detección diagnóstica de cianotoxinas cianobacterias … · toxinas cianobacterianas (metabolitos...
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Detección diagnóstica de
Cianotoxinas
y Cianobacterias Toxígenas
Graciela L. Salerno
FUNDACIÓN PARA INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS APLICADAS
Centro de Investigaciones Biológicas- Mar del Plata - ARGENTINA
FIBA
FIBA-Mar del PlataBuenos Aires, 25/11/2011
Las Floracioneso “BLOOMS”
Las cianobacterias como
organismos “peligrosos”
Diversidad de cianobacterias
Toxinas cianobacterianas(Metabolitos secundarios)
HEPATOTOXINAS (microcistina, nodularina,
péptidos cíclicos) Anabaena spp., Anabenopsis, Microcystis,
Nostoc, Oscillatoria, Planktothrix, Nodularia)
HEPATOTOXINAS (Cilindrospermopsina, alcaloide)Aphanizomenon, Cylindrospermopsis
NEUROTOXINAS (Anatoxina a, saxitoxina, alcaloides)
Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermum,
A. circinalis, Aphazinomenon flos-aquae, Lyngbya wolleii)
Dermototoxinas (Aplisiatoxina, Lyngbiatoxina,
alcaloides) Lyngbia
Compuestos volátiles (olor a gamexane, debido a la producción de
geosmina y 2-metil isoborneol, o de gas sulfhídrico), por
cianobacterias o hongos asociados.
“BLOOMS”
Microcystis sp.
Microcystis aeruginosa
Caracterización morfológica de M. aeruginosa
(CAAT 2005-3) (Light microscopy 100x) y tinción negativa
Detección de
especies productoras de toxinas
Monitoreos ambientales
-- Análisis microscópicos
-- Detección molecular
Moffit MC et al. 2004
Operones de cianotoxinas8
8
8
8
mcyE
mcyG
mcyD
mcyJ
mcyF
mcyD
mcyE
mcyE
mcyG
mcyD
mcyG
mcyA
mcyA
mcyH
mcyB
mcyB
mcyBmcyA
mcyC
mcyC
mcyC mcyJ
mcyH I F
mcyJ I H
mcyT
ndaI H G ndaF ndaE ndaD ndaC ndaA ndaB
Anabaena
Nodularia
Microcystis
NRPS PKS Enzimas complementares Transportador ABC
Planktothrix
16
16
16
16
24
24
24
24
32
32
32
32
40
40
40
40
48
48
48
48
kb
kb
kb
kb
Anabaena
Nodularia
Microcystis
Planktothrix
mcy G mcy D mcy Emcy
J
A PC
P
KS AT CM KR ACP KSKS
AT
ACPACP
KRKR
AT
DH
DH
CM A
PC
P
CM
AMT C CAT
ACPKS
S
O
S
OH
OS
O
OH
OS
OH
NH2
OS
O
SO
NHO
O
H
NH2
O
O
mcy G mcy D mcy Emcy
J
A PC
P
KS AT CM KR ACP KSKS
AT
ACPACP
KRKR
AT
DH
DH
CM A
PC
P
CM
AMT C CAT
ACPKS
S
O
S
OH
OS
O
OH
OS
OH
NH2
OS
O
SO
NHO
O
H
NH2
O
O
+Phenylacetate+ATP
+Malonyl-CoA
+NADPH + H+2 x SAM
+
+Malonyl-CoA
+NADPH + HSAM-H O
+
2+Malonyl-CoA
+NADPH + H-H O
+
2+Malonyl-CoA+Glutamate?+SAM
+L-Glu
+ATP
Microcystis aeruginosa PCC7806
Microcistina LR
Genes para identificar cianotoxinas
Microcistina
Nodularina
Cilindrospermopsina
Saxitoxina
mcyB
mcyA
mcyD
mcyE
mcyG
nda
cyr
sax
PCR Multiplex: mcy
mcyD
mcyC
mcyG
-- Real Time PCR
-- Detección de chips de DNA
Metodologías más novedosas
qPCR o PCR en tiempo real
Identificación de 10 a 10.000.000 de moléculas “blanco” por muestra
CIANOTOXINAS
Microcistina
> 80 formas
Detección de toxinas
Cilindrospermopsina
Nodularina
Microcystis, Oscilatoria, Anabena, Nostoc
MC-LR
Detección de toxinas
-- ELISA (inmunodetección en placa)
-- Métodos cromatográficos HPLC/Masa
-- Kits de inhibición de fosfatasa PP2A
Análisis de Microcistinas (MCs)
• Grandes esfuerzos en desarrollar técnicas para
analizar MCs en cyano y agua
• Un desafío: detectar y cuantificarlas
en tejidos animales
Análisis de Microcistinas (MCs)
Limitaciones:
-- Están en MUY BAJAS concentraciones
-- Los tejidos tienen altas cantidades de proteínas
y otras macromoléculas (interferencias y
subestimación).
