Diagnosi di Laboratorio della Emoglobinuria Parossistica

Notturna

FRANCESCO LANZA

UOC EMATOLOGIA /Lab Specialistico di Citometria e Cellule

Staminali

CREMONA

EPNEPN

Malattia clonale di natura acquisita Malattia clonale di natura acquisita

delle cellule staminalidelle cellule staminali emopoieticheemopoieticheche provoca:che provoca:

1.1.AnemiaAnemia dovuta ad dovuta ad emolisi emolisi

intravascolareintravascolare cronica e acuta;cronica e acuta;

1.1.Diatesi tromboembolicaDiatesi tromboembolica;;

2.2.LeucoLeuco--piastrinopeniapiastrinopenia

3.3.Distonia della muscolatura lisciaDistonia della muscolatura liscia

• Malaria• Auto-immune• Drug-induced• Micro-angiopathic• Other

ParoxysmalNocturnal

Haemoglobinuria(PNH)

Acquired

Familial HUS (due to defective C regulatory protein)

• Hemoglobinopathies• Enzimopathies• Membranopathies• Other

Hereditary

Extracorpuscolarcauses

Intracorpuscolar causes

CLASSIFICATION OF HAEMOLYTIC ANAEMIAS

HistoryHistory

Investigator Year Contribution

Gull 1866 Described nocturnal and paroxysmal nature of “intermittenthaematinuria” in a young tanner.

Strubing 1882 Distinguished PNH from paroxysmal cold haemoglobinuriaand march haemoglobinuria. Attributed the problem to RBC

van den Burgh 1911 Red cells lysed in acidified serum. Suggested a role forfor complement.

Enneking 1928 Coined the name “paroxysmal nocturnal haemoglobinuria”.

Marchiafava 1928- Described perpetual hemosiderinemia in absence of

and Micheli 1931 hemolysis. Their names became eponymous for PNH in Europe

Ham 1937- Identified the role of complement in lysis of PNH red cells

1939 cells. Developed the acidified serum test, also called “TheHam test, which is still used to diagnose PNH. Demonstrated that only a portion of PNH RBC are abnormally sensitiveto complement.

Davitz 1986 Suggests defect in membrane protein anchoring system responsible

Hall & Rosse 1996 Flow cytometry for the diagnosis of PNH

EpidemiologiaEpidemiologiaEPN, una malattia orfana molto raraEPN, una malattia orfana molto rara

�� Incidenza : 1 caso/1 milione abitanti (?) Incidenza : 1 caso/1 milione abitanti (?)

�� Prevalenza : 10Prevalenza : 10--20 casi/milione 20 casi/milione

�� Primo studio francese Primo studio francese �������� 220 casi / 1950 220 casi / 1950 –– 1995 1995

(Lancet, 1996, aggiornato nel 2006 (Lancet, 1996, aggiornato nel 2006 �������� 460 paz460 paz�� BBritish registry ritish registry �������� 55--600 pazienti (300 casi a Leeds)600 pazienti (300 casi a Leeds)

�� ItaliaItalia……? (98 casi Registro ISS, stima ? (98 casi Registro ISS, stima 250250--300300))

�� LombardiaLombardia 40 casi 40 casi

�� EtEtàà

�� media alla diagnosi : 35 anni media alla diagnosi : 35 anni

�� SopravvivenzaSopravvivenza

�� media : 10 media : 10 –– 15 anni (anni 90); simile a popolazione 15 anni (anni 90); simile a popolazione di controllo (2010) di controllo (2010)

MorbiditMorbiditàà e Mortalite Mortalitàà

�� Incidenza: 1Incidenza: 1--5 nuovi5 nuovicasi per casi per milione/annomilione/anno

�� MortalitMortalitàà a 5 a 5 anni: 35%anni: 35%

�� Diagnosi a tutte le Diagnosi a tutte le etetàà, mediana a 30 , mediana a 30 anni.anni.

�� Malattia progressivaMalattia progressiva

�� Impatto sulla qualitImpatto sulla qualitààdella vita della vita

100100

8080

6060

4040

2020

00

00 55 1010 1515 2020 2525

Anni dopo la diagnosiAnni dopo la diagnosi

Sopravvivenza (%)

Sopravvivenza (%)

The expected survival of an age- and sex-matched control group is shown for comparison

Hillmen et al 1995.

