt in der Genauigkeit und der guten Reproduzierbarkeit der ermittelten Wertc. Ein Nachteil besteht allerdings in der geringen Spezi- fitat. Ergosterin, 7-Dehydrocholesterin, Lumisterin, Ta- chysterin und die Suprasterine vermogen die Vitamin D-Bestimmung zu storen. Auch Vitamin A und Carotin rcagieren positiv. Cholesterin und Sitosterin reagieren dagegen nicht. Demnach konnen also durch diese Reak- tion Ergosterin u n d Cholesterin unterschieden werden.

Bei Anwendung der JCl3-Titration ist die geringe Spe- zifitat hinderlich, obwohl es gelang, die LGsung chroma- tographisch weitgehend zu reinigen, wie weiter unten noch ausgefuhrt wird. Ein anderer, sehr stark empfun- dener Nachteil liegt in der Schwierigkeit der Reinigung des Reagenzes. Mehrfaches Umkristallisieren des JCl, ist erforderlich, um ein annahernd reines Produkt zu erhalten. Ferner mu13 das Chloroform eine solche Rein- heit besitzen, wie sie nur sehr schwicrig zu erreichen ist. Die fertige Reagens-Losung wurde zuweilen ohne er- kennbare Ursache von einem Tag auf den anderen un- br-auchbar. Ferner stellt diese Reaktion an die analytische Geschicklichkeit besonders hohe Anforderungen u n d ver- langt gute Einarbeitung. Von Sonderfallen abgesehen, schien die JC1,-Titration keine besonderen Vorteile ge- geniiber der kolorimetrischen Bestimmung rnit SbCl, zu bieten.

Sehr aussichtsreich erscheinen Versuche, d ie wir z. Z. entsprechend den Angaben von J . Tiews durchfuhren.

? Biochem J . 49, 36, 45 [1951]. Diss. Kiel 1952.

FETTE UND SEIFEN 55.Jahrg. Nr.2 1953 119

/. 7iews hat die Umsetzungen der elektrophilen Metall- halogenide mit den A- und D-Vitaminen eingehend un- tersucht und dabei festgestellt, dai3 nicht das SbCl,, son- dern das darin stets als geringe Verunreinigung vor- handene SbC1, rnit diesen Vitaminen reagiert. 1. Briig- gemann, W. Krauss und J. Tiews schlugen daraufhin das SbC1, zum Nachweis der D-Vitamine vor. Bei den bis- herigen SbCl,-Losungen erfolgt stets eine sehr starke Verdiinnung der Testlosung, von der nur 0.25ml rnit 3 ml Reagenslosung versetzt werden. Bei der Verwen- dung von SbCl,-Losung kommen zu 4 ml der Losung des D-Vitamins in Chloroform nur 0.02 ml Reagens. Die Empfindlichkeit der Reaktion wird also um ein Viel- faches gesteigert. Da SbC1, sehr zersetzlich und schlecht z1.1 handhahen ist, wird es durch Oxydation von SbCl, in Salzsaure-Losang hergestellt. Die Autoren geben dafiir folgende Vorschrift an:

In 50ml rauchendcr Salzsaure (Dichte 1.19) werden nach- einander kleine Mengen von handelsublichem, kristallisiertem, uber Schwefelsaure getrocknctem SbC1, gegeben, und zwar so lange, bis die Dichte der Liisung den Wert 1.35 bis 1.36 erreicht hat, was durch Dichtcmessungen laufend kontrolliert wird. Im ganzen werden etwa l3g SbC1, benotigt. Zu dieser 1,iisung werden 2 g Kaliumdithromat (p. a.) hinzugesetzt. Die rotbraune Farbe schlagt sofort in griin urn. Hierhei konnen maximal etwa 6 g SbC1, entstehen. Dieses Reagens wird zwedcmifiig in kleinen hraunen Schliffflaschen im Dunkeln aufbewahrt.

Die Reaktion erfolgt also in einem dipbasismen Sy- stem, doch treten dabei keine Schwieriykeiten auf. Fol- gende Untersuchungsvorschrift wird angegeben :

4 ml Testlosung werden mit 0.02 ml ShC1,-Losung versetzt und vorsichtig mit 0.5 ml frisch destilliertem Acetylchlorid uberschichtet. Durch langsames Schwenken Iafit sich die an der Grenzflache zwischen Chloroform und Acetylchlorid entwickelte gelb-braune Farbc innerhalb von 30 Sek. uber das ganze Reaktionsgemisch verteilen. Es mufi vermieden werden, die Reaktionslosung zu kraftig zu schutteln, da sonst leicht Emul- sionen auftreten konnen. In 30 Sek. ist die maximale Farbung erreicht; das Reaktionsgemisch wird vorsihtig in die Me% kuvette des Photometers dekantiert und die Extinktion nach weiteren 30 Sek. im Photometer mit Filter S 50 in geeigneter Schichtdicke gemessen. Die angegebenen Zeiten zahlen von dem Augenblick des Schuttelbeginns.

