JUAN CARLOS RODRÍGUEZS. MICROBIOLOGÍAHOSPITAL GENERAL

UNIVERSITARIO DE ALICANTE

Diagnóstico microbiológico de las infecciones causadas por

micobacterias

Mycobacterium

Características de los microorganismos del género Mycobacterium

�Bacilos aerobios curvados�No se tiñen por la coloración de Gram�Tienen ácidos micólicos en la pared, por lo que son ácido-alcohol resistentes

�Crecimiento lento (tiempo de generación entre 2 y 20 horas)

�El género incluye más de 60 especies, algunas patógenas y otras saprófitas

�Necesitan tratamientos especiales y no responden a los antibióticos habituales

Características de los microorganismos del género Mycobacterium

�No crecen en los medios de cultivo habitualmente utilizados en los laboratorios de Microbiología. ¡¡Hay que solicitar expresamente su aislamiento!!

�Mediante la tinción de Gram no se visualizan, ¡hay que hacer tinciones especiales!

� Los cultivos tardan semanas

Mycobacterium tuberculosis

� El complejo está formado por varias especies:�M. tuberculosis (causa la mayoría de los casos)�M. bovis: Se transmite además, por leche de vaca con tuberculosis. Resistente a pirazinamida

�M. africanum, M. caprae, M. microti

Mycobacterium tuberculosis

�Hay que diferenciar entre:�Infección tuberculosa o tuberculosis latente: Nuestro sistema inmune ha estado en contacto con el microorganismo pero el paciente no ha sufrido ninguna alteración clínica

�Enfermedad tuberculosa: El paciente presenta signos y síntomas de tuberculosis

Infección tuberculosa

�Cuando nos infectamos, el microorganismo llega al pulmón

�Se produce una bacteriemia: tb extrapulmonares

�El sistema inmune reacciona y generalmente controla la infección, quedando los microorganismos acantonados en algunas células humanas (persiste intracelularmente durante largos periodos de latencia).

� La activación del sistema inmune produce la positividad del Mantoux (tuberculina)

Infección tuberculosa

�Si el sistema inmune no controla la infección, se desencadena la enfermedad clínica llamada TBC primaria (generalmente en los dos primeros años).

� Puede haber reactivaciones cuando se deteriora el sistema inmune, muchos años después de la infección: SIDA, ancianos, inmunodeprimidos

Infección tuberculosa

�Se realiza mediante el Mantoux, también llamado, prueba de la tuberculina

�Es una intradermorreacción tras inoculación de un extracto antigénico de M. tuberculosis

�Si el paciente ha estado en contacto con el microorganismo, se desencadena una reacción del sistema inmune que produce induración

�El Mantoux positivo indica contacto con el microorganismo (infección tuberculosa), pero no siempre se asocia a enfermedad tuberculosa

Infección tuberculosa

El Mantoux presenta reacciones cruzadas con:

�Vacunación�Otras micobacterias no tuberculosas

Indicaciones de la tuberculina

Convivientes y contactos de enfermos tuberculososPersonas cuya radiografía de tórax presente imágenes

compatibles con tuberculosis inactiva Personas con sospecha clínica de enfermedad tuberculosa Personas que si estan infectadas tienen mayor riesgo para el

desarrollo de enfermedad tuberculosaInfección por el VIHAdictos a drogas por vía parenteralMarginados sociales Extranjeros procedentes de países de alta incidenciaEnfermedades inmunosupresoras Candidatos a trasplantePersonas que constituyen un riesgo social y epidemiológico si desarrollan una TB activa

Falsos negativos de la tuberculina

Infecciones Virales: VIH, sarampión, varicela, parotiditisTuberculosis (formas graves y localización en serosas

Fiebre tifoidea, brucelosis, tosferina, lepra Vacunación con virus vivos: sarampión, parotiditis,

poliomielitisInsuficiencia renal crónica Desnutrición graveEnfermedad de órganos linfoides: linfomas, leucemias,

sarcoidosis Corticoterapia, quimioterapia y medicación inmunosupresoraMenores de 6 meses y ancianos Técnica y/o lectura incorrectasExposición de la tuberculina a la luz o el calorPerıódo ventana

Alternativas al Mantoux

� IGRAs (Interferon gamma release assay): Quantiferon y T-spot.

