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Diagnóstico de infecções virais
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Diagnóstico de infecções virais
Duas formas:
-buscar o vírus ou seu genoma
Ou
- buscar a resposta do organismo
(especialmente anticorpos)
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Problema/suspeita levantada a campo
Encaminhamento ao laboratório
Diagnóstico presuntivo
Diagnóstico convencional Diagnóstico molecular
Análises filogenéticas
Confirmação do diagnóstico
Tomada de decisão
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Diagnóstico de viroses
► Sinais clínicos
► Detecção do vírus, antígenos ou genomas
Isolamento (+ detecção imunológica)
Hemaglutinação (HA)
ELISA
PCR
Deteção imunológica (IPX, IF)
Microscopia eletrônica
1- na busca do vírus
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- inoculação em animais
- inoculação em ovos embrionados
- microscopia eletrônica
- cultivos celulares
-
Cultivo e identificação
de vírus
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Cultura de células é o processo pelo qual células são
mantidas vivas e em multiplicação fora de seu tecido original, em condições controladas.
CULTURA DE CÉLULAS
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- cultivos primários (células diplóides)
- linhas celulares
(diplóide, 40 passagens )
- células de linhagem
(número de passagens indefinido)
Cultivos celulares
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Cultivo Primário
- Preparadas diretamente das células obtidas de
um tecido de um organismo
- Sensível a vírus
- Resiste poucas passagens ( máximo 20)
CULTIVO DE CÉLULAS
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Cultivo primário senescente
Células de linhagem
Algumas células sobrevivem
Seguem multiplicando-se
Tornam-se “imortais”
Capacidade ilimitada de crescimento em cultura
– Derivadas de células tumorais
– Sofreram transformação espontânea ou
induzida
CULTURA DE CÉLULAS
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CULTIVO DE VÍRUS
IN VITRO
- Garrafas de Vidro
- Garrafas de Plástico
- Garrafas fechadas ou abertas (CO2)
-Garrafas estacionárias ou rolantes
-Tubos de vidro ou plástico
-Tubos com lamínulas (tubos de Leighton)
- Placas de microtécnica com 6, 12, 24, 96 orifícios
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Tubos de cultivos celulares em equipamento rotativo
Microplacas de cultivos celulares
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EFEITO CITOPÁTICO (ECP):
É o dano que o vírus causa à célula !
- infelizmente, nem todos os vírus
causam danos às células!
- a maioria não causa dano nenhum!
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FCV
BVDV
RSV
Rotavírus
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HSV
Adenovírus
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EFEITO CITOPÁTICO (ECP):
- lise
- arredondamento
- vacuolização
- formação de sincícios
- inclusões
- picnose
- apoptose
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EFEITO CITOPÁTICO (ECP): Herpes (coloração: violeta de genciana)
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EFEITO CITOPÁTICO (ECP): Herpes (coloração: carbazol)
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Microscopia eletrônica
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Hemaglutinação (HA)
com vírus hemácias
se entrelaçam
e aderem
às paredes
Sem vírus Hemácias livres
sedimentam
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HEMAGLUTINAÇÃO
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►Interpretação Reação positiva: presença de vírus
Reação negativa: ausência de vírus
HEMAGLUTINAÇÃO
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Hemaglutinação (HA) Infelizmente, Nem todos os vírus hemaglutinam ! Alguns: Influenza (gripe) Rubéola Parvovírus Coronavírus Vários arbovírus Adenovírus e vários outros
Parvo B19
Rubéola
Arbo- vírus
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Hemaglutinação (HA)
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Hemaglutinação
Diluição
2 4 8 16 32 64 128 256 512
prozona título
1024
Sem
vírus
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Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA DE CAPTURA)
Amostra a ser testada
para a detecção de vírus
vírus
Anticorpo de captura
Anticorpo
Detector
Enzima +Substrato
solúvel= cor
no líquido
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Exemplos de ELISAs
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Imunoperoxidase (IPX)
Soro com anticorpos
contra o vírus
Células infectadas com vírus
Anticorpo
Detector
Enzima
Substrato insolúvel
células coradas
Microscópio
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Imunoperoxidase
