determinacion de flavonoides

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PRÁCTICA N° 08

DETERMINACiÓN DE FLAVONOIDES

8.1 FLAVONOIDES:

Los flavonoides, son compuestos fenólicos y son en su mayoría pigmentos

responsables de la coloración de numerosas flores y de algunos frutos. El

elemento común de estos compuestos se han descrito varios millares de los

mismos, esta relacionado con un núcleo básico: el 2-fenil cromano. Los

flavonoides se encuentras ampliamente distribuidos en el reino vegetal,

generalmente en la forma soluble de glicósidos. Sus propiedades

farmacológicas están asociadas con la reducción de la permeabilidad

capilar. Entre estos tenemos a la rutina, la hesperidina y la quercetina.

FlavonoIs

HO

R¡ R2 Aglycone

At OH H QuercetinOH H H Kaempferol

OH OH . MyricetinOCH3 H IsorhamnetinR2

OH O

OBJETIVOS:~ Determinar la presencia del flavonoide rutina y hesperidína.

~ Conocer las reacciones químicas de identificación para flavonoides.

8.2 DETERMINACiÓN DE LA RUTINA:

8.2.1 FUNDAMENTO:La rutina es un flavonoide que tiene una mejor solubilidad en medio

alcohólico, que se caracteriza por dar positiva la prueba de Shinoda con una

variación de color que depende del tipo de estructura, asimismo se

__________~------------~----~~--~--~~-------------------65Universidad Los Ángeles de Chimbote / Escuela de Farmacia y Bioquímica --

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determina sus grupos fenólicos con el F+3 y por dar fluorescencia frente a la

luz UV.

8.2.2 MUESTRA: Hojas de Ruta graveolans "Ruda"

8.2.3 MATERIALES Y REACTIVOS:

~ Éter etílico~ Equipo soxhlet» Beaker de 100 y 250mL» Mg metálico» Tubos de ensayo» Alcohol etílico>- H2S04 concentrado

~ HCI concentrado>- FeCb 1% y EtOH~ Lámpara de Luz UV~ Alcohol amilico» Placas cromatográficas~ Acetato de Plomo 5%

8.2.4 EXTRACCiÓN

Fraccionar las hojas y proceder a un desengrasado en soxhlet con éter, con

el fin de eliminar las grasas, resinas y otros constituyentes. Al residuo

tratarlo posteriormente con agua caliente y decantar el líquido sobrenadante.

Concentrar el extracto acuoso y dejar en reposo por 5 días, tiempo en el

cual cristalizará la rutina. Si se desea purificar, efectuar cristalizaciones

empleando alcohol y por último desecar.

8.2.5 REACCIONES DE IDENTIFICACiÓN

>- Reacción de Shinoda o Cianidina: Caracteriza compuestos de estructura

benzopirona Si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se diluye

con 1mL de HCI concentrado y un pedacito de cinta de Mgo. Después de la

reacción se espera 5 minutos, se añade 1mL de alcohol amílico, se mezclan

fases y se deja reposar hasta que se separen.

o Si la alícuota del extracto os encuentra en agua, se procede de la

misma manera, a partir de la adición del HCI concentrado.

o El Ensayo se considera positivo, cuando el alcohol amílico se colorea

de amarillo, naranja, carmelita o rojo. Intensos en todos los casos.

>- Reacción con el FeCb 1%: Utilizar una solución acuosa de rutina, añadirle

gotas del reactivo de FeCb 1%.

~ __ ~~~,-~ __ ~~~ __ ~~~~~ __ ~ __ ~~~ 66Universidad Los Ángeles de Chimbote / Escuela de Farmacia y Bioquímica

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>- Observar a la Luz UV con y sin vapores amoníaco en un cromatograma

8.3 DETERMINACiÓN DE LA HESPERIDINA:

La hesperidina es un complejo cítroflavonolde que se encuentra en la

porción blanca y coloreada de la cáscara de naranja.

8.3.1 OBJETIVOS:

~ Determinar la presencia de hesperidina

8.3.2 FUNDAMENTO:

La Hesperidina, se caracteriza por ser soluble en alcohol diluido y como todo

flavonoide tiene fluorescencia frente a la Luz UV que se acentúa en medio

alcalino.

