Bol. San. Veg. Plagas, 22: 789-801, 1996

Detección de la grafiosis agresiva en la isla de Ibiza (Baleares)

M.a GARCÍA ROTGER y J. ROMERO CASADO

Se ha detectado por primera vez en la isla de Ibiza (Baleares) la especie fúngicaagresiva a los olmos Ophiostoma novo-ulmi (Ascomicetes). Hasta el momento sólo sehabía aislado la especie no agresiva O. ulmi y se presumía que las Baleares podríanconstituir una reserva genética para los olmos europeos.

Se detallan las técnicas utilizadas para el aislamiento e identificación de las especiesagresiva y no agresiva, así como la descripción de sus caracteres macro y microscópi-cos.

Ma GARCÍA ROTGER: Fundació Ules Balears, Ora. de Soller, km 4, 07080 Palma deMallorca. Baleares.

J. ROMERO CASADO: Consejería de Medio Ambiente y Pesca, C/ Foners, 10, 07006Palma de Mallorca. Baleares.

Palabras clave: Ophistome novo-ulmi, O. ulmi, grafiosis, Ulmus, Baleares, España

INTRODUCCIÓN

En MUÑOZ (1985) e IPINZA et al., (1990)se relatan los estudios realizados referentes ala detección y expansión de la enfermedadde la grafiosis en Europa y más concreta-mente en España. A continuación resumi-mos brevemente los datos más importantes:

La primera detección de la grafiosis enlos olmos fue hecha en Holanda (1919), y alpoco tiempo, en Francia y Bélgica. En 1920en el Servicio de Protección de los Vegetalesde Wagenigen (Holanda) se hizo una des-cripción detallada de ella, SCHWARZ (1922)comprobó los postulados de Koch y se nom-bró como "la enfermedad holandesa delolmo". Se detectó su presencia en Austria(1926), en Inglaterra (1927) y por primeravez, en Norteamérica (1930), debido a quese transportó desde Europa Central en unostroncos infectados y rápidamente se exten-dió por toda el área de crecimiento del olmo.

Al poco tiempo apareció la enfermedaden Madrid (MARTÍNEZ, 1932), en Burgos yPortugal (1933); y en Canadá (1944). En

1970, como consecuencia de una grave epi-demia, se descubrieron en Inglaterra doscepas asociadas a la enfermedad: una alta-mente patógena denominada agresiva y otramenos patógena o no agresiva.Posteriormente se ha intentado demostrar(BRASIER y GIBBS, 1973, en BRASIER yGIBBS, 1975) que probablemente fue origi-nada por la importación de troncos infecta-dos de Norteamérica que contenían la cepaagresiva. Investigaciones posteriores indica-ron que pudieran haber ocurrido dos epide-mias simultáneas en Europa; una occidentala partir de fuentes norteamericanas, y la otraoriental. Se intentó averiguar las diferenciasmorfológicas y de patogenia entre los aisla-mientos americanos y asiáticos, llegándose ala conclusión de que eran dos razas diferen-tes y que ambas habían colonizado Europaindependientemente. Las dos razas se deno-minaron NAN y EAN -Norteamericana yEuroasiática, respectivamente- (IPINZA etal, 1990).

En 1980 quedó constancia por primeravez, de la presencia de la cepa agresiva en

España detectándose en San Sebastián,Santorcaz (Madrid) y Aracena (Huelva)(ROBREDO, 1980 en ROBREDO, 1985). En1984 se realizó un trabajo mucho másamplio abarcando gran parte de la península(MUÑOZ, 1985) en el que se detectó la cepaagresiva en Madrid, Guadalajara, Avila,Segovia, Murcia y Toledo. La primerademostración científica de que el causantede la grafiosis en dichas localidades corres-pondía a la raza NAN (Norteamericana) dela cepa agresiva fue dada por MUÑOZ (1985)y por BRASIER (1988) (en IPINZA et al,1990).

La insularidad de las Baleares actúacomo barrera geográfica a la entrada depatógenos, disfrutando así de una situaciónprivilegiada y en conjunto, reprenta el lugaridóneo para controlar la enfermedad y paraestablecer una reserva genética de éste géne-ro en Europa (GIL, 1990).

