Jean Weissenbach

(CEA/Institut de Génomique/Genoscope)

Académie de Pharmacie 18-05-2016

Des premières molécules d'origine

biotechnologique à la Biologie synthétique

In the early days of chemistry fermentation is an easy way to the

production of some basic chemicals and pharmaceuticals

fermentation

purification (cristallisation, distillation)

- Ethanol

- Acetic Acid

- Tartric Acid *

- Lactic Acid *

- Citric Acid (*)

Early examples of biological procedures for synthesis of pure chemicals

1780 Discovery by Carl Wilhelm Scheele from sour milk

1856 Louis Pasteur establishes the role of Lactobacillus in its production by

fermentation

1873 Chemical structure established by Johannes Wisclicenus

Lactic acid

*

Early examples of biological procedures for synthesis of pure chemicals

Medical uses

- iron lactate against anemia and chlorosis used in 1839 in

France

- proposed by Emmanuel Merck in his product catalog in 1842

- zinc lactate Pharmacopoiea Saxonia 1867 against epilepsy

- Deutsches Arznei Buch (DAB) 1872 (first issue)- lactic acid (uses: digestion, diphteria, mouth waters, tooth cleaning)

- iron and magnesium salts : magnesia lactica (mild laxative)

Lactic acid

Early examples of biological procedures for synthesis of pure chemicals

1881 First commercial production in the US (Avery company) based on a bona

fide microbial process, business stops in 1889

1893 Carl Krauch (Merck) reports a procedure to produce lactic acid using

fermentation of whey.

1895 The fermentation process becomes industrial at Boehringer Ingelheim for

technical grade lactic acid, using fermentation by Lactobacillus delbrueckii

The product has many uses in dyeing, leather, textile and food industry and

more recently poly-lactic acid, a biodegradable polymer (1981)

Boehringer becomes one of the first world leading biotech company and first

producer of lactic acid

Lactic acid

Early examples of biological procedures for synthesis of pure chemicals

Albert Boehringer, the

founder of the company

Lactic acid

Early examples of biological procedures for synthesis of pure chemicals

Both chemical and microbial processes competed during a long

time and are still competing.

The fermentation process accounts for 90% of the world

production presently.

Lactic acid

Early examples of biological procedures for synthesis of pure chemicals

Citric acid

Citric acid first pure cristals obtained by Scheele in 1784

obtained from lemon juice.

Was probably known by the first alchemists

Found in the Pharmacopoeia of Baden 1841

Early examples of biological procedures for synthesis of pure chemicals

Citric acid fermentation tanks in Pfizer's

Brooklyn facility, circa 1920s.

Courtesy Pfizer, Inc.

Production in 1929: 5000 metric tons

Ephedrine precursor (~1930) (enantioselectivity, use of whole cells as

reactor)

Early examples of biological procedures for synthesis of pure chemicals

Early examples of biological procedures for synthesis of pure chemicals

Acetone and n-butanol, Chaim Weizmann (1915)using Clostridum acetobutylicum and cornstarch as C source

Citric acid, Currie (1923), Aspergillus niger

Ephedrine precursor (~1930) (enantioselectivity, use of whole cells as

reactor)

Biocatalytic step for ascorbic acid, Reichstein (1934)

Biocatalysis in cortisone production (Starting with progesterone and combining a chemical step and an enzymatic 11-alpha- (or beta) hydroxylation of the steroid ring structure the Upjohn company produces hydrocortisone (regio and stereo specific reaction with an enzyme from Rhizopus or Cunninghamella)

antibiotics, hormones, vitamins

Early examples of biological procedures for synthesis of pure chemicals

Biological systems engineering

The beginning of the molecular era

In the 1940s: beginning of bacterial genetics

- DNA is identified as the support of genetic information

- Importance of strain selection

- Spontaneous mutants can be selected

- Mutagenic agents are being used

Biological systems engineering

The new biotechnology era (1)

In vitro recombination (1973)

DNA sequencing (1975)

Production of recombinant insulin in E coli (1978)

New methods for strain improvement

- improvement of selection methods

- molecular screening (70s)

- DNA synthesis (1983)

In vitro mutagenesis

- PCR (1985)

- protein engineering/site directed mutagenesis

- metabolic engineering

- directed evolution

Biological systems engineering

The new biotechnology era (2)

Complete genome sequences (1995-96)

Bioinformatics algorithms for sequence alignment and assembly (1990s-2000s)

Homologous recombination in higher eukaryotes (2000s)

Modeling metabolic networks and biological systems (2000s)

Improvements in directed evolution and protein engineering (1990s – 2000s)

Progress in DNA synthesis (2008)

Genome replacement (2007, 2010)

Dès 1978 Szybalski et Skalka prévoient

_"a new era of synthetic biology"_

appuyée sur la synthèse de molécules d'ADN inédites

conduisant à des combinaisons géniques avec des

fonctionnalités nouvelles

Synthetic biology is the design and

engineering of biologically based parts,

novel devices and systems as well as the

redesign of existing, natural biological

systems. It has the potential to deliver important new applications

and improve existing industrial processes.

(UK Synthetic Biology Roadmap)

Definition of Synthetic Biology

Chemical Synthetic Biology

Luisi et al. FEBS Lett 2012

- source illimitée de gènes (mais pas de fonctions)

- connaissance de génomes dans leur intégralité (modélisation)

- référence pour les autres analyses "omiques"

Conséquences de la génomique

Biology

Synthetic Biology

Electronics

Gardner et al. Nature 2000

Elowitz & Leibler Nature 2000

Ingénieries :

- acides nucléiques (gènes, génomes, ADN recombinant)

- protéines

- circuits de contrôle de l'expression

- métabolisme

- processus biologiques

communications inter-cellulaires

interactions milieu extérieur

…

Que peut-on regrouper sous le vocable de

Biologie Synthétique ?