�Se basa en que dos proteínas de M. tuberculosis (ESAT-6 y CFP-10) estimulan al sistema inmune e inducen una fuerte producción de IFN-gamma por las células CD4

�Estos antígenos están ausentes en la cepa vacunal y en la mauoria de las micobacterias no tuberculosas

�Excepto M. kansasii, M. marinum y M. szulgai

IGRAs

�Ensayo in vitro: La sangre del paciente se incuba toda la noche con los antígenos (obtenidos de forma sintética)

�Se detecta la presencia de interferon mediante ELISA (quantiferon) o por inmunospots (T-spot)

IGRAs

Cuando hacer estudio de IGRAs

Se recomienda utilizar la TST como prueba base: - Si es positiva en paciente vacunado B IGRA de confirmación, para

descartar efecto vacuna - Si es negativa en paciente inmunodeprimido B IGRA confirmación,

porque es más sensible

Enfermedad tuberculosa

� Fue descrita por Koch en 1886� Generalmente se contagia por inhalación, en pocas ocasiones por ingestión y excepcionalmente por inoculación cutánea o congénita

� En pacientes inmunocompetentes, afectación pulmonar en el 80% de los casos y extrapulmonar en el 20%

� En pacientes con HIV se produce afectación extrapulmonar en el 30-60% de los pacientes

Distribución de la tuberculosis extrapulmonar

� Linfática: 30%� Pleural: 23%�Genitourinaria: 12%�Osea: 10%�Miliar: 7%�Meningea: 5%� Peritoneal:3%�Otras: 10%

Muestras a procesar en función de la localización de la infección

� Pulmonar: 3 muestras de esputo de calidad o muestras invasivas

� Linfática: Punción del ganglio � Pleural: Líquido o biopsia pleural� Genitourinaria: 3 muestras de orina de tres días (más de 25 ml)

� Ósea: Material quirúrgico� TB Miliar: Muestras respiratorias, orina, sangre, LCR y otras muestras

� Meningea: LCR� Infección diseminada por M. avium: Muestras respiratorias, sangre, heces y médula ósea

� Muestras de piel y tejidos blandos:Biopsia o punción, con incubación de los cultivos a 30ºC (M. marinum)

� Sospecha de M. genavense: Incluir medios líquidos

Muestras pulmonares invasivas

� También pueden utilizarse muestras invasivas:�Aspirado bronquial (BAS)�Lavado broncoalveolar (BAL)�Cepillado bronquial�Biopsia transbronquial�Aspirado transtraqueal�Biopsia pulmonar, obtenida quirúrgicamente

� Los esputos obtenidos en los días siguientes a estos procedimientos son muy rentables

� Los aspirados gástricos deben procesarse o neutralizarse rápidamente con carbonato cálcico para neutralizar el ácido clorhídrido estomacal

Tinción

�Se basa en demostrar la existencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en la muestra

Tinción

� La tinción de Ziehl Neelsen utiliza fuschina y azul de metileno y se observa a 1000 aumentos en microscopio óptico

� La tinción de auramina se observa a 200 aumentos en microscopio de fluorescencia

Tinción

� La sensibilidad en muestras respiratorias es de 50-75% dependiendo de:�Calidad de la muestra�Tipo de lesión del paciente

� La sensibilidad en muestras extrarespiratorias es mucho más baja, dependiendo del tipo de muestra

� Las dos tinciones tienen rentabilidad semejante

�No diferencia las especies del género

Cultivo

� Puede hacerse en medios sólidos o líquidos� Se incuban 2 meses, aunque suelen ser positivos entre 2 y 4 semanas. El rango de crecimiento está entre 2 días y 8 semanas.

� Se incuban a 37ºC salvo algunas excepciones (biopsias cutáneas con sospecha de infección por M. marinum)

� Los medios sólidos se leen cada semana, mientras que los líquidos tienen lectura diaria automatizada

Siempre hay que hacer cultivo porque mejora� Sensibilidad: Detecta casos con tinción negativa� Especificidad: Permite identificar las micobacterias no tuberculosas� Permite estudiar la sensibilidad de la cepa mediante el antibiograma

Cultivo en medio sólido

�Cultivos con base de huevo:�Lowenstein Jensen�Coletsos�Petragnani

�Cultivos con base de agar:�Middelbrook 7H10�Middelbrook 7H11

�Medios selectivos:�Adición de antibióticos

Colonias de Mycobacterium

Cultivo en medio líquido

Semiautomáticos: Detectan el metabolismo bacteriano mediante el estudio del consumo de oxígeno y la producción de anhídrido carbónico�BACTEC�ESP�MGIT

Cultivos líquidos semiautomáticos

� La positividad de la máquina debe confirmarse mediante tinción y cultivo en medio sólido o por PCR

�Detecta la presencia de micobacterias en menos tiempo que en medio sólido

�Es más sensible que el medio sólido, por lo que es útil en muestras con pocas bacterias (tuberculosis extrapulmonar)

