der medizinischen fakultät der friedrich-alexander ... · als dissertation genehmigt von der...

Etablierung und Anwendung von Echtzeit-PCR Verfahren

zur quantitativen Bestimmung der Parasitenbeladung

bei kutaner und viszeraler Leishmaniose in vitro und in vivo

Aus dem Mikrobiologischen Institut – Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. C. Bogdan

Der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med.

vorgelegt von

Theresia Julia Schulz

aus Plauen

Als Dissertation genehmigt von der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Vorsitzender des Promotionsorgans:

Gutachter:

Gutachter

Tag der mündlichen Prüfung:

Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler

Prof. Dr. C. Bogdan

Prof. Dr. S. Krappmann

23. November 2015

1. INHALTSVERZEICHNIS

1 INHALTSVERZEICHNIS 1 INHALTSVERZEICHNIS ................................................................................. 1

2 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................... 1

2.1 Deutsche Zusammenfassung .............................................................................. 1

2.1.1 Hintergrund und Ziele ................................................................................. 1

2.1.2 Methoden ..................................................................................................... 1

2.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen .................................................................. 2

2.1.4 Praktische Schlussfolgerungen .................................................................... 2

2.2 English Abstract ................................................................................................. 3

2.2.1 Background ................................................................................................. 3

2.2.2 Methods ....................................................................................................... 3

2.2.3 Results ......................................................................................................... 3

2.2.4 Conclusion ................................................................................................... 4

3 EINLEITUNG .................................................................................................... 5

3.1 Leishmanien ....................................................................................................... 5

3.1.1 Klassifizierung und Epidemiologie ............................................................. 5

3.1.2 Übertragungszyklus ..................................................................................... 5

3.1.3 Durch Leishmania-Spezies verursachte Krankheitsbilder .......................... 6

3.1.4 Nachweismethoden ..................................................................................... 7

3.1.5 Aktuelle Therapieansätze ............................................................................ 8

3.1.6 Das Mausmodell der kutanen und viszeralen Leishmaniose .................... 10

3.2 Real-time PCR als diagnostisches Nachweisverfahren .................................... 11

3.2.1 Konventionelle bzw. Endpunkt-PCR ........................................................ 11

3.2.2 Reaktionsablauf und quantitative Auswertung der real-time PCR ........... 11

3.3 Fragestellung der vorliegenden Arbeit ............................................................. 15

4 MATERIAL & METHODEN .......................................................................... 17

4.1 Material ............................................................................................................ 17

4.1.1 Chemikalien .............................................................................................. 17

4.1.2 Oligonukleotide für Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ........................... 18

4.1.3 Zytokine .................................................................................................... 19

4.1.4 Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien ................................................... 19

4.1.5 Kits ............................................................................................................ 21


4.1.6 Kulturmedien ............................................................................................. 22

4.1.7 Versuchstiere ............................................................................................. 23

4.1.8 Leishmanien .............................................................................................. 24

4.1.9 Klonierungsvektor/Plasmid ....................................................................... 24

4.2 Methoden .......................................................................................................... 24

4.2.1 Bestimmung der Zellzahl und –viabilität .................................................. 24

4.2.2 Gewinnung von Knochenmark aus Mäusen und Generierung von Knochenmarksmakrophagen (BM-MΦ) ................................................... 25

4.2.3 In vitro-Pulsinfektion von murinen Makrophagen (BM-MΦ) mit Leishmania major ...................................................................................... 26

4.2.4 Leishmanien-Erhaltungskultur .................................................................. 27

4.2.5 Experimentelles Modell der kutanen Leishmaniose ................................. 27

4.2.6 Experimentelles Modell der viszeralen Leishmaniose .............................. 27

4.2.7 Bestimmung der Erregerlast durch Grenzverdünnungsanalyse (Limiting Dilution Analysis) ...................................................................................... 28

4.2.8 DNA-Isolierung aus murinen Geweben und Zellkulturen ........................ 29

4.2.9 Bestimmung der DNA-Konzentration durch photometrische Messung ... 31

4.2.10 Quantitative real-time PCR ....................................................................... 31

4.2.11 Kinetoplasten-PCR .................................................................................... 37

4.2.12 Statistische Auswertung ............................................................................ 38

5 ERGEBNISSE .................................................................................................. 39

5.1 Etablierung und Evaluierung einer Leishmanien/Maus-Duplex-PCR zur quantitativen Bestimmung der Parasitenlast .................................................... 39

5.1.1 Verifizierung der geeigneten Primerkonzentration ................................... 40

5.1.2 Verifizierung der geeigneten Sondenkonzentration .................................. 45

5.1.3 Etablierung der Duplex Leishmanien/λ-PCR ............................................ 48

5.1.4 Etablierung einer Maus-PCR und Duplextest mit Leishmanien-PCR ...... 52

5.1.5 Generierung einer Standardkurve als Voraussetzung zur absoluten Quantifizierung .......................................................................................... 55

5.1.6 Vergleich der Sensitivität zwischen Kinetoplasten-PCR und 18S rDNA real-time PCR ............................................................................................ 58

5.1.7 Vergleich zwischen StepOne® Real-Time PCR System und 7900 HT Fast Real-Time PCR System .............................................................................. 60

5.2 Vergleich zwischen DiffQuik® und real-time PCR für in vitro-Pulsinfektionen muriner Knochenmarksmakrophagen .............................................................. 62

5.3 Vergleich zwischen Limiting Dilution Analysis und real-time PCR für in vivo-Infektionsexperimente ...................................................................................... 66


5.3.1 Vergleich der Parasitenlast von BALB/c-bzw. C57BL/6-Mäusen mittels LDA und TaqMan nach subkutaner Infektion mit L. major ...................... 66

5.3.2 Vergleich der Parasitenlast von BALB/c-bzw. C57BL/6-Mäusen mittels LDA und TaqMan nach subkutaner Infektion mit L. infantum ................. 70

6 DISKUSSION .................................................................................................. 76

6.1 Etablierung eines real-time PCR-Systems zur Quantifizierung von Leishmanien ..................................................................................................... 76

6.1.1 Leishmanien-PCR ..................................................................................... 76

6.1.2 Duplex der Leishmanien-PCR mit λ-bzw. Maus-PCR ............................. 79

6.1.3 Vergleich zwischen konventioneller und real-time PCR .......................... 81

6.2 Leishmania real-time PCR im praktischen Gebrauch für in vitro/in vivo-Experimente...................................................................................................... 83

6.2.1 Anwendung der Leishmania real-time PCR bei in vitro-Infektionsexperimenten ............................................................................. 83

6.2.2 Anwendung der real-time PCR zur ex vivo-Analyse von Mausgewebe nach Infektion mit Leishmania .......................................................................... 85

7 LITERATURVERZEICHNIS.......................................................................... 92

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................. 100

2. ZUSAMMENFASSUNG

1

2 ZUSAMMENFASSUNG

2.1 Deutsche Zusammenfassung

2.1.1 Hintergrund und Ziele

Bei der Leishmaniose handelt es sich um eine von Sandmücken übertragene Erkran-

kung. Einzellige Erreger der Gattung Leishmania rufen in Abhängigkeit von der jewei-

ligen Spezies eine kutane, mukokutane oder viszerale Verlaufsform hervor. Der Klima-

wandel wie auch die zunehmende Mobilität sind Risikofaktoren für deutlich höhere

Fallzahlen der Leishmaniose in Deutschland in naher Zukunft. Die Weiterentwicklung

von Nachweis- und Therapiemethoden nimmt damit einen wichtigen Stellenwert ein. In

der vorliegenden Arbeit sollte überprüft werden, ob eine für diesen Zweck entwickelte

real-time PCR die bisherigen Goldstandard-Methoden zur Quantifizierung der Parasi-

tenbeladung ersetzen könnte, welche sehr zeitaufwändig sind und experimentelle Erfah-

rung erfordern. Die neu etablierte PCR-Methode sollte auch auf ihre Anwendbarkeit in

Forschungsarbeiten am Mausmodell für kutane und viszerale Leishmaniose getestet

werden.

2.1.2 Methoden

Ein bereits publiziertes real-time PCR-Protokoll, basierend auf dem 18S rRNA-

Genabschnitt des Leishmaniengenoms, wurde zunächst evaluiert und bezüglich ver-

schiedener Parameter (Primerkonzentration, Sondenkonzentration etc.) optimiert. Um

die Parasitenlast in Leishmania-infizierten Zellen und Mausgewebe quantifizieren zu

können, wurde die Leishmania-spezifische PCR im Duplexverfahren mit einer PCR für

ein endogenes Mauskontrollgen etabliert. Anschließend wurde die Parasitenlastbestim-

mung mittels Leishmania-Duplex-PCR sowohl mit in vitro-infizierten Zellen als auch

mit Gewebe aus Leishmanien-infizierten Mäusen getestet und mit der jeweils herkömm-

lichen Diagnostik (in vitro-Infektion: mikroskopische Auszählung nach Zellfärbung mit

DiffQuik®-Lösung; ex vivo-Analyse: Grenzverdünnungsanalyse und anschließende

Kultur für 7-10 Tage) verglichen.

2. ZUSAMMENFASSUNG

2

2.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen

In vitro mit Leishmania (L.) major infizierte murine Knochenmarkmakrophagen zeigten

in der mikroskopischen Auszählung erwartungsgemäß eine Abnahme der Infektionsrate,

wenn sie mit Immunstimulanzien inkubiert wurden, die Makrophagen zum Abtöten der

Parasiten aktivieren. Im Gegensatz dazu ergaben sich mit der in dieser Arbeit etablierten

Leishmania real-time PCR abweichende und zum Teil entgegengesetzte Ergebnisse,

sodass diese als Ersatz der bisherigen Untersuchungsmethode nicht geeignet erscheint.

Für in vivo-Untersuchungen wurden C57BL/6 und BALB/c- Mäuse mit L. major (kuta-

ne Leishmaniose) bzw. L. infantum (viszerale Leishmaniose) infiziert. In beiden Model-

len entwickelte sich der erwartete Infektionsverlauf. Das Ergebnis für die Beladung mit

Leishmanien gemessen mit Hilfe der konventionellen Grenzverdünnungsanalyse ent-

sprach den Daten aus der Literatur. Der Vergleich von real-time PCR und Grenzver-

dünnungsanalyse zeigte in beiden Modellen eine gute Übereinstimmung, sodass die

real-time PCR für ex vivo-Untersuchungen von Leishmanieninfektionen eine zuverläs-

sige und schnelle Quantifizierung zulässt.

2.1.4 Praktische Schlussfolgerungen

Ob die real-time PCR zum Nachweis der Leishmanienlast geeignet ist, hängt demnach

im Wesentlichen von den Versuchsbedingungen ab. Pulsinfektionsexperimente erstre-

cken sich meistens über wenige Tage; eine Abnahme von Parasiten kann hier in der

PCR nicht sicher detektiert werden. Hierfür ist wahrscheinlich die Parasiten-DNA, wel-

che nach dem Absterben der Erreger über eine längere Zeit in der Wirtszelle verbleibt,

verantwortlich. Bei ex vivo-Analysen von Geweben aus Leishmania-infizierten Mäusen,

bei denen sich die Infektion über längere Zeiträume ersteckte, zeigte sich eine gute Re-

produzierbarkeit und Korrelation zwischen den Ergebnissen der Duplex-PCR und der

konventionellen Methode. Damit wäre ein Einsatz des in dieser Arbeit evaluierten

Leishmania real-time PCR-Systems auch für Leishmaniose-Patienten denkbar und

könnte zum Beispiel zur Erfolgskontrolle einer Therapie eingesetzt werden.

2. ZUSAMMENFASSUNG

3

2.2 English Abstract

2.2.1 Background

Leishmaniasis is a disease transmitted by sand flies. Dependent on the species and strain

protozoan Leishmania parasites may cause a cutaneous, mucocutaneous or visceral in-

fection. Climate changes as well as the increasing mobility are risk factors for increas-

ing numbers of cases in Germany in the future. Advanced methods for parasite detection

and diagnosis are therefore of great relevance. This dissertation aimed to develop a real-

time PCR-based quantification method for Leishmania parasites which allows replace-

ment of the current time-consuming gold standard methods requiring significant exper-

imental know-how. In addition, the newly established PCR method should be evaluated

for its applicability for research studies in the murine model of cutaneous and visceral

leishmaniasis.

2.2.2 Methods

An already published real-time PCR protocol based on the 18S rRNA gene of the

Leishmania genome was initially evaluated and optimized for different parameters

(primer and probe concentrations etc.). To quantify the parasite burden in infected cells

and mouse tissue, a duplex PCR-system consisting of the Leishmania-specific PCR and

a PCR able to detect an endogenous mouse control gene was established. Afterwards

the duplex PCR-system was tested with in vitro infected cells as well as with tissue

samples from Leishmania-infected mice and compared to the respective conventional

diagnostic methods (in vitro infection: microscopic enumeration of the parasites after

cell staining with DiffQuik®; ex vivo: limiting dilution analysis followed by cultivation

for 7-10 days).

2.2.3 Results

In vitro, both the microscopically analyzed infection rate and the parasite load in L. ma-

jor-infected murine bone marrow-derived macrophages decreased when macrophages

get activated by stimulants known to induce parasite killing. The Leishmania real-time

PCR established in this dissertation, however, showed different or even opposite results.

Thus, the duplex-PCR method seems to be inappropriate to replace microscopic evalua-

tion of the parasite load in infected cells. For ex vivo examinations C57BL/6 and

2. ZUSAMMENFASSUNG

4

BALB/c mice were infected with L. major (cutaneous leishmaniasis) or L. infantum

(visceral leishmaniasis). In both models the expected course of infection developed. The

resulting Leishmania load measured with the conventional limiting dilution assay was

comparable to the results obtained with the real-time PCR indicating that the established

duplex-PCR method allows reliable and fast ex vivo quantification of parasite burden in

infected mouse tissues.

2.2.4 Conclusion

Whether real-time PCR is appropriate as a method for Leishmania quantification mainly

depends on the experimental setting that is used. In vitro experiments usually last only a

few days; here a decrease of the parasite load cannot be detected reliably. This is most

likely due to the detection of parasite DNA that will persist for some time in the host

cell after the death of the pathogens. In contrast, ex vivo analysis of tissues from

Leishmania-infected mice which had been infected for longer time periods showed a

good reproducibility and correlation of results by duplex-PCR and conventional evalua-

tion. Thus, the established Leishmania real-time PCR system might be also used for

quantification of parasite loads in human leishmaniasis patients in order to control for

the success of a therapeutic intervention.

3. EINLEITUNG

5

3 EINLEITUNG

3.1 Leishmanien

3.1.1 Klassifizierung und Epidemiologie

Einzellige Erreger der Gattung Leishmania sind begeißelte Flagellaten, die der Ordnung

der Kinetoplastida und Familie der Trypanosomatidae zugeordnet werden. Innerhalb der

Gattung sind über 20 verschiedene humanpathogene Spezies bekannt.

Die Leishmaniose ist endemisch in 88 Ländern der Welt und findet Verbreitung zwi-

schen dem 45. nördlichen und 30. südlichen Breitengrad [71]. Es wird unterschieden

zwischen der „Neu-Welt“-Leishmaniose mit Hauptendemiegebieten in Mittelamerika

sowie nördlichem und zentralem Südamerika sowie der „Alten Welt“; hier betroffen

sind weite Teile Asiens vom Nahen und Mittleren Osten bis Nordwestchina sowie die

Länder im Mittelmeerraum [42, 80]. Schätzungsweise 350 Mio. Menschen sind bedroht,

ca. 12 Mio. bereits infiziert; die Inzidenz beträgt rund 1,5 bis 2 Mio. Neuerkrankungen

pro Jahr [24].

