diagnostic methods in virology - masarykova univerzita · diagnostic methods in virology rndr. lud...
TRANSCRIPT
![Page 1: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/1.jpg)
Diagnostic Methods in Virology
RNDr. Luděk Eyer, Ph.D.Veterinary Research Institute, Brno
Department of VirologyEmerging Viral Diseases
![Page 2: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/2.jpg)
Why? • Identify virus/clusters
• Virus subtyping• Chain transmission
• Identification of drug-resistant mutants• Strain evolution
• Detect emerging pathogens
more effective therapy
![Page 3: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/3.jpg)
Klasické metody pro diagnostiku virů
![Page 4: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/4.jpg)
Culture methods in virologyCytopathic effect examination
Mock-infected cells: (no CPE) Tick borne encephalitis virus infected cells: (strong CPE)
Cell lines for TBE: porcine kidney cells (PS), human neuroblastoma cells (UKF-NB-4 )
![Page 5: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/5.jpg)
TBEV-induced cytopathic effect quantification
(Eyer et al. 2015)
![Page 6: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/6.jpg)
Histopathological changes
(Růžek et al., 2010)
![Page 7: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/7.jpg)
1 4 5 8
Non-infected
TBEV infected, non-treated
TBEV infected, treated with 7-deaza-2´-CMA (50 mg/kg)
Days post infection Monitoring the course of infection using in vivo imaging system
![Page 8: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/8.jpg)
Plaque titration assay
![Page 9: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/9.jpg)
Immunofluorescence staining
TBEV protein E
rabbit anti-TBEV protein E antibody (primary ab)
goat anti-rabbit antibody (secondary ab)
Fluorophore
cell structures
Fluorescence/confocal microscopy
![Page 10: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/10.jpg)
![Page 11: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/11.jpg)
Immunofluorescence staining of TBEV-infected PS cells
![Page 12: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/12.jpg)
Immunofluorescence staining: antiviral activity testingTick-borne ecephalitis virus
no antivirals
7-deaza-2´-C-methyladenosine(Eyer et al., 2015)
![Page 13: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/13.jpg)
Immunofluorescence staining: antiviral activity testingZika virus
![Page 14: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/14.jpg)
Elektronová mikroskopie
![Page 15: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/15.jpg)
Transmisní elektronový mikroskopNepohyblivý svazek elektronů, detekují se elektrony prošlé vzorkem, vhodnépro velmi malé objekty (viry, bakterie) případně se mikroskopují řezy (např. z buněk), velkými objekty elektrony neprojdou.-větší vzorky (buňky) se před prohlížením musí fixovat, odvodnit, zalít do pryskyřice a nařezat na ultramikrotonu-malé vzorky (hlavně viry) se přichytí na síťku a negativně barví (viz. protokol a ukázkové fotografie virů)
Rastrovací elektronový mikroskop Pohyblivý svazek elektronů, detekují se odražené sekundární elektrony (tedy používá se pro zobrazení povrchu vzorku)-vzorky se musí před mikroskopováním fixovat, odvodnit a vysušit
![Page 16: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/16.jpg)
Morfologické studie virových částic
![Page 17: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/17.jpg)
herpes simplex poxvirus paramyxovirus
adenovirus coronavirus rotavirus
Fotografie virových částic (transmisní EM, negativní barvení)
![Page 18: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/18.jpg)
Molekulárně-biologickémetody pro diagnostiku virů
![Page 19: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/19.jpg)
Molekulárně-biologické metody pro diagnostiku virů
znalost sekvence molekulární otisk (pattern, fingerprint)
![Page 20: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/20.jpg)
Molekulární techniky bez amplifikace DNA/RNA
Molekulárně-biologické techniky nevyžadujícípředchozí amplifikaci pomocí PCR
•pulsní gelová elektroforéza•hybridizační techniky
•restrikční analýza
![Page 21: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/21.jpg)
Hybridizace in situsondy značené fluorescenční protilátkou, nebo sondy tvořeny fluorescenčně
značenými nukleotidy – fluorescenční hybridizace in situ (FISH).