�Complemento de los medios sólidos

Medios líquidos

Lisis-centrifugación

�Util para el diagnóstico en muestras de sangre: infecciones diseminadas por M. avium

� La sangre se extrae en un tubo especial con saponinas que lisan las células sanguineas y permiten la salida de las micobacterias

�Se centrifuga y el sedimento se procesa como el resto de las muestras para micobacterias (medios líquidos y sólidos)

� Problemas de contaminación de la muestra�Complemento de los métodos clásicos

Nuevos métodos diagnósticos

� Basados en la reacción en la cadena de la polimerasa (PCR)

Más útiles en:�Muestras con pocas bacterias, como las extrapulmonares�Muestras pulmonares con tinción negativa �Aumentar la rapidez diagnóstica�Complemento de los medios líquidos�Permite detectar simultaneamente algunas resistencias antibióticas

� Un resultado negativo no descarta la infección aunque tienen buena sensibilidad

� No sustituye a los métodos tradicionales

Identificación a partir de cultivo

� Sondas de RNA� Amplificación e hibridación con sondas específicas de cada especie

� Secuenciación de diferentes genes

Fármacos antituberculosos

� 1ª línea: �Isoniacida�Rifampicina�Etambutol�Pirazinamida

� 2ª línea:�Estreptomicina�Moxifloxacino y otras fluoroquinolonas�Acido paraaminosalicílico (PAS)�Aminoglucosidos: Capreomicina, kanamicina, amikacina �Etionamida�Cicloserina�Linezolid

Estudios fenotípicos

�Antibiograma:

�Se realiza con medios sólidos o líquidos con antibióticos incorporados. Los antibióticos activos no dejaran crecer al microorganismo

�Hay puntos de corte que se asocian con la resistencia clínica

Estudios genotípicos

�Detección de genes de resistencia: �Puede detectarse la presencia de mutaciones de algunos genes por biología molecular asociados a la resistencia clínica

�Disminuye el tiempo de obtención de resultados�No está disponible para todos los fármacos�El principal inconveniente es que la resistencia a un fármaco puede ser debida a algunas mutaciones no recogidas en el sistema (Sensibilidades mayores del 90%)

Detección de genes de resistencia

Tipos de resistencias

� Dentro de una cepa existen microorganismos intrínsecamente resistentes a los antibióticos, por lo que:�Nunca se puede emplear la monoterapia�Controlar la adherencia al tratamiento

Tipos de resistencias: �Primarias: La cepa era resistente cuando infectó al enfermo�Secundarias: Por mal cumplimiento del tratamiento, la cepa se hace resistente)

Tipos de resistencias

MDR (Multirresistencia): �Resistencia a isoniacida y a rifampicina

XDR (Extremadamente resistente): �Resistencia a isoniacida y a rifampicina�Resistencia a fluoroquinolonas�Resistencia a aminoglucósidos

TDR (Extremadamente resistente): �Resistencia a todos los fármacos disponibles

Tuberculosis en Elche

0

10

20

30

40

50

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

Nº PACIENTES

Tuberculosis en la CV

� NÚMERO TOTAL DE CASOS: 607 CASOS (9,8 CASOS/100.000 H) � TB PULMONAR: 75,8% (460 CASOS)� EXTRAPULMONAR: 147 CASOS

– PLEURAL: 51 CASOS– LINFÁTICA: 31 CASOS– MENINGEA: 3 CASOS (NINGUNO EN NIÑOS)

� EDAD MEDIA: 41,8 AÑOS� ASOCIACIÓN CON EL HIV: 10,8%� INMIGRANTES: 13% (RUMANIA, MARRUECOS Y ECUADOR)

INFORME TUBERCULOSIS COMUNIDAD VALENCIANA 2011

Tuberculosis en la CV

� TIEMPO DESDE EL INICIO DE LOS SÍNTOMAS AL DIAGNÓSTICO: 61,8 DIAS

� TIEMPO DESDE EL INICIO DE LOS SÍNTOMAS AL DIAGNÓSTICO EN TB PULMONAR CON TINCIÓN POSITIVA: 59,2 DIAS

� TASA GLOBAL DE RESISTENCIAS: 13,3%• RESISTENCIA A ISONIACIDA: 7,1%• MULTIRRESISTENCIA: 1,1%

� Nº TRATAMIENTOS DIRECTAMENTE OBSERVADOS: BAJO

INFORME TUBERCULOSIS COMUNIDAD VALENCIANA 2011

Tuberculosis en el mundo

� Incidencia de casos por 100.000 habitantes

– Unión Europea: 10– Portugal: 32– España: 18– Reino Unido: 14– Italia: 7– Alemania: 7– Suecia: 5