Infolge des Klimawandels könnten sich die Endemiegebiete ausweiten und die Leish-

maniose an Bedeutung weiter zunehmen; so wurde beispielsweise das Auftreten von

Mücken der Gattung Phlebotomus, die als Vektoren für Leishmanien fungieren können,

in Süddeutschland beobachtet [73]. Die zunehmende Mobilität birgt außerdem die Ge-

fahr in sich, dass Leishmanien auch in Nicht-Endemiegebiete verschleppt werden. Das

Auftreten von autochthonen Leishmaniose-Fällen in Deutschland könnte dadurch eben-

falls erklärt werden [10, 53].

3.1.2 Übertragungszyklus

Die Übertragung von Leishmanien erfolgt durch weibliche Sandmücken (engl. sand

flies) der Gattung Phlebotomus, Lutzomyia und Psychodopygus. Durch eine Blutmahl-

zeit aufgenommen, entwickeln sich im Mitteldarm der Mücken über mehrere Zwischen-

stufen innerhalb einer Zeitspanne von 4 bis 25 Tagen [114] aus nicht-infektiösen pro-

zyklischen hochinfektiöse metazyklische Promastigoten (15 – 20 µm lang) mit einer ca.

20 µm langen Geißel im Bereich des vorderen Poles [90]. Nach Einwanderung in den

Proboscis der Mücke können bei einem erneuten Stich die Parasiten auf einen weiteren

3. EINLEITUNG

6

Wirtsorganismus übertragen werden [79], wo sie in der Haut sehr schnell von phagozy-

tierenden Zellen aufgenommen werden, insbesondere von Makrophagen (MΦ), Langer-

hanszellen, dendritischen Zellen und Granulozyten [85]. Im Phagosom dieser Zellen

findet die Transformation in die intrazelluläre, unbegeißelte und unbewegliche, amasti-

gote Form mit einem Durchmesser von 2 – 4 µm statt. Leishmania-Amastigote sind

gegenüber den äußeren Bedingungen im Phagosom und Phagolysosom unempfindlich

und können in diesem Zellkompartiment sehr gut überleben und sich sogar vermehren

[52]; nach starker Vermehrung ist die Freisetzung von Amastigoten durch Exozytose

oder Zelllyse und danach eine erneute Wirtszell-Infektion möglich [9]. Mücken können

beim Stich durch die Aufnahme freier Amastigoten oder Leishmania-beladener Phago-

zyten infiziert werden. Die infizierten Phagozyten zerfallen im Insektendarm, was zur

Freisetzung der Amastigoten führt [85], dadurch schließt sich der Infektionszyklus. Sel-

tener ist die Übertragung auch über die Plazenta, durch Bluttransfusionen, Geschlechts-

verkehr oder die gemeinsame Nutzung von Injektionsnadeln bei Drogenabhängigen

beobachtet worden [21, 68].

3.1.3 Durch Leishmania-Spezies verursachte Krankheitsbilder

Beim Menschen können drei große Krankheitsbilder voneinander abgegrenzt werden,

deren Ausprägung und Schweregrad einerseits von der/dem zugrundeliegenden Leish-

manien-Spezies/Stamm abhängig ist, zum anderen in starkem Zusammenhang mit dem

Immunstatus des Infizierten steht [67].

Die kutane Leishmaniose (CL), die überwiegend in Afghanistan, Syrien, Saudi-Arabien,

Brasilien, Peru, und im Iran vorkommt [25, 80], macht den größten Anteil der Leishma-

niosen aus. Sie ist gekennzeichnet durch das Auftreten einer Hautläsion an der Infekti-

onsstelle. Eine singulär auftretende Papel (auch als „Orientbeule“ bezeichnet) heilt nach

anfänglicher Schwellung und möglicher Ulzeration meist spontan innerhalb von 3 – 15

Monaten narbig ab [5]. Nach dem Ausheilen der Läsion kommt es meist zur Ausbildung

einer langanhaltenden Immunität [78], die Erreger persistieren dauerhaft [1]. Bei einer

Immunsuppression kann die Erkrankung erneut ausbrechen und in eine diffuse kutane

Leishmaniose übergehen, bis hin zum Befall innerer Organe (viszerale Leishmaniose)

mit letalem Ausgang [81, 114]. Erreger der kutanen Leishmaniose sind insbesondere L.

major, L. tropica, L. aethiopica und L. mexicana [80].

3. EINLEITUNG

7

Die mukokutane Leishmaniose, welche hauptsächlich in Lateinamerika Verbreitung

findet [97] und von den Spezies L. braziliensis, L. mexicana und L. peruviana hervorge-

rufen wird, ist gekennzeichnet durch rekurrierende und progredient verlaufenden Läsio-

nen in Bereich der Mund- und Nasenschleimhaut, welche nicht spontan abheilen [22].

Die viszerale Form der Leishmaniose (VL), auch Kala-Azar genannt, hat die schwer-

wiegendsten Auswirkungen auf den Wirtsorganismus und wird unter anderem durch L.

donovani und L. infantum / L. chagasi ausgelöst. Es kommt zum Befall innerer Organe

wie Milz, Leber und Knochenmark. Symptome sind Fieberschübe, Schleimhautblutun-

gen, Panzytopenie, Hepatosplenomegalie und ein zur Kachexie führender Gewichtsver-

lust [42], welcher unbehandelt fast immer letal endet. Verbreitung findet die viszerale

Leishmaniose vor allem in Bangladesch, Indien, Brasilien und dem Sudan.

3.1.4 Nachweismethoden

In Endemiegebieten treten eine Reihe von Krankheiten anderer Ätiologien auf, die im

klinischen Erscheinungsbild der Leishmaniose ähneln (z.B. Lepra, Hautkrebs, Tuberku-

lose bei der kutanen Form bzw. Malaria oder Schistosomiasis bei der viszeralen Leish-

maniose) [83], sodass eine Differentialdiagnose von großer Bedeutung ist.

Um die Diagnose einer Leishmaniose sicher zu stellen ist, ist der Nachweis des Erregers

unabdingbar. Aufgrund der weiten Verfügbarkeit und hoher Spezifität ist die Mikrosko-

pie in vielen Ländern der Goldstandard hierfür. Insbesondere in endemischen Gebieten

sind weiter ausgereifte Nachweistechniken zu teuer und nur selten verfügbar, sodass der

mikroskopische Nachweis das Mittel der Wahl ist. Mit Giemsa gefärbte Biopsieabstri-

che (CL) bzw. Punktate von Lymphknoten, Knochenmark oder Milz (VL) werden auf

das Vorliegen von Parasiten, vor allem aufgenommen in MΦ, untersucht. Problematisch

ist hierbei die geringe Anzahl an Amastigoten in chronischen Läsionen [6], was zu einer

Abnahme der Sensitivität führt.

Die kulturelle Anzucht auf geeigneten Nährböden/-medien zeichnet sich durch eine hö-

here Sensitivität aus. Allerdings ist die Kultivierung mit einer Reihe an Nachteilen ver-

bunden (siehe Kapitel 3.3).

Da das Ausmaß der klinischen Manifestation und auch der Therapieerfolg oft spezies-

abhängig sind [19], kann die Identifikation und Charakterisierung der Leishmanienspe-

zies sinnvoll sein, insbesondere bei der mukokutanen Verlaufsform. Dies ist z.B. mög-

3. EINLEITUNG

8

lich, wenn die Anzucht der Erreger mit der Multi-Lokus-Enzym-Elektrophorese

(MLEE) kombiniert wird [83].

Serologische Untersuchungen werden nicht routinemäßig durchgeführt. Aufgrund einer

eher geringen Menge an frei zirkulierenden Antikörpern, vor allem bei der CL [83], und

kreuzreagierenden Parasiten (z.B. Trypanosoma cruzi), können Sensitivität und Spezifi-

tät stark beeinträchtigt sein.

Trotz einer Vielzahl an erfolgreich evaluierten Methoden in der Leishmaniendiagnostik

geht die Tendenz immer mehr zur Molekulardiagnostik auf Basis der PCR (Polymerase

Chain Reaction) über. Vorteile gegenüber anderen etablierten Ansätzen wie kultureller

Anzucht ergeben sich im schnellen Vorliegen von Ergebnissen, die gleichzeitig eine

hohe sensible und spezifische Aussagekraft haben, dem DNA-Nachweis sowohl von

Amastigoten als auch von Promastigoten, sowie der Nutzbarkeit unterschiedlicher bio-

logischer Materialien [38]. Insbesondere, wenn eine niedrige Parasitenbeladung zu er-

warten ist, beispielsweise bei mukokutaner Leishmaniose [34] oder Proben aus Blut

[21] bzw. Konjunktivalsekret [102], ist die PCR anderen Methoden überlegen. Es exis-

tiert eine Vielzahl an PCR-Protokollen, die sich im technischen Ablauf (z.B. konventio-

nelle versus real-time PCR, siehe Kapitel 3.2), aber auch in den jeweiligen Zielgenen

voneinander unterscheiden. Hier seien stellvertretend die Mikrosatelliten-DNA [88],

SSU rRNA [107], das Tubulin-Gen [62], aber auch repetitive Sequenzen wie die Kine-

toplasten-DNA [23] genannt. Um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten und die Durch-

führbarkeit in verschiedenen Zentren zu ermöglichen, ist es von großer Bedeutung,

PCR-basierte Protokolle zu standardisieren und zu optimieren.

Für weitere Fortschritte der Diagnostik in Endemiegebieten ist bei der Entwicklung

neuer bzw. Verbesserung bestehender Methoden auf eine einfache Durchführbarkeit

und möglichst niedrige Kosten zu achten.

3.1.5 Aktuelle Therapieansätze

Seit über 60 Jahren ist der Einsatz pentavalenter Antimonpräparate sowohl für die visze-

rale als auch kutane Leishmaniose erprobt und hat sich, insbesondere bei nicht vorbe-

handelten Patienten, mit einer Ansprechrate von ca. 95% bewährt [95]. Probleme erge-

ben sich aus der Toxizität bei systemischer Gabe und zunehmenden Resistenzraten, ins-

besondere bei chronisch Erkrankten [17]. Die Kombination mit Paromomycin, einem

Aminoglykosid-Antibiotikum, wird in gemeinsamer Gabe mit pentavalentem Antimon

3. EINLEITUNG

9

getestet und zeigt in Phase III-Studien eine erhöhte Effizienz, reduzierbare Behand-

lungsdauer und herabgesetzte Mortalität gegenüber der Einfachtherapie [49, 104].

Ebenso zeigt das auch als Mittel gegen Pilzinfektionen eingesetzte Amphotericin B,

welches durch Wechselwirkungen mit Sterinen die Permeabilität der Zellmembran be-

einflusst, gute Erfolge. Gerade in Gebieten mit hohen Resistenzen gegen Antimonprä-

parate, aber auch in Europa und den USA wird Amphotericin B als Medikament erster

Wahl eingesetzt [4]. Aufgrund von Nebenwirkungen (u.a. Nephrotoxizität [6]) ist der

Einsatz des weiterentwickelten, liposomalen Amphotericin B vorzuziehen: nach Endo-

zytose durch MΦ gelangt das Medikament in unmittelbare Nähe zum Erreger [42], die

Toxizität und Behandlungsdauer lassen sich reduzieren; schon durch einmalige Gabe

können über 90% der Patienten geheilt werden [103]. Nachteilig sind die hohen Kosten

des Medikaments, die einen flächendeckenden Einsatz in endemischen Gebieten derzeit

unmöglich machen [103]. Weitere Antipilzmittel, wie z.B. Azole, wirken ebenfalls

leishmanizid [105], denn sie blockieren die Synthese von Ergosterol, welches auch in

der Membran von Leishmanien nachweisbar ist. Sie dienen als Reservemedikation bei

Resistenz gegen Antimonverbindungen.

Miltefosin, ursprünglich für die Antitumortherapie entwickelt, zeigt in L. donovani un-

ter anderem Einflüsse auf den Etherlipidstoffwechsel, die Synthese von Membranankern

sowie die Signaltransduktion [63]. Hier stellt allerdings die lange Halbwertszeit (150-

200 Stunden) mit Erreichen von Medikamentenspiegeln unter dem therapeutischen Le-

vel ein hohes Risiko der Resistenzentwicklung dar [13].

Die kutane Leishmaniose heilt meist von selbst aus, insbesondere bei Immungesunden.

Eine Indikation zur Therapie ist jedoch gegeben, um die Selbstheilung zu beschleuni-

gen, die Narbenbildung zu reduzieren und eine Disseminierung des Erregers zu unter-

binden [71]. Insbesondere Infektionen mit L. tropica benötigen zur Ausheilung eine

große Zeitspanne (bis zu einem Jahr). Hier kann die zusätzliche Einleitung einer

Thermotherapie oder topischer Paromomycin-Behandlung sinnvoll sein [6]. Die wohl

beste Effizienz und niedrigste Rückfallrate zeigt klinischen Studien zufolge die intralä-

sionale Gabe von Antimonpräparaten [5].

Eine vorbeugende Impfung in Endemiegebieten könnte die Inzidenzraten drastisch sen-

ken, Versuche mit Lebendvakzinen sind wegen nicht tolerierbaren kutanen Narbenbil-

dungen gescheitert. Derzeitige Studien untersuchen unter anderem die Wirksamkeit von

3. EINLEITUNG

10

rekombinanten Antigenen, Speichelproteinen von Schmetterlingsmücken und genetisch

modifizierten Vakzinen als Bestandteil eines möglichen Impfstoffes [50, 54].

3.1.6 Das Mausmodell der kutanen und viszeralen Leishmaniose

Durch subkutane oder intradermale Injektion von L. major-Promastigoten wird in der

Maus eine kutane Leishmaniose ausgelöst, welche der kutanen Leishmaniose beim

Menschen ähnelt. Klinische Manifestation und Krankheitsverlauf weisen in gängigen

Inzuchtmausstämmen eine sehr unterschiedliche Ausprägung auf: die meisten Inzucht-

mausstämme wie C57BL/6-Mäuse bilden allenfalls lokale Läsionen an der Inokulati-

onsstelle und entwickeln langanhaltende Immunität, wohingegen es bei empfänglichen

Stämmen wie BALB/c Mäusen wegen fehlender Möglichkeiten der Parasitenkontrolle

zur generalisierten Leishmaniose kommt, welche letztlich letal verläuft [89]

Zur Induktion einer viszeralen Leishmaniose werden L. donovani oder L. infantum

Promastigoten intravenös in Mäuse injiziert. Im Verlauf der Infektion kommt es haupt-

sächlich zum Befall innerer Organe wie Milz und Leber. In der Milz findet ein langsa-

mer Anstieg der Parasitenlast statt und die Erreger können im Verlauf der Erkrankung

auf einem hohen Niveau persistieren [28]. Die Leber hingegen weist eine schnelle Ver-

mehrung der Parasiten auf, mit beginnender Immunantwort können die Erreger dann

aber kontrolliert werden und die Parasitenzahl im Lebergewebe wird im Verlauf der

Infektion reduziert. Bei der viszeralen Leishmaniose ist im Gegensatz zur L. major-

Infektion kein grundsätzlich abweichender Krankheitsverlauf zwischen BALB/c und

C57BL/6-Mäusen zu beobachten [46].

Sowohl im Mausmodell der kutanen als auch der viszeralen Leishmaniose wurden in

zahlreichen Studien wichtige Komponenten der Immunabwehr definiert, die für eine

erfolgreiche Kontrolle der Leishmanien notwendig sind. Unerlässlich ist das Vorhan-

densein des Zytokins Interferon-γ (IFN-γ), das von Natürlichen Killerzellen und T-

Helfer-Zellen produziert wird. Zusammen mit dem Zytokin Tumornekrosefaktor (TNF)

führt Interferon-γ zu einer potenten Aktivierung von infizierten Makrophagen, die, in-

folge der Expression der induzierbaren Stickstoffmonoxidsynthase und Produktion von

Stickstoffmonoxid, Leishmanien abtöten [70].