Tempo di sopravvivenza dopo la diagnosiTempo di sopravvivenza dopo la diagnosi

di EPN di EPN –– confronto con controlli saniconfronto con controlli sani

Controlli sani (appaiati Controlli sani (appaiati

Per etPer etàà e sesso)e sesso)

Pazienti EPNPazienti EPN

Overall survival of patients before and after eculi zumab .

Kelly R J et al. Blood 2011;117:6786-6792©2011 by American Society of Hematology

FisiopatologiaFisiopatologia�� I globuli rossi EPN mancano delle I globuli rossi EPN mancano delle

proteine di membrana di regolazione del proteine di membrana di regolazione del

complemento.complemento.

�� Tali proteine (Tali proteine (CD55 e CD59), impediscono CD55 e CD59), impediscono

normalmente lnormalmente l’’attivazione del sistema del attivazione del sistema del

complementocomplemento verso le cellule sane.verso le cellule sane.

�� Le cellule EPN ne sono parzialmente (tipo II) Le cellule EPN ne sono parzialmente (tipo II)

o totalmente (tipo III) deficitarie.o totalmente (tipo III) deficitarie.

GlicosilGlicosil--FosfatidilFosfatidil--Inositolo (GPI)Inositolo (GPI)

il glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI) svolge un ruolo importante nell’ancoraggio di proteine che non possono entrare nella membrana lipidica per la mancanza di un segmento idrofobo su fficientemente esteso.

EPNEPN

Surface of the red cellGPI-LINKED versus INTEGRAL MEMBRANE PROTEINS

CD55 CD55 (DAF)(DAF)Decay Accelerating Factor

Attiva il C3 e C5CD59 CD59 (MIRL)(MIRL)

Membrane Inhibitor of Reactive Lysis

Previene la formazione del MAC (Membrane Attack Complex)

EPN: FisiopatologiaEPN: Fisiopatologia

Gene Disease / FunctionF2L Coagulation Factor II like XG Xg blood groupXGR Expression of Xg on Erythrocytes

PIG A PNHCYBB Chronic granulomatous diseaseXK Mc Leod’s PhenotypeTHC Thrombocytopenia 1WAS Wiskott-Aldrich SyndromeGF1 Globin transcriptase factor 1ASB Anaemia‚ Sideroblastic‚ HypocromicALA S2 Aminolevulinate sinthase 2SCIDX1 Severe Combined Imm. Def.

AGMX1 Bruton Agammaglobulinaemia

HIGM1 Hyper IgM SyndromeLYP Lymphoproliferative SyndromeF9 Coagulation Factor IXF8C Coagulation Factor VIIICG&PD Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase

AGHX2 Agammaglobulinaemia (with GH deficit)

Somatic mutation(s) in the X-linked PIG -A geneCHROM. 1

EPN: rilievi laboratoristici

• Anemia, reticolocitosi, <aptoglobina

• Aumento del valore serico LDH (800-3000)

• Citopenia: neutropenia, trombocitopenia

• Emoglobinuria a poussee

• “Perpetual Hemosiderinuria”

• Segni di trombosi (dimero D) >40% pts

• Aumento parametri di flogosi (infezioni)

• Ipertensione polmonare

• Insufficenza renale

EPN: EmoglobinuriaEPN: Emoglobinuria

Emosiderina nelle urineEmosiderina nelle urine• L'EMOSIDERINURIA è un esame che serve per

valutare l'eliminazione dell'emosiderina (un prodotto di degradazione della ferritina , proteina di deposito del ferro) nelle urine (relevabile in alcune rare malattie emolitiche )

Patient RBCControlRBC

Test di Ham in corso di EPN

dAc dS dAc dHi pHi pAc H 20

GR Normali GR lisati

G6PD-A G6PD-B Whole RBC PNH RBCControls Patient

Luzzatto L et al. Florence ITT

Clonal origin of PNH cells in a G6PD A/B heterozygous patient

(From Elebute et al., BJH 123:552,2003)