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD

Tuberculosis en el mundo

Incidencia de casos por 100.000 habitantes– Europa: 48– Rumanía: 127– Rusia: 106– USA: 5– Ecuador: 128– Bolivia: 198– Marruecos: 93– Mali: 280– Senegal: 270– China: 99

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD

XDR

Micobacterias no tuberculosas

�Hay muchas especies diferentes que pueden ser:

�Patógenas: �Lepra

�Patógenos oportunistas�M. avium�M. kansasii�M. chelonae�M. fortuitum

�Saprófitos�M. gordonae

Mycobacterium leprae

�Bacilo de Hansen� Produce la lepra�En el diagnóstico son muy importantes los datos clínicos y epidemiológicos

�No crece en medios de cultivo artificiales, por lo que sólo se puede diagnosticar por tinción y PCR en centros especializados (Foncilles)

�Biopsias cutáneas, moco nasal o biopsia de tronco nervioso engrosado

�Tratamiento: Dapsona, rifampicina, acedapsona, clofazimida

Mycobacterium leprae

Mycobacterium leprae

Micobacterias ambientales

� Responsables de las micobacteriosis� Afectan principalmente a:

�Pacientes inmunodeficientes�Niños�Pacientes con procesos pulmonares crónicos

� Reservorios: �Agua�Suelo�Aves y otros animales

� No hay transmisión interhumana� Incremento asociado a los pacientes HIV, sobre todo de las infecciones diseminadas por M. avium

Micobacterias ambientales oportunistas

Infección pulmonar M. avium, M. kansasii, M.

malmoense, M. fortuitumDiseminada en

inmunodeprimidos

M. avium, M. genavense

Linfadenitis en niños M. avium, M. kansasii, M.

scrofulaceum, M.

haemophylum, M. abscessusPiel y partes blandas M. fortuitum, M. peregrinum,

M. chelonae, M. abscessus, M.

marinum, M. kansasiiOsteoarticulares M. fortuitum, M. mucogenicum,

M. peregrinum, M. chelonae, M.

abscessus, M. marinum

CASOS CLÍNICOS

Caso clínico 1

� Varón de 45 años�Antecedentes de estancia en una cárcel rusa� Consultó por presentar desde hace unas 3-4 semanas: �Astenia�Pérdida no cuantificada de peso�Febrícula vespertina�Sudoración nocturna�Hemoptisis ligera.

Caso clínico 1

¿Cual sería la sospecha clínica inicial?

¿Qué pruebas rápidas deberían hacerse?

Caso clínico 2

�Hombre de 29 años, aficionado a los peces tropicales, que acude al médico porque después de hacerse una herida al limpiar el acuario, presenta el siguiente cuadro

Caso clínico 2

� ¿Qué micobacterias pueden estar implicadas?

� ¿Cómo se tiene que obtener la muestra?

� ¿Cómo se debe procesar?

Caso clínico 3

� Paciente de 28 años con infección con HIV avanzada sin tratamiento antirretroviral y 23 CD4.

�Acude a urgencias con fiebre de varias semanas de evolución, diarrea y afectación pulmonar

Caso clínico 3

� ¿Qué micobacterias pueden estar implicadas?

� ¿Cómo se tiene que obtener la muestra?

� ¿Cómo se debe procesar?

Caso clínico 4

� Cooperante que visita un poblado remoto del interior de Brasil y encuentra esta lesión en una mujer indígena de 60 años de edad

� Proceso crónico de años de evolución

Caso clínico 4

� ¿Qué proceso asociado a micobacterias habría que descartar?

� ¿Qué muestras se procesarían?

� ¿como se procesarían?

Caso clínico 5

� Paciente de 50 años con piuria estéril, dolor lumbar, hematuria e infecciones urinarias de repetición

Caso clínico 5

� ¿Qué proceso asociado a micobacterias habría que descartar?

� ¿Qué muestras se procesarían?

� ¿Qué técnicas microbiológicas se emplearían y como se interpretarían sus resultados?

Caso clínico 6

� En un estudio de contactos realizado por un caso de tuberculosis pulmonar en una oficina se encuentra:

�Hombre de 50 años vacunado con BCG en la infancia

�Mantoux positivo de 5 mm

Caso clínico 6

� ¿Qué pruebas microbiológicas adicionales se podrías realizar?

� ¿Qué muestras se procesarían?

� ¿Como se interpretarían sus resultados?

Caso clínico 7

� En un estudio de detección de la infección tuberculosa previo a la instauración de un tratamiento inmunosupresor, un paciente de 65 años con artritis reumatoide presenta el Mantoux negativo

� ¿Podría hacerse alguna prueba microbiológica adicional?

Hasta 1959, el 50% de los infectados morían