3. EINLEITUNG

11

3.2 Real-time PCR als diagnostisches Nachweisverfahren

3.2.1 Konventionelle bzw. Endpunkt-PCR

Herkömmliche PCR-Methoden funktionieren nach dem Prinzip, ein nachzuweisendes

Genprodukt, das zwischen zwei flankierenden Primern gelegen ist, zu vervielfältigen

und anschließend zu detektieren. Dies erfolgt durch die Aufspaltung eines DNA-

Doppelstranges bei ca. 94°C, Ausbildung eines komplementären Stranges mithilfe einer

hitzebeständigen DNA-Polymerase im Bereich zwischen den beiden Primern, im An-

schluss folgt die erneute Auftrennung des gebildeten Doppelstranges und Vorlage des

ursprünglichen und neu synthetisierten DNA-Abschnittes für die Bildung dazu kom-

plementärer Stränge im Folgezyklus usw.; durch die Abfolge vieler solcher Zyklen

nacheinander kommt es zur Anreicherung des nachzuweisenden Genproduktes. Anfangs

erfolgt die Vervielfältigung (Amplifikation) exponentiell, mit zunehmender Dauer die-

ses Prozesses werden Reagenzien verbraucht und damit kommt es zum Übergang in

einen linearen Produktzuwachs; letztlich erreicht die Menge des synthetisierten Gen-

produktes eine Plateauphase.

Bei der konventionellen PCR wird das amplifizierte Genprodukt erst nach Abschluss

der Reaktion nachgewiesen, indem das PCR-Produkt auf ein Agarose-Gel aufgetragen

und elektrophoretisch aufgetrennt wird. Die Laufgeschwindigkeit ist hierbei indirekt

proportional zum dekadischen Logarithmus der Moleküllänge [41]. Die Auswertung

erfolgt durch Fotografie des Geles im ultravioletten Licht; dabei wird der vorher zuge-

gebene Fluoreszenzmarker Ethidiumbromid sichtbar gemacht, welcher in die DNA

interkaliert. Eine untersuchte Probe wird als positiv beurteilt, wenn das PCR-Produkt

der erwarteten Größe entspricht, was durch den Vergleich mit einem parallel eingesetz-

ten DNA-Größenstandard mit DNA-Fragmenten bekannter Größen ermittelt werden

kann. Zur Überprüfung der Spezifität des PCR-Produktes kann es ggf. auch sequenziert

werden.

Diese Form der PCR wird auch als Endpunkt-PCR bezeichnet, weil die Detektion des

gesuchten Genproduktes erst im Anschluss an den Amplifikationsprozess erfolgt.

3.2.2 Reaktionsablauf und quantitative Auswertung der real-time PCR

Bei der real-time PCR wird das gebildete Produkt im Gegensatz zur konventionellen

PCR unmittelbar während der Amplifikation durch Messung eine Fluoreszenzsignals

3. EINLEITUNG

12

sichtbar gemacht, daher auch der Begriff „Echtzeit-PCR“ (engl. real-time). Das Ausmaß

der Fluoreszenzstärke ist dabei abhängig von der gebildeten Produktmenge [44] [40].

Die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe besitzen eine bestimmte Grundfluoreszenz, die

als Basislinie gesetzt wird. Ausgehend von dieser Hintergrundfluoreszenz wird ein

Schwellenwert (engl. Threshold) definiert, der der Standardabweichung der Basisfluo-

reszenz (gemessen zwischen dem 3. und 15. Zyklus) multipliziert mit 10 entspricht [37].

Eine Probe wird dann als positiv bewertet, wenn das Fluoreszenzsignal den Schwellen-

wert überschreitet, wobei der Threshold Cycle (CT) dem Zyklus entspricht, bei dem die-

ser Schwellenwert erstmals überstiegen wird. Je niedriger der CT-Wert ist, desto höher

war demzufolge die Ausgangsmenge des nachzuweisenden Genabschnittes. Verschiebt

sich der CT-Wert um einen Zyklus nach oben oder nach unten, so ist davon auszugehen,

dass eine halb so große bzw. doppelte Menge des interessierenden Gens in der einge-

setzten DNA vorlag. Der CT-Wert ist folglich die Basis für die Quantifizierung in der

real-time PCR [37].

Um DNA-Mengen zu untersuchender Proben absolut messen zu können, wird eine

Standardkurve mit bekannten Konzentrationen oder Genomäquivalenten mitgeführt

(Abb. 3.1).

Abb. 3.1: Standardkurve einer real-time PCR: Durch Mitführen eines Standards mit bekannter

Konzentration oder Menge an Ausgangs-DNA, welche beispielsweise durch eine dekadische Ver-

dünnungsreihe hergestellt wird, wird eine Standardkurve erstellt. Dabei werden die ermittelten CT-

Werte gegen den dekadischen Logarithmus der Quantität aufgetragen. Durch Eintragen der CT-

Werte zu untersuchender Proben kann nun an der Abszisse die DNA-Menge bzw. Konzentration

abgelesen werden [32], dabei sollte der Standardbereich die erwarteten Probenkonzentrationen

umfassen [33]. Abbildungsnachweis: Theresia Schulz

3. EINLEITUNG

13

Als Fluoreszenzstoff wird heute meist SYBR Green® eingesetzt. Dieser Farbstoff bin-

det in doppelsträngiger DNA und zeigt nach Anregung eine etwa 1000-mal erhöhte

Fluoreszenz gegenüber dem ungebundenen Farbstoff [43, 44]. Vorteil ist die Möglich-

keit des universellen Einsatzes, da SYBR Green® nicht sequenzspezifisch bindet [14].

Allerdings besteht die Gefahr eines unspezifischen Fluoreszenzanstieges beim Vorlie-

gen von Artefakten, z.B. von Primerdimeren und unspezifischen PCR-Produkten [108].

Eine weitere Möglichkeit ist die Nutzung fluoreszierender Sonden (engl. probes). Diese

mit Farbstoffen markierten Oligonukleotide sind meist zwischen 20 und 30 Basenpaa-

ren lang und binden spezifisch an eine zwischen den Primern gelegene Sequenz. Erst

nach Bindung an die Zielsequenz kommt es zum Fluoreszenzanstieg. Es gibt eine Reihe

unterschiedlicher Sondensysteme, doch das Wirkprinzip ist allen gleich: der sogenannte

Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) [15, 31]. Dies besagt, dass ein Fluo-

reszenzstoff nach Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge (A1) die aufge-

nommene Energie mit Licht einer anderen Wellenlänge wieder abstrahlt (E1, = Emissi-

on). Dabei hat jeder Fluoreszenzstoff ein eigenes Anregungs- und Emissionsspektrum.

Befindet sich ein Farbstoff 1 in ausreichender Nähe (max. 17-20 bp Abstand; bp = Ba-

senpaare) zu einem Farbstoff 2, dessen Anregungsspektrum dem Emissionsspektrum des

Ersteren entspricht (A2 = E1), so erfolgt bei Anregung keine Lichtabstrahlung von Farb-

stoff 1, sondern ein Energietransfer auf Farbstoff 2 [15]. Bei der quantitativen PCR kann

durch Messung der Emission von Farbstoff 1 oder 2 auf die räumliche Nähe beider Farb-

stoffe geschlossen werden [96]. In der vorliegenden Arbeit wurde die Emission von

Farbstoff 1 detektiert, der in diesem Fall als Reporterfarbstoff bezeichnet wird, während

Farbstoff 2 als Quencher fungiert. Die hier eingesetzten TaqMan-Sonden sind sogenann-

te Hydrolysesonden: durch die Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase werden die an

die Zielsequenz gebundenen Sonden aufgespalten, Reporter und Quencher werden

räumlich voneinander getrennt und es kommt zum Fluoreszenzanstieg bei E1 [37, 40,

45] (Abb. 3.2).

Mit dem Einsatz verschiedener Reporter- und Quencherfarbstoffe können mehrere

PCRs simultan in einem Ansatz erfolgen; diese Weiterentwicklung der real-time PCR

wird als Multiplex-PCR bezeichnet. Im vorliegenden Fall wurden die Fluoreszenzmar-

ker FAM und VIC als Reporter ausgewählt, sowie TAMRA und NFQ als Quencher.

NFQ ist zusätzlich an einen

mit der DNA-Helix im Bereich der kleinen Furche

stärkten Bindung der Sonde an die Zielsequenz und ermögl

zerer Sonden. Hierdurch steigen Sensitivität und Spezifität an, wodurch die benötigte

Sondenkonzentration und damit auch die Hintergrundfluoreszenz abnimmt

Abb. 3.2: Prinzip der TaqMan

sondengebunden; bei Anregung des Reporters kommt es zum Energietransfer (FRET) auf den

Quencher, welcher Licht einer bestimmten Wellenlänge

beide Farbstoffe in unmittelbarer Nähe zueinander befinde

ist. Bei Vorliegen von DNA mit der entsprechenden Zielsequenz kommt es im Rahmen der Ampl

fikation zur Anlagerung der Sonde an den komplementären Strang

Aktivität der Taq- Polymerase zur Spaltung der Sonde. Infolge der räumlichen Trennung

nicht mehr möglich und der Reporter strahlt Licht der Wellenlänge E

messbaren Fluoreszenzanstiegs bei

dungsnachweis: Theresia Schulz

3. EINLEITUNG

14

NFQ ist zusätzlich an einen Minor groove binder (MGB) gekoppelt; dieser hybridisiert

Helix im Bereich der kleinen Furche [56]. Der MGB führt zu einer ve

stärkten Bindung der Sonde an die Zielsequenz und ermöglicht so die Verwendung kü

Sonden. Hierdurch steigen Sensitivität und Spezifität an, wodurch die benötigte

Sondenkonzentration und damit auch die Hintergrundfluoreszenz abnimmt

TaqMan-Hydrolysesonden: Farbstoffe 1 (Reporter) und 2 (


welcher Licht einer bestimmten Wellenlänge (E2) abstrahlt. Dies ist möglich,

beide Farbstoffe in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, wie es bei der intakten Sonde der Fall

ist. Bei Vorliegen von DNA mit der entsprechenden Zielsequenz kommt es im Rahmen der Ampl

fikation zur Anlagerung der Sonde an den komplementären Strang (Annealing

Polymerase zur Spaltung der Sonde. Infolge der räumlichen Trennung

der Reporter strahlt Licht der Wellenlänge E1 ab. Die

messbaren Fluoreszenzanstiegs bei E1 dient als Grundlage der quantitativen Auswertung.

dungsnachweis: Theresia Schulz

3. EINLEITUNG

(MGB) gekoppelt; dieser hybridisiert

. Der MGB führt zu einer ver-

icht so die Verwendung kür-

Sonden. Hierdurch steigen Sensitivität und Spezifität an, wodurch die benötigte

Sondenkonzentration und damit auch die Hintergrundfluoreszenz abnimmt [57].

) und 2 (Quencher) sind


ist möglich, wenn sich

bei der intakten Sonde der Fall

ist. Bei Vorliegen von DNA mit der entsprechenden Zielsequenz kommt es im Rahmen der Ampli-

Annealing) und durch die

Polymerase zur Spaltung der Sonde. Infolge der räumlichen Trennung ist FRET

. Die Höhe des jetzt

Grundlage der quantitativen Auswertung. Abbil-

3. EINLEITUNG

15

3.3 Fragestellung der vorliegenden Arbeit

Das bisher standardmäßig genutzte Verfahren zur Bestimmung der Parasitendichte mu-

riner Gewebe bei kutaner und viszeraler Leishmaniose in vivo ist die Grenzverdün-

nungsanalyse (Limiting Dilution Analysis, LD). Hierbei erfolgt das sequentielle Austit-

rieren von Zellsuspensionen über viele Verdünnungsstufen mit mindestens 12 Replika-

ten je Verdünnungsschritt. Nach Anzüchtung und Kultivierung wird durch die Auszäh-

lung positiver (Wachstum von Leishmanien) und negativer Replikate die Parasitenlast

statistisch ermittelt. Aufgrund des hohen Zeit- und Arbeitsaufwandes, der Anfälligkeit

gegen Pipettierfehler, z.B. Kreuzkontamination einzelner Verdünnungsstufen, Probleme

bei der statistischen Auswertung, die beispielsweise infolge des Überganges einer Ver-

dünnungsstufe mit 100% positiven Replikaten zu 100% negativen Replikaten in der

folgenden Verdünnungsstufe auftreten können, und einiger anderer Faktoren, hat diese

Methode etliche Nachteile. Eine Alternative könnte die Quantifizierung mittels real-

time PCR-Methode darstellen. Bisher veröffentlichte Arbeiten liefern klare Hinweise,

dass zwischen der Parasitenlast und dem PCR-Signal eine Korrelation besteht [64, 94].

Ziel 1: Die bereits beschriebene 18S rDNA-basierte real-time PCR [115] zum Nachweis

von Leishmanien-DNA soll etabliert und evaluiert werden (u.a. Ermittlung optimaler

Primer- und Sondenkonzentrationen, Testung der Spezifität und Sensitivität) und mittels

Amplifizierung von Proben unterschiedlicher Ausgangskonzentrationen an Leishma-

nien-DNA auf ihre quantitative Aussagekraft überprüft werden.

Die Quantifizierung infizierter muriner Organe bzw. Gewebe erfordert das gleichzeitige

mengenmäßige Erfassen eines Wirtszell-Genes, welches während der Infektion mög-

lichst nicht reguliert wird und als Bezugsgröße dient (Angabe als Leishmanien-DNA-

Äquivalente pro Wirtszell-Gen bzw. pro Wirtszelle). Dafür muss ein geeignetes Gen mit

bekannter Kopienzahl im murinen Genom definiert und ausgehend davon ein PCR-

System etabliert werden. Wünschenswert wäre ein Nebeneinander-Ablaufen beider

PCRs in einem Ansatz (sog. Duplex-PCR).

Ziel 2: Nach Etablierung eines geeigneten Leishmanien/Maus-PCR-Systems soll dieses

zunächst in in vitro-Bedingungen getestet werden. Hierbei soll analysiert werden, ob die

Parasitenlast in Zellkulturen von infizierten murinen Knochenmarksmakrophagen (BM-

3. EINLEITUNG

16

MΦ) mit Hilfe der real-time PCR verlässlich quantifiziert werden kann. Die dafür stan-

dardmäßig verwendete Methode ist die Fixierung und Anfärbung mittels DiffQuik®-

Färbereagenz, und die anschließende mikroskopische Ermittlung des prozentualen An-

teils infizierter Zellen und der Parasitenzahl in den infizierten Zellen, woraus sich Infek-

tionsrate und Parasitenlast bestimmen lassen. Es ist demnach zu prüfen, ob die Quanti-

fizierung über das PCR-Signal (ausgehend von einer DNA-Präparation aus entspre-

chenden Zellkulturen) mit den Resultaten aus mikroskopischer Auszählung nach Diff-

Quik®-Färbung übereinstimmt.

Ziel 3: Das etablierte Leishmanien/Maus-PCR-System soll schließlich für ex vivo-

Analysen von Geweben aus infizierten Mäusen (kutane Leishmaniose [L. major], visze-

rale Leishmaniose [L. infantum]) evaluiert werden. Damit verbunden ist die Fragestel-

lung, ob eine Quantifizierung der Parasitenlast durch real-time PCR unter Verwendung

von DNA aus Organen infizierter Mäuse mit den Ergebnissen der LD-Analyse korre-

liert.