Herpesvírus (coloração por imunoperoxidase)
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Imunoperoxidase
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Tabela 1. Perfís de reatividade de amostras brasileiras do vírus da raiva com um
painel de anticorpos monoclonais anti-Lyssavirus
Anticorpos monoclonais
Amostras 5A3 5G2 CVS-2 L3 L18 DB1 DB3 DB4 D3 DB9 M11
Bovinos (42)
Morcegos (6)
Felino (1)
NA (1)CVS
Caninos (8)
Humano (1)
Cachorro-do mato* (1)
Morcegos (3)
Canino (1)
Cachorro-do-mato* (1)
Reação positiva, Reação negativa
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Imunofluorescência Direta
anticorpo marcado sobre material infectado
material infectado (suspeito)
+ anticorpo específico marcado com FITC
+ luz UV
________________________________________
reação colorida
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Imunofluorescência direta - raiva
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Imunofluorescência Indireta
Material infectado (células ou tecidos)
+ soro específico (ex: soro humano)
+ conjugado anti-IgG específico (ex. anti-IgG humana/FITC)
+ luz UV
______________________________________________
= reação colorida
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Imunofluorescência- Herpes
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Western blot (para a detecção de antígenos)
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Reação da polimerase em cadeia (PCR)
DNA viral
primers
Primeiro ciclo
Segundo ciclo
20-40 ciclos
Milhões de cópias
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Amplificação pela reação da polimerase em cadeia (PCR)
DESNATURAÇÃO
HIBRIDIZAÇÃO
POLIMERIZAÇÃO
DNA FITA
DUPLA
5´-
3´
fragmento a
amplificar
ADN
ciclo 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo
4
0 0 2 8
nº de cadeias
duplicadas
de comprimento
correto:
4 PRIMEIROS CICLOS DA PCR: 4 primeiros ciclos
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REA com Bgl II
PV 022
Hum
568
Can
3558
Can
3462
Bov
189
Bov
M03
Bov
97
Fel
1024
Morc
2138
Morc
2217
C.mato
0,6 kb
1,5 kb
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MODIFICAÇÕES da PCR
RT-PCR
AAAAA
AA RT
PCR
RNA
ADN
fs
DNA fd
Nested-PCR
PCR 1er par de primers
PCR 2do par de primers
ADN fd
Multiplex
PCR Possíveis múltiplos
pares de primers
ADN fd
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15
6
4
3
2
1
10
20
30
Kbp
A E B D
A
B C D E
G, H, I F
J
K
L
M
N
Análise do DNA viral com enzimas de restrição
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HERPESVÍRUS RFLP
- RFLP
BamHI EcoRI BstEII HindIII
BHV
1 5a 5a 1 5a 5a 1 5a 5a 1 5a 5a
23,1 23,1
9,4 9,4
6,5 6,5
4,4 4,4
2,3
2,0 2,0
2,3
Kb Kb
FIGURA 2: Perfis de restrição enzimática das amostras de BHV-5 analisadas após eletroforese em gel de agarose 0,6%.
: marcador de peso molecular HindIII; 1: amostra padrão de BHV-5b A663; 2: amostra de campo SV 136/88 (BHV-5a); 3: amostra de campo EVI 88/95 (BHV-5a). As diferenças entre os subtipos são destacadas pelas setas.
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Figura 4. Árvore filogenética baseada na sequência de aminoácidos deduzidas do sequenciamento
de 225 pb do gene N. Origem da amostras: 2217 e 2263 (Cachorro-do-mato; Cerdocyon thous),
585 (canino), 189 (bovino), 576 (morcego não hematófago Molossus molossus), 97 (felino), 686
(morcego, espécie não identificada), rvu22862 (canino), AF070449 (morcego hematófago
Desmodus rotundus), AF070450 (morcego não hematófago Tadarida brasiliensis).
0 2 4
BRfx2217
BRfx2263
BRdg585
rvu22862
AF070449Dr
BRbv189
AF070450Tb
BRbt576
BRct97 .1
BRbt686
Cachorro-do-mato (2217)
Cachorro-do-mato (2263)
Canino (585)
Canino (rvu22862)
Morcego H (AF070449)
Bovino 189
Morcego NH (AF070450)
Morcego NH (576)
Felino (97)
Morcego NI (686)
Análises filogenéticas
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Neuraminidase > aqui fica clara a origem do segmento
6 em suíno > amostras com quadrado vermelho
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Hemaglutinina > sem valor
filogenético, possível origem
só com amostras de suíno
Aqui as amostras recentes
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Até aqui, só
vimos métodos de
detecção do agente !
Como podemos detectar
anticorpos?
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Diagnóstico sorológico:
Amostras de soro pareadas
0 30 60 90 Dias
Anticorpos Anticorpos IgG
Nível de
Anticorpos
IgM IgG
D o e n ç a
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Anticorpos
1a
2a
3a
4a
Efeito da vacinação e doses de reforço
nos níveis de anticorpos
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A presença de anticorpos indica:
- contato prévio com o
agente !
ou
- Vacinação !!!
