DIAGNOSI DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSITUBERCOLOSI

Enrico Enrico TortoliTortoli

La La tubercolositubercolosi

nel MONDO– 2.000.000 morti all’anno2.000.000 morti all’anno– 8.000.000 nuovi casi all’anno8.000.000 nuovi casi all’anno– 1/3 della popolazione mondiale infettato1/3 della popolazione mondiale infettato

in ITALIA– 4.287 casi notificati nel 20014.287 casi notificati nel 2001

Infezione da Infezione da M. tuberculosisM. tuberculosis

Malattia tubercolareMalattia tubercolare– se il sistema immunitario non riesce a se il sistema immunitario non riesce a

controllare l’infezionecontrollare l’infezione Infezione latente (assenza di malattia)Infezione latente (assenza di malattia)

– se l’infezione rimane sotto il controllo del se l’infezione rimane sotto il controllo del sistema immunitario sistema immunitario

M. tuberculosisM. tuberculosis, infezione, infezione

Esposizione al M. tuberculosis Assenza di infezione (5%)

Infezione (95%) TBC attiva (5%)(entro 2 anni)

TBC latente (95%) Riattivazione (5%)

nessuna riattivazione (90%)

Tempo

Risposta

ICM

Moltiplicazione batterica

Anticorpi

infezione malattia

Risposta immune Risposta immune all’infezione tubercolareall’infezione tubercolare

I linfociti TI linfociti T

Cellula-T nativa = non venuta in Cellula-T nativa = non venuta in contatto con l’Agcontatto con l’Ag

Cellula-T effettrice = cellula-T nativa Cellula-T effettrice = cellula-T nativa venuta in contatto con l’Agvenuta in contatto con l’Ag

Cellula-T memoria = cellula effettrice Cellula-T memoria = cellula effettrice dopo l’allontanamento dell’antigenedopo l’allontanamento dell’antigene

Cellula-T effettrice = cellula-T Cellula-T effettrice = cellula-T memoria in occasione di un nuovo memoria in occasione di un nuovo contatto con l’Agcontatto con l’Ag

La MantouxLa Mantoux

Introdotta nel 1890, è il più vecchio Introdotta nel 1890, è il più vecchio test diagnostico ancora in usotest diagnostico ancora in uso

Si basa sull’inoculo intradermico del Si basa sull’inoculo intradermico del PPD, (miscela di antigeni del PPD, (miscela di antigeni del M. M. tuberculosistuberculosis, alcuni dei quali sono , alcuni dei quali sono presenti anche nel BCG e nei presenti anche nel BCG e nei micobatteri non tubercolari)micobatteri non tubercolari)

MantouxMantoux

Linfocita TCellula presentante l’Ag

richiamo e richiamo e attivazione cellulareattivazione cellulare

indurimento e indurimento e arrossamentoarrossamento

nel punto dell’iniezionenel punto dell’iniezione

Rilascio di IFN-, TNF e IL8

Punti di forza della MantouxPunti di forza della Mantoux

Utile per predire la TBC attivaUtile per predire la TBC attiva Il trattamento dei soggetti Mantoux-Il trattamento dei soggetti Mantoux-

positivi riduce drasticamente il rischio di positivi riduce drasticamente il rischio di passaggio alla tubercolosi attivapassaggio alla tubercolosi attiva

Basso costoBasso costo Non richiede l’intervento del laboratorio Non richiede l’intervento del laboratorio

Limiti della MantouxLimiti della Mantoux

Falsi positiviFalsi positivi- 5-60% dei vaccinati5-60% dei vaccinati

Tempo trascorso dalla vaccinazioneTempo trascorso dalla vaccinazione Numero di vaccinazioniNumero di vaccinazioni Età al momento della vaccinazioneEtà al momento della vaccinazione

- Esposizione a micobatteri non tubercolari (NTM)- Esposizione a micobatteri non tubercolari (NTM)- Effetto - Effetto boosterbooster- Anergia (soggetti immunodepressi, malnutriti, con tubercolosi Anergia (soggetti immunodepressi, malnutriti, con tubercolosi

avanzata)avanzata) Falsi negativiFalsi negativi

- Errori di inoculo Errori di inoculo - Errori di lettura (soggettività, inaccuratezza della misurazione)Errori di lettura (soggettività, inaccuratezza della misurazione)

Problemi di ordine praticoProblemi di ordine pratico- Doppia presentazione del pazienteDoppia presentazione del paziente- Mancata lettura nel 30% dei casiMancata lettura nel 30% dei casi