4. MATERIAL & METHODEN

17

4 MATERIAL & METHODEN

4.1 Material

4.1.1 Chemikalien

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Deisenhofen

2-Propanol Roth, Karlsruhe

Agarose ultra pure Invitrogen/Life Technologies, Karlsru-

he

Ammoniumchlorid Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Brain-Heart-Infusion-Agar, pH 7,4 Charles River, Sulzfeld

DiffQuik® Färbereagenz Medion Diagnostics, Düdingen,

Schweiz

Dulbecco’s modified Eagle Medium

(DMEM)

Gibco/Life Technologies, Karlsruhe

dNTPs (20mM) = PCR Polymerization Mix GE-Healthcare, München

Ethanol Merck, Darmstadt

Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe

Ethylenoxid (Anprolene®-Ampullen) Andersen Products, North Carolina

Fötales Kälberserum (FCS) Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Humane DNA Bioline, Luckenwalde

LAL Wasser Lonza, Köln

Lambda-DNA New England Biolabs, Frankfurt/Main

MEM, nicht essentielle Aminosäuren, 100x Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Phosphate buffered saline (PBS) Seromed-Biochrom, Berlin

pUC Mix MBI Fermentas, St. Leon-Rot

RPMI 1640 Gibco/Life Technologies, Karlsruhe

Hepes Gibco/Life Technologies, Karlsruhe

Penicillin-Streptomycin Gibco/Life Technologies, Karlsruhe

Schneider’s Insekten-Grundmedium Genaxxon BioScience, Ulm

TAE-Puffer, 50x Eppendorf, Hamburg


18

Tetramethylammoniumchlorid (TE) Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Taq Polymerase (5 U/µl) Invitrogen/Life Technologies, Karlsru-

he

TaqMan Gene Expression MasterMix 2x Applied Biosystems, Weiterstadt

Trypanblau Gibco/Life Technologies, Karlsruhe

Zap-Oglobin Beckman Coulter, Krefeld

4.1.2 Oligonukleotide für Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

PCR/Zielgen Sequenz

TaqMan PCR

Leishmanien-

18S rDNA

[115]

Primer

Sonde

LEIS.U1

LEIS.L1

LEIS.P1

5’-AAGTGCTTTCCCATCGCAACT-3’

5’-GACGCACTAAACCCCTCCAA-3’

FAM-CGGTTCGGTGTGTGGCGCC-TAMRA

Leishmanien-

18S rDNA

(modifiziert)

[36]

Primer

Sonde

LEIS.U3

LEIS.L1

LEIS.P2

5’-TGCTTTCCCATCGCAACTTC-3’

5’-GACGCACTAAACCCCTCCAA-3’

FAM-TTCGGTGTGTGGCGCC-NFQ-MGB

Lambda D Primer LamD_F 5’-CCCTGCGGCTGGTAATGG-3’

[36] LamD_R 5’-TGAACACACCAGTGTAAGGGATGT-3’

Sonde LamD_P VIC-AAGGTTTCTTTGCTCGTCATA-NFQ-

MGB

Lambda C

[36]

Primer LamC_F

LamC_R

5’-CCGTTAACGATTTGCTGAACACA-3’

5’-GGCTGGTAATGGGTAAAGGTTTC-3’

Sonde LamC_P VIC-CAGTGTAAGGGATGTTTATGACGA-

NFQ-MGB


19

Nidogen 3

[36]

Primer Nido.F3 5’-TCGGCTCAGTAGCGCCTT-3’

Nido.R3 5’-CCCAGGCCATCGGTTGT-3’

Nidogen 4

[36]

Sonde

Primer

Sonde

Nido.P3

Nido.F4

Nido.R3

Nido.P4

VIC-CCTGGCTGACTTGGA-NFQ-MGB

5’-ACCCAGCTTCGGCTCAGTAG-3’

5’-CCCAGGCCATCGGTTGT-3’

VIC-CCTTTCCTGGCTGACTT-NFQ-MGB

Kinetoplasten-

PCR

Primer Lei13A 5’-GTGGGGGAGGGGCGTTCT-3’

[86] Lei13B 5’-ATTTTACACCAACCCCCAGTT-3’

Primer/Sonden TaqMan-PCR

Applied Biosystems/Life Technologies,

Darmstadt

Primer/Sonden Kinetoplasten-PCR Sigma-Aldrich, Deisenhofen

4.1.3 Zytokine

Rekombinantes murines Interferon-γ (rmIFN-

γ)

Zur Verfügung gestellt von Dr. G.

Adolf, Ernst-Böhringer-Institut, Wien

Rekombinanter muriner Makrophagen-

kolonie-stimulierender Faktor (rmM-CSF)

R&D Systems, Wiesbaden-

Nordenstadt

Rekombinanter muriner Tumornekrosefaktor-

α (rmTNF-α)

R&D Systems, Wiesbaden-

Nordenstadt

4.1.4 Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien

24-well Kulturplatten Cellstar® Greiner Bio-one, Frickenhausen

96-well Kulturplatten Nunc, Wiesbaden

Axioskop 40 Carl Zeiss, Jena

Axiovert 40C Mikroskop Carl Zeiss, Jena


20

BioPhotometer Eppendorf, Hamburg

Brutschrank BBD 6220 Heraeus, Hanau

Brutschrank Heracell 240 Heraeus, Hanau

Chamber Slide LabTek® Thermo Fisher Scientific, Schwerte

Computer Optiplex 745 DELL, Frankfurt

Costar® Stipette® 5, 10, 25ml Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Deckgläser Marienfeld, Lauda-Königshofen

Edelstahlsiebe VWR, Nürnberg

Elektrophoresekammer 40-1214 Mini L PeqLab, Erlangen

Feinwaage TE64 Sartorius, Göttingen

Gel Dokumentationssystem Gel iX Imager Intas, Göttingen

GeneAmp® PCR System 9700 Applied Biosystems/Life Technolo-

gies, Darmstadt

Injektionskanülen 20G/27G Becton Dickinson, Heidelberg

Injektionsspritzen 10ml Becton Dickinson, Heidelberg

Injektionsspritzen 20ml Codan, Lensahn

Kunststoffküvette UVette® Eppendorf, Hamburg

Magnetrührer RCT basic IKA, Staufen

MicroAmp® 48-well optical adhesive film Applied Biosystems/Life Technolo-

gies, Darmstadt

Fast optical 384-well reaction plate Applied Biosystems/Life Technolo-

gies, Darmstadt

MicroAmp® Fast optical 48-well reaction

plate

Applied Biosystems/Life Technolo-

gies, Darmstadt

Mikrowelle MW749 Clatronic, Kempen

Minishaker MS2 IKA, Staufen

Multipette® plus Eppendorf, Hamburg

Netzgerät E844 Consort, Turnhout, Belgien

Neubauer Zählkammer (0,02mm Tiefe) Brand, Wertheim

Neubauer Zählkammer (0,10mm Tiefe) Labor Optik, Bad Homburg

Optically Clear Adhesive Seal Sheets Thermo Fisher Scientific, Schwerte

PCR-Reaktionsgefäße 0,2 ml Eppendorf, Hamburg


21

PCR-Reaktionsgefäße 1,5 ml SafeLock Eppendorf, Hamburg

PCR-Reaktionsgefäße 1,5 ml Standard Eppendorf, Hamburg

Petrischalen, steril verpackt Nunc, Wiesbaden

Pipetten 10, 20, 100, 1000µl Eppendorf, Hamburg

Pipetten 2, 10, 20, 200, 1000µl Gilson, Limburg

Pipettenspitzen 10 µl Sarstedt; Nümrecht

Pipettenspitzen 100 µl PeqLab, Erlangen

Pipettenspitzen 1000 µl Sarstedt, Nümrecht

Pipettierhilfe macro Brand, Wertheim

Pipettierhilfe Pipetboy acu Integra Biosciences, Fernwald

Plastikröhrchen (Falcons) 15ml Becton Dickinson, Heidelberg

Plastikröhrchen (Falcons) 50ml Becton Dickinson, Heidelberg

Plastiksiebe cell strainer Becton Dickinson, Heidelberg

Reagenzgläser 5ml (Round bottom tubes) Becton Dickinson, Heidelberg

Schnelltaster Kroeplin, Schlüchtern

StepOne® Real-Time PCR System Applied Biosystems/Life Technolo-

gies, Darmstadt

Sterilbank Hera Safe Heraeus, Hanau

TaqMan 7900 HT Fast Real-Time PCR Sys-

tem

Applied Biosystems/Life Technolo-

gies, Darmstadt

Taumler REAX3 Heidolph, Schwabach

Thermomixer compact Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifuge 5417C Eppendorf, Hamburg

Tissue Lyser Qiagen, Hilden

Zellkulturschalen Nunc, Wiesbaden

Zentrifuge Multifuge 3 SR+ Heraeus, Hanau

4.1.5 Kits

High Pure PCR Template Preparation Kit

(100)

Roche Diagnostics, Mannheim


22

4.1.6 Kulturmedien

Kaninchenblut-Schrägagar (Novy-MacNeal-Nicolle, NNN-Agar)

200 ml 1% (v/v) Brain-Heart-Infusion-Agar

50 ml frisches Kaninchenblut (Charles River, Sulzfeld)

50 ml PBS

100 IU/ml Penicillin G (30 000 IU)

0,1 mg/ml Streptomycin

Schneider’s Insektenzellmedium

Schneider´s Insekten-Grundmedium, ergänzt durch Zusatz von:

4 % (v/v) Aminosäure-Antibiotika-Pyruvat (AAP)-Lösung (25x)

10 mM Hepes

10 % (v/v) inaktiviertes FCS (56°C, 30 min)

2 % (v/v) Humanurin, steril

Aminosäure-Antibiotika-Pyruvat-Lösung enthält:

1.5 mg/ml Penicillin G (2500 U/ml)

3.25 mg/ml Streptomycinsulfat

25 mM Natriumpyruvat

50

50

6,8

13,8

mM

ml

mM

mM

L-Glutamin

DMEM, ohne Phenolrot

L-Asparagin

L-Arginin

in deionisiertem (Leitungswiderstand >18 MegaOhm) H2O (dH2O)


23

Differenzierungsmedium für Knochenmarksmakrophagen

DMEM-Kulturmedium (incl. 4,5 g/l Glucose, L-Glutamin, Pyruvat), ergänzt durch Zu-

satz von:

10 % (v/v) inaktiviertes FCS

5 % (v/v) inaktiviertes Pferdeserum

50 µM 2-Mercaptoethanol

1 % (v/v) MEM nicht-essentielle Aminosäuren

15 % (v/v) Überstand der L929 Fibroblastenzelllinie (eigene Herstellung, enthält

m-CSF)

Zellkulturvollmedium

RPMI-1640 (incl. 300 mg/l L-Glutamin, 2000 mg/l NaHCO3),

ergänzt durch Zusatz von:

10 mM Hepes

50 µM 2-Mercaptoethanol

100 U/ml Penicillin G

100

5

mg/ml

% (v/v)

Streptomycin

inaktiviertes fötales Kälberserum (FCS)

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

enthält:

0,2 g/l KCl

8,0 g/l NaCl

0,2 g/l KH2PO4

1,44 g/l Na2HPO4

in Aqua bidest.

4.1.7 Versuchstiere

Zur Gewinnung von murinen Organen wurden Mäuse der Inzuchtstämme

BALB/cAnNCrl (BALB/c) und C57BL/6NCrl (C57BL/6) im Alter von 6-12 Wochen

von Charles River Breeding Laboratories, Sulzfeld bezogen. Die Tiere wurden in Käfi-

gen mit Filterhaube gehalten und hatten freien Zugang zu Trinkwasser und Futter.


24

Bei Infektionsexperimenten wurden regelmäßig der Allgemeinzustand und das Gewicht

der Tiere überprüft; die Fußdicke als Parameter der Läsionsentwicklung wurde mithilfe

eines Schnelltasters erfasst und dokumentiert.

4.1.8 Leishmanien

Für die in vitro-Infektion von BM-MΦ und für Mausinfektionsexperimente zum Modell

der kutanen Leishmaniose wurde der Stamm L. major MHOM/IL/81/FEBNI [98] einge-

setzt, der 1981 aus der Läsion einer israelischen Patientin isoliert wurde (Dr. F. Ebert,

Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg).

Für Mausinfektionsexperimente zur viszeralen Leishmaniose wurde der Stamm L. in-

fantum MHOM/00/98/LUB1 [10] eingesetzt. Dieser war aus dem Knochenmark eines

an viszeraler Leishmaniose erkrankten Kindes in Bayern isoliert worden.

4.1.9 Klonierungsvektor/Plasmid

Für quantitative Analysen des Leishmaniengehaltes zu untersuchender Proben wurde

von der Arbeitsgruppe ein Plasmid (pGEM-T Easy, Invitrogen/Life Technologies, Dar-

mstadt) zur Verfügung gestellt, in welches die 18S rRNA-Gensequenz aus dem Leish-

maniengenom [115] kloniert worden war (Karin Knoll, Ulrike Schleicher und Christian

Bogdan, unpublizierte Daten, siehe auch Kapitel 4.2.10).

4.2 Methoden

4.2.1 Bestimmung der Zellzahl und –viabilität

Zur Bestimmung der Zellzahl einer Zellsuspension wurde diese 1:10 in 0,08 % (v/v)

Trypanblau verdünnt.

Unter Zuhilfenahme einer Neubauer-Zählkammer kann die Zellzahl mikroskopisch be-

stimmt werden. Dazu wird ein Deckglas auf den Neubauer-Objektträger so aufgebracht,

dass „Newtonringe“ sichtbar werden. Damit ist die Kammer auf ein definiertes Volu-

men geeicht. Die Zählkammer kann nun mit der Trypanblau-gefärbten Zellsuspension

befüllt werden. Lebende und tote Zellen können voneinander unterschieden werden,

weil Trypanblau nur in solche Zellen eindringen kann, deren Zellmembran geschädigt

ist; und die Zellkerne blau anfärbt. Lebende Zellen mit intakter Membran hingegen

werden nicht angefärbt.


25

Die Anzahl der Zellen in einer Suspension kann durch die folgende Formel ermittelt

werden:

Zellen/ml = n/c x f x k

Gesamtzellzahl = Zellen/ml x v

n = Summe der Zellen in den ausgezählten Großquadraten (bestehend aus 4 x 4 Unter-

quadraten)

c = Anzahl der ausgezählten Großquadrate

f = Verdünnungsfaktor in der Trypanblaulösung

k = Kammerfaktor der Neubauer-Zählkammer

(Zählkammer für Zellen: 1 x 104 , Zählkammer für Leishmanien: 5 x 104)

v = Gesamtvolumen der Suspension [in ml]

4.2.2 Gewinnung von Knochenmark aus Mäusen und Generierung von

Knochenmarksmakrophagen (BM-MΦ)

Nach Tötung von naiven Mäusen mittels Isofluran-Narkose und anschließender zervika-

ler Dislokation wurden diesen die Ober- und Unterschenkelknochen entnommen. Im

Anschluss erfolgte das Abtrennen der Epiphysen, Ausspülen der Knochenmarkszellen

mit Zellkulturvollmedium mit Hilfe einer 27G-Kanüle und einer Spritze und Zentrifuga-

tion bei 300 x g, 4°C für 10 min. Das entstandene Zellpellet wurde zur Generierung von

BM-MΦ verwendet. Entsprechend dem Protokoll von Schleicher und Bogdan [92] wur-

den einem Volumen von 50 ml MΦ-Differenzierungsmedium (enthält 5 ng/ml rmM-

CSF) 6 x 106 Knochenmarkszellen hinzugegeben. Die Differenzierung der Knochen-

markzellen zu Makrophagen (engl. bone marrow macrophages, Abk. BM-MΦ) erfolgt

in hydrophober Teflonfolie, die zuvor zu Schläuchen zusammengeschweißt und danach

mit Ethylenoxid (Anprolene®) sterilisiert wurde. Nach einer Inkubation für 7 bis 8 Tage

bei 37°C, 10% CO2, und 95% Luftfeuchtigkeit im Brutschrank können die reifen BM-

MΦ geerntet werden. Die hydrophobe Oberfläche erleichtert dabei das Ablösen der ad-

härenten Zellen.


