Dicrosmo CircularYraima CordeiroDepartamentos de Frmacos Faculdade de Farmcia UFRJ

Yraima Cordeiro

DICROSMO CIRCULAR DE PROTENAS

Yraima Cordeiro Dicrosmo Circular a medida da absorbncia diferencial entre as duas rotaes de luz circularmente polarizada por uma molcula assimtrica.

Dicrosmo Circular de Protenas

Elliptical polarized light (purple) is composed of unequal contributions of right (blue) and left (red) circular polarized light. Eric Y. Hayden

CD gera luz elipticamente polarizada

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= eixo menor(b)/eixo maior (a)

ER e EL, magnitudes dos vetores eltricos da luz circularizada para a direita e para a esquerda, respectivamente; Quando ER = EL, 0 luz linearmente polarizada; luz circularmente polarizada. Quando ER ou EL = 0, 45

O efeito de CD geralmente pequeno, ento a tan pequena e pode ser aproximada de Dessa forma a elipcicidade diretamente proporcional ao CD. em radianos.

Luz linearmente x circularmente polarizada

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Circular

Linear

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Um pouco de espectroscopia aplicada a sistemas biolgicosDeterminao de Concentrao de Protenas

1) Bradford (1976) Comassie blue 2) Lowry (1951) Cu2+ Ensaios colorimtricos

3) Coeficiente de Extino Molar @ 6,0 M GdmHCl/H2O - Pace et al, 1995, Protein Science, 4, 2411

(280, gua, M-1 cm-1) = (#Trp)(5.500) + (#Tyr)(1.490) + (#Cistina)(125)- Gill & von Hippel, 1989, Anal. Biochem., 1812, 319 - Edelhoch, 1967, Biochemistry 6, 1948.

A = .c.l

Expresso do CDDiferena de absorbncia dos dois componentes (lcp e rcp).

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Ou medir a elipcicidade pode ser usada como medida pois a luz plano polarizada se torna elipticamente polarizada aps passar atravs de um meio opticamente ativo.

Relao entre elipcicidade molar e

L R = (AL AR)/(lC) []() = 100()/(lC)l, centmetros C, moles.L-1Elipcicidade molar por resduo

Dimenses: [] em deg.cm2dmol-1 (L- R) em M-1cm-1

Importante: especificar a notao utilizada!Fasman, G.D., Circular Dichroism and the Confromational Analysis of Biomolecules (1996) Plenum Press, New York. Hecht, E., Optics 3rd Edition (1998) Addison Wesley Longman, Massachusetts.

Relao elipcicidade vs CD = elipcicidade (rad) tan = (|El| |Er |)/ (|El|+|Er |)= [exp(-Al/2) - exp(-Ar/2)]/[exp(-Al/2) + exp(-Ar/2)]

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Convertendo para deg, (deg) = 180 x ln 10 x A/4 = 32.98 A Elipcicidade diretamente proporcional ao CD

1 rad = 57.29578 deg

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Unidades Dicrosmo CircularFrom to (A) (mA) () (o) (mo) []

AbsorbanceA mA/1000 *C*l/Mo/32.98

Milli absorbanceA*1000 mA *C*l*1000/Mo/0.03298

Molar ExtinctionA*M/(C*l) A*M/(C*l*1000) o*M/(C*l*32.98)

DegreesA*32.98 mA*0.03298 *C*l*32.98/ Mo

MillidegreesA*32980 mA*32.98 *C*l*32980/ Mo*1000

Molar ellipticityA*M*3298/ (l*C) mA*M*3.298/ (l*C) *3298o*M*100/(l*C)

mo/32980 []*C*l/ (3298*M)

mo/32.98 []*C*l/ (3.298*M)

mo*M/ (C*l*32980) []/3298

mo/1000 []*C*l/ (100*M)

mo []*C*L*10/ (M)

mo*M/(10*l*C) []

Instrumentao

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Relao entre luz linearmente x luz circularmente polarizada

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Vetor eltrico da luz linearmente polarizada soma de luz rcp e lcp de = magnitude.

Gerao de luz circularmente polarizada a partir de feixes lineares

Gerao de luz elipticamente polarizada a partir de feixes circulares

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Equipamentos atuais de CD: modulam a luz entre as 2 rotaes e medem a de absorbncia a cada . A = log (IO/IL) - log(IO/IR) = log(IR/IL)www.protein.iastate.edu/images/cd_fig1.jpg

Instrumentao

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Jasco J-810 Fonte de luz: lampada de xennio 150w (180 a 800nm); Monocromador prismtico para disperso da luz em diferentes comprimentos de onda; Modulador fotoelstico gera luz circularmente polarizada; Permite quantificao da luz rcp e lcp; Deteco tubo fotomultiplicador.

Equipamentos atuais

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Jasco, photophysics (Chirascan)... Nitrognio: remoo de oxignio dos compartimentos da lmpada, do monocromador e da amostra; Oznio: degradao da ptica, proteo do usurio; Absoro de UV pelo oxignio.Acessrio Peltier (0 a 100oC); Banho trmico; Stopped flow cintica rpida.

Calibrao cido d-10-canforsulfnico

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Concentrao da amostraA intensidade do CD proporcional a concentrao da espcie ativa; a concentrao? a absoro reduo na quantidade de luz que chega nos detectores. Voltagem do PMT - do rudo.Absorbncia tima para medidas de CD: Abs = 0,89 Para uma cubeta com 1mm de caminho ptico, esta absorbncia alcanada com concentrao protica de 0,1 a 0,3 mg/mL.

Relao sinal/rudo em funo da absoro da amostra

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Solvente tambm absorve! Abs mxima a 1.0 amostra + solvente + cubeta Abs amostra normalmente vlida 0,3

~0,9

Johnson, 1985

Cubetas Caminho ptico:1,00 cm quantidade de amostra (~ 3mL) 1,0 mm 200 a 300L 0,1 mm ~ 50L (outro suporte necessrio)

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A concentrao tima protica depende do caminho ptico da cubeta utilizada

A = .c.l

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Importncia da escolha do tampoSolvent system Cut off (nm) for 1mm path length Solvent system Cut off (nm) for 1mm path length

Water Trifluoroethanol Hexafluoroisopropanol Acetonitrile Methanol Ethanol 2-Propanol Cyclohexane Dioxane

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