En 1991 se realizaron unos aislamientospor la Dra. MUÑOZ de unas ramillas de U.minor correspondientes a la zona deS'Albufera (Mallorca) y remitidas al labora-torio de la Escuela Universitaria deIngeniería Técnica Forestal de laUniversidad Politécnica de Madrid, dondese aisló la especie no agresiva O. ulmi.

En 1992 el equipo formado por CORREA,MARTÍNEZ AZAGRA y GARCÍA-NETO realiza-ron un estudio fitosanitario de 74 poblacio-nes de olmo de Mallorca y Menorca, lo querepresenta prácticamente la totalidad deolmedas de ambas islas. Del total se realiza-ron 34 aislamientos en Mallorca y 4 enMenorca, correspondientes a las que presen-taban peor aspecto fitosanitario. De este estu-dio resultaron dudosos los siguientes aisla-mientos: En Mallorca, S' Estorell, Sa Molad'es Fangar (ésta última se eliminó por com-pleto en el año 1994 a causa de la mortandadtotal de árboles) y la olmeda de la Albufera.En Menorca el estado general de las olmedasera bastante mejor que en Mallorca, a pesarde estar muy defoliadas por la galénica(Galerucella luteola Mün.) incluso se sugirióla posibilidad de la ausencia de las cepas noagresivas (GIL, 1990; CORREA et al, 1992).

Sin embargo, tampoco descartaron laausencia de grafiosis agresiva en Baleares, yaque podría haber pasado desapercibida en elcaso de una introducción reciente durante sumuestreo en 1992.

En este estudio se han repetido los ais-lamientos de las olmedas de peor aspectodel anterior trabajo como S'Estorell y elcanal Siurana de la Albufera a las que seles ha añadido por los mismos motivos lafinca Alcoraya de Montuiri y se han añadi-do las de Ibiza. Los olmos de Sa Mola d'esFangar fueron apeados en su totalidadantes de empezar este estudio, por lo quefiguran en él. En Ibiza, hasta ahora no sehabía realizado ningún aislamiento debidoa que hay muy pocas poblaciones deolmos. Al haber sido detectadas por losServicios de la Consejería del MedioAmbiente, unas introducciones de maderaprocedente de zonas peninsulares (León,Cazorla, Jaén) sin descortezar se procedióal muestreo de la totatidad de las olmedasde la isla.

El objetivo del presente trabajo ha sidocompletar los estudios fitosanitarios anterior-mente realizados y determinar la presencia oausencia de la especie agresiva en ellos.

El hecho de que estuviera presente seríapreocupante, porque estarían en peligro losolmos de las islas y por tanto la conserva-ción de esta reserva natural de las especiesUlmus minor Mill., y la especie híbrida entreel U. minor y un bajo porcentaje de Ü. gla-bra Hudson denominado como U. x hollan-dica, que se encuentra en numerosos lugaresde Mallorca (IPINZA, 1990).

MATERIAL Y MÉTODOS

Muestreo en campo y observaciónde síntomas:

Para la toma de muestras se siguieron lassugerencias descritas por MUÑOZ (1985). Serecogieron muestras de brotes jóvenes dediámetro inferior a los 15 mm., con la corte-za aún verde, que tuvieran zonas con hojas

Fig. 1.- Puntos de muestreo de las islas de Mallorca e Ibiza durante 1995

desecadas y zonas con hojas turgentes y queno estuvieran excesivamente atacadas porlos escolítidos para evitar así un enmascara-miento del patógeno por saprofitos quehubieran colonizado esas galerías. Se pudocomprobar en campo la presencia de grafio-sis, porque al raspar superficialmente o alhacer un corte transversal en las ramas,mostraron vetas o el anillo de los haces vas-culares necróticos.