26

4.2.3 In vitro-Pulsinfektion von murinen Makrophagen (BM-MΦ) mit

Leishmania major

Für in vitro-Experimente wurden murine BM-MΦ von C57BL/6-Mäusen in 8-well

ChamberSlides mit promastigoten L. major für 24h infiziert. Pro well wurden 0,15x106

Makrophagen ausgesät; die gewählte Infektionsdosis (MOI= multiplicity of infection)

betrug 10 Leishmanien pro MΦ. Zusätzlich zu den Leishmanien wurden die MΦ mit

Zytokinen in unterschiedlicher Konzentration stimuliert. Danach wurden die Zellen

zweimal mit warmem PBS gewaschen. Leishmanien, welche nicht phagozytiert worden

sind, werden dadurch entfernt. Anschließend wurde frisches Kulturmedium (RPMI

1640 mit Zusatz von 5% FCS) zugegeben. Es erfolgte eine Kultivierung bei 37°C, 5%

CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit im Zellinkubator.

Nach Ablauf von 24h erfolgte jeweils ein Wechsel des Mediums. Das Medium wurde

abgenommen, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und wieder mit frischem Medi-

um inkl. der Stimulanzien versetzt. Vor und nach dem Mediumwechsel erfolgte eine

mikroskopische Kontrolle der Zellen, um sicherzugehen, dass die MΦ nicht versehent-

lich durch den Waschvorgang entfernt wurden. Nach 48 bzw. 72h fand die Analyse der

Zellen mittels lichtmikroskopischer Auszählung statt. Dazu wurde das ChamberSlide

nach zweimaligem Waschen mit warmem PBS mittels DiffQuik® gefärbt. Neben dem

MΦ-Zellkern werden hier auch Kern und Kinetoplast der Leishmania-Amastigoten blau

angefärbt. So ist es möglich, Infektionsrate und Parasitenlast pro Zelle zu ermitteln. Pro

Kammer eines ChamberSlides wurden ca. 250 Zellen in mehreren Gesichtsfeldern aus-

gezählt, um die durchschnittliche Infektionsrate und Parasitenbeladung zu bestimmen.

Die durchschnittliche Anzahl der Parasiten pro MΦ, bezogen auf Gesamtzahl der MΦ,

lässt sich aus der Infektionsrate und der Parasitenzahl pro infiziertem Makrophagen wie

folgt berechnen:

Leishmanien pro MΦ = Infektionsrate [in %] x Ø Parasitenzahl pro infizierter MΦ

100

Parallel zu den verschiedenen Kulturansätzen im ChamberSlide wurden entsprechende

Kulturen und Stimulationen auch in der 24-well-Kulturplatte angesetzt. Pro well wurden

hier 1,5x106 Makrophagen ausgesät (MOI ebenfalls 10). Die Ansätze in der 24-well


27

Platte dienten der Isolation von DNA, welche für TaqMan-Analysen eingesetzt werden

sollten. Das 24-well Format im Gegensatz zum ChamberSlide-Format wurde gewählt,

um die Ausbeute an DNA aus den einzelnen Stimulationsbedingungen zu erhöhen.

4.2.4 Leishmanien-Erhaltungskultur

Für die Weiterzucht der Leishmanien erfolgte abwechselnd die in vitro-Anzucht pro-

mastigoter Leishmanien bei 28°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit über maximal 5

bis 8 Passagen auf Kaninchenblut-Schrägagarplatten, und die Infektion von BALB/c-

Mäusen [99]. Für die Anzucht größerer Mengen an Promastigoten wurden diese von der

Blutagarplatte in flüssiges Leishmanienmedium überführt, wo ein weiteres Wachstum

für 2 bis 4 Passagen erfolgte.

4.2.5 Experimentelles Modell der kutanen Leishmaniose

Zur Induktion einer kutanen Leishmaniose wurden die Versuchstiere der Inzuchtstämme

BALB/c und C57BL/6 subkutan (s.c.) mit L. major-Promastigoten, die aus einer statio-

när bewachsenen Blutagarkulturplatte entnommen und 2x mit PBS gewaschen worden

waren, infiziert. Dazu wurden jeweils in die Fußrückenhaut beider Hinterpfoten 3 x 106

L. major, resuspendiert in einem Volumen von 50 µl PBS, injiziert.

Der Infektionsverlauf wurde durch das regelmäßige Messen der Schwellung der Hinter-

pfoten dokumentiert und überwacht; hierzu erfolgte die Bestimmung der Fußdicke 2x

wöchentlich mit einem Schnelltaster. Der Allgemeinzustand der Tiere wurde täglich

kontrolliert.

4.2.6 Experimentelles Modell der viszeralen Leishmaniose

Für das experimentelle Modell der viszeralen Leishmaniose wurden die Versuchstiere

mit L. infantum-Promastigoten s.c. in beide Hinterpfoten infiziert. Die Infektion erfolgte

analog zum L. major-Modell, pro Fuß wurden jedoch nur 106 L.i., in 50 µl PBS, inji-

ziert.

Die Tiere entwickelten eine systemische Leishmaniose; eine Schwellung der infizierten

Haut war dagegen kaum zu beobachten. Die Fußdicke wurde jedoch regelmäßig (1x pro

Woche) überprüft, ebenso das Gewicht der Tiere. Der Allgemeinzustand der Tiere wur-

de täglich kontrolliert.


28

4.2.7 Bestimmung der Erregerlast durch Grenzverdünnungsanalyse (Limi-

ting Dilution Analysis)

Die Erregerlast in den einzelnen Organen der infizierten Mäuse wurde jeweils durch

zwei verschiedene Methoden bestimmt: mithilfe der bereits etablierten Grenzverdün-

nungsanalyse (Limiting Dilution Analysis, LDA) sowie einer quantitativen real-time

PCR.

Es wurden folgende Organe untersucht: im Fall der kutanen Leishmaniose nach Infekti-

on mit L. major beide Hinterpfoten, die drainierenden poplitealen Lymphknoten und die

Milz; bei L. infantum-infizierten Mäusen zusätzlich Leber und Knochenmark von Ober-

und Unterschenkel.

Die Mäuse wurden nach Isofluran-Narkose durch zervikale Dislokation getötet. Danach

wurden die zu untersuchenden Organe entnommen, in sterilen Gefäßen gewogen und in

RPMI-Medium überführt.

Die weitere Aufbereitung erfolgte unter sterilen Bedingungen. Von allen Zellsuspensio-

nen der verschiedenen Organe wurden jeweils zwei identische Ansätze hergestellt, die

nach Abzentrifugation der Zellen mit den Leishmanien (10 min bei 4000U/min, 4°C)

auf unterschiedliche Art und Weise weiter verarbeitet wurden. Eines der Zellpellets

wurde für die LDA-Analyse in Leishmanienflüssigmedium resuspendiert, das andere

Zellpellet bei -20°C weggefroren, um daraus später DNA zu präparieren und die Parasi-

tenlast mittels TaqMan PCR zu evaluieren.

Die Hinterpfoten wurden nach Entfernung der Zehen mit einer Schere zerkleinert und

mithilfe eines Spritzenstempels durch ein Edelstahlsieb gerieben. Dieses wurde mehr-

mals mit PBS gespült. Das Zellpellet wurde auf zwei 50-ml Gefäße (Falcon-Röhrchen)

aufgeteilt, zentrifugiert (10 min bei 4000 U/min, 4°C) und die Überstände verworfen.

Ein Pellet wurde bei -20°C eingefroren, das zweite Pellet in 3 ml Schneider’s Medium

resuspendiert. Für die Parasitenbestimmung der Leber wurde ein kleines Stück abge-

trennt, gewogen (die gesamte Leber wurde ebenfalls gewogen) und durch ein Plastik-

sieb (cell strainer) gedrückt. Auch hier wurde mehrmals mit PBS gespült und die ent-

standene Suspension halbiert und zentrifugiert. Das Pellet für die Grenzverdünnungs-

analyse wurde in 3-10 ml Schneider’s Medium aufgenommen, das zweite Pellet einge-

froren. Milz und Lymphknoten wurden mit dem Stempel einer Injektionsspritze jeweils

durch ein Plastiksieb (cell strainer) gerieben, welches auf ein 50 ml Röhrchen (Falcon)


29

gesetzt wurde. Stempel und Sieb wurden mehrmals mit PBS gespült und anschließend

zentrifugiert. Das entstandene Pellet der Milzzellen wurde zur Lyse der Erythrozyten in

5 ml Ammoniumchlorid (vorgewärmt auf 37°C) resuspendiert und 5 min bei Raumtem-

peratur belassen. Nach einer erneuten Zentrifugierung wurde das Pellet in PBS gelöst.

Es erfolgte eine mikroskopische Auszählung der Zellkonzentration (siehe: Bestimmung

der Zellzahl und –viabilität). Anschließend wurde das Volumen bestimmt, in dem sich

30 Mio. Zellen befinden, vom Gesamtvolumen entnommen und in ein neues Falcon-

Röhrchen gegeben. Beide Ansätze mit 30x106 Milzzellen wurden wiederum zentrifu-

giert, das Pellet für die LDA anschließend in 3 ml Schneider’s resuspendiert. Dadurch

ergibt sich eine Ausgangszahl von 107 Zellen/ml. Für Lymphknoten wurde analog ver-

fahren, allerdings entfällt hier die Zugabe von Ammoniumchlorid. Es wurden 3 Mio.

Zellen pro 3 ml Schneider’s eingestellt, sodass die Ausgangszahl 106 Zellen/ml beträgt.

Knochenmark wurde aus Ober- und Unterschenkelknochen gewonnen. Nach Abtren-

nung der Epiphysen wurden die Knochen mit PBS ausgespült. Nach Zentrifugierung

wurden auch hier die Zellen gezählt und anschließend zweimal 30 Mio. Zellen abzentri-

fugiert. Eines der Pellets wurde in 3 ml Schneider’s Medium resuspendiert, das andere

weggefroren.

Für die LDA wurden anschließend, ausgehend von der Ausgangssuspension, 16-24 Ver-

dünnungsstufen angelegt; je nach erwarteter Parasitenlast betrug der Verdünnungsfaktor

2, 3 oder 5. Hierbei wurden von jeder Verdünnungsstufe 12 Replikate zu je 100 µl in

96-well-Kulturplatten angelegt; diese wurden danach für 7-10 Tage im Brutschrank

kultiviert (bei 28°C, 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit). Nach der Bebrütung erfolgte die

mikroskopische Kontrolle der Kulturplatten auf Leishmanienwachstum. Es wurde die

Anzahl an positiven (Wachstum erfolgt) und negativen (kein Wachstum erkennbar)

Wells für jede Verdünnungsstufe bestimmt, und mithilfe des Programmes Lcalc® 1.1

(Limiting dilution ananlysis software, StemCell Technologies Inc.) konnte nach den

Regeln der Poisson-Statistik unter Angabe der verwendeten Verdünnungsschritte, der

Zellzahl und des Organgewichtes die Erregerlast pro Organ bestimmt werden.

4.2.8 DNA-Isolierung aus murinen Geweben und Zellkulturen

Die Isolierung von DNA aus murinen Organgeweben und Makrophagenkulturen erfolg-

te mit dem High Pure PCR Template Preparation Kit der Firma Roche Diagnostics ent-

sprechend den Herstellerangaben. Das Aufreinigungsprinzip beruht auf Bindung der


30

DNA an eine Silica-Membran; danach folgt ein Reinigungsprozess durch Waschpuffer

und anschließend die Elution der DNA von der Membran mithilfe eines Elutionspuffers.

Die zu untersuchende Probe enthielt 25-50 mg murines Organgewebe bzw. 104-106 Zel-

len von einer Zellkultur.

Nach Zugabe von 40 µl Proteinase K und 200 µl Tissue Lysis Buffer zum vorliegenden

Zellpellet bzw. zum Organstück erfolgt eine mehrstündige Inkubation, idealerweise

über Nacht, bei 55°C und 1100 U/min im Minishaker, um einen Verdau der Zell- und

Kernmembran sowie Freisetzung der nukleären DNA zu erreichen. Danach wird 200 µl

Binding Buffer zugegeben und für 10 min bei 72°C, 1400 U/min inkubiert. Zur Präzipi-

tation der DNA werden 100 µl reiner Isopropanol zugegeben und die gefällte DNA auf

die Silica-Membran-Isoliersäule aufgetragen. Es folgt eine einminütige Zentrifugation

bei 8700 U/min, wodurch die DNA an die Membran gebunden wird; der Durchfluss

wird anschließend verworfen. Die nächsten Waschschritte sind die Zugabe von je 500

µl Inhibitor Removal Buffer und Wash Buffer, nach deren Beigabe die Säule jeweils

wieder für eine Minute zentrifugiert wird. Nach der wiederholten Zugabe von 500 µl

Wash Buffer erfolgt eine 10-sekündige Zentrifugation bei 11000 U/min, um den restli-

chen gebundenen Alkohol aus der DNA zu entfernen. Im Anschluss wird das Säulchen

auf ein neues PCR-Reaktionsgefäß überführt und 100 µl Elution Buffer zugegeben, der

zuvor auf 70°C erhitzt wurde. Eine einminütige Zentrifugation bei 8700 U/min ergibt

als Durchsatz das Eluat mit der aufgereinigten DNA.

Um den Erfolg der DNA-Isolierung aus den verschiedenen Organen zu kontrollieren, und damit

falsch-negative PCR-Ergebnisse auszuschließen, wurden vor Beginn des Proteinase K-

Verdaus jeder Probe 10µl IPC Probenmix (=internal positive control) hinzugegeben.

Dieser setzt sich zusammen aus 4000 Kopien humaner DNA/µl sowie 15000 Kopien λ-

DNA/µl, welche dem λ-Phagen entstammt. In der quantitativen PCR wird die λ-DNA

ebenfalls amplifiziert. Ein positives Amplifikationsergebnis liefert einerseits die Bestä-

tigung, dass die DNA-Isolierung funktioniert hat, da die λ-DNA den Auf-

reinigungsprozess von Beginn an mit durchläuft; andererseits den Nachweis, dass die

erhaltene DNA frei von PCR-Inhibitoren ist. Somit erfüllt die λ – DNA den Zweck ei-

ner internen Positivkontrolle. Die Zugabe humaner DNA erfüllt beim Einsatz zellarmer

Proben die Funktion einer sogenannten „carrier-DNA“, um die Bildung einer ausrei-

chenden Menge an Präzipitat sicherzustellen.


31

4.2.9 Bestimmung der DNA-Konzentration durch photometrische Messung

Im Anschluss erfolgte eine photometrische Konzentrationsbestimmung der aufgereinig-

ten DNA. Hierzu werden die DNA-Proben zunächst in TE-Puffer 1:50 vorverdünnt. Die

Messung erfolgt bei 260 nm (A260), da Nukleinsäuren bei dieser Wellenlänge ein Ab-

sorptionsmaximum besitzen. Dies lässt sich auf die in Nukleinsäuren enthaltenen Basen

und deren Spektraleigenschaften zurückführen. Für Doppelstrang-DNA bedeutet eine

optische Dichte von 1 eine Konzentration von ca. 50 µg/ml. Für Proteine liegt das Ab-

sorptionsmaximum bei 280 nm (A280). Eine Aussage über die Reinheit der Nukleinsäu-

relösung gibt der Quotient von A260 und A280 an; dieser sollte zwischen 1,6 und 2,0

liegen. Niedrigere Werte deuten auf eine Verunreinigung insbesondere durch Proteine

hin; Werte über 2,0 ergeben sich bei denaturierter DNA oder bei zusätzlichem Vorlie-

gen von RNA.

4.2.10 Quantitative real-time PCR

Für die real-time PCR wurden zwei verschiedene Messgeräte eingesetzt: das StepOne®

Real-Time PCR-System in Kombination mit der StepOne® Software v2.0 und das 7900

HT Fast Real-Time PCR-System mit der dazugehörigen Software SDS 2.3 zum Auswer-

ten der Daten.

Der Nachweis von Leishmanien-DNA erfolgte mithilfe des ribosomalen 18S rRNA-

Gens; das entsprechend der Publikation von Wortmann et al. [115] durch das Primer-

paar (Leis.U1/Leis.L1) und eine Sonde (Leis.P1) zu einem 62 bp langen Fragment amp-

lifiziert wurde. Zusätzlich wurde eine weitere, modifizierte Primer/Sonden-

Kombination getestet. Hierbei ist der Primer Leis.U3 gegenüber Leis.U1 um drei Ba-

senpaare im Leseraster Richtung 3´-Ende verschoben; die Sonde Leis.P2 enthält als

Quencherfarbstoff NFQ-MGB anstelle von TAMRA.