Multiplex detection in Huh-7 cells using the RNA FISH assay. Multiplex fluorescence RNA in situ detection of HCV viral genomic RNA (green) and 18S RNA (red) in Huh-7 cells lacking (-HCV) or containing (+HCV) an HCV replicon (Ikeda et al., 2002, J. Virol., 76: 2997-3006). In both panels, nuclei are stained with DAPI (blue).
![Page 22: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/22.jpg)
HIV-1 is expressed in HeLa and collected at different time points. Viral RNA expression is tracked in green while the cellular protein, hnRNP A1, is stained in red. Size bars are 10 µm.
![Page 23: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/23.jpg)
Detection of H1N1 Influenza A RNA migration in MEF cells using RNA fluorescence in situ hybridization. Murine embryonic fibroblasts (MEFs) were incubated on ice with influenza A virus (H1N1, PR8 strain). The cells were fixed and processed with the probe set against the nucleoprotein (NP) viral genomic segment (green). DNA is stained blue with DAPI.
![Page 24: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/24.jpg)
DNA-microarrays
• Labeled PCR product is hybridized to the probes, and hybridization signals are mapped to sevral positions within the array.
• Sequencing by hybridization
• Confocal microscopy is used to can the chip.
• First application: rapid sequencing to detect HIV mutations associated with drug resistance.
![Page 25: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/25.jpg)
Techniky založené na amplifikaci signálu•bDNA assays•hybrid capture assays
Techniky založené na amplifikaci cílovésekvence•PCR techniky•amplifikační metody založené na transkripci•amplifikace vytěsňováním řetězce
Techniky založené na amplifikaci sondy•cleavase-invander technology•ligázová řetězová reakce•technologie cyklující sondy
Molekulární techniky založené na amplifikaci
![Page 26: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/26.jpg)
Metody založené na polymerázové řetězové reakci (PCR)
![Page 27: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/27.jpg)
Tick-borne encephalitis diagnosis
ELISA, FIA, neutraliz. tests
Fatal cases: el. microscopy / RT-PCR from brain and other organs
![Page 28: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/28.jpg)
Zpětná PCR (RT-PCR)• metoda určená k amplifikaci molekul RNA• RNA – cDNA – DNA• retrovirové zpětné traskriptázy: M-MuLV, AMV
(termolabilita, enzym ztrácí funkčnost nad 42°C)
• termostabilní Tth DNA-polymeráza, za přítomnosti Mn2+ se vyznačuje RNA-dependentní DNA-polymerázovou aktivitou
• pro zahájení RT-PCR se využívá jako jeden z primerů oligo(dT)-primer rozeznávající poly(A)-konce mRNA nebo náhodné hexanukleotidy v případě, že mRNA není polyadenylovaná
• možnost využití taktéž sekvenčně specifických primerů
![Page 29: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/29.jpg)
Revese transcriptase-PCR methods for tick-borne encephalitis diagnostics
![Page 30: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/30.jpg)
• 252-bp long portion of highly conserved NS5 region of TBEV genome
• AMV reverse transcriptase
PCR-method for early differential diagnosis of tick-borne encephalitis
(Saksida et al., 2005)
![Page 31: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/31.jpg)
Mnohonásobná („MULTIPLEX“) PCR• do reakční směsi je přidáno několik párů primerů
rozpoznývajících několik rozdílných cílových sekvencí, což umožňuje detekci několika genů současně v jednéreakční směsi
• výhoda: nižší cenové náklady než při samostatných amplifikacích a proto se používá pro vyhledávání změn na dlouhých úsecích DNA, testování vzájemněnesouvisejících oblastí na DNA a zejména pro amplifikaci vnitřních kontrol současně se vzorky.
![Page 32: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/32.jpg)
Multiplex RT-PCR for subtyping of tick-borne encephalitis virus isolates
Unique conmbination of oligonucleotide primers hybridizing with subtype-specific signature positions of the sequence encoding viral E protein. (Růžek et al., 2007)
![Page 33: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/33.jpg)
Multiplex RT-PCR for subtyping of tick-borne encephalitis virus isolates
Subtyping of TBEV strains using the multiplex RT-PCR. Members of separate subtypes were analyzed individually (a) and in all possible combinations (b).