LTC-ICs ARE MARKEDLY REDUCED IN PNH PATIENTS

TROMBOSITROMBOSI

100%124Total1,6%2Infarto miocardico / Angina instabile

13,7%17Ictus/TIA

Trombosi arteriosa4,0%5Trombosi superficiale5,6%7Trombosi venosa cerebrale6,5%8Embolia Polmonare

16,9%21Trombosi portale18,5%23Trombosi venosa mesenterica/splenica

33,1%18,5%14,5%

412318

Trombosi venosa profonda- Arti inferiori- Altre

Trombosi venosaTrombosi venosa EventiEventi %%

Ecografia addome con color-doppler: trombosi ramo portale destrotrombosi ramo portale destro

Trombo

Correlation between thrombotic Correlation between thrombotic

events & clone size: several factorsevents & clone size: several factors

may be implicated may be implicated

37%

19%

44%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

<20% 20-50 >50

PNH Granulocyte Clone Size (%)

% T

E

Lee JW et al. Hematologica 2010. 95 (s2): Abstract #505.

(n=43)

South Korean National Registry

EE’’ possibile stimare il rischio trombotico possibile stimare il rischio trombotico nei pz con EPN ? nei pz con EPN ?

SCREENING TROMBOFILICO ?SCREENING TROMBOFILICO ?

� La trombocitopenia associata a incidenza elevata di eventi TE1

– Nell’EPN si osserva trombocitopenia da consumo 1,21,2

–– La trombocitopenia da consumo può essere dovuta a La trombocitopenia da consumo può essere dovuta a microtrombosi diffusamicrotrombosi diffusa1,31,3

� D-dimero e altri markers di elevata risposta infiammato ria 3,4

– 61% e 82% di pz EPN in Francia e USA presentano livelli elevati di D-dimero

– Nell’EPN l’attivazione cronica del complemento porta a infiammazione cronica sistemica e ipercoagulabilità

1. Socie G et al. Blood. 2009; 114:Abtract 4030. 2. Hill A et al. Br J Haematol. 2007;137:181-192. 3. Weitz I et al. Thrombosis Research. 2010; 125: S106-107. 4. Helley D et al. Hematologica.2010; 95(4): 574-81 .

Baseline Platelet Count Proportion with History of TE 1

Thrombocytopenic < 100,000 X 109/L 45%

Non-Thrombocytopenic ≥ 100,000 X 109/L 27%

Prevalenza dellPrevalenza dell’’EPN nelle trombosi EPN nelle trombosi

atipiche: atipiche:

ll’’esempio della sindrome di Buddesempio della sindrome di Budd--ChiariChiari

�� Hoekstra et al, 2009Hoekstra et al, 2009–– Fino al 40% di incidenza di BCS nei pz. EPNFino al 40% di incidenza di BCS nei pz. EPN

�� Garcia Pagan, 2008Garcia Pagan, 2008–– In 128 pazienti con BCS il 10,5% EPN+In 128 pazienti con BCS il 10,5% EPN+

�� Darwish et al, 2009Darwish et al, 2009–– Su 168 pazienti 77 testati per EPN, di cui 15 Su 168 pazienti 77 testati per EPN, di cui 15

(19,5%) EPN+(19,5%) EPN+

Trombosi in sede atipica: iter diagnostico

Trombosi eredo-familiari

ATIIIProteina CProteina SPCA-R e FV LeidenProtombina mutataIperomocisteinemia

Più rare:↑ lipoproteina (a)Ridotta fibrinolisi (↑ di PAI-1 o ↓ di tPA)

Stati trombofilici acquisiti

Diabete mellitoSindrome da APANeoplasie (pancreas, stomaco, polmone)Sindrome nefrosicaMPDEPNProtesi valvolariMorbo di CrohnSindrome di BehcetTrombocitopenia da eparina

Patogenesi multifattoriale della Patogenesi multifattoriale della

trombosi nelltrombosi nell’’EPNEPN

� Emolis i

– Deplezione di ossido nitrico 1,2,3

• Iperattivazione piastrinica • Espressione P-selectine sull’endotelio• Esposizione di fosfatidilserina all’esterno delle cellule