Ein zweites PCR-System dient der Messung des Gehaltes an Wirtszell-DNA, um den

Leishmaniengehalt einer Probe quantifizieren zu können. An die Publikation von Saidac

et al. [91] anlehnend wird das Single-Copy-Gen Nidogen nachgewiesen. Zwei verschie-

dene Primer/Sondensysteme wurden mittels des Programmes PrimerExpress 3.0 gene-

riert: Nido.3 enthält die Primer Nido.F3 und Nido.R3 sowie die Sonde Nido.P3, die

Modifikation Nido.4 enthält statt Nido.F3 den Primer Nido.F4 und die Sonde Nido.P4,

welche im DNA-Leseraster um einige bp Richtung 3‘-Ende verschoben sind. Die für die

Sonden verwendeten Farbstoffe sind VIC sowie NFQ-MGB.


32

Das dritte verwendete PCR-System (λ-PCR) soll als Inhibitionskontrolle dienen: die

hier detektierte Zielsequenz entstammt der DNA des Bakteriophagen Lambda, welcher

aus infizierten E.coli-Zellen isoliert werden kann. Mithilfe der PrimerExpress-Software

wurden zwei alternative Primer-Sonden-Systeme im Bereich der Gene lamC und lamD

ausgesucht, weshalb die Primer/Sonden-Systeme entsprechend mit LambdaC bzw.

LambdaD bezeichnet wurden. Die Sonden sind analog zur Nidogen-PCR mit VIC bzw.

NFQ-MGB markiert. Zu Beginn der DNA-Präparation wurde allen Proben λ-DNA zu-

gegeben. Diese soll als interne Positivkontrolle für die Abwesenheit von PCR-

Inhibitoren und eine erfolgreiche DNA-Isolierung fungieren. Im Falle eines negativen

Ergebnisses der Leishmanien-PCR belegt die gleichzeitige Amplifikation von λ-DNA in

demselben Reaktionsansatz, dass die DNA-Isolierung funktioniert hat und die PCR-

Reaktion nicht inhibiert wurde. Damit ist sichergestellt, dass tatsächlich keine Leishma-

nien-DNA vorlag.

Für jede Probe erfolgten ein Dreifachansatz der Leishmanien/Maus-PCR sowie ein wei-

terer Ansatz der Leishmanien/λ-PCR. Die Dreifachmessung wurde zur Kontrolle der

Pipettiergenauigkeit durchgeführt. Als Ergebnis wird der jeweils der Mittelwert eines

Triplikates angegeben.

Die Leishmanien/Maus-PCR stellt eine Duplex-PCR dar, in der die Primer/Sonden-

Systeme zur Codierung sowohl von muriner als auch Leishmanien-DNA vorliegen. Die

Amplifikate beider PCRs können unabhängig voneinander durch das PCR-Gerät detek-

tiert werden, da zwei unterschiedliche sondengebundene Fluoreszenzmarker eingesetzt

werden. Eine gegenseitige Beeinflussung im Ablauf der PCR-Reaktion, z.B. durch feh-

lerhafte Anlagerung von Primern oder vorzeitiges Aufbrauchen freier Nukleotide, wur-

de durch entsprechende Testungen ausgeschlossen (siehe Kapitel 5.1).

Da die Validierung und Etablierung einer Leishmanien/Maus-Duplex-PCR ein wesent-

liches Ziel der vorliegenden Arbeit war, wird auf die Auswahl und Testung geeigneter

Primer- und Sondenkonzentrationen sowie sondenspezifischer Fluoreszenzmarker in

Kapitel 5.1 des Ergebnisteils näher eingegangen.

Der endgültige PCR-Ansatz (nach Abschluss der Etablierungsphase) setzt sich folgen-

dermaßen zusammen (Tab. 4.1):


33

Reagenz Volumen [µl]

(ges.: 20 µl) Finale Konzentration

Master Mix 2x Konz. 10 1x Konz.

Prämix A

enthält:

Primer LEIS.U1/U3 [4 µM]

Sonde LEIS.P1[2 µM]

Primer Nido.F3/R3 [1,5 µM]

Sonde Nido.P3 [1 µM]

6

[2]

[2]

[2]

400 nM

200 nM

150 nM

100 nM

Proben-DNA 4

Tabelle 4.1: Konzentrations- und Mengenangabe eingesetzter Reagenzien im Ansatz der

Leishmanien/Maus-PCR; der Prämix A wurde zuvor in einer größeren Menge, ausreichend

für je 100 Ansätze, hergestellt und aliquotiert. Dabei enthalten 6µl des Prämixes jeweils 2µl

der Primer sowie 2µl Sonde der Leishmanien-PCR in den angegebenen Konzentrationen

sowie 2µl des Primer/Sonden-Gemisches für die Maus-PCR, welche bereits zuvor zusammen-

pipettiert worden waren (Volumenangabe der einzelnen Bestandteile deshalb in Klammern).

Analog dazu setzt sich der PCR-Ansatz für die Leishmanien/ λ-PCR zusammen, welche

ebenfalls als Duplex-PCR abläuft und somit ermöglicht, dass Leishmanien- und λ-DNA

in einem Ansatz zeitgleich detektierbar sind. Eingesetzte Volumina und die sich erge-

benden Konzentrationen des PCR-Ansatzes sind nachfolgend aufgeführt (Tab. 4.2).

Die Stammlösungen der Primer und Sonden wurden mit 1 mM Tris-HCl pH 8,5 (= 1:10

verdünnter Elutionspuffer des High Pure PCR Template Preparation Kits der Firma

Roche Diagnostics) verdünnt.


34

Reagenz Volumen [µl]

(ges.: 20 µl) Finale Konzentration

Master Mix 2x Konz. 10 1x Konz.

Prämix A

enthält:

Primer LEIS.U1/U3 [4 µM]

Sonde LEIS.P1 [2 µM]

Primer LamD_F/R [1,5 µM]

Sonde LamD_P [1 µM]

6

[2]

[2]

[2]

400 nM

200 nM

150 nM

100 nM

Proben-DNA 4

Tabelle 4.2: Konzentrations- und Mengenangabe eingesetzter Reagenzien Ansatz der Leish-

manien/ λ-PCR; der Prämix B wurde zuvor in einer größeren Menge, ausreichend für je 100

Ansätze, hergestellt und aliquotiert. Dabei enthalten 6µl des Prämixes jeweils 2µl der Primer

sowie 2µl Sonde der Leishmanien-PCR in den angegebenen Konzentrationen sowie 2µl des

Primer/Sonden-Gemisches für die λ-PCR, welche bereits zuvor zusammenpipettiert worden

waren (Volumenangabe der einzelnen Bestandteile deshalb in Klammern).

Für die absolute Quantifizierung ist das Mitführen einer Standardkurve mit bekannten

Ausgangskonzentrationen für jeden Probenlauf erforderlich. Prinzipiell könnte für das

Erstellen einer Leishmanien-DNA Standardkurve Parasiten-DNA eingesetzt werden, die

aus Leishmania-Promastigotenkulturen mit bekannter Parasitenanzahl gewonnen wurde.

Problem hierbei ist jedoch, dass die Zahl und Konzentration an Leishmanien-

Genomäquivalenten ausgehend von einer mikroskopisch ausgezählten Leishmanienkul-

tur nur sehr ungenau ermittelt werden kann, da bei der DNA-Isolierung aus dem Leish-

mania-Promastigotenlysat von einem Verlust an DNA auszugehen ist, der nicht exakt

bestimmt werden kann und von Probe zu Probe schwanken kann. Des Weiteren gibt es

nur ungenaue Angaben zur Anzahl der 18S rRNA-Genkopien in Leishmania (laut Lite-

ratur ca. 200 Kopien pro Genom [61, 84, 109]). Um diese Schwierigkeiten zu vermei-

den, wird zur Erstellung der Leishmania-DNA-Standardkurve ein Plasmid verwendet

(pGEM-T Easy Vektor), in welches das Zielgen der Leishmanien-PCR (18S rDNA)

einkloniert worden war (unpublizierte Daten, Karin Knoll, Ulrike Schleicher, Christian


35

Bogdan): mithilfe eines speziellen Lyseverfahrens erhält man nahezu reine Plasmid-

DNA, und da die Zahl der Basenpaare im Plasmid genau bekannt ist, kann nach photo-

metrischer Absorptionsmessung eine genaue Konzentrationsangabe erfolgen (in Plas-

mid-Kopien/µl). Für die Standardkurve von murinem Nidogen wird genomische DNA

aus der Maus eingesetzt, die aus Ohr-und Lebergewebe von naiven C57BL/6 Mäusen

präpariert worden war. Um eine bestehende Kontamination mit Leishmanien-DNA aus-

zuschließen, wurden alle hierfür verwendeten Gewebeproben zunächst mittels real-time

PCR untersucht; dabei wurden alle Gewebeproben mit positivem Amplifikationsergeb-

nis der Leishmanien-PCR von der weiteren Präparation für die Standardkurven-DNA

ausgeschlossen. Die Konzentration der beiden Standard-DNAs wird zunächst photomet-

risch bestimmt. Mithilfe der folgenden Formel:

1 µg von 1000 bp DNA = 1.52 x10-12 mol = 9.1 x 1011 Moleküle bzw. Kopien [77]

ergibt sich für 1 µg Plasmid-DNA (3076 bp, Summe aus 3015 bp des pGEM-T Easy

Plasmids und 61 bp des PCR-Produkts) eine Anzahl von 2,8x1011 Plasmid-Kopien.

Ausgehend von der DNA-Konzentration kann somit die Kopienzahl des Plasmids pro µl

berechnet werden. Die Quantifizierung von Leishmanien-DNA aus infizierten Mausge-

webeproben anhand der vorliegenden Standardkurve erfolgt demnach als Angabe von

Leishmania 18 rDNA-Kopien bezogen auf Menge an Maus-DNA.

Zur Erstellung der Standardkurve wurde eine dekadische Verdünnungsreihe über 6

Zehnerpotenzen pipettiert (Tab. 4.3).

Kopienzahl Leishmanien-Plasmid/µl Konzentration murine DNA [ng/µl]

105 102

104 101

103 100

102 10-1

101 10-2

100 10-3

Tabelle 4.3: Verdünnungsreihe Standardkurve


36

Pro Verdünnungsstufe wurden 100 µl des Leishmanienplasmid/Mausgewebe-DNA-

Gemisches hergestellt. Die Verdünnung erfolgte in Elution Buffer (entnommen aus dem

High Pure PCR Template Preparation Kit, Roche Diagnostics). Beim Pipettieren der

Verdünnungsreihe war darauf zu achten, bei jeder Verdünnungsstufe die Pipettenspitzen

zu wechseln, um keine DNA zu „verschleppen“. Die Standardkurve wurde im doppelten

Ansatz angelegt. Pro Ansatz wurden in einem PCR-Lauf 4 µl der DNA eingesetzt, ent-

sprechend den zu untersuchenden Proben (siehe Tab. 4.1/4.2). Aus den sich ergebenden

CT-Werten dieser Ansätze mit bekannten Mengen wurde von der Software eine Stan-

dardkurve erstellt, die für den jeweiligen PCR-Lauf die Basis für die Quantifizierung

lieferte (siehe Kapitel 3.2.2 und Abb. 3.1).

Als Kontrolle wurde neben den Probentriplikaten bei jedem Probenlauf eine No templa-

te control im Dreifachansatz mitgeführt, in die anstelle der Proben-DNA Wasser zum

PCR-Mix hinzupipettiert wird. Ein negatives Amplifikationsergebnis weist darauf hin,

dass keine falsch positiven Ergebnisse zu erwarten sind, wie es beispielsweise bei Ver-

unreinigung der Primer/Sonden-bzw. des Mastermixes mit Leishmanien-DNA möglich

wäre.

Eine zusätzliche Validierung der Ergebnisse eines jeden PCR-Laufs lieferte die IPC

Wasser-Kontrolle (enthält 750 Kopien λ-DNA/µl), welche im Einfachansatz mitlief und

mit der Leishmanien/λ-PCR untersucht wurde. Sie enthält nur halb so viel λ-DNA wie

der IPC-Probenmix (1500 Kopien λ-DNA/µl; siehe Kapitel 4.2.8), welcher zu jeder

Probe vor der DNA-Präparation hinzugegeben wurde. Wenn man von einem etwa 50%-

igen DNA-Verlust beim Aufreinigungsprozess ausgeht, sollten die Konzentrationen an

λ-DNA in den Proben und in der IPC Wasser-Kontrolle einander entsprechen und auch

die Amplifikationsergebnisse (CT-Werte) ähnlich sein. Ist dies der Fall ist, kann davon

ausgegangen werden, dass die DNA-Isolation ohne größere Verluste stattgefunden hat.

Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die Quantifizierung von Geweben mit geringer

Parasitenlast: würde im Aufreinigungsprozess nämlich zu viel DNA verloren gehen,

könnte dies zu falsch negativen Ergebnissen führen.

Der Ablauf und die Bedingungen für die verschiedenen quantitativen PCRs sind in Tab.

4.4 dargestellt.


37

Phase Temperatur Zeit

1 50°C 2 min

2 95°C 10 min

3 95°C

15 sek 45x

60°C 1 min

Tabelle 4.4: Thermoprofil quantitative PCR

4.2.11 Kinetoplasten-PCR

Mit der hier verwendeten konventionellen PCR-Methode wird ein Abschnitt der Kine-

toplasten-Minicircle-DNA amplifiziert. Die Minicircle-DNA entstammt dem einzigen

Leishmanien-Mitochondrium, welches sich an der Flagellenbasis befindet. Die Ampli-

fikation wurde mit dem PCR-Gerät GeneAmp® PCR System 9700 durchgeführt.

PCR-Primer (13A ; 13B) entsprechen dem Protokoll von Rodgers [86], das entstehende

Amplifikat besitzt eine Länge von 120 bp.

Der PCR-Ansatz setzt sich wie folgt zusammen (Tab. 4.5):

Reagenz Volumen [µl]:

(ges.: 50 µl)

Finale

Konzentration

PCR-Polymerization Mix,

setzt sich zusammen aus:

Wasser

10x Taq Puffer

MgCl2 [50 mM]

dNTPs [20 mM]

Primer Lei13A [100 µM]

Primer Lei13B [100 µM]

37,55

5,0

1,5

0,25

0,25

0,25

1x

1,5 mM

100 µM

500 nM

500 nM

Taq Polymerase [5 U/µl] 0,2 0,02 U/µl

Proben-DNA 5

Tabelle 4.5: Konzentrations- und Mengenangabe eingesetzter Reagenzien je

PCR-Ansatz


38

Bei jedem PCR-Lauf wurden zwei Positivkontrollen (genomische DNA von <0,1 bzw. <0,01

Leishmanien/µl nach mikroskopischer Auszählung) und eine Negativkontrolle (Wasser anstelle

der Proben-DNA) mitgeführt. Die Bedingungen der Kinetoplasten-PCR sind in Tab. 4.6.

dargestellt.

Temperatur Zeit

94°C 3 min

94°C 30 sek

55°C 30 sek 40x

72°C 30 sek

72°C 5 min

4°C ∞

Tabelle 4.6: Thermoprofil Kinetoplasten-PCR

Anschließend wurden pro PCR-Ansatz jeweils 10µl mit 5µl Blaumarker vermischt, auf

ein 2%iges Agarose-Gel in einer Elektrophoresekammer aufgetragen und das PCR-

Fragment durch Elektrophorese (45 min bei 120V) nach Größe aufgetrennt. Zur Be-

stimmung der PCR-Fragmentlänge wurde der DNA-Größenmarker pUC Mix mitge-

führt. Das in die DNA-Banden interkalierte Ethidiumbromid wurde durch UV-

Bestrahlung sichtbar gemacht und mit Hilfe des Gel-Dokumentationssystems Gel iX

Imager ausgewertet.

