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Detección Molecular de Resistencia a Antimicrobianos.
D en C. Verónica Jiménez
Laboratorio de Infectología
Resistencia antimicrobiana “Un problema mundial”
Impacto
•Salud
•Social
•Económico
La resistencia a los
antimicrobianos
Cada vez que se ha puesto en uso un nuevo agente
antimicrobiano se han detectado a continuación
cepas de microorganismos resistentes al mismo.
Pérdida de la sensibilidad de un
microorganismo a un antimicrobiano al que
originalmente era susceptible.
Es un fenómeno biológico natural.
Capacidad de las bacterias de desarrollar
mecanismos para evadir el efecto de los
antibióticos a los cuales eran previamente
susceptible.
La Resistencia
Bacteriana
Natural Adquirida Presión selectiva
Cambio genético
Mutaciones
cromosomales
Elementos genéticos
extracromosomales Plásmidos
Transposones
Integrones
Desvío metabólico
Enzima que degrada antibiótico Enzima alteradora
de antibiótico
Plásmido con genes de resistencia a antibióticos
Sobreproducción de enzima blanco
Bomba de eflujo
Antibiótico
Antibiótico
Antibiótico
Reducción de absorción
Mecanismos de
Resistencia Bacteriana
Mecanismos de
Resistencia Bacteriana
Mecanismos de
Transferencia genética
Transformación
Conjugación
Transducción
La determinación genética de los mecanismos de resistencia ha
permitido el uso de métodos de Biología Molecular.
La biología molecular ha sido el gran responsable de una profunda revolución en el entendimiento del comportamiento de las poblaciones bacterianas teniendo un
directo impacto en el diagnóstico y tipificación de agentes infecciosos.
Identificación rápida de agentes infecciosos en pacientes críticos.
Identificación rápida de agentes infecciosos fastidiosos o de lento cultivo
en que los métodos tradicionales no presentan un buen desempeño
(microbiológicos y/o serológicos)
Identificación de agentes no viables o no cultivables.
Determinación rápida de resistencia antimicrobiana.
Diagnóstico de agentes infecciosos de alto riesgo biológico.
Áreas de desarrollo de la Biología Molecular en el diagnóstico de agentes infecciosos bacterianos.
Hibridación
Amplificación, Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
PCR en Tiempo Real
Métodos Basados en secuenciación
Espectrometría de Masas MaldiTof
Técnicas de biología molecular aplicadas al diagnóstico bacteriano
Sondas de
ácidos nucléicos
Sondas: segmentos de DNA
o RNA que han sido marcados
y que pueden unirse con una
alta especificidad a secuencias
complementarias de DNA o
RNA
Detección a resistencia
a Rifampicina
M 1 2 3 4 5 6
pb
pb
450
1353
872
603
271
mef
Amplificación de ácidos nucléicos
PCR
Detección de BLEEs y
carbapenemasas mediante
PCR
TEM
SHV
CTX-M
OXAs
KPC
PCR en Tiempo
real
PCR en Tiempo real
Pol
Pol
Pol
DNTPs
DNA blanco
Sonda Iniciadores
Taq polimerasa
Pol
Pol
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
Pol
Pol PCR en Tiempo real
PCR en Tiempo real
Pol
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo real
Pol
PCR en Tiempo
real
Detección de patógenos
Genotipificación
Resistencia:
En algunos casos el aumento de resistencia se debe a:
Un incremento de la expresión de la beta-lactamasa
Sobreexpresión de bombas de eflujo
Disminución de la expresión de porinas.
PCR en Tiempo
real
Detección y cuantificación del producto
amplificado
Alta especificidad y sensibilidad.
No requiere análisis posterior.
El procesamiento y análisis de resultados
se realiza en aproximadamente 30-40 min.
Representa una oportunidad para optimizar
el diagnóstico temprano y tratamiento
específico de la enfermedad (Desescalado)
Falsos positivos (flora normal)
PCR en Tiempo
real
Penicilina en Streptococcus pneumoniae
Tetraciclina
Carbapenems en Klebsiella pneumoniae
Identificación de CTX_M en B-lactamasas de
espectro extendido
15.Detection of gyrA and gyrB mutations in Clostridium difficile isolates by real-time PCR.
Spigaglia P, Carattoli A, Barbanti F, Mastrantonio P. Mol Cell Probes. 2010 Apr;24(2):61-7. doi: 10.1016/j.mcp.2009.10.002. Epub 2009 Oct 21.
Real-time PCR and high-resolution melt analysis for rapid detection of Mycobacterium leprae
drugresistance mutations and strain types.
Li W, Matsuoka M, Kai M, Thapa P, Khadge S, Hagge DA, Brennan PJ, Vissa V.
J Clin Microbiol. 2012 Mar;50(3):742-53. doi: 10.1128/JCM.05183-11. Epub 2011 Dec 14.
PCR en Tiempo
real
Secuenciación
Nos permite determinar el
orden de los nucleótidos
en un fragmento de DNA
Secuenciación
Secuenciación
Espectrometría de Masas
MaldiTof
Identificación bacteriana
basada en el espectro de
masas de proteínas:
Una nueva mirada a la
microbiología del siglo XXI
Espectrometría de Masas
MaldiTof
Alta sensibilidad, especificidad y bioseguridad. (Este ultimo aspecto se
fundamenta en que estas metodologías no requieren la presencia del agente
infeccioso vivo, ya que las pruebas moleculares se pueden realizar en muestras o
extractos sometidos a procesos químicos de inactivación).
Se pueden realizar directamente sobre muestras clínicas.
Determinación genotípica mas veloz que la fenotípica (organismos de
crecimiento lento).
Utilidad en agentes no cultivables.
Ventajas de los métodos
moleculares
Falta de sensibilidad si concentración de organismos es baja en la muestra.
Diferentes pruebas son requeridas para cada antimicrobiano.
Resistencia a un determinado antimicrobiano puede ocurrir por varios
mecanismos asociados involucrando diferentes genes de resistencia.
Para algunos agentes, los mecanismos genéticos son aún desconocidos.
Desventajas de los métodos
moleculares
Epidemiología molecular
En epidemiología es muy importante la identificación no solo del microorganismo en
cuestión sino que muchas veces la identificación a nivel de cepas ayuda a:
1.- Determinar el causante del brote infeccioso,
2.- Detectar la transmisión cruzada de patógenos,
3.- Determinar la fuente de infección,
4.-Reconocer cepas particularmente virulentas de organismos y
5.- Monitorear los programas de vacunación (Olive y Bean, 1999).