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Diagnóstico de viroses
► Quando os sinais clínicos já passaram
► Quando houve algum contato com o vírus
► Detecção de anticorpos: ► (usualmente no soro – raramente no líquido céfalo-raquidiano (LCR)
Soro-neutralização
Imunodifusão
Inibição da hemaglutinação (IH)
Hemaglutinação passiva
Imunoperoxidase para anticorpos
Imunofluorescência indireta
ELISAs (diversos)
Western blot
outros
2- na busca de anticorpos
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Detecção de exposição ao vírus (sorologia= detecção de anticorpos)
► Soro/Vírus neutralização
Diluir o soro seriadamente: ex:
1/2 1/4 1/8 1/16……….1/512
Adicionar volume igual de vírus (100 DICC50) a cada tubo ( ou orifício da placa)
Incubar a 37oC
Colocar mistura sobre células
Última diluição que evita multiplicação viral é o título
Sem soro 1/2 1/4 1/256 1/512 1/128
--
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IMUNODIFUSÃO - Influenza
Antígeno Soro c/anticorpos ou s/anticorpos
Antígenos
Soro c/anticorpos anti- H3N2 (reação cruzada parcial
Identidade
+
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IMUNODIFUSÃO
Soros em teste
Identidade
?
Ag
+
+
+
?
?
Soro controle +
Sem identidade
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Hemaglutinação (HA)
com vírus hemácias
aglutinam
e aderem
às paredes
Sem vírus Hemácias livres
sedimentam
no orifício
côncavo
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Inibição da Hemaglutinação (HI)
Inibição
da HA
(ou IH) Anticorpos
Hemácias
vírus
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Resultado positivo PRESENÇA DE ANTICORPOS
INIBIDORES DA HEMAGLUTINAÇÃO (HA)
Resultado negativo AUSÊNCIA DE ANTICORPOS
INIBIDORES DA HEMAGLUTINAÇÃO (HA)
INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO (HI)
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Inibição da Hemaglutinação (HI)
Diluições do soro
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
1/1280
Controle de
Vírus (sem soro)
8 semanas 1 semana
Controle
de Vírus
HA
Anticorpos HI em animal vacinado
Negativo Positivo
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Diluente
Látex com Ag adsorvido
AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX
POSITIVO
soro +
NEGATIVO
soro -
Soro com Acs
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ELISA INDIRETO (para anticorpos)
Soro a ser testado
para anticorpos
Antígeno aderido à placa
Anticorpo
Detector
Enzima => cor
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ELISA de bloqueio (para anticorpos)
Soro suspeito
+? -?
Células infectadas com vírus
Substrato solúvel
sem cor
Microscópio
Anticorpo
Detector
Enzima
onde ligar ?
?
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Substrato
•Reações Falso positivas
Artrite reumatóide
Anti- HLA
•Não detecta baixos títulos de anticorpos
•Somente detecta IgG
Lisado de Virus
Ag celular
Ac paciente
Ac anti IgG humana
Marcado com Enzima
E
ELISA Indireto para anticorpos anti-HIV
1ª GERAÇÃO
Suporte sólido
Cor
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Suporte Solido
E HIV-2
E
Substrato
Proteinas
recombinantes
Peptidos sinteticos
Ac paciente
Ag viral
Ac conjugado
HIV-2 env
HIV-1 env
HIV-1gag
HIV-O
ELISA 4ª GERAÇÃO
•Muito boa especificidade
•Detecta baixos títulos de anticorpos
•Boa sensibilidade para Ac. anti HIV-2 e Ac anti-grupo M e O de HIV-1
•Detecta IgG e IgM
•Detecta antígenos virais também (HIV-1 y HIV-2)
HIV-2
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Western blot (para a detecção de anticorpos)
Western Blot
Critérios:
WB Positivo: p24,gp41,gp120/160 (pelo menos 2 bandas)
WB Negativo: Ausencia total de bandas
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Testes imunocromatográficos – ex.: teste oral HIV
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Limitações da sorologia
►Detecta exposição (ou vacinação), mas não
quando ela ocorreu !!!
►Para correlação com a doença:
Soros pareados
IgM
Líquido céfalo raquidiano
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Fim deste bloco Disponível em: labvir
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Infecções Persistentes
- após infecções “in útero”
- vírus não é reconhecido como “estranho”
- hospedeiro dissemina vírus
- hospedeiro pode não desenvolver anticorpos
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O QUE É INFECÇÃO LATENTE ?
- ocorre nas infecções por herpesvírus
- vírus aloja-se no gânglio nervoso ou células
do sistema imune
- sem lesões aparentes
- periodicamente reativado
- periodicamente dissemina
vírus ao meio ambiente