diagnostikk ved nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk
TRANSCRIPT
![Page 1: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/1.jpg)
1
Diagnostikk vedNasjonalt referanselaboratorium for
medisinsk mykologi
Lonny M. KløvfjellFagbioingeniør
Avdeling for mikrobiologi OUS‐Rikshospitalet
lklovfje@ous‐hf.no
DISPOSISJON
• Litt tall/ aktivitet
• Definisjoner
• Diagnostikk / metoder
• Kasus ‐ Pasient
![Page 2: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/2.jpg)
2
Hva er et referanselaboratorium?
En institusjon som er tildelt en nasjonal medisinsk mikrobiologisk referansefunksjon, er tillagt ansvar for å utføre eller videreføre undersøkelser
vedrørende definerte agens, på vegne av alle andre laboratorier.
Referansefunksjoner
• Samle alle gjærsoppisolater fra blodkultur til NORM (identifikasjon og resistensbestemmelse)
• Identifisere (verifisere) vanskelige sopp‐isolater fra andre laber
• Resistensbestemmelse for laber som ikke utfører dette selv
• Stammebank
![Page 3: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/3.jpg)
3
Hvilke analyser har vi?• Identifikasjon av gjærsopp, muggsopp og dermatofytter.‐ Maldi‐TOF‐ Sekvensering‐ Mikroskopi‐ Selektive medier‐ Vitek2
• Påvisning av sopp‐DNA (PCR). Utføres på molekylær‐enheten for oss.
• Langtidsdyrkning mhp sopp• Resistensbestemmelse av gjær‐ og muggsopp.• Pneumocystis IF• Serologi• Antigenpåvisning (galaktomannan, utføres på virus).
LITT TALL……
• I 2015 mottok vi 203 soppisolater fra blod, hvorav 199 var candida.
• Candida albicans er hyppigst isolert ved candidemi, 67,8 %. C.glabrata utgjør 16,6 % mens andel av andre candidaarter er lav, C.tropicalis C.dubliniensis og C.parapsillosis er av disse hyppigst forekommende med 3‐ 4 %.
• Vi får også flere isolater fra andre lokalisasjoner enn blod. I 2015 var det 191 slike gjærsoppisolat og 79 muggsoppisolat.
• 32 dermatofyttisolater til identifikasjon i 2015.
![Page 4: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/4.jpg)
4
Sopp ‐ analyser
Totalt antall analyser i 2015: 6989
SOPPTYPER
GJÆRSOPP
MUGGSOPP
DIMORFE SOPP
DERMATOFYTTER
![Page 5: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/5.jpg)
5
Gjærsopp
•Får tilsendt alle isolater fra blodkultur, samt en del fra andre materialer. Sendes som oftest på pensel.
‐Såes ut på Saboraud og kromskål
•Identifikasjon:
–Krom (grønn/ikke grønn)
–Maldi‐TOF
–Andre enkle tester
–Evt. Vitek
–Sekvensering
•Resistensbestemmelse
![Page 6: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/6.jpg)
6
Muggsopp
•Hvis sendt på skål:
–Rask vurdering av farge og øvrig morfologi
–Lupe
–Mikroskopi (bomullsblått, tapeteknikk)
–Sub på ulike temperaturer (28/37/45/50+ °C)
–Resistensbestemmelse dersom ønsket
• Maldi‐TOF – ID kommer nå
• Sekvensering
• Invasive infeksjoner• Luftveier• Hud• Øye
•Aspergillus
•Penicillum
•Mucorales
![Page 7: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/7.jpg)
7
13
Aspergillus sp
A.fumigatus
A.flavus
A.niger
A.terrus
180 species
• Vel 30 assosiert med human sykdom
Aspergillus
![Page 8: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/8.jpg)
8
Penicillum
Mucorales
![Page 9: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/9.jpg)
9
Dermatofytter
• Tinea pedis – fot• Tinea unguis (onychomycose)
– negler (hånd/fot)• Tinea corporis – kropp (ringorm)• Tinea capitis – hode (hår/skjegg)
![Page 10: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/10.jpg)