Durante los meses de junio y julio de1995, ajustándose a las recomendaciones dePAJARES y AZAGRA (1990), se realizó unmuestreo complementario a los trabajos rea-lizados en 1992, en diversos puntos deMallorca e Ibiza (Fig. 1). De cada muestrase recogieron aproximadamente entre 10 y15 varetas, de distintos puntos del árbol conposibles síntomas de grafiosis, de lassiguientes olmedas:

Muestra núm. 1 (Mallorca): Olmeda quecrece paralela al Canal Siurana de laAlbufera de Alcudia de las especies U.minor Mill, y U. x hollandica Mili.(ALOMAR, et al, 1992) (Fig 2). Está com-puesta principalmente de árboles jóvenescon los bordes de las hojas secos, de dondese cogió la muestra, y unos pocos más vie- Fig. 2.-Aspecto general de la olmeda del canal

Siurana de la Albufera de Alcudia en enero de 1995

Fig. 3.- Olmeda del torrente de S^storell en el términomunicipal de Lloseta en enero de 1995.Los árboles centrales fueron eliminados

Fig. 4.-Típica curvatura a modo de gancho producidaen las ramas de los olmos afectados de la zona másseca de la finca Alcoraya de Montuiri (octubre 95)

jos completamente secos sin galerías deescolítidos en el tronco.

Una vez descortezadas las ramas longitu-dinalmente se observaban puntos necróticosy pequeñas manchas aisladas y superficialesen algunas varetas, que no llegaban a dañarlos haces vasculares. Tranversalmente, no sevio ningún síntoma de la grafiosis.

Muestra núm. 2 (Mallorca): Olmeda deltorrente de S'Estorell, correspondiente a laespecie U. minor Mill., en el término munici-pal de Lloseta (Fig. 3). Era una olmeda querecorría todo el torrente, pero a raíz de lamuerte de varios árboles fue saneada y reduci-do considerablemente el número de árbolesque la formaban. En general la arboleda teníacolor verde salpicado de manchas marronescorrespondientes a ramas con hojas completa-mente desecadas, de color marrón y enrolla-das, de donde se cogió la muestra.

En un análisis más detallado del anillovascular se apreciaron líneas necróticas decolor negro separadas medio mm. entre sí y alo largo de toda la familia. Transversalmente,en algunas zonas de las ramas aparecía el ani-llo vascular con necrosis discontinuas, aunqueen la mayoría de los cortes realizados aparecióel anillo completamente necrótico.

Muestra núm. 3 (Mallorca): Olmeda dela especie U. minor Mill, de la fincaAlcoraya en el macizo de Randa del términomunicipal de Montuiri. También está situadaen un torrente. En esta olmeda hay doszonas, una húmeda con árboles de mejoraspecto y una zona más seca con árbolesdebilitados, de donde se recogió la muestraque se describe a continuación. Las ramasmás altas estaban muy defoliadas; en uno delos árboles presentaba curvaturas a modo degancho o jota invertida (Fig. 4). En general,

el follaje tenía un aspecto ralo. Algunashojas presentaban síntomas de marchitez ypermanecían adheridas a las ramas. En nin-gún árbol se observó la presencia de galerí-as de escolítidos en el tronco. Las ramillasrecogidas eran jóvenes, muy finas.

Al descortezar longitudinalmente apare-cían esporádicamente algunas líneas necróti-cas gruesas de donde se realizó el aislamien-to, porque la mayoría de las ramillas estabansanas. Esta vetas se correspondían, en uncorte transversal, con puntos necróticos ais-lados.

Muestra núm. 4 (Ibiza): Olmeda de lafinca Ca'n Bernat de Canadella del términomunicipal de San Joan correspondiente a laespecie U. minor Mill. Está originada a par-tir de un olmo plantado a principios de siglo.La olmeda estaba en buen estado con esca-sos marchitamientos de las hojas y una granespesura del follaje del arbolado joven; sinembargo, observamos daños de Galerucellaluteola.

La zona del cambium presentaba puntos ymanchas difusas de color marrón oscuro. Loshaces vasculares aparentemente estaban sanos.

Muestra núm. 5 (¡biza): Olmeda de Ca'sMallorquí, U. x hollandica Mill., del térmi-no municipal de San Joan. Pequeño rodal deolmos situado junto a una acequia(Fig. 5).La olmeda estaba en deficiente estado sani-tario, con ejemplares fuertemente atacadosde escolítidos. Del 80 al 90 % de las ramasestaban completamente defoliadas y casi latotalidad de las hojas que permanecían en elárbol estaban desecadas, con un color ma-rrón atabacado.

Tras un análisis de los síntomas internos,una vez retirada la corteza, se vio que apare-cían abundantes estrías necróticas que coa-lescían entre sí formando una capa. El hazvascular estaba completamente necrosado(color negro) en toda la muestra recogida.