Die Reaktion hat den weiteren Vorteil, dai3 ,die Be- standigkeit der Extinktionen gegeniiber der Verwendung von SbC13 erheblich gesteigert ist.

Die Tatsache, dai3 SlbCla m8it Vitamin D, und D, we- sentlich langsamer reagiert als mit Vitamin A: wurde von J . Tiews noch zu einer Trennung des Vitamin A von den D-Vitaminen benutzt, die recht gute Ergebnisse liefert. 7 iews schlagt folgendes Verfahren vor:

100 Teile eines inaktiven Trigers, z. B. Talkum, werden mit 20 Teilen gesattigter ShCI,-Losung in Chloroform ohne Zusatz von Acetylchlorid oder Essigsaureanhydrid benetzt. Die Substanz wird 20 Min. hei 100°C getrocknet, zerrieben und sofort zur Adsorption verwandt, da sie nur 2 bis 3 Std. halthar ist.

aus den unverseifbaren Anteilen von Lebertran, wird das Vitamin A gut absorbiert; es bildet im obersten Teil der Saule einen intensiv blauen Ring. In den ersten 30ml des zum Eluieren verwendeten Chloroforms findet man das D-Vitamin und Teile von eluiertem SbCI,. Fur die Chromatographie des Unverseifbaren von 5 g Lebertran genugt nach eigenen Versuchen eine Saule von 8cm

Aus Gemischen von A- und D-Vitaminen, z. B.

Z. analyt. Chem. 135, 241 j19521

180

Lange bei einem Durchmesser des Rohres von 12mm. Das aus dem Chromatogramm herausgeloste SbCI, wird durch eine Saule yon Kartoffelstarke zuriickgehalten. Zwedrmafiig chromatographiert man durch eine zusam- mengesetzte Saule, bei der .die Starke die untere Schicht bildet. Besonderen Wert ist auf die volle Wasserfreiheit der verwenjdeten Starke zu legen. Dann werden durch die Starke auch SbC1,- bzw. SbC1,-Vitamin D-Komplexe quantitativ in ihre Ausgangsverbindungen gespalten. Leider wird durch dieses Chromatogramm nur das Vita- min A entfernt; d'ie Sterine bleiben noch in Losung. Bei Versuchen, nach dieser Reinigung sofort eine Vitamin D3-Bestimmung in Lebertran durchzufuhren, ohne die noch vorhandenen Sterine zu beriicksichtigen, wurden in zwei Lebertranen, bei 'denen im Tierversuch 110 und 165 i. E. Vita,m,in D gefunden wurden, 310 und 350 i. E./g gefunden. Die Abtrennung der Sterine tierischer Fette von den D-Vitaminen scheint ein noch schwierige- res Problem zu sein a b die Abtrennung bei kstrahlten Hefen.

G. Pirlot und E. Rouir ' 0 verwendeten als Erganzung zur Digitonin-Fallung Maleinsaure- oder Citraconsaure- anhydrid, die nach Art der Dim-Synthese nach Diels vor allem mit Tachysterin reagieren und damit eine in Chloroform unlosliche Verbindung geben, wahrend die D-Vitamine nicht reagieren. Diese Reaktion Iiefert: wo- von man sich im Modellversuch iiberzeugen kann, recht gute Ergebnisse, wenn es sich um die Entfernung von Tachysterin handelt; sie bat uns als Erganzung zur chromatographischen Vorbereitung fur die Vitamin D- Bestimmung gute Dienste geleistet.