- clonage (années 70)

- modifications dirigées/aléatoires (1971-79)

- synthèse d'ADN jusqu'à génomes complets

- "chirurgie génomique" (nucléases) (depuis les années 90)

- génome minimal, brassage génomique (depuis la fin des

années 90)

- transplantation de génomes (années 2000)

Ingénierie des acides nucléiques

Technologies de l'ADN recombinant

- Transplantation de génome

Ingénierie à l’échelle du Génome

+

Mycoplasma mycoides

Mycoplasma capricolum

milieu de sélection

Venter et al. Science 2010

40 M$

15 years

Transformation d'une espèce en une autre

Ingénierie à l’échelle du Génome

- Compatibilité entre les systèmes

Ingénierie à l’échelle du Génome

Compatibilité entre les systèmes

90-94%

Lartigue et al.

Ingénierie à l’échelle du Génome

- Compatibilité entre les systèmes

- Réduction de génome/Génome minimal

Ingénierie à l’échelle du Génome

Réduction de génome

- éviter le fardeau des séquences inutiles

- séquences sans fonctions

- fonctions inutiles

- élements contraires au but

2013

Ingénierie à l’échelle du Génome

- Compatibilité entre les systèmes

- Réduction de génome/Génome minimal

- Dessine-moi un génome !

Ingénierie à l’échelle du Génome

- Compatibilité entre les systèmes

- Réduction de génome/Génome minimal

- Dessine-moi un génome !

- Quels gènes ?- Comment les arranger entre eux ?- Comment les réguler ?- Comment prédire ou évaluer leur compatibilité ?

Ingénierie à l’échelle du Génome

- Compatibilité entre les systèmes

- Réduction de génome/Génome minimal

- Dessine-moi un génome !

Ingénierie à l’échelle du Génome

James Collins

(2011)

Carroll D. 2014

Ingénierie à l’échelle du Génome

Results found: 769

Sum of Times Cited without self-citations : 8963

Citing Articles without self-citations : 3120

(16/03/2015)

CRISPR/Cas citations

- mutagénèse et évolution dirigée/brassage

(shuffling)

- anticorps catalytiques

- fonction aléatoire non évoluée ("mRNA display")

- conception de novo

- extension du code (aminoacides non naturels)

Ingénierie des protéines

- ex nihilo- mRNA display

- conception avec connaissances préalables- Conception assistée par ordinateur- Anticorps catalytiques

- faire du neuf avec du vieux- Evolution dirigée (nombreux procédés)- “Redesign” rationnel (information structurale détaillée requise)- “Redesign” semi-rationnel (connaissance du site actif requise)

Ingénierie des protéines

Faire du neuf : composer de nouvelles fonctions (enzymes)

Le vieux renferme encore du neuf : 20% des familles de

domaines protéiques sont des "DUFs"

Conception de nouvelles fonctions

Conception assistée par ordinateur

- Diels-Alder cycloaddition

- proton transfer

- multistep retroaldol transformations

- hydrolysis of phosphotriesters (metal-

mediated)

- ….

kcat/KM très bas

Extension du code génétique

Isaacs FJ Nature 2015

N Benzyme 1 Cenzyme 2 Denzyme 3 Eenzyme 4 Penzyme 5

bacteriaN P

N Penzyme 1

fermentation

Ingénierie métabolique

Dans le but d'optimiser des processus existants de production de molécules

(petites ou macro) ou de constructions génétiques ad hoc.

- recrutement d'activités hétérologues pour améliorer les souches

- extension de voie métaboliques existantes

- transplantation de voies métaboliques hétérologues

- modification de l'ingestion et du flux métabolique de nutriments

- redirection de flux métaboliques

- canaliser le flux vers la voie utile

- réduire les autres flux

- réduire d'autres activités

- agir sur la régulation de l'expression

Ingénierie métabolique

N Benzyme 1 Cenzyme 2 Denzyme 3 Eenzyme 4 Penzyme 5

bacterieN Pfermentation

Ingénierie métabolique

conception/optimisation de voies métaboliques

"pathway engineering/design"

1995 2000 2005 2010 2015

Ingénierie métabolique

1,3-propanediolNakamura 2003

Biosynthèse du

cortisol dans la levureSzczebara et al. Nature

Biotec.2003

Acide artémisinique

dans E coliKeasling et al. Nature.2003

Production commerciale

par fermentation d'acide

artémisinique clonéSanofi

Ingénierie des circuits de

régulation de l'expression

circuits logiques

bascules

verrous

portes logiques

dispositifs de mémoire

dispositifs de comptage

Ingénierie des circuits de

régulation de l'expression

"Ingénierie aléatoire"

Stephanopoulos, Curr Op Chem Biol 2008

Programming cells by

multiplex genome

engineering

and accelerated evolution

Harris H. Wang1,2,3*, Farren J. Isaacs1*, Peter A.

Carr4,5, Zachary Z. Sun6, George Xu6, Craig R.

Forest7& George M. Church1

NATURE 2009

Relaxing medium Stressing medium

CLU (3 µM) + THY (3 µM) CLU (3 µM)

"Ingénierie aléatoire"

"Ingénierie aléatoire"

Le pouvoir de prédiction reste limité en biologie

A ce jour la biologie synthétique est une ingénierie

essentiellement empirique

Cette approche empirique s'appuie sur des procédés

expérimentaux souvent massivement parallèles

développés durant les décennies récentes

Biologie synthétique pour quoi faire ?

Certaines propriétés des systèmes biologiques peuvent être

mises à profit

- énergie : récupération et stockage

- transformations chimiques

- reconnaissance de signaux

- logistique, ciblage et biodisponibilité (vecteurs etc.)

- mémoire/comptage