8.3.3 MUESTRA: Cáscara de Citrus sinensis "Naranja"


~ Alcohol diluido~ NaOH 1°%~ Beaker de 100 y 250MI~ HC110%~ Pipetas de 5MI~ Tubos de Ensayo~ Lámpara UV>- CIFe3

~ Embudo);> H2S04 concentrado~ Papel Filtro);> HN03 concentrado~ HCI concentrado~ NaOH 30%>- NH3 QP~ Placas Cromatográficas

8.3.4 EXTRACCiÓN:

Tratar 5 9 de la parte blanca de la cáscara de naranja con una mezcla de 20

mL de alcohol diluido y 5mL de una solución de NaOH 10%, dejar en reposo

24 h Y añadirle HCI al 10% hasta pH 5, con lo que se consigue precipitar la

hesperidina.

Dejar en reposo y filtrar, el líquido filtrado se vuelve a dejar en reposo, filtrar

nuevamente sobre el anterior y lavar el pp. hasta reacción neutra.

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Q.FMaría Isabel palacios Palacios cura de Prácticas de sarmaccancsra y Fitoqufmlca

Posteriormente secar el residuo, con lo que se consigue que cristalice la

hesperidina.

8.3.5 REACCIONES DE IDENTIFICACiÓN:

>- Tratar mg del pp. más gotas de H.2S04 concentrado, inicialmente da

coloración amarillo rojizo, que por calentamiento pasa a rojo.

> Tratar mg del pp. más gotas de Hel concentrado, da coloración amarillo

intenso.

> Tratar mg del pp. más gotas de NaOH 30 %, da coloración amarillo naranja.

>- Reacción de Shinoda similar a la Rutina

>- Observar la Fluorescencia a la lámpara UV con y sin vapores de NH3 en un

cromatograma

8.4 RESULTADOS:

__________~~ __--~ ----~~--~--~~~-----------------68Universidad Los Ángeles de Chimbote / Escuela de Farmacia y Bioquímica

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8.6 CONCLUSIONES:

8.7 CUESTIONARIO:

~ Color de la fluorescencia de la rutina y la hesperidina

~ Qué color se observa con la rutina y la hesperidina después de hacer la

reacción de Shinoda.

~ Mencione otros tipos de flavonoides que existan y esquernatice su

estructura química.

~ De las reacciones de identificación del (1) al (4) explique por se producen

los cambios y/o aparición de las colo raciones.

~ A que cree que se deba que los flavonoides presenten fluorescencia.

~ Propiedades farmacológicas de los flavonoides.

~ __ ~~~-, __ ~~~~ __ ~~ __ ~~~ __ ~~~~~ 70Universidad Los Ángeles de Chimbote / Escuela de Farmacia y 8ioquímica

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PRÁCTICA N° 9

DROGAS CON CUMARINAS E IRIDOIDES

9.1 DROGAS CON CUMARINAS

Las cumarinas son derivados de la -benzopirona, es una láctona

cíclica que se caracteriza por que dan fluorescencia frente a la Luz UV y que

se acentúa en medio alcaüno. El nombre de cumarina proviene de

"coumarou' nombre vernácula del "haba tonka" (Dipteryx odorata willd.), del

que se aisló en 1820. Casi todas las cumarinas se encuentran sustituidas en

7 por un hidroxilo.

Cumarina Fraxino

OCH3

HO~

HCO~O~O:3 .

OBJETIVO:

~ Determinar la presencia de cumarinas en Plantas Medicinales

~ Observar la Fluorescencia a la Luz UV

9.1.1 FUNDAMENTO:

Las cumarinas se extraen con acetona ó también en medio alcohólico dando

soluciones coloreadas. La Reacción de Baljet es para detectar grupos

lactónicos y la reacción del hidroxamato es por el grupo carbonilo y la amina

formándose un compuesto condensado.

9.1.2 MUESTRA: Cichorium intybus "Achicoria" y Taraxacum offinacinale "Diente

de León"

____~~ __~~--~~~ __~--~~~--~~~~~-----------------73Universidad Los Ángeles de Chimbote / Escuela de Farmacia y Bioquímíca

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9.1.3 MATERIALES Y REACTIVOS:» Matraz de 250 mi » NaOH 5%» Refrigerante » Hel 0.5 mol/L» Embudo » NaOH 2N» Tubos de ensayo » Ácido acético glacial» NaOH 5% > NH3~ N03Ag 1N en acetona » Clorhidrato de hidroxilamina en EtOH a110%~ FeCb » KOH 10%» Acido Pícrico 1% en EtOH

9.1.40BTENCfÓN:

Se toman 5 g de raíz, fresca o desecada, triturada y pulverizada y se le

adiciona 50 mL de acetona ó éter de petróleo, se le somete a una extracción

por reflujo por 30 minutos, obteniéndose una solución de color amarillo.