Produzione di interferone-Produzione di interferone- (IFN-(IFN-))

L’infezione tubercolare stimola la risposta della L’infezione tubercolare stimola la risposta della cellule Tcellule T

Le cellule-T attivate secernono citochineLe cellule-T attivate secernono citochine– IFN-IFN- – TNFTNF– IL8IL8

Le cellule-T effettrici producono IFN-Le cellule-T effettrici producono IFN- entro poche entro poche ore dalla stimolazioneore dalla stimolazione

Le cellule-T memoria devono prima proliferare Le cellule-T memoria devono prima proliferare trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi in grado di produrre IFN-in grado di produrre IFN- prima di 24h prima di 24h

L’IFN-L’IFN- non è normalmente presente in circolo, è non è normalmente presente in circolo, è stabile e misurabilestabile e misurabile

I test basati sull’interferone-I test basati sull’interferone-γγ

I linfociti del soggetto in esame vengono posti in I linfociti del soggetto in esame vengono posti in contatto con l’antigene, con un controllo negativo contatto con l’antigene, con un controllo negativo privo di antigene e con un controllo positivo contiene privo di antigene e con un controllo positivo contiene fitoemoagglutininafitoemoagglutinina

Ricerca dell’IFN-Ricerca dell’IFN-γγ dopo opportuna incubazionedopo opportuna incubazione– assenza di IFN-assenza di IFN-γγ = ASSENZA DI INFEZIONE= ASSENZA DI INFEZIONE– presenza di IFN-presenza di IFN-γγ = INFEZIONE= INFEZIONE

presenza di IFN-presenza di IFN-γγ nel controllo NEG = TEST NON VALIDOnel controllo NEG = TEST NON VALIDO assenza di IFN-assenza di IFN-γγ nel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIOnel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIO

La scelta degli antigeniLa scelta degli antigeni

I linfociti T dei soggetti con infezione I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono interferone-tubercolare producono interferone-γγ se se vengono in contatto con uno o più antigeni vengono in contatto con uno o più antigeni del del M. tuberculosisM. tuberculosis– PPD (PPD (purified proteic derivativepurified proteic derivative))– ESAT-6 (ESAT-6 (early secretory antigenic targetearly secretory antigenic target 6) 6)– CFP-10 (CFP-10 (culture filtrate proteinculture filtrate protein 10) 10)

ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica (RD1) che manca nel BCG e regione genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i MNTin quasi tutti i MNT

Specificità di ESAT-6 and Specificità di ESAT-6 and CFP-10CFP-10

NTM Antigeni

M abscessus - -M avium - -M branderi - -M celatum - -M chelonae - -M fortuitum - -M gordonae - -M intracellulare - -M kansasii + +M malmoense - -M marinum + +M genavense - -M scrofulaceum - -M smegmatis - -M szulgai + +M terrae - -M vaccae - -M xenopi - -

Antigeni

ESAT-6 CFP-10 EAST-6 CFP-10

M tuberculosis + +

Ceppi BCG    

gothenburg - -

moreau - -

tice - -

tokyo - -

danish - -

glaxo - -

montreal - -

pasteur - -

Sangue eparinatoSangue eparinato

ESAT-6 CFP-10 Mitogeno

Trasferimento in pozzettiTrasferimento in pozzettie aggiunta dell’antigenee aggiunta dell’antigene

Incubazione overnight a 37Incubazione overnight a 37ooCC

Se sono presenti cellule-T effettrici Se sono presenti cellule-T effettrici viene secreto IFN-viene secreto IFN-

Recupero del plasma eRecupero del plasma edosaggio dell’IFNdosaggio dell’IFN--γγ(‘sandwich’ ELISA, (‘sandwich’ ELISA,

incubazione 120 min)incubazione 120 min)

Lavaggio, aggiuntaLavaggio, aggiunta di substrato e letturadi substrato e lettura

COLORECOLORE

Misura della DO e dosaggio dell’IFN-Misura della DO e dosaggio dell’IFN-contro una curva di taratura contro una curva di taratura

Metodo ELISAMetodo ELISA

K -

DO

450

nm

DO

450

nm

IFN- IU/ml

Metodo ELISA Metodo ELISA in-tubein-tube

Raccolta del sangue in provette eparinate

Incubazione per 16-24h a 37°C

Recupero del plasma eRecupero del plasma edosaggio dell’IFNdosaggio dell’IFN--γγ(‘sandwich’ ELISA, (‘sandwich’ ELISA,

incubazione 120 min)incubazione 120 min)