– Microparticles che esprimono leukocyte derived tissue factor 5

– Alterazione della fibrinolisi1,3

� Eccessiva attivazione piastrinica da deficit di CD5 91,3

� Il fattore C5a contribuisce ad aumentare il rischio trombotico1,4

– Aumentata produzione di Tissue factor1,2,4

• Il recettore per l’urokinase-type plasminogen activator (u-PAR) èassente sui leucociti EPN6

• Alterazioni delle membrane endoteliali

1. Hill A et al. Br J Haematol. 2007;137:181-192. 2. Weitz I. Thrombosis Research. 2010; 125: S106–S107. 3. Helley D et al. Hematologica.2010; 95(4): 574-81. 4. Markiewski MM et al. Trends Immunology. 2007; 28(4): 184-192.; 2. Liebman HA, Feinstein DI. Thrombosis Research. 2003;111:235-238; 3. Plough et al, Blood. 1992.

Fisiopatologia della trombosi nellFisiopatologia della trombosi nell’’EPNEPN

Monocytes

Platelet

? Endothelial Cells

HemolysisHemolysis

Complement Injury

TF

ThrombinThrombin

GenerationGeneration

Co

mp

lem

en

tC

om

ple

me

nt

TF = Tissue factor, NO = Nitric-Oxide, PS = Protein S

NO

PS

InflammationC5aCytokines Il-6

FisiopatologiaFisiopatologiaLL’’emolisi nellemolisi nell’’EPNEPN

Emolisi intravascolare

Emoglobinemia

Emoglobinuria

Emosiderinuria

Eccessiva perdita di ferro

ANEMIAANEMIA

Danno renale

• Insufficienza acuta• Tossicità tubulare• Danno interstiziale• Insufficienza cronica

Deplezione del NO

•Dolore addominale•Disfagia•Disfunzione sessuale•Ipertensione polmonare

TROMBOSITROMBOSI

I globuli rossi normaliI globuli rossi normalisono protetti dallsono protetti dall ’’attacoattacodel complemento dalledel complemento dalle

proteine GPIproteine GPI --ancorateancorateCD55 e CD59CD55 e CD59

I globuli rossi EPN, non I globuli rossi EPN, non essendo protetti, essendo protetti, vengono lisativengono lisati

GR intattiGR intatti

AttivazioneAttivazionedel del

complementocomplemento

Riduzione dei GR Riduzione dei GR EmoglobinemiaEmoglobinemia

Anemia Anemia

EmoglobinuriaEmoglobinuria

TrombosiTrombosi

AffaticamentoAffaticamento

Danno RenaleDanno Renale

Impatto Impatto sulla sulla

morbilitmorbilit àà

Ipossibile Ipossibile mpatto mpatto

sulla sulla

mortalitmortalit ààIpertensione Ipertensione polmonarepolmonare

disfunzione erettiledisfunzione erettile

DispneaDispnea

DisfagiaDisfagia

AddominalgiaAddominalgia

FisiopatologiaFisiopatologiaLL’’emolisi nellemolisi nell’’EPNEPN

C5b

C5 C5a C7C8

C5b

C7

C6

C7

C6

C5b,6,7

C8

C5bC6

C5b-8

C9

C7

C8

C5bC6

C9

C7

C8

C5bC6

C9 x 12 - 15

C5b-9

CD59 CD59

X X

C5

conv

erta

se

C5

conv

erta

se

PNH COMPLEMENTPNH COMPLEMENT--MEDIATED MEDIATED

DISEASEDISEASE

TCD8+CD28-sup/reg

APC

TCD4+h

TCD4+h

IL-10

IL-6

IFNyAUTOREACTIVE T-CELLS FROM PNH SPECIFICALLYRECOGNIZE GPI

• Size of PNH red cell population

• PNH II versus PNH III

• Extent of Complement activation– In steady state (tick-over)

–When sudden further activation is caused by intercurrent event (various triggers possible)

FACTORS THAT INFLUENCE SEVERITY OF HEMOLYSIS

IN PNH

Classificazione dell’EPN Parker et al, Blood 2005

Categorie Emolisi CitopeniaIpoplasia

BM

Classica + -EPN in corso di altre patologie midollari (MDS, AA)

+ +

Subclinica - +/-

QuickTime™ and aGIF decompressor

are needed to see this picture.