Filtrar.

9.1.5 REACCIONES DE IDENTIFICACiÓN:

~ Reacción de Baljet: Si la alícuota no se encuentra en alcohol, debe

evaporaras el solvente en un baño de agua y redisolverse en la menor

cantidad de alcohol (1 mI) se le adiciona 1 mI del reactivo de Baijet, formado

por cantidades iguales de NaOH 10% Y de Acido pícrico 1 % en EtOH que se

deben mezclar en el momento del ensayo y llevar a BM hasta la aparición

de una coloración 6 precipitado rojo (++ y ++++) respectivamente.

> Ensayo de Hidroxamato férrico: Una alícuota se coloca en un tubo y se

añade 1 gota de clorhidrato de hidroxilamina en EtOH al 10%. Se añaden

gotas de KOH 10% en etanol y se calienta hasta burbujeo, se añaden unas

gotas de ácido clorhídrico 0.5 mol/L y una gota de FeCh 1%. El desarrollo

de una coloración violeta (+), claro (++), intenso( +-H-) indica presencia de

cumarinas.

~ Del extracto tomar unos 5 mi y añadirle 2 mi de una solución de NaOH 5%,

se acentúa la coloración amarilla y se ve un tenue precipitado.

>- CCF.

o Sistema de solvente: CHCI3: AcOH:H20 (4:1:1)

o Soporte : Silicagel G

__------__~~-- __~ __--~-- ~-- __--~~~-----------------74Universidad Los Ángeles de Chimbote / Escuela de Farmacia y Bioquímica

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o Revelador : Luz UV, Sol. de N03Ag 1N en Acetona,

NaOH 2N y EtOH(5:15) y AcOH glacial.

9.2 DROGAS CON IRIDOIDES:

Son monoterpenos que se caracterizan por un esqueleto biciclico

ciclopentapiránico, los iridoides toman su nombre de unas hormigas

australianas: el iridodial, es el compuesto más sencillo del grupo, se aisló a

partir de Iridomirmex y en estos insectos desempeña un papel de defensa.

Iridoide VaJepotriato Loganina

ORl

HO

Q-Gluc

Loganine

9.2.1 OBJETIVO

~ Determinar la presencia de iridoides en Plantas Medicinales

~ Detectar por cromatografía la presencia de iridoides

9.2.2. FUNDAMENTO:

Se fundamenta en una extracción del iridoide en una especie vegetal fresca

y su posterior determinación con vainillina en medio ácido.

9.2.3 MUESTRA: Plantago major "Llantén" - Valeriana officinalis "Valeriana"

9.2.4 MATERIALES y REACTIVOS

» Matraz de 250 mi » Metanol ó etanol Q.P.

__________~----~--~~~~------------~~----------------75Universidad Los Ángeles de Chimbote / Escuela de Farmacia y Bioquímica

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~ Capilar de vidrio ~ Vainillina

~ Papel de filtro ~ HCI

~ Alcohol de 70° ~ Placas cromatográficas

~ H2S04 concentrado ~ Anís aldehído

~ Ácido acético glacial ~ Lámpara UV

~9.2.5 EXTRACCIÓN

Macerar algunos gramos de hojas de Plantaga majar « llantén" o raíz de

Va/eríana Off valeriana", recién recolectados y finamente triturados en

cantidad suficiente de alcohol de 70' para cubrir y dejar en reposo por

espacio de 48 horas a temperatura ambiente. Filtrar.

9.2.6 REACCIONES DE IDENTIFICACiÓN

>- Tomar del extracto con un capilar y puntear en un papel de filtro unas 5 a 10

veces, dejando secar después de cada adición. Colocar en la mancha 1 ó 2

gotas de la solución reactivo de vainillina clorhídrica, calentar suaver:nente

por 5 minutos y observar la coloración persistente que oscila entre la gama

del rosado al rojo en caso positivo.