(Růžek et al., 2007)
![Page 34: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/34.jpg)
Diagnosis of TBEV in ticks
virus RNA isolationQIAamp RNA kit
(Qiagen)
tick samples
tick homogenisation
PCR amplification of sequence encoding E protein
identification of TBEV positive samples
(Růžek et al., 2007)
![Page 35: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/35.jpg)
Real time PCR/Kvantitatvní real time PCR
• amplifikace a detekce probíhají simultánně• kvantifikace amplikonu v reálném čase se provádí
prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve specálním zařízení, které kromě cyklického střídání teplot umožňuje detekci fluorescence a monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat produkty PCR elektroforeticky
• pro kvantitativní detekci produktu v průběhu PCR existují tři obecné metody založené na použití:
1. interkalačního barviva vázajícího se na DNA2. fluorescenčně značených sond vázající se na střední část
amplifikovaného produktu3. fluorescenčně značených primerů
![Page 36: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/36.jpg)
![Page 37: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/37.jpg)
Quantitative real-time RT-PCR for the laboratory detection of tick-borne encephalitis virus RNA
• targeting the 3´-noncoding region of the TBEV genome • highly sensitive and specific method to quantify of even low viral loeads in serum/CSF/tick
homogenate samples.
(Schwaiger and Cassinotti, 2003)
![Page 38: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/38.jpg)
(DeBiasi and Tyler, 2004)
![Page 39: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/39.jpg)
Miniature RT–PCR system for diagnosis of RNA-
based viruses
Molecular diagnosis of TBE: future perspectives
(Liao, 2005)
![Page 40: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/40.jpg)
Asymetrická PCR• technika pro přípravu PCR produktů pro sekvencování (Sangerova metoda vyžadující
ssDNA)• při asymetrické PCR jsou preferenčně tvořeny ssDNA• výchozí koncentrace primerů: jeden z primerů je ve 100x vyšší koncentraci než druhý
primer. Dvouřetězcové formy se tvoří až do okamžiku, kdy se jeden z primerů vyčerpá. Druhý primer pak dále syntetizuje pouze jeden z řetězců
• asymetrická PCR může být prováděna rovněž pouze s jedním primerem, zejména pro účely automatického sekvencování
![Page 41: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/41.jpg)
Imunologické metody pro diagnostiku virů
![Page 42: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/42.jpg)
Imunologické metody• Založeny na interakci protilátka-antigen
• Polyklonální protilátky-imunizace zvířat• Monoklonální protilátky-hybridomová technologie
• Rekombinantní protilátky-mol.biol.techniky• Nanoprotilátky-velbloudovití, paryby
Antigen Antigen
Protilátka
![Page 43: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/43.jpg)
• Klasické imunologické metody (aglutinační techniky, imunodifuzní
techniky, imunoelektroforetické metody) • Imunoanalytické metody (immunoassays)• Rychlé imunologické metody (lateral flow
immunoassays, dipstick techniky)• Biosenzorové technologie
Imunologické metody
![Page 44: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/44.jpg)
Klasické imunologické techniky
![Page 45: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/45.jpg)
• Precipitační metody• Aglutinační metody• Komplement-fixační reakce• Imunodifuzní metody• Imunoelektroforetické metody• Neutralizační testy
Klasické imunologické techniky
![Page 46: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/46.jpg)
+
HEMAGLUTINACE
![Page 47: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/47.jpg)
Aglutinační testy
Komerčně dostupné latexové aglutinační testy pro detekci Shiga toxin produkující E. coli
• Dryspot E. coli Seroscreen (Meridian BioScience, Inc., Cincinnati, OH)detekce non-O157 E. coli
• VTEC-RPLA (Oxoid Ltd. Hampshire, UK)detekce non-O157 E. coli
• VTEC-RPLA SEIKEN (Denka Seiken Co., Ltd., Tokyo, Japonsko)detekce non-O157 E. coli
![Page 48: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/48.jpg)
Virus neutralizační testSérologická metoda, při které se detekují protilátky z vyšetřovaného séra jedince proti virům. Je tedy určena k diagnostice některých virových nemocí člověka a zvířat. Test je založen na principu vazby specifických protilátek proti viru a následné inhibici cytopatického efektu.