Procesado de las muestras e identificaciónde los aislados:

Se siguió la metodología descrita porBRASIER (1981). De las ramas afectadas se

Fig. 5.- Olmos de Ca's Mallorquí del término municipalde San Joan fuertemente defoliados con el 80-90%

de las hojas restantes secas y enrolladas (enero de 1995)

separaron con un bisturí la corteza y la made-ra dejando a la vista las necrosis vasculares.De esta zona se cogían pequeños trozos y sesembraban en medio de aislamiento de maltaagar (M. A.) (Difco) al 0,1 % al que antes deautoclavar (15 min a 121°C y 1,1 atm de pre-sión) se había añadido lg/1 de cloranfenicol(Chloromycetin de Parke Davis).

Las placas así inoculadas se incubaronen oscuridad a 20°C y las distintas coloniasse repicaron posteriormente a dos placas deM. A. al 2 %. Todas las placas se incubaronen oscuridad a 20°C durante un período pre-liminar de dos días, tras los cuales se señalóel crecimiento de las colonias sobre dos lí-neas perpendiculares marcadas en el reversode la placa.

Una primera serie de placas se incubó a20°C y la otra serie a 33°C, ambas en oscuri-dad, volviéndose a medir el radio de la colo-nia siete días después de la siembra. A partir

Cuadro 1. Decripción de los síntomas observados en campo

Características morfológicas de las ramas

Marchitez +Enrollamiento de las hojassin defoliación +% de defoliación 0 9?

Coloración de las hojas

% de hojas verdes 15 %% de hojas pardas -% de hojas amarillas 10 %% de hojas verdescon los bordes secos

En el troncoEn ramas gruesasEn ramas delgadas

*:+/-; presencia / ausencia del carácter estudiado.

de la diferencia obtenida entre las observacio-nes del 2o y T días de 21 placas de aislamien-tos de Ca's Mallorquí de San Joan (Ibiza), 8 dela finca Alcoraya de Montuiri (Mallorca) y 14del torrente de S'Estorell en Lloseta(Mallorca), se obtuvo el crecimiento radialmedio diario para cada muestra.

Posteriormente las colonias se colocaronen el laboratorio a temperatura ambiente (20- 25 °C) y luz solar difusa durante 10 días alcabo de los cuales se observaron sus carac-terísticas culturales.

La terminología descriptiva que hemosutilizado es la siguiente: la fase conidialestudiada la hemos denominado Sporothrixclasificada por HOOG (1974) como estado

conidial de Ophiostoma y es una terminolo-gía que sigue aún vigente (IPINZA et al,1990; BRASIER, 1991); Ophiostoma ulmi(Buism.) Nannf. [syn. Ceratocystis ulmi(Buism.) Moreau] para el teleomorfo consi-derado como especie no agresiva yOphiostoma novo-ulmi. Brasier como espe-cie agresiva. Sin embargo, queremos hacerconstar que no se ha trabajado más que conel anamorfo de estado cornidial Sporothrix.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En los cuadros 1 y 2 se describen lossíntomas externos, de la totalidad de la

Cuadro 2. Descripción de los síntomas internos oservados en las ramillas

Muestra 1Canal Siuranade la albufera

(Mallorca)

Muestra 2S'EstoreUde Lloseta(Mallorca)

Muestra 3S'Alcorayade Montuiri(Mallorca)

Muestra 4Ca Bernatde S. Joan

(Tbiza)

Muestra 5Ca's Mallorquí

de S. Joan(Ibiza)

Sección longitudinal

Puntos necróticosManchas marronesdispersasEstrías longitudinalesde al menos 1 cmde largo separadasentre síRed de estríaslongitudinalesnecróticas compactas

Sección transversal

Puntos necróticosaislados / Anillodiscontinuo -Anillo continuo -Médula ennegrecida -

(*):+/-; Presencia / ausencia del carácter estudiado.

olmeda, observados en campo e internosobservados en las ramillas, respectivamen-te.