Sehr eingehend und fruchtbar hat sich J . Green' mit diesem Problem beschaftigt. Er stellte fest, dai3 sich Ergosterin, 7-Dehydrocholesterin und die D-Vitamine in ihrer Loslichkeit in 72 V01.~/a Athanol wesentlich von- einander unterscheiden, wie folgende Zusammenstellung zeigt :

Loslidilceit von Sterinan in i20Iuigem Atliaiiol

Vitamin D, 80 mg in 1OOml Vitamin D2 100 ., ,) l o o : , Ergosterin 6 . 5 . , ., I O O . , 7-Dehydrocholesterin 2.0 ,, ?, 100 ,, Cholesterin 80 ,, ,, 100 ,, Lumisterin 100 ,, :, 100 1,

100 $, ,, l o o . , Tachysterin

Eine Ausnutzung dieser verschiedenen Loslichkeiten eignet sich gut zur Entfernung von Ergosterin und 7-De- hydrocholesterin. Cholesterin laBt sich auf diese Weise also nicht albtrennen, ebenso nicht die A-Vitamine, da sie in 7Z0/aigem Alkohol zu lijslich sind, und nur unvoll- kommen das Carotin.

Die weitere Reinigung mit Hilfe des Sterinfallungs- mittels Digitonin wird in der Losung in 72OIoigem Alko- hol vorgenommen. Hierbei wird nun auch Cholesterin, aber immer noch nicht Tachysterin, entfernt. Nach Ah- zentrifugieren des Niederschlags werden aus der Losung die D-Vitamine durch Tetrachlorkohlenstoff ausgeschiit- telt. Hierbei wird das Vitamin D mehr geschont, als wenn man die Losung im Vakuum zur Trockne bringt urid dann den Riickstand mit Tetrachlorkohlenstoff ex- trahiert.

Zur Entfernung des Tachysterins und etwaiger wei- terer, bisher nicht entfernter Verunreinigungen wird von

' 0 Bull. Soc. chim. Belges 56, 296 [1947].

FETTE U N D S E I F E N 55. Jahrg. Nr.2 1953

/. Greea noch eine Chromatographie mit Floridinerde vorgeschlagen. Die Floridinerde wird wie folgt durch Kochen mit Salzsaure vorbehandelt und alitiviert:

100g Floridinerde werden mit 260g konz. Salzsiiure und 40g Wasser aufgeschwemmt. Die Mischung wird SOMin. am RiickfluBkiihler gekocht, nach dem Abkiihlen wiederholt de- kantiert und auf einer Filternutsche an der Saugpumpe gc- waschen, bis die Salzsaure quantitativ entfernt ist. Die Flori- dinerde wird dann bei 40°C in diinnen Schirhten unter hau- figem Umriihren getrocknet. Die so vorhereitete Floridinerde ist unbegrenzt haltbar.

Die Aktivierang entstcht dadurch, dafl einmal #die Kar- bonate und andere liisliche Verbindungen entfernt wer- den und zum anderen die Olberflachenstruktur der Erde verandert wird. Zu langes Kochen mit Salzsaure kann zu einer Oberaktivierung der Erde fuhren, wahrschein- lich dadurch; dafi ihre Oberflache zu sehr verandert wird. Auf einer iiberaktivierten Erde werden 20 bils 40°/o des D-Vitamin wahrend der Adsorption zerstort. Dabei ist das Vitamin D:; noch empfindlichcr als Idas Vitamin D,. Eine Oberaktivierung der Floridinerde i'st nicht rever- sibel. Es ist deshalb unbedingt erforderlich, dies'e nach der Aktivierung auf ihre Wirkung gegenuber Vit'aniiri D unld auf ihre Trennfahigkeit im Modellversuch zu iiber- priifen. Vitamin D darf nicht durch Petrolather, mui3 jedoch quantitativ durch I00 ml Tetrachlorkohlenstoff eluierbar sein. Saulen von 8 cm Lange un.d 12 mm Durch- messer vermogen nach Vorwaschen mit YVioigem Atha- no1 und mehrercn Anteilen von Petrolather his zu 50 mg D-Vitamine zu adsorbieren.