~ CCF

o Sistema de solvente: BuOH:AcOH:H20 (63:10:27)

o Soporte: Silicagel G

o Revelador: Vainillina Clorhídrica al 2%

• Anisaldehído en medio clorhídrico

• AcOH:HCI (2:8)

• Lámpara UV

9.3 RESULTADOS:

__________~------------------------------~-------------------76Universidad Los Ángeles de Chimbote / Escuela de Farmacia y Bioquímica

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9.5 CONCLUSIÓN:

9.6 CUESTIONARIO:

~ ¿Qué color de fluorescencia tiene la cumarina y cuando se añade

vapores de amoníaco que cambios se observa?

~ ¿Qué otras especies vegetales contienen glicósidos cumarinicos e

iridoides?

~ Importancia terapéutica de las cumarinas y los iridoides

__________ ~--------------------------------~-------------------78Universidad los Ángeles de Chimbote I Escuela de Farmacia y Bioquímica

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PRÁCTICA N° 10

DROGAS CON TANINOS GÁLlCOS y CA TÉQUICOS

COOH OG OH

08~OG ~OHHO

lB0,---- ,\ ~

,\\\

HO OH G -,OH Tanino gálico ° OH

IÁcido gálico G OH Catequina

10.1 OBJETIVOS:

~ Extraer los taninos de una droga vegetal

~ Caracterizar a los taninos mediante reacciones químicas de identificación y

diferenciación

~ Cuantificar espectrofotométricamente los taninos en plantas medicinales

10.2 FUNDAMENTO:

Los taninos son sustancias de composición quirrúca cornpieja, que a\

degradarse o hidrolizarse se obtienen polifenoles relativamente simples. En

general son polímeros de alto peso molecular que forman soluciones

coloidales en medio acuoso. Por su naturaleza fenólica reaccionan con las

sales de fierro dando coloraciones azules o verdes, tienen capacidad de

reducir al permanganato, forman complejos con cationes divalentes como el

Pb+2, Hg+2.

10.3 MUESTRAS:

Vainas de Caesalpínea spínosa "tara" -

Raíz de Krameria triandra "ratania del Perú"

Hojas de Piper elongatum "matico"

__________ ~----------------~~---- __ ----~ ---------------81Universidad Los Ángeles de Chimbote I Escuela de Farmacia y Bioquímíca

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10.4 MATERIALES Y REACTIVOS:

» Tubos de Prueba ~ FeCb 1%

» Matraz de 250 mL ~ KMn041%» Refrigerante » Acetato de Pb 5%» Cocina eléctrica » Acetato de Hg 5%» Papel de Filtro » Solución de gelatina» Embudo » Solución de alcaloides

10.5 EXTRACCiÓN:

Preparar extractos etanólicos al 50 % de las muestras con 48 horas de

anticipación, con agitación permanente con la finalidad de extraer los taninos

de las muestras y puedan ser utilizadas en las determinaciones cualitativas,

de diferenciación y de cuantifícación.

REACIONES CUALITATIVAS DE IDENTIFICACiÓN:

Filtrar los extractos y concentrar para reducir el volumen y prep~rar una

batería de tubos de prueba y realizar las siguientes reacciones:

REACCiÓN DE COLORACiÓN CON EL CLORURO FÉRRICO:

Tomar una alícuota de las muestras y añadirle gotas del reactivo de FeCb

1%; observar el color que se forman:

>- Color azul-negruzco: Taninos gálicos

>- Color verde-azulado: Taninos catéquicos

REACCiÓN DE ÓXIDO REDUCCiÓN:

Tomar una alícuota de las muestras y añadirle gotas del reactivo de KMn04

1%. La reacción es positiva si desaparece el color violeta del permanganato

REACCiÓN DE PRECIPITACiÓN:

Tomar una alícuota de las muestras y añadirle gotas de los reactivos de

Acetato de Plomo 5%, Acetato de Mercurio 5%, Acetato de Cu 5%. Observar

.~ __ ~~ __ ~~ __ ~~~ __ ~ __ ~~~ __ ~ __ ~~~ 82Universidad Los Ángeles de Chimbote / Escuela de Farmacia y Bioquímica

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la formación de precipitados por la formación de complejos metálicos o

tanatos de Pb, Hg Y Cu; respectivamente.

REACCiÓN DE DIFERENCIACiÓN: REACCiÓN DEL FORMOl

ClORHIDRICO O REACCiÓN DE STIASNY

Los taninos gálicos o catéquicos se hidrolizan en medio ácido y de forrnol.

Los taninos gálicos permanecen en solución, mientras que los taninos

catéquicos se polimerizan formando una sustancia insoluble de color rojo

llamado flobafeno o tanino rojo.