De un total de 353 aislamientos realiza-dos 21 fueron de O. novo ulmi (o especieagresiva) localizados en la olmeda de Ca'sMallorquí de San Joan (Ibiza) (muestra 5) y22 de O. ulmi (o especie no agresiva) locali-zados en las muestras 2 y 3. En el CanalSiurana de la albufera de Alcudia (Mallorca)(muestra 1) y en Ca'n Bernat de Canadellaen San Joan (Ibiza) (muestra 4) no se halogrado aislar ninguna de las dos. El aspectodebilitado de los olmos de la Albufera deMallorca (muestra 1) podía deberse a otros

daños ajenos a los producidos por la grafio-sis o conjuntamente con ella, ya que sedetectó en el estudio de 1992 (CORREA et al,1992), aunque en este de 1995 no se hayalogrado aislar.

En el cuadro 3 se comparan las caracte-rísticas de las colonias descritas por BRASIER(1981) y las aisladas en este trabajo. No hanaparecido situaciones intermedias en los ais-lamientos. Se ha encontrado una correlaciónentre el aspecto de las colonias y su veloci-dad media de crecimiento; las aisladas enS'EstoreU de Lloseta (muestra 2) y fincaAlcoraya de Montuiri (muestra 3) presenta-ban características macroscópicas similares

BOL. SAN. VEG. PLAGAS, 22, 1996 797

Fig. 6.-Morfología de la colonia de la especieno agresiva en 2% M. A.

Fig. 7.-Morfología de la colonia de la especieagresiva en 2% M. A.

a las de O. ulmi (Fig. 6), sin embargo; losaislados de Ca's Mallorquí de San Joan deIbiza (muestra 5) se parecían a las descritasen O. novo-ulmi (Fig. 7)

Las especies no agresivas de S'Estorellde Lloseta (muestra 2) y finca Alcoraya deMontuiri (muestra 3) crecieron 1,75 - 3,5mm. radiales diariamente. La morfologíapredominante ha sido la lobulada, cespitosa,con el margen de la colonia regular. La zona-ción miceliar es concéntrica.

Los aislamientos de la especie agresivade Ca's Mallorquí de S. Joan (muestra 5)oscilan entre 4,15 - 5,8 mm. de crecimientodiario, radial. En ellas hay una mayor canti-dad de micelio aéreo, pero con la mismaapariencia cespitosa que en la especie noagresiva. La morfología cambia y adquiereuna zonación miceliar petaloide a partir de lazona del inoculo. El margen de la colonia esirregular.

Para la identificación microscópica nosbasamos en las descripciones de las especiesO. novo-ulmi y O. ulmi (BRASIER, 1991).Ambas especies presentan hifas aéreas quemiden de 1 a 6 um. de diámetro; los coni-dióforos son en su mayoría laterales entre 10- 30 (-50 um) de longitud y las dentículas

conidiógenas entre 0,5 - 1 um de longitud.Los conidios son holoblásticos, unicelulares,hialinos, de forma variable que puede serdesde redondo a elipsoide. Se caracterizanporque mengua su tamaño en la punta queincluso es ligeramente curvada (Fig. 10)(estado conidial de Sporothrix).

Los conidios miceliares están agregadosen gotitas mucilaginosas. A su vez puedenreproducirse por gemación. A menudo coa-leseen agregados en una masa parecida a lalevadura confiriendo una apariencia cerosa alas colonias (estado conidial de levadura).

En el cuadro 4 se resumen las dimensionestaxonómicas del anamorfo Sporothrix tomadode las distintas cepas. Es interesante ver queuna de las diferencias entre las cepas agresivasy no agresivas radica en el grosor de las hifassumergidas en el agar. BRASIER (1991) descri-bió que la especie no agresiva presenta diáme-tros de hasta 10 um y la especie agresiva supe-riores a 10 um. En nuestras observaciones nose han encontrado los diámetros de hifas quedescribe BRASIER en su artículo: las hifasinmersas en el agar de la especie agresivaefectivamente son más grandes que las noagresivas, ya que casi miden el doble, pero lostamaños que hemos medido oscilan entre 2,7

M. GARCIA ROTGER y J. ROMERO CASADO

Cuadro 4. Medidas microscópicas de especies agresivas y no agresivas aisladas en Baleares

Medidas conidio

Medidasconidióforo

Dimámetro hifainmersa en agar

Medidas conidio

MedidasConidióforo

Diámetrohifa inmersaen agar

Medidas conidio

Medidasconidióforo

Diámetrohifa inmersa en agí

1: longitud; a: anchuraValores mínimos, medios y máximos de 25 inividuos para cada uno de los parámetros medidos de cada uno de los cuatroaislamientos de cada localidad (en \\m.)

y 3,7 um para O. ulmi y 6,4 a 7,1 um para O.novo-ulmi (Figs. 3. 8 y 9), y coinciden máscon la descripción de HOOG (1974), quien lasdescribe como hifas hialinas ocasionalnentemarrón pálidas, lisas o de paredes rugosas,normalnente delgadas, 1-2.5 (-3) um deanchura, y mezcladas con hifas fuertementeseptadas de una anchura de 3 - 8 um.