![Page 49: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/49.jpg)
![Page 50: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/50.jpg)
Imunonalytické metody
![Page 51: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/51.jpg)
Imunoanalytické metody
•Radioizotopové metody
•Imunoenzymové metody
•Fluorescenční metody
•Chemiluminiscenční metody
•Alternativní metody
![Page 52: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/52.jpg)
Imunoanalytické metody
Homogenní x heterogenní
Kompetitivní x nekompetitivní
Antigen
Signálanalyt
tracer
![Page 53: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/53.jpg)
Imunoenzymovémetody (EIA)
protilátka nebo antigen značený enzymem
kolorimetrické stanovení (absorbance)
![Page 54: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/54.jpg)
Enzymy používané v EIA
![Page 55: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/55.jpg)
ELISAEnzyme linked immunosorbent assay
![Page 56: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/56.jpg)
![Page 57: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/57.jpg)
Přímá nekompetitivní ELISA
Antigen
Protilátka
Enzym
Substrát
Produkt Signál
![Page 58: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/58.jpg)
Nepřímá nekompetitivní ELISA
Antigen
Protilátka
Protilátka značenáenzymem
Enzym
Substrát
Produkt Signál
![Page 59: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/59.jpg)
Sandwich ELISA
Záchytnáprotilátka
Enzym
Antigen
Substrát
Produkt Signál
Protilátka značená
enzymem
Epitop 1
Epitop 2
![Page 60: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/60.jpg)
Stanovení
•mikrobiální antigen = přítomnost mikroorganismu v daném prostředí (např. v krvi pacienta, ve vzorku potraviny, ve vzorku životního prostředí)•specifickou protilátku proti mikroorganismu v klinických vzorcích
![Page 61: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/61.jpg)
Standardní k řivka pro nekompetitivní ELISA
Signál je přímo úměrný koncentraci analytu
![Page 62: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/62.jpg)
ELISA-based (serological) methods for tick-borne encephalitis diagnostics
![Page 63: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/63.jpg)
TBEV protein E
IgM / IgG from serum or CSF
Secondary anti-IgM or anti-IgG antibody
Enzyme
Substrate
Product Signal
![Page 64: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/64.jpg)
Commercial IgG/IgM-ELISA kits for the detection of anti-TBEV antibodies
(Niedrig, 2000)
![Page 65: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/65.jpg)
Virological interpretations of serological test results in case of a clinically suspected TBE
![Page 66: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/66.jpg)
Subviral particle-based ELISA• co-expression of recombinant prM/E protein
of TBEV in mammalian cells• realease of subviral particles (SPs) into the
culture medium• using the SPs as antigen for development of
TBE-specific ELISA • SP-IgG and SP-IgM ELISA systems• No cross-reactivity with antibodies against
other flaviviruses
![Page 67: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/67.jpg)
Komerčně dostupné kity pro detekci filovirů
![Page 68: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/68.jpg)
Technologie dipstick(Lateral flow immunoassay)
![Page 69: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/69.jpg)
Technologie dipstick
kontrolní
testovacíkontrolní
![Page 70: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/70.jpg)
RychlostNízké náklady
Vysoký počet vzorkůNekvalifikovaný personál
Polní a provozní podmínky
Nižší citlivost Preenrichment
Předběžné stanovení
Rychlé imunologické metody:
![Page 71: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/71.jpg)
PanBio Dengue Duo IgM and IgG Rapid Strip Test (PanBio,
Brisbane, Australia)
![Page 72: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/72.jpg)
Proteomické metody pro diagnostiku virů
![Page 73: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/73.jpg)
Elektromigra ční metody
![Page 74: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/74.jpg)
Elektromigrační metodySeparace nabitých látek ve stejnosměrném elektrickém poli
+
- +El. síla Fe Frikční síla Ff
= tření
mobilita: µ=v/E=Q/f [m-2V-1s-1]
![Page 75: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/75.jpg)
ElektroforézaDělení nabitých částic na základě rozdílných mobilit
Volná Zónová
Stabilizující prost ředí
•rotace
•gradienty hustoty
•porézní médium
•kapilára
Separace probíhávoln ě v elektrolytu
![Page 76: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/76.jpg)
Porézní média
chromatografický papír
agar, agaróza
acetát celulózy
škrob (hydrolyzovaný)
sypané (nalévané) vrstvy (Sephadex)
polyakrylamid
![Page 77: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/77.jpg)
![Page 78: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/78.jpg)
Polyakrylamid
kopolymer akrylamidu a N,N-bisakrylamidu
polymerace katalyzovaná TEMED
iniciátor persíran amonný
síťovaný gel
!!!! monomery jsou silné neurotoxiny !!!!
