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DIAGNOSTIC DE LA LMMC: PHÉNOTYPAGE
JOURNÉE GFHC-AFC_3 FÉVRIER 2016
Orianne Wagner-BallonHématologie Cellulaire
Hôpitaux universitaires Henri Mondor
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LES SOUS-POPULATIONS MONOCYTAIRES
CIRCULANTES CHEZ LES SUJETS SAINS
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LES 3 SOUS-POPULATIONS MONOCYTAIRES
ZIEGLER-HEITBROCK et al, Blood 2010WONG et al, Blood 2011
NOMENCLATURE COMMITEE OF THE INTERNATIONAL UNION OF IMMUNOLOGICAL SOCIETIES
MO3MONOCYTES
NON CLASSIQUES
CD14faibleCD16++
MO2
MO1MONOCYTES
CLASSIQUES
CD14++CD16-
10 ±4%
85 ±6%
5 ±2%
MONOCYTES
INTERMÉDIAIRES
CD14++CD16+
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CARACTÉRISATION PAR CMF À PARTIR DE PBMC
CD14
CD
16
MO2: 5.2%
MO3:5.4%
MO1:89.4%
Monocyte sans DN
CD45
SS
C-A
SS
C-A
CD24
Singulets
SS
C-A
CD16
CD14
CD
16
Monocyte
CD56
SS
C-A
DN
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
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VALIDATION DE LA STRATÉGIE D’ANALYSE
MORPHOLOGIE MONOCYTAIRE DES POPULATIONS MO1, MO2 & MO3
MO1
MO2
MO3
CD14
CD
16
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
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MO
1
MO
2
MO
3
CD16
VALIDATION DE LA STRATÉGIE D’ANALYSE
EXPRESSION DE GÈNES MONOCYTAIRES PAR LES POPULATIONS MO1, MO2 & MO3
MO
1
MO
2
MO
3
MO
1
MO
2
MO
3
CD14 CX3CR1 CD115
MO
1
MO
2
MO
3
MO
1
MO
2
MO
3
MO
1
MO
2
MO
3
CD64 CCR2 CD62L
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
MO
1
MO
2
MO
3
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VALIDATION DE LA STRATÉGIE D’ANALYSE
HIÉRARCHISATION DES POPULATIONS PAR SPADE
T cells
B cells
Residual Gran
NK
CD14
CD16
CX3CR1
CCR2MO1 MO2
MO3SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
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LES SOUS-POPULATIONS MONOCYTAIRES
CIRCULANTES DANS LA LMMC
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SIGNATURE PHÉNOTYPIQUE DE LA LMMC
ACCUMULATION DE MO1 DANS LA LMMC
Au
tres
hém
op
ath
ies
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
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COHORTE D’APPRENTISSAGE (PBMC)
MO
1(%
mo
no
cyte
s to
taux
)
Co
Age
d-C
o
Non
-CM
ML
Rea
ctiv
e
CM
ML
60
70
80
90
100
Co
ntr
ôle
s
Co
ntr
ôle
s âg
és
No
n L
MM
C
Mo
no
cyto
ses
réac
tio
nn
elle
s
LM
MC
� 26 Témoins < 65 ans: 86,1%
� 39 Témoins > 65 ans: 84,0%
� 24 Hémopathies non LMMC: 84,4%
� 33 Monocytoses réactionnelles: 79,1%
� 53 LMMC: 96,6%
***175 PATIENTS
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
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CO
HO
RT
ED
’AP
PR
EN
TIS
SA
GE
(PB
MC)
MO1 (% monocytes totaux)
C o
A g e d -C o
N o n -C M M L
R e a c tiv e
C M M L
60 70 80 90
100
Contrôles
Contrôles âgés
Non LMMC
Monocytosesréactionnelles
LMMC9
4%
Sp
écificité: 95,1%
Sen
sibilité: 9
0,6%
SE
LIM
OG
LU
-BU
ET
et al, B
loo
d 2
015
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VALIDATION EN ROUTINE ?