Lavaggio, aggiuntaLavaggio, aggiuntadi substrato e letturadi substrato e lettura

COLORECOLORE

K neg ESAT6 + CFP10 mitogenocentrifugazione

Misura della DO e dosaggio dell’IFN-Misura della DO e dosaggio dell’IFN-contro una curva di taratura contro una curva di taratura

DO

450

nm

DO

450

nm

IFN- IU/ml

Sangue eparinatoSangue eparinato

ESAT-6 CFP-10 Mitogeno

Trasferimento dei linfociti (250.000 cell.)Trasferimento dei linfociti (250.000 cell.)in pozzetti coated con Ab anti-IFN-γin pozzetti coated con Ab anti-IFN-γ

e aggiunta dell’antigenee aggiunta dell’antigene

Incubazione overnight a 37Incubazione overnight a 37ooCC Lavaggio e dosaggio dell’IFN-γLavaggio e dosaggio dell’IFN-γ(‘sandwich’ ELISA, (‘sandwich’ ELISA,

incubazione 120 min)incubazione 120 min)

Conteggio degli spot,Conteggio degli spot,al microscopio o conal microscopio o con

lettore automaticolettore automatico

K -

Separazione e conteggio dei leucociti Separazione e conteggio dei leucociti mononucleatimononucleati

COLORECOLORE

Metodo ELISpotMetodo ELISpot

Man mano che una cellula secerne Man mano che una cellula secerne IFN-IFN-γ γ questo viene legato dagli Ab questo viene legato dagli Ab sottostanti, si forma quindi uno spotsottostanti, si forma quindi uno spot

POSITIVO: quando si hanno spot con POSITIVO: quando si hanno spot con almeno uno degli antigenialmeno uno degli antigeni– se il K- ha 0-4 spot ed il pozzetto dell’Ag se il K- ha 0-4 spot ed il pozzetto dell’Ag

ha più di 5 spotha più di 5 spot– se il K- ha >5 e <10 spot ed il pozzetto se il K- ha >5 e <10 spot ed il pozzetto

con l’antigene ha un numero di spot con l’antigene ha un numero di spot almeno doppio almeno doppio

NON VALIDO se K- >10 spot e/o K+ NON VALIDO se K- >10 spot e/o K+ <20 spot<20 spot

Metodo ELISpot: letturaMetodo ELISpot: lettura

Test in vitroTest in vitro Nessun effetto Nessun effetto boosterbooster Specificità elevataSpecificità elevata Non influenzati dalla vaccinazione con BCG Non influenzati dalla vaccinazione con BCG Praticità: occorre solo un prelievo di Praticità: occorre solo un prelievo di

sangue e non è richiesta la collaborazione sangue e non è richiesta la collaborazione del pazientedel paziente

Interpretazione oggettivaInterpretazione oggettiva Eliminano il ricorso a trattamenti non Eliminano il ricorso a trattamenti non

necessarinecessari

Vantaggi dei metodi basati su Vantaggi dei metodi basati su IFN-IFN-

Valutazione clinica dei Valutazione clinica dei test test basati su IFN-basati su IFN-

Non esiste un gold standard per la Non esiste un gold standard per la tubercolosi latentetubercolosi latente– La sensibilità del test viene solitamente La sensibilità del test viene solitamente

stimata in soggetti con tubercolosi attiva, stimata in soggetti con tubercolosi attiva, usando la coltura come gold standard usando la coltura come gold standard

– La specificità viene solitamente stimata in La specificità viene solitamente stimata in soggetti ad alto rischiosoggetti ad alto rischio

La risposta IFN-La risposta IFN- ad ESAT-6/CFP-10 è ad ESAT-6/CFP-10 è predittiva del passaggio a TBC attiva?predittiva del passaggio a TBC attiva?