Estas diferencias de diámetros de lashifas descritas por BRASIER y las descritaspor nosotros podrían deberse, al igual que enlas olmedas, a una diferencia en el estadohídrico de los árboles y consecuentementede las hifas, como se cree ocurre en los coni-dios de Pestalotiopsis sp (GAMS, com.pers.).

Fig. 8.-Aspecto del micelio y el estado conidialSporothrix de un aislamiento de la especie no agresiva

en Montuiri (Mallorca).

Fig. 10.- Conidiogénesis del anamorfo Sporothrixde un aislamiento de la especie agresiva

de S. Lorenzo (Ibiza).

Se ha estado estudiando, gracias al pro-yecto de mejora genética del olmo, delMAPA, el tipo de compatibilidad sexual (otipo de unión) y a qué raza pertenecen lascepas aisladas durante este muestreo. Losresultados obtenidos, hasta el momento, hansido del tipo de unión B y la raza NAN(GARCÍA-NIETO, com. pers.).

Una vez detectada la presencia de maderade olmo sin descortezar e infestada de escolí-tidos vectores de grafiosis (Figs. 11 y 12) envarios puntos de la isla de Ibiza, unido a losresultados obtenidos en laboratorio de los ais-

Fig. 9.- Grosor de las hifas sumergidas en el agarcaracterístico de la especie agresiva de S. Lorenzo (Ibiza).

Fig. 11.- Galerías de escolítidos con larvasencontradas en el depósito de madera de Ca Negreta

(Ibiza, Nov. 95)

Fig. 12.-Mayor detalle de las larvasde escolidos de la Ca Na Negreta (Ibiza, Nov. 95).

lamientes de Ca's Mallorquí, se puede confir-mar la instalación de Ophiostoma novo-ulmiBRASIER en Ibiza. Por ello, se procedió a laerradicación mediante apeo a ras de suelo yeliminación por fuego de todos los árboles queconformaban la olmeda.

AGRADECIMIENTOS

A la Fundació Ules Balears y a laConselleria d'Agricultura y Pesca de laComunidad Autónoma de las IslasBaleares por patrocinar conjuntamenteeste trabajo. Al Dr. José García Jiménezde la Escuela Técnica Superior de

Ingenieros Agrónomos de Valencia y alDr. Enrique Descais del InstitutoMediterráneo de Estudios Avanzados(Centro Superior de InvestigacionesCientíficas - Universidad de las IslasBaleares) por sus tareas de revisión ydirección. A María Eugenia García Nietodel equipo del proyecto de mejora genéti-ca del olmo de Madrid por su amabilidady por su interés en el trabajo empezado eneste artículo. Y de un modo especial aMaría del Mar Peñalver (becaria de cola-boración en los trabajos del laboratoriopor la Fundació Ules Balears de Palma deMallorca) que ha trabajado con rigurosi-dad y empeño en este proyecto

ABSTRACT

GARCÍA ROTGER, M., y ROMERO CASADO, J., 1996. Presence of the "Dutch elm dise-ase" on Ibiza (the Balearic islands). Bol. San. Veg. Plagas, 22 (4): 791-803.

The fungal pathogen species Ophiostoma novo-ulmi (fungi Ascomycotina) has beendetected in Ibiza (the Balearic islands). So far only the non-aggressive speciesOphiostoma ulmi had been detected. It was presumed that the Balearic islands couldconstitute a genetic reserve for european elms.

The tecniqes used for the isolation and identification of the aggresive and non aggre-sive species are detailed and their caracters macro and microscopic are described.

Key words: Ophiostoma novo-ulmi, O. ulmi, Dutch elm disease, Ulmus, Balearicislands, Spain.

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(Aceptado para su publicación: 14 junio 1996).