Die Chromatographie mit dieser Floridinerde hat clen erheblichen Vorteil, dafi man damit aufier Tachysterin und anderen storenden Substanzen in einem Arbeits- gang auch das Vitamin A abtrennen kann. Floridin adsorbiert aus einer Losung in Petrolsther quantitativ Vitamin A, Tachysterin und, soweit sie noch vorhanden sind, andere Sterine und Vitamin D. Vitamin ,4 w:ird in der obersten Schicht der Saule als dunkelblaue Zone festgehalten und dabei quantitativ zerstiirt, vorausgesetzt, dafi die Menge des Vitamin A nicht zu grofi und die Saule aktiv genug ist. Die Zersetzungsprodukte, unter denen auch Anhydro-Vitamin A festgestellt wurde, wer- den zusammen mit anderen Verunreinigungen mit Petrol- ather ausgewaschen. Mit 50 ml einer Miachung von 3'10 Xthanol in Ather oder mit 100 ml Tetrachlorkohlenstoft' werden 'die D-Vitamine quantitativ eluiert. Nach /. Greeii werden nur 15 % des vorhandenen Tachysterins vom Tetrachlorkohlenstoff eluiert. Diese Trennfahigkeit cler Saule ist allerdings in hohem Mafie von einem bestim.m- ten Wassergehalt un'd einer bestimmten KorngroBe des Floridins abhiingig. Die Begrenzung der Aktivierung wurde bereits erwahnt. Die Losung darf 'die Saule nicht zu langsam passieren - snnst besteht Gefahr, dafi auch Vitamin D zerstort wird - und nicht zu schnell, sonst wird nicht alles Tachysterin adsorbiert. In etwa 1 'Std. sollen bei einer Saule von 8 cm Lange und 12 mm Durch- messer Adsorption und Elution beenmdet sein. In Vor- versuchen an Vitamin D-Losungen bekannten Gehalts ist genav zu priifen, ob die Alctivierung des Floridins den richtigen Grad erreicht hat. Nach diesem, von uns nur unwesentlich abgeanderten Trennverfahren nach /. Green konnten bei der Vitamin D-Bestimmung in Hefe sehr brauchbare Erfolge erzielt werden. Die folgende Tab. gibt eine Zusammenstellung der Vitamin D-Bestimmun- gen in bestrahlten Hefen nach biologischer und chemi- scher Metho'de.

FETTE U N D S E I F E N 55. Jahrg. Nr.2 1953

biologisch chemisch

Trockene Backereihefe, bestrahlt i 500 8 900 i.E./g Trockene Backereihefe.

Holzzuckerheie bestrahlt. Probe I 3400 5200 angeblich doppelt bestrahlt 12 200 35.500 ,,

,, I ., 11 9000 4300 ,, ., , > I 111 3200 4900 .,

Bei bestrahlten Holzzuckerhefen, die ohnehin im Vita- min D-Gehalt niedriger liegen als die bestrahlten Backe- reihefen, ist die Differenz der chemischen und biologi- schen Bestimmung griifler als bei den anderen Hefen. Bei diesen ist die Differenz niemals groi3er gewesen als 3 O 0 / o , die man ohnehin als iibliche Fehlerbreite fur bio- logische Bestimrnungen betrachten niufl. Es mui3 ange- nommen werden, dafi in der Holznuckerhefe Verbindun- gen enthalten sind, die mit SbC1, zu reagieren vermogen. Doch ist anzunehmen, dafi diese chemische Vitamin D- Bestimmung trotzdem auch gut bei Holzzuckerhefen bi auchbar ist.

Wesentlich ungiinstigere Erfahrungen konnten wir bei Anwendung dieser Trennmethode bei der Vitamin D-Be- stimmung in Lebertran, in bestrahlter Milch und in Be- strahlungsprodukten von 7-Dehydrocholesterin machen. Da festgestellt werden konnte, dai3 Vitamin D3 dazu ncigt, an Floridinerde eher zerstort zu werden als Vita- min DP, sollte man annehlncn, dai3 in den genannten Piodukten stets zu, wenig Vitamin D3 gefunden wiirde. Das Gegenteil war aber der Fall. Es wurden oft 50 bis 7 . i 0 i 0 mehr Vitamin D, gefunden als den biologisch er- mittelten Werten entsprach. Es mui3 deshalb angenom- men werden, dafi bei dieser Chromatographie auch noch Substanzen durchgeschlupft sind, die die Vitamin D- Reaktion mit SbCl, gelben. Das konnte auch daran fest- gcstellt werden. dai3 diese Liisungen mit SbCls nicht die grlb-braune Farbe des reinen Vitamin D,, sondern eine mehr rotliche Farbung ergaben. Wenn wir vor der Chro- matographie noch eine weitere Reinigung mit Citracon- saureanhydrid vornahmen, so konnte das Ergebnis zwar vcrbessert werden, es lag jedoch immer noch ungiinstiger als bei den D2-Bestimmungen in bestrahlter Hefe. Des- halb haben wir diese Methode einstweilen nur fur Vita- min D-Bestimmungen in bestrahlter Hefe oder in be- sti ahlter Ergosterin-Losung benutzt.