-- Unión covalente de las toxinas con proteínas
El estado del arte
y
recientes reportes
Identificación de microcistinas
en suero
Primera identificación en una población
humana expuesta crónicamente
Chen et al. (2009) TOXICOLOGICAL SCIENCES 108(1), 81–89
MCs en el suero de pescadores
chinos
Resultados de la Cromatografía líquida /MS/MS del suero de 35
pescadores seleccionados al azar que viven en el Lake Chaohu.
MC-RR
MC-YR
MC-LR
Evidencia estadística que indica
que una exposición prolongada a
MC-LR (a bajas dosis) influencia
los niveles séricos ALT, AST, LDH
y ALP.
Índces Bioquímicos en el suero de los pescadores
(n = 35)
Comparación con niveles de MCs en
pacientes de Caruarú
En este estudio:
MCs totales (-LR, -YR, -LR):
entre 0,045 y 1,832 ng/ml
En promedio, en sueros de muestras de
los pacientes hemodializados de
Caruarú, que sufrieron exposición letal
fue estimada en 2,2 ng/ml eq.MC-LRpor el método de ELISA (17 muestras de 12 víctimas)
Efecto de exposición crónica a MCs
en niños
• A Cross-Sectional Investigation of Chronic
Exposure to Microcystin in Relationship to
Childhood Liver Damage in the Three Gorges
Reservoir Region, China
Li et al. Environmental Health Perspectives • vol.119 | number 10 | October 2011
Los participantes fueron seleccionados al azar de 5 escuelas (Fuling Borough, Chongqing)
• Se detectó MCs en el agua de bebida, en la comida y en el suero de los niños en estudio.
• La exposición a MCs estuvo asociada con el incremento de niveles de enzimas en el sueroy daño hepático entre los niños en estudio.
• Este estudio puede ayudar al gobierno a hacer
una política sobre prohibir acuacultura en lagos que suministran agua de bebida
• Son necesarios métodos de detección de MC más sensibles y biomarcadores más apropiados en las poblaciones expuestas!!!
Conclusiones
Contar con datos ambientales de presencia de cianobacterias toxígenas y niveles de toxinas.
Generar datos para implementar políticas.
Contar con métodos para dosaje de MCs en los laboratorios.
Plantearse iniciativas a nivel nacional para desarrollar métodos de diagnósticoen tejidos.
FUNDACIÓN PARA INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS APLICADAS
Centro de Investigaciones Biológicas- Mar del Plata- ARGENTINA
FUNDACIÓN PARA INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS APLICADAS
Centro de Investigaciones Biológicas- Mar del Plata- ARGENTINA
V Taller
Cianobacterias Toxígenas
Mar del Plata 2012
FUNDACIÓN PARA INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS APLICADAS
Centro de Investigaciones Biológicas- Mar del Plata - ARGENTINA
FIBA
¡¡Muchas gracias !!