La risposta IFN-La risposta IFN- correla con l’esposizione correla con l’esposizione Circa il 90% dei pazienti rispondeCirca il 90% dei pazienti risponde In Etiopia, un In Etiopia, un follow upfollow up di 2 anni di di 2 anni di

contatti conviventi col caso indice, ha contatti conviventi col caso indice, ha dimostrato la correlazione della risposta dimostrato la correlazione della risposta ad ESAT-6 (ma non al PPD) con la ad ESAT-6 (ma non al PPD) con la progressione verso la malattia progressione verso la malattia

Doherty et al (JCM 2002)Doherty et al (JCM 2002)

CorrelazioneCorrelazione IFN- IFN-γγ//MantouxMantoux

IFN-IFN-γγ MantouxMantoux

SensibilitàSensibilità 89.0%89.0%(105/118)(105/118)

65.7%65.7%(50/76; 5 mm)(50/76; 5 mm)

SpecificitàSpecificità 98.2%98.2%(213/217)(213/217)

35.4%35.4%(73/113; 10 mm)(73/113; 10 mm)

Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004

Test IFN-Test IFN-γγ vs. Mantoux vs. Mantoux

Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva: Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva: SOVRAPPONIBILESOVRAPPONIBILE

Sensibilità nei casi di sospetta infezione Sensibilità nei casi di sospetta infezione latente: MAGGIORE per IFN-latente: MAGGIORE per IFN-γγ

I casi con Mantoux NEG e IFN-I casi con Mantoux NEG e IFN-γγ POS sono POS sono generalmente associati con l’esposizionegeneralmente associati con l’esposizione

I casi con Mantoux POS e IFN-I casi con Mantoux POS e IFN-γγ NEG non NEG non sono generalmente associati con sono generalmente associati con l’esposizionel’esposizione

AJRCCM, Mori, 2004

IFN-IFN-γγ e gruppi di rischio e gruppi di rischio

Studio dei contattiStudio dei contatti

Caso indice: uno studente di una scuola danese Caso indice: uno studente di una scuola danese Stratificazione dei contatti: Stratificazione dei contatti:

– Soggetti che cSoggetti che cantavano nello stesso coro del caso indiceantavano nello stesso coro del caso indice– Compagni di classeCompagni di classe– Altri studenti della scuolaAltri studenti della scuola

Forte correlazione della risposta IFN-Forte correlazione della risposta IFN-γγ con l’esposizione con l’esposizione Forte correlazione della Mantoux con la vaccinazioneForte correlazione della Mantoux con la vaccinazione

AJRCCM Brock , 2004

Studio dei contattiStudio dei contatti

Caso indice: una partoriente in un Caso indice: una partoriente in un ospedale italiano ospedale italiano

Stratificazione dei contatti: Stratificazione dei contatti: – Ricoverate nella stessa stanzaRicoverate nella stessa stanza– Neonati Neonati – VisitatoriVisitatori

Positività al test a base di IFN-Positività al test a base di IFN- fortemente correlata con l’esposizionefortemente correlata con l’esposizione

Mantoux quasi sempre negativaMantoux quasi sempre negativa

AJRCCM Richeldi, 2004

Altri studiAltri studi

Nessuna correlazione con la vaccinazioneNessuna correlazione con la vaccinazione Nessuna correlazione con le Nessuna correlazione con le

micobatteriosimicobatteriosi Nessuna variazione in corso di terapiaNessuna variazione in corso di terapia Alta riproducibilitàAlta riproducibilità Maggior sensibilità negli immunodepressiMaggior sensibilità negli immunodepressi

Da approfondireDa approfondire

Sensibilità negli immunodepressiSensibilità negli immunodepressi Sensibilità nei bambiniSensibilità nei bambini Sensibilità nella tubercolosi Sensibilità nella tubercolosi

extrapolmonareextrapolmonare Utilità nel monitoraggio della terapiaUtilità nel monitoraggio della terapia Specificità nei pazienti con Specificità nei pazienti con

micobatteriosimicobatteriosi

ATS: soggetti da testareATS: soggetti da testare

Soggetti con fibrosi polmonareSoggetti con fibrosi polmonare Soggetti provenienti da paesi ad alta endemia (in Soggetti provenienti da paesi ad alta endemia (in

particolare se arrivati da meno di un anno)particolare se arrivati da meno di un anno) Soggetti appartenenti a categorie sociali particolari Soggetti appartenenti a categorie sociali particolari

(senza fissa dimora, carcerati)(senza fissa dimora, carcerati) Operatori sanitariOperatori sanitari Contatti stretti (> 4h/settimana) di soggetti con Contatti stretti (> 4h/settimana) di soggetti con

tubercolositubercolosi HIV-positiviHIV-positivi Soggetti con Mantoux-conversione recente (< 2 anni)Soggetti con Mantoux-conversione recente (< 2 anni) Pazienti affetti da silicosi, neoplasie ematologiche, Pazienti affetti da silicosi, neoplasie ematologiche,

tossicodipendenti, immunosoppressitossicodipendenti, immunosoppressi