4.2.12 Statistische Auswertung

Für statistische Analysen wurde der t-Test für unabhängige Stichproben verwendet.

Signifikante Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 werden mit

* gekennzeichnet, wenn sich der Unterschied auf zwei verschiedene Messzeitpunkte

bezog. Beim Vergleich der beiden Mausstämme untereinander sind signifikante Unter-

schiede (p<0,05) mit einer Raute (#) deutlich gemacht.

5. ERGEBNISSE

39

5 ERGEBNISSE

5.1 Etablierung und Evaluierung einer Leishmanien/Maus-

Duplex-PCR zur quantitativen Bestimmung der Parasi-

tenlast

Die standardmäßig eingesetzte Methode zur Bestimmung der Parasitenlast muriner Ge-

webe bei kutaner und viszeraler Leishmaniose ist die Limiting Dilution Analyse, bei der

Verdünnungsreihen von den zu untersuchenden Gewebeproben angelegt werden und

aus dem Verhältnis der Leishmania-positiven und negativen Ergebnisse in den jeweili-

gen Verdünnungsstufen eine statistisch basierte Ermittlung der Erregerzahl erfolgt. Die

Quantifizierung bezieht sich auf lebende Leishmanien und erfolgt bei dieser Methode

indirekt. Bei in vitro-Infektionsexperimenten mit Makrophagenkulturen wird die Parasi-

tenbeladung meist durch mikroskopisches Auszählen der infizierten Zellen evaluiert.

Sowohl die LDA als auch die mikroskopische Analyse stellen eine zeitaufwändige Me-

thode dar und zeigen in Abhängigkeit vom jeweiligen Experimentator eine gewisse

Schwankungsbreite. Viele aufeinander folgende Arbeitsschritte erhöhen zudem die Feh-

leranfälligkeit.

In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb ein PCR-System etabliert werden, welches –

basierend auf dem Prinzip der computerbasierten Echtzeitmessung – eine sehr präzise

und reproduzierbare Quantifizierung von Leishmanien ermöglichen würde und die bis-

herig eingesetzten Methoden ersetzen könnte.

Zur Messung von Leishmanien-DNA wurden Primer und Sonden entsprechend dem

Protokoll von Wortmann et al. [115] ausgewählt, die zum Nachweis des 18S rRNA-

Gens innerhalb des Leishmanien-Genoms geeignet sind. Laut Publikation ist das be-

schriebene PCR-System in der Lage, eine Vielzahl an Leishmanienspezies zu erfassen.

Zudem konnte zwischen geringen und hohen Konzentrationen an Leishmanien sehr gut

unterschieden werden, was eine unmittelbare Voraussetzung für eine Quantifizierung

darstellt. Zum Nachweis der Leishmania 18S rDNA wurden von Wortmann et al. die

beiden Primer LEIS.U1 und LEIS.L1 sowie die Sonde LEIS.P1 eingesetzt, welche mit

dem Reporter FAM und dem

die Lage des Primer/Sonden

Abb. 5.1: 18S rRNA-Gensequenz (hier: Spezies

der von Wortmann [115]

(gelb) und Primer LEIS.L1 (grün)

Im Zuge der Etablierung der Leishmanien

optimalen Amplifikationsb

leisten.

5.1.1 Verifizierung der

Zur Optimierung der von Wortmann

wurden einer der beiden Primer

genden als Wortmann modifiziert bezeichnet):

zu LEIS.P1 den Quencherfarbstoff NFQ

(minor groove binder) ermöglicht durch eine verstärkte DNA

Verkürzung der Sonde um drei Basenpaare

modifizierte Primer LEIS.U3 gegenüber LEIS.U1 um drei Basenpaare

5. ERGEBNISSE

40

FAM und dem Quencher TAMRA markiert ist. In Abb

die Lage des Primer/Sonden-Paares innerhalb der 18S rDNA-Sequenz dargestellt.

Gensequenz (hier: Spezies L. amazonensis) mit Lokalisationsa

eingesetzten Primer LEIS.U1 (grün markiert), Sonde LEIS.P1

LEIS.L1 (grün) .

Im Zuge der Etablierung der Leishmanien real-time PCR war es zunächst

Amplifikationsbedingungen auszutesten, um eine effiziente PCR zu gewäh

Verifizierung der geeigneten Primerkonzentration

Zur Optimierung der von Wortmann et al. beschriebenen Leishmania

einer der beiden Primer sowie die Sonde wie folgt leicht modifiziert (im Fo

genden als Wortmann modifiziert bezeichnet): die Sonde LEIS.P2 enthält im Gegensatz

farbstoff NFQ-MGB anstelle von TAMRA. Der Zusatz MGB

) ermöglicht durch eine verstärkte DNA-Bindungsfähigkeit eine

ng der Sonde um drei Basenpaare am 5´-Ende. Dem entsprechend wurde der

Primer LEIS.U3 gegenüber LEIS.U1 um drei Basenpaare

5. ERGEBNISSE

Abbildung 5.1 wird

Sequenz dargestellt.

Lokalisationsangabe

rkiert), Sonde LEIS.P1

zunächst nötig, die

auszutesten, um eine effiziente PCR zu gewähr-

18S rDNA-PCR

leicht modifiziert (im Fol-

nthält im Gegensatz

Der Zusatz MGB

Bindungsfähigkeit eine

sprechend wurde der

Primer LEIS.U3 gegenüber LEIS.U1 um drei Basenpaare im Leseraster

5. ERGEBNISSE

41

Richtung 3´-Ende verschoben. Mit dem modifizierten Primer sollte eine in manchen

Genbank-Einträgen vorhandene Basenfehlpaarung toleriert werden.

LEIS.U1 P1 L1 5´ GACAAGTGCTTTCCCATCGCAACT TCGGTTCGGTGTGT GGCGCCTTTGGAGGGGTTTAGTGCGTC CGG 3´

LEIS.U3 P2 L1 5´ GACAAG TGCTTTCCCATCGCAACTTC GGTTCGGTGTGTGGCGCC TTTGGAGGGGTTTAGTGCGTC CGG 3´

Abb. 5.2: Gegenübergestellt sind die Sequenzunterschiede der Primer- und Sondenpaare nach

Wortmann [115] (obere Zeile, Primer sind grün markiert und Sonde gelb) und Wortmann

modifiziert [36] (untere Zeile): die um drei bp verkürzte Sonde LEIS.P2 lässt eine Verschie-

bung von Primer LEIS.U3 gegenüber LEIS.U1 um ebenfalls 3 bp Richtung 3´-Ende zu.

Es wurden im Folgenden jeweils das ursprüngliche und modifizierte Primer/Sonden-

Gemisch getestet und miteinander verglichen, um die PCR mit möglichst hoher Sensiti-

vität sowie Spezifität auszuwählen.

Im Protokoll der von Wortmann publizierten Arbeit [115] wurden die Primer in einer

Endkonzentration von je 200 nM und die Sonde mit 20 nM eingesetzt. Da sich keine

Angaben zur analytischen Sensitivität finden ließen, wurden zur Optimierung des PCR-

Protokolls die Konzentrationen an Primern und Sonden neu evaluiert.

Zunächst erfolgte bei konstanter Sondenkonzentration (festgelegt auf 200 nM) die Er-

mittlung einer geeigneten Primerkonzentration. Dazu wurden in verschiedenen Ansät-

zen die Primer in Endkonzentrationen von 200, 300 und 400 nM eingesetzt. In Abbil-

dung 5.3 sind exemplarische Amplifikationskurven für unterschiedliche Primerkonzent-

rationen dargestellt (nach Originalprotokoll von Wortmann [115]). Dem Verlauf der

Kurven kann man entnehmen, dass die Primerkonzentration nur einen geringen Einfluss

auf das Ergebnis hat: die CT-Werte, welche als Basis für Detektion und Quantifizierung

anzusehen sind, liegen im gewählten Beispiel mit 36,83 (200 nM Primer), 35,96 (300

nM Primer) bzw. 35,57 (400 nM Primer) sehr nah beieinander. Vorausgesetzt ist eine

konstant belassene Konzentration an Leishmanien-DNA, im aufgezeigten Beispiel han-

delt es sich um eine 10-5 Verdünnung einer Leishmania-DNA-Lösung, die mikrosko-

pisch ermittelt 105 Leishmanien/µl enthielt.

Die verschiedenen Primerkonzentrationen wurden zusätzlich mit weiteren DNA-

Mischungen getestet, die neben Leishmanien-DNA auch humane DNA, Maus- oder λ-

DNA enthielt, um Kreuzreaktionen der Primer mit den verschiedenen DNA-Vorlagen

auszuschließen. Zum Einsatz kamen folgende Mischungen:

5. ERGEBNISSE

42

• 10-3-Verdünnung der Leishmania-DNA Stammlösung mit 105 L./µl

• 10-5-Verdünnung der Leishmania-DNA Stammlösung mit Zusatz von humaner

DNA 10 ng/µl

• 10-5-Verdünnung der Leishmania-DNA Stammlösung mit Zusatz von humaner

DNA 100 ng/µl

• 10-5-Verdünnung der Leishmania-DNA Stammlösung mit Zusatz von Maus-

DNA 10 ng/µl

• 10-5-Verdünnung der Leishmania-DNA Stammlösung mit Zusatz von Maus-

DNA 100 ng/µl

• 10-5-Verdünnung der Leishmania-DNA Stammlösung mit Zusatz von λ-DNA

1,5x103 Kop./µl

• 10-5-Verdünnung der Leishmania-DNA Stammlösung mit Zusatz von λ-DNA

1,5x106 Kop./µl

Der in Abb. 5.3 dargestellte Kurvenverlauf ließ sich mit allen DNA-Mischungen repro-

duzieren (Daten sind nicht gezeigt). Für die Primertestung des modifizierten Protokolls

ergaben sich keine wesentlichen Differenzen zu den beschriebenen Ergebnissen.

5. ERGEBNISSE

43

Abb. 5.3: Amplifikationskurven Leishmanien-PCR (hier: nach Original-Protokoll von

Wortmann et al. [115]) für unterschiedliche Primer-konzentrationen (200 nM - rot

dargestellt, 300 nM - schwarz, 400 nM - blau) bei konstanter Sondenkonzentration (200

nM). Eingesetzt wurde eine 10-5 Verdünnung einer Stammlösung, die mikroskopisch

ermittelt 105 Leishmanien/µl enthielt. Eines von acht ähnlichen Experimenten ist darge-

stellt; jeder Ansatz wurde als Einzelbestimmung durchgeführt.

Es zeigte sich, dass der Zusatz von humaner, Maus- und λ-DNA zur 10-5-Verdünnung

der L.-Stammlösung nicht zur Beeinträchtigung der Leishmanien-PCR führte: beim Zu-

satz unterschiedlicher Mengen „Fremd“-DNA ergaben sich bei konstanter Primerkon-

zentration von 400 nM CT-Werte zwischen 34,89 und 35,96 (es wurden je zwei Experi-

mente pro „Fremd“-DNA durchgeführt, für jeweils unterschiedliche Konzentrationen;

siehe oben). Im Vergleich zum Ansatz mit reiner Leishmanien-DNA (CT-Wert 35,57)

lagen die Abweichungen also bei weniger als einem Amplifikationszyklus.

5. ERGEBNISSE

44

Abb. 5.4: Amplifikationskurven Leishmanien-PCR nach Wortmann-Originalprotokoll [115] (Pri-

merkonzentration konst., 400 nM) für Ansätze mit reiner Leishmanien-DNA sowie dem Zusatz von

humaner bzw. Maus-DNA (finale Konzentration je 10 und 100 ng/µl) sowie λ-DNA (1500 und

150000 Kopien/µl). Eines von drei ähnlichen Experimenten (in Abhängigkeit von der Primerkon-

zentration) ist dargestellt; jeder Ansatz wurde als Einzelbestimmung durchgeführt.

Das Prinzip der quantitativen PCR beruht auf einer linearen, umgekehrt proportionalen

Beziehung zwischen dem CT-Wert und dem Logarithmus der eingesetzten Menge ent-

sprechend folgender Formel:

n = log x / log 2

n = Linksverschiebung des CT-Wertes (Angabe in PCR-Zyklen)

x = Eingesetzte Menge (Angabe als Faktor des Ausgangswertes)

5. ERGEBNISSE

45

Bei der 10-3-Verdünnung der Stammlösung mit 105 L./µl wurde ein CT-Wert von 28,78

ermittelt. Dies bedeutet, dass ein Fluoreszenzanstieg ca. 7 Zyklen früher detektiert wer-

den konnte als bei der 100fach stärker verdünnten Probe (10-5-Verdünnung; CT-Wert

35,57). Damit erfüllt sich die Erwartung, wonach entsprechend der o.g. Formel eine

doppelte bzw. hundertfache DNA-Menge zu einer Linksverschiebung des CT-Wertes

um einen bzw. rund 6,64 Zyklen führt. Da je Ansatz 4 µl Proben-DNA eingesetzt wer-

den, entspräche dies in der 10-5-Verdünnung der Stammlösung (105 L./µl) 4 Leishma-

nien im PCR-Ansatz. Aus dem konstant positiven Amplifikationsergebnis trotz geringer

DNA-Menge lässt sich ableiten, dass das PCR-Verfahren hoch sensitiv ist.

Bei künftig zu untersuchenden Proben ist mit eher niedrigen Mengen an Leishmanien-

DNA im Bereich der unteren Nachweisgrenze zu rechnen. Eine Konzentration von 400

nM Primer lässt im Vergleich zu 200 nM tendenziell auch höhere Sensitivität erwarten.

Außerdem traten keine falsch positiven Amplifikationsergebnisse auf, wenn Proben frei

von Leishmanien-DNA waren (getestet wurden humane, murine sowie λ-DNA; Daten

sind nicht gezeigt). Deshalb wurde die Konzentration auf 400 nM festgelegt.

5.1.2 Verifizierung der geeigneten Sondenkonzentration

Zur Bestimmung der optimalen Sondenkonzentration wurde die Primerkonzentration

konstant bei 400 nM belassen. Es wurden Ansätze mit 100 nM, 200 nM sowie 300 nM

Sonde getestet und gegenübergestellt.

Die hierbei ermittelten CT-Werte lagen für alle getesteten Sondenkonzentrationen nah

beieinander und zeigten auch beim Vergleich der beiden PCR-Systeme, Wortmann ori-

ginal versus Wortmann modifiziert, keine nennenswerten Unterschiede, wie in Tab. 5.1

an einer beispielhaften Probe erkennbar ist (hier: 10-5-Verdünnung der Stammlösung

mit 105 L./µl).

5. ERGEBNISSE

46

Für die 10-5-Verdünnung der Leishmanien-Stammlösung ergaben sich die in Abbildung

3.5 gezeigten Amplifikationskurven, welche für die Testung drei anderer Proben repro-

duziert werden konnten (Daten sind nicht gezeigt):

• 10-5-Verdünnung der Stammlösung mit Zusatz von humaner DNA 100 ng/µl

• 10-5-Verdünnung der Stammlösung mit Zusatz von Maus-DNA 100 ng/µl

• 10-5-Verdünnung der Stammlösung mit Zusatz von λ-DNA 1,5x106 Kop./µl

Wortmann [115] Wortmann modifiziert [36]

100 nM Sonde 35,95 35,61

200 nM Sonde 36,27 36,48

300 nM Sonde 36,42 36,96

Tabelle 5.1: Vergleich der CT-Werte der Leishmanien-PCR, durchgeführt nach dem Wortmann-

Originalprotokoll [115] oder dem modifizierten Protokoll [36] für eine 10-5 – Verdünnung einer

Stammlösung mit 105 Leishmanien/µl, in Abhängigkeit von der gewählten Sondenkonzentration.