![Page 79: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/79.jpg)
Denaturační polyakrylamidová gelováelekroforéza (SDS-PAGE)
polyakrylamidový gel + aniontový detergent (SDS, dodecylsulfát sodný)
na 1 g bílkoviny se váže 1,4 g SDS – uniformnínáboj bílkoviny na jednotku Mr
![Page 80: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/80.jpg)
Denaturační polyakrylamidová gelováelekroforéza (SDS-PAGE)
Mr1
Mr2
Mr3
Mr1>Mr2>Mr3
![Page 81: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/81.jpg)
Studium proteomu a identifikace strukturních proteinůpolyvalentního stafylokokového bakteriofága
![Page 82: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/82.jpg)
Izoelektrická fokusaceElektroforéza v prostředígradientu pH. Látky se rozdělujípodle izoelektrických bodů (pI).
Proteiny se v elektrickémpoli pohybují podle náboje ažna místo, kde pH = pI.
Náboj má nulovou hodnotu a tamzůstávají stát.
IEF fokusace patří mezi metodys největší rozlišovací schopností.Gradient pH se tvoří pomocíamfolytů (komerčně dostupné)
Nosič - polyakrylamid
![Page 83: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/83.jpg)
2-D SDS-PAGEstudium proteomu
vysoká rozlišovací schopnost
I. klasická isoelektrická fokusace
II. SDS-PAGE
detekce stříbrem
srovnání jednotlivých gelůdensitometry
+ -
+ -
pI
Mr
![Page 84: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/84.jpg)
Proteinové profily polyvalentního stafylokokového bakteriofága získané pomocí 2-D SDS-PAGE
![Page 85: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/85.jpg)
![Page 86: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/86.jpg)
Western blotting
![Page 87: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/87.jpg)
Blotting (přesávka)
Přenesení biomolekuly na membránu
Southern blotting – přenos DNA
Northern blotting – přenos RNA
Western blotting – přenos proteinu
gel
membránaprotein
![Page 88: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/88.jpg)
Blotting (přesávka)
difuzní
kapilární
vakuový
elekroblotting
polosuchý (semidry blot)
kapkovací (dot blot)
![Page 89: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/89.jpg)
ElektroblottingKapilární blotting
Kapkovací blottingPolosuchý blotting
Vakuový blotting
![Page 90: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/90.jpg)
Membrány pro blotting
PVDF (polyvinyldendifluoridová) –hydrofobní interakce
nitrocelulosová – hydrofobní interakce
nylonová (+polymer) – elstat interakce
membrána s NH 2 skupinami –kovalentní reakce
![Page 91: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/91.jpg)
Western blot EBOLA-specifických glykoproteinů (GP) izolovaných ze séra 8 osob s akutní infekcí EBOLA
![Page 92: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/92.jpg)
Komerčně dostupnéwestern blot testy pro
detekci protilátek proti HIV
![Page 93: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/93.jpg)
Proteinové mikro čipy (biočipy)
![Page 94: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/94.jpg)
• Slibný experimentální přístup pro analýzu proteinů v budoucnosti
• Použití pro purifikaci proteinů, stanovení expresních profilů, meziproteinových interakcí
• Imobilizace protilátek, receptorů, ligandů, nukleových kyselin, uhlovodíků, látek s určitými biologickými vlastnostmi (kationty, anionty, látky s hydrofilním/fobním povrchem)
• Některé mají nízkou specifitu a vážou celé skupiny proteinů, jiné jsou vysoce specifické
• Kombinace s hmotnostní spektrometrií nebo biosenzory
• Stacionární vs. průtočné uspořádání