/. Green empfiehlt iibrigens, die chromatographische Reinigung werst vorzunehmen, unld erst damn die Rei- nigung durch Verdiinnen des Alkohols und die Digitonin- E'allung anzuschliefien. Durch die vorhergehenden chemi- schen Behandlungen sol1 das D-Vitamin gegenuber den Angriffen durch die Floridinerde empfindlicher gewor- den sein. Diese Beolbachtung konnten wir nicht machen und halten deshalb die hier angegebene Reihenfolge fur 7weckmafliger.

Bei der Vitainin D-Bestimmung in Tabletten, die vor- wiegend Mineralstoffe, insbesondere Calciumsalze, ent- hielten, traten keine Schwierigkeiten auf. Allerdings wurdfe in vielen Fallen festgestellt, dafi das Vitamin D bei ungiinstiger Zusammenstellung der Tabletten wah- rcnd der Lagerung z.T. zerstort wurde. Vitamin D-Be- stimmungen in Praparaten, die noch andere Vitamine, Keimole, Aminosauren oder dgl. enthielten, gaben im allgemeinen zufriedenstellende Ergebnisse. Bei Gegen- wart von Lecithinen wurde bei der chemischen Bestim- mung meistens erheblich zu wenig Vitamin D gefunden. Dieses wird von Lecithinen sehr energisch festgehalten,

121

wie der Vergleich rnit biologischen Bestimmungen zeigte. Erhebliche Diff erenzen wurden auch bei der chemischen und biologischen Bestimmung von Vitamin D in Eiwei5- Verbindungen, insbesondere in Milcheiweii3, gefunden. Ob das Vitamin D mit den Eiwei5-Verbindungen bzw. mit bestimmten Peptidgruppen Verbindungen eingeht, die es der chemischen Bestimmung entziehen, oder ob das D-Vitamin durch die Bindung an Eiweii3 eine Wirkungs- steigerung erfahren hat, von der auch Scheer und an,dere Forscher wiederholt berichten, soll hier dahingestellt bleiben. 1. Green berichtet umgekehrt, da5 von ihm ein wirkliches Ansteigen des Vitamin D-Gehaltes von frisch bestrahlten und 14 Tage gelagerten Ergosterin-Losungen und vielen anderen Vitamin-Produkten festgestellt wurde. Er hat die Bestimmungen nur chemisch durchgefiihrt; die Zunahme betragt etwa 20 Oh. Nach seiner Meinung ist sie auf die langsame, spontan verlaufende Bildung von Vita- min D, aus einer Vorstufe des D,, wahrscheinlich dem von L. Velluz und G. Amiard" und von L. Velluz, G. Amiard unfd A. Petit " beschriebenen und isolierten Prae- calciferol zuriickzufuhren. Die Umwandlung geht, wie vun diesen Autoren gezeigt wird, auch in der Dunkelheit vor sich.

Am Beispiel einer ibestrahlten Hefe soll die von uns verwendete Methode im folgendcn kurz skizziert wer-

** C. R. Seances Acad. Sci. 228, 692 [1949]. lz Bull. SOC. chim. France 16, 501 [1949].

den; fur Trane, bestrahlte Milch und dgl. ist die Methode nicht zu benutzen.

2 g Hefe werden fein gemahlen und am Rudcflulkuhler auf dem Wasserbad 20 Min. mit 20 ml 96°/oigem Athanol gekocht, abzentrifugiert und nochmals mit 10 ml Athanol extrahiert. Die alkoholischen Losungen werden im Vakuum zur Trockne gebracht, der Ruckstand mit genau 20 ml Alkohol (96"/0) auf- genommen, in ein Zentrifugenglas iiberspiilt und 6.6 ml Was- ser zugesetzt. Nach 5 Min. wird ein entstandener Niederschlag abzentrifugiert und mit einigen ml Athanol (74 " /u) nachge- waschen. Zu der klaren Losung werden 100 mg Digitonin in 5 ml 72"/oigem Alkohol gelost gegeben. Nach 1 Std. wird der Niedei schlag durch Zentrifugieren entfernt, die klare Losung im Vakuum zur Trockne gebrarht, der Riidcstand nach sorgfal- tigem Trodmen iiber P,O, in 20 bis 30 ml Petrolather gelost, auf 5 bis 10 ml eingeengt und chromatographiert. Die Saule besteht aus einem unten verengten und mit Glaswolle ver- schlosseiien 12 bis 13 inm weiten und 1.50 mm langen Rohr. Die nach obiger Vorschrift vorbereitete Floridinerde wird 7 bis 8 cm hoch eingefiillt, einmal mit 20 in1 96"ioigem Athanol und 5 ma1 mit j e 6 ml niedrigsiedendem Petrolsther ge- waschen. Darauf wird die Testlosung auf die Saule gegeben, nach Eindringen mit 25 ml Petrolather nachgewaschen und nach Wechsel der Vorlage das D-Vitamin mit 100 ml Tetra- chlorkohlenstoff eluiert. Die Durchlaufgeschwindigkeit ist so einzustellen, dai3 die ganze Chromatographie einschl. dem Elu- ieren in etwa 1 Std. beendet ist. Der Tetrachlorkohlenstoff wird im Vakuum zur Trockne gebracht, der Ruckstand rnit ChIoroform aufgengmmen und im Mei3kolbchen auf 10 ml auf- gefullt. Die Messung wird nach J . TiewA vorgenommen.