10
• Trichophyton rubrum
• Trichophyton mentagrophytes
(interdigitale)
• Microsporum canis
• Microsporum audouinii
• Trichophyton soudanense
• Trichophyton violaceum
Identifikasjon av dermatofytter
Dyrkning og tilsendte isolat:
• Mikroskopi• Kolonimorfologi• Veksttemperatur• Selektive medier• Sekvensering
Direkte på prøvematerialet:
• Dermatofytt – PCR
![Page 11: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/11.jpg)
11
Trichophyton sp T.soudanenseReflexive hyfer
Microsporum ‐makrokonidier
![Page 12: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/12.jpg)
12
Dimorfe sopp
• Gjærsoppform ved 37C• Mugggsoppform 28C
• Histoplasma• Blastomyces• Coccidioides• Penicillum marneffeii
• Sjelden i Norge• Reiseanamnese!• Immunsupprimerte (HIV)
• P3‐lab
Histoplasma capsulatum
![Page 13: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/13.jpg)
13
Mikroskopi
Ulike metoder:• CFW – direkte på prøvemateriale• Bomullsblått‐ Blokkpreparat‐ Nålepreparat‐ Tapeteknikk• Lupe
Noe av det viktigste vi gjør• Rask og sikker• Krever øvelse• Oppslagsverk
• Struktur• Mikrokonidier• Makrokonidier• Sporangier («stilk»)• Forgreninger• Vesikkel («hoder»)• Apophyse («hals»)• Phialider• Fruktlegemer – chleistotechia/pycnidia• Røtter• Størrelse
• Må alltid sees på sammen med kolonimorfologi og andre egenskaper.
‐veksthastighet‐temperatur
![Page 14: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/14.jpg)
14
Sekvensering + mikroskopi
Maldi‐TOF + mikroskopi
![Page 15: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/15.jpg)
15
Aspergillus
Penicillum
Mucorales
CALCOFLUORWHITE
• Flourescens – farging• Binder seg til chitin som finnes i celleveggen hos sopp.• Direkte på prøvemateriale• Rask diagnostikk• Kan til en viss grad skille noen typer muggsopp fra
hverandre.
![Page 16: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/16.jpg)
16
BOMULLSBLÅTT ‐ tapeteknikk
• Lactophenolblått
• Blank tape
• Objektglass
• Dekkglass
![Page 17: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/17.jpg)
17
Pneumocystis ‐ Immunfluorescens
• Vi bruker farge fra Biorad (Monofluo P. jirovecii IFA Test Kit)• Monoklonal, FITC merket antistoff• BAL og Indusert sputum
1. Forbehandler med di‐thio‐threitol og PBS2. Sentrifugerer3. Bunnfall på objektglass4. Tørkes5. Fikseres6. Farges7. Mikroskoperes
![Page 18: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/18.jpg)
18
Resistensbestemmelse av sopp
• Etest
• Flytmetode
• RPMI‐skåler
Amfotericin B leses av ved 100 % hemming
Øvrige midler leses av ved 80 (90) % hemming
• Amphotericin• Fluconazole• Voriconazole• Caspofungin• Anidulafungin• Micafungin• Itraconazole
• Posaconazole• Flucytosin
• Isovuconazole
• Vi bruker brytningspunkter anbefalt av EUCAST• Ikke alle sopp har fått brytningspunkter
![Page 19: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/19.jpg)
19
Buljongfortynning
• Gullstandard for resistensbestemmelse• EUCAST bruker dette ved utarbeidelse av brytningspunkt.• Statens Serum Institut i København utfører buljongfortynning
![Page 20: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/20.jpg)
20
Screening for azole‐resistens hos Aspergillus
Serologi
• Aspergillus antistoff (presipiterende antistoff mot aspergillus)
‐ Utføres ved klinisk mistanke om aspergillose og lungeaspergillose. Liten verdi hos
pasienter med kraftig nedsatt immunforsvar.
‐ Elektroforese.
‐ Titrering ved positivt funn.