10.6 MATERIALES Y REACTIVOS:

~ Matraz de 250 mL ~ Embudo

~ Beaker ~ HCI concentrado

~ Refrigerante > Formol al 38-40%

~ Cocina eléctrica ~ Pipetas de 5,10 mL

> Papel de Filtro ~ FeCb

"10.7 PROCEDIMIENTO:

Tomar unos 50 mL de la muestra problema al 40%, añadir unos 5 mL de

HCI concentrado y 10 mL de Formol al 38-40% y llevar a ebullición por unos

30 minutos en un sistema de reflujo. Los taninos gálicos no forman

precipitados. Los taninos catéquicos forman precipitados insolubles de color

rojo. Enfriar y filtrar la solución, tomar una alícuota del filtrado y añadirle

gotas del reactivo de FeCI3 en presencia de acetato de sodio al 5%. Si se

forma una coloración azul oscura, indica la presencia de taninos gálicos o

elágicos.

10.8 CUANTlFICACIÓN DE TANINOS POR ESPECTROFOTOMETRIA:

MÉTODO DEL ÁCIDO FOSFOMOllBDICO

Se fundamenta en la capacidad reductora del tanino sobre el ácido

fosfomolíbdico que en medio alcalino da una coloración azul que puede ser

leído al espectrofotometro a 700 nm.

____~~--~~--~~~--~~~~~--~~~~~-----------------83Universidad Los Ángeles de Chimbote I Escuela de Farmacia y Bioquímica

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:» Etanol

:» Balanza Analítica

> Erlenmeyer

~ Na2C03

:» Ácido tánico

:» Pi eta de 5mL, 1 mL 2 mL

:» Equipo de reflujo

> Tungstato de sodio

> Acido fosfomolíbidico

:» Embudo

> Papel de Filtro

> Fiola de 50 mL


10.8.2 PROCEDIMIENTO

Pesar 10g de la droga en polvo, se lleva a un frasco cónico de 1000 mL con

500 mL de alcohol al 50%. Mantener en agitación durante 6 horas en un

agitador magnético, dejar en reposo por 8 horas, luego volver a agitar por 30

minutos y filtrar. Se transfieren 3 mL del filtrado a un matraz aforado y se

diluye con agua destilada hasta enrase (SOLUCIÓN MUESTRA).

Se prepara un juego de 4 matraces aforados de 50 mL cada uno y se rotula

como B (blanco), S (referencia), M1 y M2 (muestra problema) y se procede

de la siguiente manera:

REACTIVOS B P M1 Y M2Solución Muestra - - 1.0 mLSolución de Referencia - 3.0 mL -Agua destilada 5.0 mL 2.0 mL 4.0 mLReactivo para taninos 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mLSe agita, se deja en reposo por 5 minutosSolución de Na2C03 20% 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mLSe completa con aqua destilada hasta enrase y se mezcla bien.

Leer la absorbancia de la solución de referencia y las muestras a 700 nm en

un término no mayor de 2 minutos.

10.8.3 CÁLCULOS:

o/ T . AmpxStxlOOO 100/0 anmos == . x

AstxMpx(IOO - %H)

__________~----------------~~----------~-------------------84Universidad Los Ángeles de Chimbote / Escuela de Farmacia y Bioquímica

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Amp = absorbancia de la muestra problema

Ast = Absorbancia del estándar

St = masa del estándar (g)

Mp = masa de la muestra problema (g)

%H = porcentaje de humedad de la droga

10.9 RESULTADOS:

__________~~--~~~--~--~~~--~~~~~----------------85Universidad Los Ángeles de Chimbote / Escuela de Farmacia y Bioquímica

O.F María Isabel palacios palacios Guía de Prácticas de Farmacognosia y FltOquímica

10.12

~

~

~

~

~

CUESTIONARIO:

Reacciones químicas de las pruebas de identificación para los tar¡¡;..•Mencione otros métodos de cuantificación de los taninos

¿Cuáles son las propiedades medicinales de los taninos?

¿Cuáles son las especies medicinales que poseen taninos?

¿Propiedades medicinales del Piper angustifolium "rnatico"?

____~~--~~--~~~~~--~~~--~~~~~-----------------87Universidad Los Ángeles de Chimbote I Escuela de Farmacia y Bioquímica

determinacion de flavonoides

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