uber den Fettreif der Schokolade I1 Von Prof. Dr. M. S a c h s s e , Miinster (Westf.) und J . K o s e ~ z s t e i n , Aachen

Arts detn Chemischeia Landes-lintersirr~aungsnmt Nol-drhein- WestJalen iind dem Laboratorium del- Firma Leonard Monheim, rriimp f-Shokolaclen frcbl-ik

Es wurde bereits darauf hingewiesen', da5 dsie schnel- len Bestimmungsmethoden des Temperiergrades, die fur das Fabriklaboratorium bis jetzt als genaueste Methoden bekanntgeworden sind, in der Aufnahme einer Abkuh- lungskurve bestehen. Die Verfahren unterscheiden sich, wie bereits erwahnt wurde, durch die angewandte Menge, deren Temperatur gemessen wird, und durch die Temperatur des Kuhlbades. Die Bestimmung soll natiir- lich wenig Zeit in Anspruch nehmen; trotzdem mui3 die Abkiihlung in der ganzen Masse ziemlich gleichmai3ig verlaufen, wenn vergleichbare und auswertbare Ergeb- nisse erzielt werden sollen. N . R. Easton und Mitarbb. suchten dieses Ziel dadurch zu erreichen, dai3 sie die Abkuhlung in einem Kaltebad sehr tiefer Temperatur vornahmen. Die Probe der zu priifenden Schokolade befindet sich bei diesem Test in einem Luftbad, um eine gleichmafligere Ableitung der Warme zu erzielen. S. V . 'loeck legt bei seinen Messangen an Kakaobutter beson- deren Wert auf genaue Erfassung der Durchschnittstem- peratur der Probe. Auch er hangt die Probe in ein Luftbad, erreicht aber den schnellen Ablauf der Erstar- rung durch eine sehr kleine Menge der Probe und sichert dadurch gleichzeitig die Erfassung der Durchschnittstem- peratur. Wie bereits gesagt, hat S. U . Uaeck nur mit Kakaobutter gearbeitet, fur Schokolade ist sein Apparat zu klein. Dai3 N . R. Easton und Mitarbb. die wirkliche Durchschnittstemperatur erfassen, ist zu bezweifeln; hierdurch 1aBt sich vielleicht erklaren, dai3 die von ihnen

M . Sachsse u. J . Rosenstein, Fette u. Seifen 55, 26 [1953].

ermittelten Abkiihlungskurven nach dem Temperier- grad verschiedene Gestalt zeigen, aber doch nicht so sehr voneinander abweichen, dai3 auch geringfiigige Unter-

Abb. I . Apparatur zur Bestim- mung der Abkuhlungskurven

schiede in der Temperie- rung erkennbar werden.

In eigenen Versuchen wurde aus den angefuhrten Griinden eine mittelgroi3e Probe in einem Luftbad be- quem einzuhaltender, mitt- lerer Temperatur abge- kiihlt. Wie die im folgen- den mitgeteilten Ergeb- nisse zeigen, wurde dami t sowohl eine hinreichend ge- naue Erfassung der Durch- schnittstemperatur als auch eine ausreichend schnelle Auskiihlung der Probe er- zielt. Die Messungen waren deshalb genauer und prak- tisch ebenso schnell aus- fiihrbar wie die nach den bisher bekannten Methoden.

Die bei den Messungen verwendete Apparatur ist aus Abb. 1 zu ersehen.

Die zu untersuchende Schokolade wird in die Aluminium- hiilse B so eingefiillt, dai3 durch die Warme der haltenden

FETTE UND SEIFEN 55. Jahrg. Nr.2 1953 122