PNHClinical variants

1.Florid haemolytic

2. PNH/aplasticanaemiasyndrome

Anemia emolitica Coombs negativa

Emoglobinuria

Conferma o esclusionedell’EPN

AA

AA +/- EPNMDS +/- EPN

Citopenia inspiegata

TrombosiInspiegata

(venosa o arteriosa)

Conferma o esclusionedell’EPN

Il risultato del test riveste un significatoin termini prognostici

e terapeutici *

MDS

* Parker, et al. Blood. 2005;106:3699-3709

Citometria ad alta sensibilità

Risultati quantitativi

Su GR e GB

Citometria ad alta sensibilità

Risultati quantitativi

Su GR e GB

Citometria ad alta sensibilità

Risultati quantitativi

Su GR e GB

Percorso diagnostico dellPercorso diagnostico dell ’’EPNEPN

Emolisi extra-vascolare C3-mediata dopo terapia con Eculizumab

(Atc Mo anti-C3 in GR- Coombs+)

Complementarity determining regions(murine origin)

Human IgG4 heavy chainconstant

regions 2 and 3

Human framework regions

Human IgG2 heavy chainconstant region 1 and hinge

CH1

CH3

CH2

HingeCL

Possibile comparsa di emolisi extra-vascolare spesso subclinica in paz in terapia con eculizumab

Rachidi S, Musallam KM, Taher AT. Eur.J Intern.Med. 2010;21:260-267;

PNH Diagnosis by Flow CytometryPNH Diagnosis by Flow Cytometry

Antigen Cell Lineage Function

CD14 monocytes LPS receptor, MDF

CD16 neutrophils Fc;III receptor

CD24 neutrophils B-cell differentiation marker

CD55 all lineages DAF

CD58 all lineages possible adhesion

CD59 all lineages MIRL, HRF, protectin

CD66b neutrophils CEA-related glycoprotein

Several monoclonal antibodies directed against GPI anchored Several monoclonal antibodies directed against GPI anchored proteins have been used in the diagnosis of PNHproteins have been used in the diagnosis of PNHThe most useful Abs are to CD14, 16, 24,55, 59, and 66.The most useful Abs are to CD14, 16, 24,55, 59, and 66.

CD59, CD90, CD109

CD55CD58CD59 CD48CD52PrPcCD16

CD24 CD55

CD58 CD59

CD48 PrPC CD73 CD108

CD55CD58CD59CD109PrPCGP500Gova/b

CD55CD58CD59PrPCAChEJMH AgDombroch HG Ag

CD55 CD58CD59 CD14CD16 CD24CD48 CD66bCD66c CD87CD109 CD157LAPNB1 PrPCp50-80 GPI-80ADP-RT NA1/NA2

CD14 CD55 CD58CD59 CD48 CD52CD87 CD109 CD157Group 8 PrPC GPI-80CD16*

CD55 CD58CD59 CD48CD52 CD87 CD108 PrPcADP-RT CD73CD90 CD109CD16

Haematopoietic Stem Cell

Platelets

RBC

Granulocytes

B cells

Monocytes

T cells

NK cells

Proteins deficient on PNH blood cells

Courtesy L. Del Vecchio

Classificazione cellule EPN

• PNH I Cellule Normali

• PNH II Deficit parziale

• PNH III Deficit Completo

Intensita’ di fluorescenza

cell count

IIIIII

Proteine GPI assenti in EPN

Granulocyte Lymphocyte

MonocyteErythrocyte

CD66b

CD24

CD59CD14

CD48

T

B

NK

Panel for cytometric analysis in patients with suspected PNH

From : Del Vecchio

Studio midollare in corso di EPN:

procedura errata a fini diagnostici

FLAER Alexa-488

CD59

RBCGR in

EPN

IIII

ERITROCITI

13.3%

FSC e SSC log

EPN: Monociti 3 popolazioni

CD33

CD45

CD14CD14

IIIIII

CD64

Proteina GPI-linked

FLAER

FLAER (FLUORESCENT AEROLYSIN)

Variante inattiva della Tossina batterica che si lega all’ancora GPI

Indicatore della presenza o della assenza

di TUTTEle molecole GPI-linked

Reagente di riferimento per la ricerca citometrica

di un Clone EPNin granulociti e monociti.