![Page 95: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/95.jpg)
DNA chips
microfluidic
surface plasmon resonance
fluorescent probes
![Page 96: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/96.jpg)
Schematické znázornění principu mikročipových/microarrayových technologií
![Page 97: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/97.jpg)
Multi-analytové mikro čipy (arrays)detekce a identifikace mnoha antigenů
v jediném stanovení
![Page 98: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/98.jpg)
Mikročip pro studium interakce virus-hostitel
![Page 99: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/99.jpg)
Aplikace mikročipů pro studium vztahů virus-hostitel
![Page 100: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/100.jpg)
Aplikace mikročipůpro detekci
biomarkerů infekce v séru pacienta
![Page 101: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/101.jpg)
Mikročip pro detekci protilátek proti mnohočetným patogenům v lidském séru
![Page 102: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/102.jpg)
Mikrofluidní (průtočné) mikročipy pro detekci
virů v klinických vzorcích
![Page 103: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/103.jpg)
Hmotnostníspektrometrie
![Page 104: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/104.jpg)
Hmotnostní spektrometrie• Hmotnostní spektrometrie je analytická metoda sloužící k
převedení molekul na ionty, rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) a následnému záznamu relativních intenzit jednotlivých iontů
• Hmotnostní spektrometr je iontově-optické zařízení, kterérozlišuje ionty podle poměru jejich m/z
• Výhody: vysoká citlivost, kvalitativní analýza (určení M.W. a dalších strukturních informací), kvantitativní analýza (odezva závislá na koncentraci), minimální spotřeba vzorku
• Nevýhody: destruktivní metoda, vysoké provozní náklady
![Page 105: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/105.jpg)
Základní části hmotnostního spektrometru1. iontový zdroj – slouží k převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice (tzv.
ionizace), konstrukce se liší podle použité ionizační techniky2. hmotnostní analyzátor – slouží k rozdělení iontů v plynné fázi za vysokého vakua podle
jejich m/z3. detektor – slouží k detekci iontů po jejich rozdělení podle m/z a k určení relativní
intenzity (četnosti) jednotlivých iontůDalší důležité části přístroje:- vakuový systém- iontová optika sloužící k urychlení a fokusaci iontů- počítač na ovládání a ladění přístroje, sběr, ukládání a zpracování dat, porovnání spekter
s knihovnou
![Page 106: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/106.jpg)
![Page 107: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/107.jpg)
Hmotnostní spektrum bakterie Mycobacterium tuberculosis
![Page 108: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/108.jpg)
Peptidové mapování s využitím hmotnostní spektrometrie pro studium proteomu stafylokokového bakteriofága
vzorek 2D-PAGE štěpenítrypsinem
MALDI TOF MS/MS
MS spektrumsrovnání s databázíidentifikace proteinu
přirazení k sekvenci DNA, identifikace ORF
![Page 109: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/109.jpg)
![Page 110: Diagnostic Methods in Virology - Masarykova univerzita · Diagnostic Methods in Virology RNDr. Lud ěk Eyer, Ph.D. Veterinary Research Institute, Brno Department of Virology Emerging](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022040316/5e24b5f2202e3d081810d178/html5/thumbnails/110.jpg)
Obr. 3. Lokalizace genů kódujících identifikované proteiny fága 812