• Galaktomannan (utføres hos virus‐avdelingen)
‐ Immunsupprimerte, langvarig nøytropene pasienter.
‐ Komponent i celleveggen hos Aspergillus.
‐ Enzym immuno assey; EIA‐teknikk som påviser Aspergillus galactomannan antigen i
serum (spinalvæske og BAL).
![Page 21: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/21.jpg)
21
Fritekst..... fritekst..... fritekst
•Fugleantigen (immundiffusjon):
–Utføres ved mistanke om allergi mot due, høns eller undulat
• Dimorfe sopp (immundiffusjon):
–Utføres ved mistanke om sykdom/eksposisjon for dimorfe sopp (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis)
Pr.nr:
Pr.nr:
Pr.nr:
Ktr
1111111
1 2
1 1
12
2 2
3 3
33
44
4 45 5
5 5
![Page 22: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/22.jpg)
22
Kryptokokk‐antigen• Ø‐hjelp• Utføres på spinalvæske, serum og BAL• Hurtigtest fra IMMY• Rimelig, rask og enkel
Dermatofytt‐PCR
•Hud, hår og negler dyrkes ikke lenger rutinemessig, kun PCR
•Metoden påviser de vanligste artene: Trichophyton, Microsporum og Epidermophyton
•Realtime PCR
•Smeltepunktsanalyse:
![Page 23: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/23.jpg)
23
Påvisning av sopp‐DNA
Spesifikke PCR analyser til bruk direkte på prøvematerialet
• Aspergillus sp og Aspergillus fumigatus DNA ‐ Utføres vanligvis parallelt‐ Sterilt materiale‐ BAL hos immunsupprimerte
• Mucorales DNA‐Rhizomucor sp‐Lichtheimia sp (Absidia)‐Rhizopus sp
• Pneumocystis jirovecii DNA‐ semikvantitativ‐ Pneumosystis IF på moderat og sterkt positive
• Påvisning av sopp‐DNA direkte på prøvematerialet‐ Ulike målgener som er felles for de fleste sopparter‐ ITS2 og D1D2‐ Der sopp‐DNA påvises, utføres en sekvensering‐ Gensekvensene sammenlignes med tilsvarende sekvenser i
internasjonale databaser for sopp.‐ Arbeidskrevende metode.
![Page 24: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/24.jpg)
24
Kasus
• Leverabscess hos nøytropen pasient etter
pseudomonassepsis.
• Ultralydveiledet leverbiopsi.
Leverbiopsi soppmikroskopi – calcofluorwhite
Mikroskopi:
brede, vridde irregulære hyfer uten septa.
• Tid til farging ca 2 minutter
Mucorales
![Page 25: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/25.jpg)
25
Leverbiopsi PCR
Mucorales PCR:
Rhizomucor sp DNA påvist
• Undersøkelsen tar < 2 timer,
• settes opp daglig
Soppsekvensering direkte på biopsien:
Rhizomucor pusillus DNA påvist
• 3 x pr uke, tid 2‐3 dager
Mucorales
• Ømfintlige hyfer
• Oppvekst kan utebli om prøven mortres eller pasienten står på
antimykotika
• Trenger ofte 37 grader
![Page 26: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/26.jpg)
26
Dyrkning mucoreles
Rhizomucor pussilus
Lokkløfter
Viktig med rask mistanke til kliniker
Behandling: Kirurgi OG høy dose amfotericin B og med posakonazol
Pasienten
• Gjentatte leverreseksjoner
• Høydosert liposomalt amfotericin B og posakonasol
• Frisk
![Page 27: Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022042619/5881fd5f1a28abc8198b8c6f/html5/thumbnails/27.jpg)
27
Mucormykose
• Disseminert form med affeksjon av flere organer.
• Risikofaktorer som for Aspergillusinfeksjoner
• Dessuten • Ketoacidose
• Ukontrollert diabetes mellitus
• Vorikonazol profylakse eller behandling
Mikroskopi av BAL og fra kultur
Takk for oppmerksomheten