Evaluación de la actividad genotóxica del extracto metanólico de Gynosis

verrucosa mediante el ensayo Micronúcleos con bloqueo de Citocinesis en la línea celular Astrocitoma cerebral (D-384).

Diana J. Herrera Torres

Director:Dr. Natalia Bailón M.

Universidad Técnica Particular de Loja

DEFINICIÓN

La muerte por cáncer en 2007 fueron 7.6 millones

El cáncer se caracteriza por un crecimiento incontrolado y la propagación de células anormales

Macdonald F. et al ,2004

La carcinogénesis, requiere varios año, involucra mutaciones y varias causas

INCIDENCIApulmón, próstata, colon y recto .

En 1997 al 2002Hombres: Estómago, próstata, S. hematopoyéticoMujeres: cérvix invasor, mama, piel, estomago

Pulmón, mama, colon y recto

Mujeres: mama y cérvix (cuello uterino).Hombres: próstata y estómago.

AGENTES ANTICANCERÍGENOS Desde décadas atrás se han utilizado los principios de origen vegetal, y se viene realizando el aislamiento y caracterización de numerosos principios activos de los cuales se han desarrollado nuevos fármacos.

Estos provienen de plantas comúnmente de uso clínico.

Catharanthus roseus

Taxus brevifolia

Podophyllum peltatum

Camptotecina cuminata

4.Camptotecinas

Cuatro clases 1. Alcaloides de la Vinca

2.Epipodofilotoxinas

3. Taxanos

PRODUCTOS DE ORIGEN VEGETAL En la provincia de Loja y Zamora Chinchipe, elaboran remedios caseros con familias: Asteraceae, Lamiaceae, Solanaceae, Fabaceae, Onagraceae y Apiaceae, por sus propiedades curativas.

Gynoxis verrucosa, propiedades curativas: presión sanguínea baja, depresión psicológica, problemas visuales, respiratorios y como sedante para cólicos.

Del extracto de G. verrucosa se han aislados lactonas sesquiterpénicas: dehidroleucodina 1,10-epoxy-2-hidroxikauniolida; al igual que compuestos derivados del ácido bisabolánico.

El extracto de G. verrucosa efecto citostático a <10ug/ml.IC50 = 22,06 ± 10,7ug/ml

Micronúcleos con bloqueo de citocinesis (CBMN)

El análisis de MN es usado como una prueba de genotóxicidad y para biomonitoreo de exposición a genotóxicos y sus efectos en humanos.

Los MN se forman por ruptura directa del ADN

Posible medir la frecuencia del rotura de cromosomas (MN), la pérdida del cromosoma (MN), la reorganización del cromosoma, cromosomas dicéntricos (NPB), amplificación de genes (NBUDs), la necrosis y apoptosis.

Posibles destinos a la exposición citotóxicos o agentes genotóxicos

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad genotóxica del extracto metanólico de Gynoxis verrucosa mediante el ensayo CBMN en la línea celular Astrocitoma cerebral (D384).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Establecer el efecto citostático mediante Índice de División Nuclear en la línea celular Astrocitoma cerebral (D384).

• Establecer el efecto genotóxico mediante la evaluación de Micronúcleos en la línea celular Astrocitoma cerebral (D384).

MATERIALES Y METODOS

24 Horas

24 Horas

24 Horas

Siembra TratamientoCultivar células D-384

24 Horas

Evaluación

CosechaTinción

24 Horas

GRUPOTRATAMIENTO

VehículoConcentraciones

de prueba MMC Citocalasina B

Cont. Positivo MMC DMSO ---- 1 uM (5ul) 4.5ug/ml (33 ul)

Concentración 25 ug/ml DMSO 25ug/ml (62,5ul) ---- 4.5ug/ml (33 ul)

Concentración 20ug/ml DMSO 20ug/ml (50ul) --- 4.5ug/ml (33 ul)

Concentración 10ug/ml DMSO 10ug/ml (25ul ) ---- 4.5ug/ml (33 ul)

Cont. Negativo DMSO < 0.5% ---- ---- 4.5ug/ml (33 ul)

MATERIALES Y METODOS

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

DMSO 10 20 25 MMC 1uM0

25

50

75

100Mo Bi Po

Concentración G.v (ug/ml)

% d

e ce

lula

s M

o, B

i, Po

li

Se utilizó la cinética de proliferación celular (CPC), para lo cual se evaluó la proporción de células mono (M), bi (B), o polinucleadas (P).

El índice mitótico se basa en el grado de proliferación celular como respuesta a la presencia de un agente externo y se define como el porcentaje de células que contiene cromosomas condensados en una etapa del ciclo celular, la mitosis

DMSO 10 20 25 MMC 1uM1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Concentración G. v (ug/ml)

IDN

Figura 3.2. Índice de división nuclear calculado para línea celular D-384 tratadas con G. verrucosa. MMC como C. positivo y DMSO como C. negativo. Cada barra representa la media ± EE de tres experimentos independientes por duplicado. Usamos T. de DUNETT. *** P<0.00001; **P< 0.00002; *P<0.00003

INDICE DE DIVISION NUCLEAR

El extracto G. verrucosa, tiene un efecto citostático a partir 10ug/ml de células CHO-K1.

Antineoplásicos como el Carboplatino (5 ug/ml).En el tamoxifeno, utilizado en 2 líneas celulares [MCF-7, MDA-MB468]

Podemos establecer que el efecto citotóxico o cistostático puede variar dependiendo de la naturaleza del estudio.

Frecuencia de Micronucleos

control 10 20 25 MMC 1uM0

10

20

30

40

50

60

70

Concentraciones G. v (ug/ml)

CB

N m

icro

nu

cle

os

/10

00

CB

N

Figura 3.3. Efecto genotóxico, en las células D384, expuestos a diferentes concentraciones de G. verrucosa. Se empleó como control positivo MMC 1 μM. Los resultados son de tres experimentos independientes que se realizaron por duplicado. Usamos T. de DUNETT. *P> 0,00001.

FRECUENCIA DE MICRONUCLEOS

Se conoce el incremento de la frecuencia de MN se observa a partir de 1ug/ml en linfocitos humanos CBN

Puede incrementar el daño al ADN a partir de 0.01 ug/ml, medido mediante el ensayo cometa.

•Las concentraciones que se probo con el extracto metanólico de Gynoxis verrucosa no tiene un efecto citostático en la línea celular de Astrocitoma cerebral D-384 evaluadas mediante el índice de división nuclear.

CONCLUSIONES

•El extracto metanólico de Gynoxis verrucosa produce un daño significativo a las concentraciones probadas de 10, 20, 25ug/ml en la línea celular de Astrocitoma cerebral D-384 evaluadas mediante el conteo de células binucleadas.

GRACIAS

Macdonald F. et al ,2004