200 µl de sang total
CD64 FITCCD24 PECD56 PC5.5CD14 PC7CD2 APCCD16 PBCD45 KOr
Acquisition ≥ 50 000 évènements dans gate MO1
% MO1 au sein des monocytes totaux
Harmonisation: cibles sur Versacomp
TRANSPOSITION DU PROTOCOLE SUR SANG TOTAL
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
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STRATÉGIE D’EXCLUSION SUR SANG TOTAL
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
BOOLÉENNE « MONO2 » =CELLULES AND SINGULETS AND MONO
AND (NOT CD56+) AND (NOT CD2+) AND (NOT CD24+) AND (NOT "PN CD16+")
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STRATÉGIE D’EXCLUSION SUR SANG TOTAL
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
BOOLÉENNE « MONO Bis » =MONO2 AND (NOT DN)
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COHORTE DE VALIDATION (SANG TOTAL)C
on
trô
les
âgés
No
n L
MM
C
Mo
no
cyto
ses
réac
tio
nn
elle
s
LM
MC
� 68 Témoins > 65 ans: 85,1%
� 79 Hémopathies non LMMC: 81,9%
� 74 Monocytoses réactionnelles: 85,8%
� 86 LMMC: 96,4%
307 PATIENTS
MO
1(%
mo
no
cyte
s to
taux
)
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
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COHORTE DE VALIDATION (SANG TOTAL)
94%
Co
ntr
ôle
s âg
és
No
n L
MM
C
Mo
no
cyto
ses
réac
tio
nn
elle
s
LM
MC
Spécificité: 94,1%Sensibilité: 91,9%
MO
1(%
mo
no
cyte
s to
taux
)
Résultat similaire sur la moelle
� Difficulté du fenêtrage +++
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
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ACCUMULATION DE MO1 DYSPLASIQUES DANS LMMC
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
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SIGNATURE PHÉNOTYPIQUE SANGUINE DE LA LMMC
� Indépendante de la monocytose
� Indépendante des mutations/anomalies
cytogénétiques
� Indépendante de la forme de LMMC (proliférative vs
dysplasique)
� Indépendante du type de LMMC (Type 1 vs 2)
60 70 80 90 1000
10
20
30
CMMLReactive
Mo
no
cyto
se (G
/L)
MO1 (% monocytes totaux)
SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015
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LES CAS TYPIQUES
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LES CAS TYPIQUES DE LMMC AVEC MO1≥ 94%
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LES CAS DE LMMC AVEC <94% DE MO1
���� Sensibilité de 91,9%
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LES DIFFICULTÉS TECHNIQUES
DU PHÉNOTYPAGE LMMC
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LES DIFFICULTÉS TECHNIQUES PRÉ-ANALYTIQUES
�Acquisition d’un nombre suffisant d’évènements (50 000 MO1 minimum)
�Technique à partir de 200 µl de sang total
�Attention aux grandes hyperleucocytoses avec myélémie (dilution: 10 G/L de
leucocytes) �CD16 +++
� Panels d’anticorps d’exclusion: non imposé (exclusion des NK et de la myélémie +++)
� Deux anticorps diagnostiques: CD14 et CD16
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LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE D’EXCLUSION
�Attention à la stratégie d’exclusion ���� large fenêtre « monocytes »
sur CD45/SSC
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LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE D’EXCLUSION
�Attention à ne pas exclure les monocytes CD16+ ni les monocytes CD56+
���� Privilégier les histogrammes FL/SSC
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LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE D’EXCLUSION
� Exclure la myélémie
���� Intérêt du CD24
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LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE DES MO1
� Difficulté de positionnement des fenêtres
- distinction MO2/MO3: pas prise en compte dans calcul %
- distinction MO1/MO2 +++: travailler en density plot
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VERS UN NOUVEAU CRITÈRE DIAGNOSTIQUE…
� Limites de la définition OMS :
- diagnostic a posteriori
- un seul critère positif: monocytose > 1 G/L persistante depuis au moins 3 mois
- dysplasie non obligatoire
- présentation hétérogène
� Nouveau critère diagnostique indépendant de la monocytose : % MO1 ≥ 94%
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PERTINENCE DU SEUIL DE LA MONOCYTOSE À 1 G/L?
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Mo
no
cyto
se (G
/L)
0,49 G/L
193 témoins (145 témoins <65 ans
+ 48 patients > 65 ans)
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LES LMMC AVEC HEMATOFLOW® (BECKMAN-COULTER)
Remisol
Préparateurd’échantillons
FC500
CytoDiff®
AnalyseurDxH
CD36 FITC/CD2-CRTH2 PE/CD19 ECD/ CD16 PC5/ CD45 PC7
CytoDiff®
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LES LMMC AVEC HEMATOFLOW® (BECKMAN-COULTER)
TÉMOIN SAIN
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LES LMMC AVEC HEMATOFLOW® (BECKMAN-COULTER)
LMMC
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AUTRES CRITÈRES DIAGNOSTIQUES
À PRENDRE EN COMPTE
![Page 34: DIAGNOSTIC DE LA LMMC PHÉNOTYPAGE Hématologie …gfhc.fr/upload/activites/fev2016/LMMC Phéno.pdf · DIAGNOSTIC DE LA LMMC: PHÉNOTYPAGE JOURNÉE GFHC-AFC_3 FÉVRIER 2016 Orianne](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022031019/5b9c617509d3f2cb3b8ccc04/html5/thumbnails/34.jpg)
LES ANALYSES CYTOGÉNÉTIQUES ET MOLÉCULAIRES
�Caryotype médullaire : anomalies cytogénétiques dans 20 à 30% des cas
� Biologie moléculaire:
SALLMAN & PADRON, 2015
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CONCLUSIONS
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CYTOLOGIE: TAKE HOME MESSAGES
�Aspects cytologiques hétérogènes
� Rechercher des signes de dysplasie même minimes, y compris sur la lignée
monocytaire
� Prudence en cas de tableau infectieux associé, porte d’entrée fréquente de la maladie
�Quantification du compartiment blastes + promonocytes souvent délicate
� Le score mono-dysplasie sur automate XN permet d’éliminer les monocytoses
réactionnelles ne nécessitant pas de revue de lame
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IMMUNOPHÉNOTYPAGE: TAKE HOME MESSAGES
� Accumulation ≥ 94% de MO1 dans le sang périphérique : signature phénotypique
très spécifique de la LMMC
� Permet de distinguer LMMC des autres diagnostics différentiels dès l’analyse du sang
� Importance du pré-analytique
� Importance du panel et de la stratégie d’exclusion +++
� Intérêt de la solution HEMATOFLOW® pour le dépistage des LMMC
�Approche complémentaire de la cytologie
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REMERCIEMENTS
U1009
� Dorothée BUET
� Margot MARABITO
� Nathalie DROIN
� Éric SOLARY
Laboratoire d’Hématologie
� Valérie BARDET
� Michaela FONTENAY
Hématologie Cellulaire
� Emmanuel BENAYOUN
Laboratoire d’Hématologie
� Véronique SAADA
Cliniciens GFM
BREVET EUROPÉEN DÉPOSÉ