The bacterial toxin Aerolysin• Proaerolysin is a 52-kDa protein secreted by

Aeromonas hydrophila. After proteolytic nicking at the C-terminus, the active form, Aerolysin binds to cell surface structures and oligomerizes, forming channels that result in cell lysis.

• Aerolysin does not lyse PNH cells • It was used to enrich rare GPI-negative PNH clones.• An Alexa 488-linked version of a non-lysing, mutated

form of proaerolysin (FLAER) was generated with specificity for GPI-linked structures but unable to cause cell lysis.

• FLAER cannot be used to assess PNH clones in the erythrocyte lineage, since the latter do not possess surface-bound proteolytic enzymes needed to process the Proaerolysin.

D.R. Sutherland, 2007

Quando eseguire il Test EPN come screening

• emoglobinuria macroscopica o rilevabile dal punto di vista

biochimico

• anemie aplastiche

• anemie emolitiche Coombs-negative

• citopenie

• mielodisplasie

• alcuni casi di trombosi

Quando eseguire il Test EPN come follow-up

• monitoraggio di EPN florido

• presenza di piccoli cloni in corso di anemia aplstica o MDS

FITC PE PerCP PE-Cy 5.5 APC

GranulocitiMonociti

FLAER (CD66b)

CD24 CD45 CD33 CD14

Eritrociti CD59 CD55 CD45

FLAER vs CD66b

FLAER Alexa-488

Monociti e granulociti:

Monitoraggio nel tempo

Livello Soglia?5%

GRANULOCITI97.5%

MONOCITI96.8%

ERITROCITI

13.3%

CASO I

REFERTAZIONE

CASO I

GRANULOCITI

MONOCITI

ERITROCITI

CASO II

0.4%

0.1%

0.1%

GRANULOCITI

MONOCITI

ERITROCITI

CASO III

Monociti

Granulociti

EPN I

EPN III

EPN II

???

EPN I

EPN III

EPN II EPN I

EPN III

EPN II

Eventi apoptotici o necrotici

GRANULOCITI

Borowitz MJ, et al.

Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders.Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 78B:211–230 (2010)

Borowitz MJ, et al.

Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders.Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 78B:211–230 (2010)

FITC PE PerCP PE-Cy 5.5 APC

GranulocitiMonociti

FLAER (CD66b)

CD24 CD45 CD33 CD14

Eritrociti CD59 CD55 CD45

5-6-8- > 8 COLORS ??

TEST OF THE MONTH

LABORATORY TESTSFOR PNH

Paziente EPN

CD11b-FITC

CD55, CD59 –PE Normal

PNH

Soggetto Sano

PNH cells80%

Normal cells20%

10 per million

GPI neg /granulociti in soggetti normali

Araten DJ et al. PNAS U S A. 1999

Untreated After Ham Test

Glycophorin-A

CD55, CD59

GPI(–) GR in soggetti normali sensibilità alla lisi da complemento

Araten DJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(9):5209-14.

Percorso Diagnostico, Terapeutico e

Assistenziale (PDTA) relativo a:

EMOGLOBINURIA PAROSSISTICA

NOTTURNACodice esenzione RD0020

www.clonepnh.com

Laboratori in Lombardia

Laboratori attivi nell‘Archivio in

Lombardia (11)

Brescia - Spedali Civili

Cremona - AO Cremona

Lecco - PO Manzoni

Legnano - AO Legnano

Milano - AO Niguarda

Milano - AO S. Carlo

Milano - AO S.Paolo

Milano - AO Sacco

Milano - Istituto Nazionale Tumori

Pavia - S. Matteo

Varese - AO Ospedale di Circolo

Laboratori iscritti all‘Archivio in

Lombardia (16)

Brescia - Spedali Civili

Busto Arisizio - AO Circolo

Cremona - AO Cremona

Gallarate - AO S.Antonio Abate

Lecco - PO Manzoni

Legnano - AO Legnano

Milano - AO Niguarda

Milano - AO S. Carlo

Milano - AO S.Paolo

Milano - AO Sacco

Milano - Istituto Nazionale Tumori

Monza - Laboratorio di Ematologia

Rozzano - Humanitas

Pavia - S. Matteo

Treviglio - AO Treviglio

Varese - AO Ospedale di Circolo

STATISTICHE ITALIA

Regione Dimensione del clone Marcatore preferito %

LOMBARDIA

<1% granulociti_flaer 67

1-5% granulociti_flaer 100

>5% granulociti_flaer 63

EMILIA-ROMAGNA

<1% -

1-5% -

>5%granulociti_flaer

granulociti_altro

45

45

ITALIA

<1% granulociti_flaer 73

1-5% granulociti_flaer 35

>5% granulociti_CD66b 35

Qual è il binomio linea cellulare/anticorpo che ha convinto l’analista della

positività del test. In funzione della dimensione del clone

Emocromo: N Analisi

TERAPIA TARGET EPN: Eculizumab Atc diretto alla proteina C5 del Complemento

SOLIRIS

• Anticorpo monoclonale umanizzato diretto alla proteina C5 del complemento che blocca il “terminal complement activation”sui GR EPN

Complementarity determining regions(murine origin)

Human IgG4 heavy chainconstant

regions 2 and 3

Human framework regions

Human IgG2 heavy chainconstant region 1 and hinge

CH1

CH3

CH2

Hinge

CL

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

-4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Settimane

Placebo

Soliris

LDH

Le

vel (

U/li

ter)

P<0.001 (mixed model analysis)

TRIUMPH: Riduzione dellTRIUMPH: Riduzione dell ’’ LDHLDH

Hillmen P, et al. NEJM. 2006;355:1233-43.

Screening

Blood transfusion requirements in the 12 months bef ore eculizumab therapy and the most recent 12 months on eculizumab treatment in 64 patients.

Kelly R J et al. Blood 2011;117:6786-6792©2011 by American Society of Hematology

Transfusion independence: 40 of 61 patients (66%)

Il trattamento con eculizumab era associato a una significativa

riduzione dei valori plasmatici di markers di attivazione della

coagulazione (F1+2, p = 0.012, and D-dimers, p = 0.01) e di

fibrinolisi (P-AP, p = 0.0002)

Il trattamento con eculizumab era anche associato a una

significativa riduzione dei markers di attivazione endoteliale (t-

PA, p = 0.0005, sVCAM-1, p<0.0001, and vWF, p = 0.0047) e dei

valori plasmatici di TFPI totali (p = 0.0008) e liberi (p = 0.0013)

Markers di trombosi e attivazione Markers di trombosi e attivazione

endoteliale durante trattmento endoteliale durante trattmento

con Eculizumabcon Eculizumab

• TE event rate in patients treated with antithrombotic agents

was examined

• Eculizumab treatment significantly reduced the overall TE

event rate in patients treated concomitantly with

antithrombotics

– TE event rate 10.61 events/100 patient-years

pre- eculizumab

– Reduced to 0.62 events/100 patient-years in the

same patients during eculizumab treatment (P<.001)

– Relative reduction of 94%, and an absolute reduction of

9.99 TE events per 100 patient-years

Risultati sui pz in trattamento antiRisultati sui pz in trattamento anti--tromboticotrombotico

Hillmen et al. Blood 2007;110:4123-4128

92% Riduzione di Eventi 92% Riduzione di Eventi

TromboticiTrombotici22

SmPC: Sono stati osservati meno eventi trombotici d urante il trattamento con SOLIRIS ® che durante il corrispondente periodo di tempo pre-trat tamento Hillmen P, et al. Blood. 2007;110:4123-4128 .

39

3

05

1015202530354045

Pre-Eculizumab Treatment Eculizumab Treatment

Thr

ombo

tic E

vent

s (#

)

P=0.0001

� L’effetto della sospensione della tp anticoagulante non è stato studiato1

� Trombosi sia arteriosa che venosa2

N=195

Eculizumab Riduce lEculizumab Riduce l’’Incidenza di Trombosi in Incidenza di Trombosi in

Pazienti Trattati con AnticoagulantiPazienti Trattati con Anticoagulanti11

� 94% di riduzione di incidenza di trombosi con SOLIRIS

(n=91)(n=91)

PP<0.001<0.001

*excludes patients on antiplatelet agents

1. Hillmen P, et al. Blood. 2007;110:4123-4128.