Dargestellt ist sind Werte für eines von vier ähnlichen Experimenten; jeder Ansatz wurde als Ein-

zelbestimmung durchgeführt.

5. ERGEBNISSE

47

Abb. 5.5: Amplifikationskurven Leishmanien-PCR (nach Wortmann [115] original

und modifiziert [36]) für unterschiedliche Sondenkonzentrationen (100 nM - blaue

Kurven, 200 nM - grüne Kurven, 300 nM - orange bzw. violett) bei konstanter Primer-

konzentration (400 nM). Probe: 10-5- Verdünnung einer Stammlösung mit 105 Leish-

manien/µl. Dargestellt ist eines von vier ähnlichen Experimenten; jeder Ansatz wurde

als Einzelbestimmung durchgeführt.

Bei Betrachtung der Amplifikationskurven (Abb. 5.5) fiel jedoch auf, dass der Fluores-

zenzanstieg (entspricht ∆Rn der Y-Achse) bei einer Sondenkonzentration von 200 nM

fast doppelt so hoch war im Vergleich zu dem bei 100 nM. Eine weitere Erhöhung der

Sondenkonzentration auf 300 nM führte zwar zu einer weiteren Verstärkung des Fluo-

reszenzsignals, allerdings war der Effekt deutlich geringer ausgeprägt im Vergleich zum

Anstieg der Sondenkonzentration von 100 auf 200 nM. Basierend auf diesen Resultaten

wurde die Sondenkonzentration für alle nachfolgenden Untersuchungen auf 200 nM

5. ERGEBNISSE

48

festgelegt, da hier bei der gewählten Primerkonzentration von 400 nM ein deutliches

Fluoreszenzsignal zu detektieren war.

Wie bereits bei den Primertestungen (siehe 5.1.1) beschrieben konnte auch bei der Eva-

luation der Sondenkonzentration bestätigt werden, dass der Zusatz von humaner, Maus-

oder λ-DNA keinen nennenswerten Einfluss auf den CT-Wert der Leishmanien-PCR hat

(Daten sind nicht gezeigt). Für Ansätze ohne Leishmanien-DNA war das Amplifikati-

onsergebnis stets negativ, was Verunreinigungen der eingesetzten Lösungen und PCR-

Materialien ausschloss.

5.1.3 Etablierung der Duplex Leishmanien/λ-PCR

Ein nächstes Ziel bestand darin, zu überprüfen, ob die Leishmania 18S rDNA-PCR im

Duplexverfahren mit anderen PCRs eingesetzt werden kann, insbesondere mit einer

PCR zum Nachweis von λ-DNA und von Maus-DNA. Dies bietet mehrere Vorteile:

Pipettierungenauigkeiten getrennter Ansätze werden vereinheitlicht, außerdem verrin-

gert sich der Materialaufwand und Chemikalienverbrauch.

Wichtig ist hier, dass beide PCRs sich nicht gegenseitig beeinflussen. Um dies zu errei-

chen, müssen mehrere Bedingungen erfüllt sein:

• Sonden und Primer dürfen nur an der jeweiligen Ziel-DNA binden, sonst kann

es zum unspezifischen Fluoreszenzanstieg und damit zu falsch positiven Ampli-

fikationsergebnissen bzw. erniedrigten CT-Werten kommen.

• Es müssen genügend freie Nukleotide vorhanden sein, sonst besteht die Gefahr,

dass die Amplifikation mit verminderter Effizienz abläuft. Die Folge wäre eine

verminderte Sensitivität; geringe Mengen an Ziel-DNA könnten in einem sol-

chen Fall eventuell gar nicht mehr detektiert werden.

• Die PCR-Sonden müssen mit unterschiedlichen Reportern und Quenchern mar-

kiert sein, die vom PCR-Gerät als verschiedene Fluoreszenzsignale wahrge-

nommen werden können.

Die Leishmanien-Sonden LEIS.P1 (Wortmann Originalprotokoll [115]) bzw. LEIS.P2

(modifiziertes Protokoll [36]) enthalten FAM als Reporter. Für die Sonde der λ-PCR

wurde der Farbstoff VIC gewählt; als Quencher wurde NFQ-MGB festgelegt. Um ge-

genseitige Einflüsse zwischen beiden PCRs auszuschließen, wurden vorab Zielsequen-

zen, Primer und Sonden mit dem Programm PrimerExpress 3.0 verglichen. Diese Soft-

ware kann auf Grundlage der Sequenzdaten ermitteln, ob es zwischen den Primern und

5. ERGEBNISSE

49

Sonden der beiden PCRs zu Wechselwirkungen kommt, die durch lange Bereiche mit

komplementärer Basenpaarung oder durch Ausbildung von Sekundärstrukturen (z.B.

Primerdimere) bedingt sein können.

Entscheidend ist letztlich aber die Kompatibilität beider PCRs in der Praxis. Dazu wur-

de der Ablauf der PCR zwischen folgenden beiden Ansätzen verglichen: Leishmania

18S rDNA-PCR allein und Leishmania 18S rDNA-PCR im Duplex mit der λ-PCR. Als

Proben wurden analog zu den bisherigen Testreihen Leishmanien-DNA, reine λ-DNA,

Gemische aus Leishmanien- und λ-DNA, sowie reine Maus- bzw. humane DNA getes-

tet. Für die λ-PCR wurden zwei verschiedene Primer/Sonden-Systeme kreiert (im Be-

reich der Gene lamC bzw. lamD des λ-Phagen, deshalb mit Lambda C und Lambda D

bezeichnet) Für Primer und Sonde der λ-PCR wurden bewusst Konzentrationen ge-

wählt, die niedriger lagen als bei der Leishmanien-PCR (Primer 150 nM, Sonde 100

nM), um die Sensitivität der Leishmanien-PCR für Proben mit niedriger Parasitenlast zu

bewahren.

Insgesamt wurden also sechs verschiedene PCR-Mixe getestet: Leishmanien-PCR (nach

Wortmann [115]), Leishmanien-PCR plus Lambda C-PCR, Leishmanien-PCR plus

Lambda D-PCR, sowie die gleiche Konstellation mit dem modifizierten Leishmanien-

PCR Protokoll.

Abb. 5.6: Amplifikationskurven Leishmanien-PCR (Wortmann [115] original) - blau

5. ERGEBNISSE

50

dargestellt- im Vergleich zur Leishmanien/Lambda C-bzw. Leishmanien/Lambda D-

Duplex-PCR - grün bzw. violett; Probe: Leishmanien-DNA 10-5 Verdünnung einer

Stammlösung mit 105 Leishmanien/µl plus λ-DNA 1500 Kopien/µl. Dargestellt ist eines

von zwei ähnlichen Experimenten (in Abhängigkeit vom jeweiligen Leishmanien-PCR-

Protokoll); jeder Ansatz wurde als Einzelbestimmung durchgeführt.

In Abbildung 5.6 dargestellt sind Amplifikationskurven der Leishmanien-PCR (Original

Wortmann-Protokoll [115]), Leishmanien/Lambda C-Duplex sowie Leishma-

nien/Lambda D-Duplex für ein DNA-Gemisch aus Lambda-DNA (1500 Kopien/µl) und

der 10-5-Verdünnung der Stammlösung (105 L./µl- also rechnerisch 1 Parasit/µl).

Erkennbar ist, dass alle drei sich ergebenden Amplifikationskurven der Leishmanien-

PCR (als Monoplex-PCR sowie jeweils im Duplex mit Lambda C- bzw. Lambda D-

PCR) sehr nah beieinander liegen, was sowohl den Kurvenanstieg als auch das finale

Fluoreszenzniveau betrifft. Die Amplifikationskurven von Lambda C- bzw. Lambda D-

PCR sind nahezu identisch. Für das nach Wortmann modifizierte Protokoll [36] ließen

sich diese Ergebnisse reproduzieren.

Wie in Tab. 5.2 erkennbar ist, sind die CT-Werte der Duplex-PCRs nahezu identisch mit

der singulär durchgeführten Leishmanien-PCR. Dies gilt für beide PCR-Protokolle, ori-

ginal und modifiziert. Die Lambda-PCR hat also offenbar keinen Einfluss auf den Ab-

lauf der Leishmanien-PCR.

Wortmann [115] Wortmann modifiziert [36]

Leishmanien-PCR

(Monoplex) 36,14 36,93

Leishmanien/Lambda C-

PCR 36,71 37,15

Leishmanien/Lambda D-

PCR 36,44 36,23

Tabelle 5.2: Vergleich der CT-Werte Leishmanien-PCR für Wortmann-Originalprotoko ll [115]

und modifiziertes Protokoll [36] (nicht graphisch dargestellt) in Abhängigkeit vom PCR-Design

(Monoplex bzw. Duplex mit λ-PCR). Probe: Leishmanien-DNA 10-5 Verdünnung einer Stammlö-

sung mit 105 Leishmanien/µl plus λ-DNA 1500 Kopien/µl. Einzelnes Experiment; jeder Ansatz

wurde als Einzelbestimmung durchgeführt.

5. ERGEBNISSE

51

Umgekehrt hemmt auch das Vorhandensein von Leishmanien-DNA nicht die Lambda-

PCR: für reine λ-DNA (Probe: 1,5x103 Kop./µl) zeigt der CT-Wert der Lambda D-PCR

mit 25,90 keine nennenswerte Abweichung vom CT-Wert für ein Gemisch aus λ- und

Leishmanien-DNA (26,09; λ-DNA-Konzentration unverändert) (Lambda C-PCR: 27,90

bzw. 27,93).

Die CT-Werte für die λ-PCR sind niedriger, da die Ausgangsmenge an λ-DNA viel hö-

her ist. Im Vergleich zur Leishmanien-PCR ist der Fluoreszenzanstieg jedoch aufgrund

der geringeren Primer- und Sondenkonzentration niedriger.

In Abbildung 5.7 wird gezeigt, dass es bei der Duplex-PCR nicht zum unspezifischen

Anstieg der Leishmanien-PCR kommt, wenn nur λ-DNA als Probe im Ansatz vorhan-

den ist. Diese exemplarisch gezeigten Amplifikationskurven ergaben sich bei allen vier

getesteten Duplex-PCR-Mixen.

Abb. 5.7: Amplifikationskurven Leishmanien-PCR nach Wortmann original [115] -

blau dargestellt- im Duplex mit Lambda D-PCR - violett dargestellt; Probe: λ-DNA

1500 Kopien/µl. Dargestellt ist eines von vier ähnlichen Experimenten (in Abhängigkeit

von dem jeweiligen Duplex-PCR-Mix); jeder Ansatz wurde als Einzelbestimmung

durchgeführt.

5. ERGEBNISSE

52

Da bei der Leishmanien-PCR in Kombination mit der Lambda C-PCR hier leichte

Schwankungen in der Grundfluoreszenz auffielen (Daten sind nicht gezeigt), wurde die

Lambda D-PCR als interne Positivkontrolle aller folgenden Experimente festgelegt.

Die Ergebnisse für das modifizierte Leishmanien-Protokoll entsprachen denen des Ori-

ginalprotokolls, allerdings waren kleine Schwankungen der Basislinie erkennbar. In

diesem Punkt war die Original-PCR, wie von Wortmann [115] beschrieben, offenbar

weniger störanfällig.

5.1.4 Etablierung einer Maus-PCR und Duplextest mit Leishmanien-PCR

Da das Ziel der PCR-Etablierung die Quantifizierung von Leishmanien-DNA infizierter

muriner Gewebe bzw. Kulturen war, musste im nächsten Schritt eine weitere PCR zur

Detektion von Maus-DNA entwickelt werden. Um als Bezugsgröße verwendbar zu sein,

sollte als Zielgen ein DNA-Abschnitt des murinen Genoms mit bekannter Kopienzahl

gewählt werden.

In einer Publikation von Saidac et al. [91] wurde das murine Nidogen als Wirtszell-PCR

zur Quantifizierung von Borrelien-infiziertem Maus-Gewebe beschrieben. Dieses Sin-

gle-Copy-Gen kommt in jeder diploiden Mauszelle zweimal vor. Eine Angabe von

Leishmanien-DNA im Bezug zu einer bestimmten Menge an murinen Zellen wäre somit

möglich. Da Saidac et al. [91] nicht die TaqMan-Methode, sondern sogenannte Molecu-

lar Beacons einsetzten, mussten geeignete TaqMan-Primer- und Sonden für das murine

Nidogen als Zielsequenz getestet werden. Mithilfe des Programmes PrimerExpress 3.0

wurden auf Grundlage des beschriebenen Genabschnittes zwei geeignete Primer-

/Sondensysteme generiert. Die als Nido.3 und Nido.4 bezeichneten PCR-Systeme [36]

sind mit dem Reporter VIC und dem Quencher NFQ-MGB markiert und wurden im

Folgenden sowohl auf ihr Vermögen, murine DNA zuverlässig zu detektieren, als auch

auf ihre Kompatibilität im Duplex mit der Leishmanien-PCR überprüft.

Die Ergebnisse zeigten ein unbeeinträchtigtes Nebeneinander-Ablaufen der Leishma-

nien- und Maus-PCR-Systeme (Abb. 5.8). Im Vergleich zur Monoplex-Leishmanien-

PCR mit einem CT-Wert von 36,58 (Probe: Leishmanien-DNA 10-5 Verdünnung einer

Stammlösung mit 105 Leishmanien/µl plus Maus-DNA 100 ng/µl) lagen die CT-Werte

für die Leishmanien-PCR im Duplex mit Nido.3 bei 36,71 bzw. im Duplex mit Nido.4

bei 36,98. Des Weiteren wurden Proben mit niedriger konzentrierter Maus-DNA (0,1

5. ERGEBNISSE

53

ng/µl) von beiden Nidogen-PCRs zuverlässig amplifiziert; humane wie auch λ-DNA

wurde nicht amplifiziert (Daten sind nicht gezeigt).

Abb. 5.8: Amplifikationskurve Leishmanien-PCR (Wortmann Original [115]) - jeweils

hellblau dargestellt - im Vergleich zur Leishmanien/Nido.3- bzw. Leishmanien/Nido.4-

Duplex-PCR - Nido.3: hellgrün / Nido.4: dunkelgrün dargestellt; Probe: Leishmanien-

DNA 10-5-Verdünnung einer Stammlösung mit 105 Leishmanien/µl plus Maus-DNA

100 ng/µl. Dargestellt ist eines von zwei ähnlichen Experimenten (in Abhängigkeit vom

jeweiligen Leishmanien-PCR-Protokoll); jeder Ansatz wurde als Einzelbestimmung

durchgeführt.

Wie in Abbildung 5.8 erkennbar, zeigte sich für die Nido.4-PCR ein geringerer Anstieg

der Fluoreszenz im Vergleich zu Nido.3. Dies war durchgehend für alle getesteten Pro-

ben der Fall. Um zu überprüfen, ob höhere Sonden-bzw. Primerkonzentrationen der

Nido4.PCR dies kompensieren würden, wurden diese im nächsten PCR-Lauf jeweils

auf das Doppelte angehoben und mit den ursprünglichen Werten verglichen. Die Ampli-

fikationskurven ergaben keinen verbesserten PCR-Verlauf (Daten sind nicht gezeigt).

Deshalb wurde die Nido.3-PCR als Standard für die Maus-PCR festgelegt (auf den Zu-

satz Nido.3 wird deshalb im Folgenden verzichtet).

5. ERGEBNISSE

54

Mit der nach Wortmann modifizierten PCR [36] für Leishmania im Duplex mit der Ni-

dogen-spezifischen PCR zur Quantifizierung des Maus-DNA-Gehaltes ließen sich ähn-

liche Ergebnisse erzielen (Daten sind nicht gezeigt). Allerdings fielen hier erneut

Schwankungen der Basislinie bei der Leishmanien-PCR auf, insbesondere in den letzten

zehn PCR-Zyklen, wenn ein negatives Amplifikationsergebnis vorlag. Bei derartigen

Fluoreszenzschwankungen besteht die Gefahr, dass durch Überschreiten des Schwel-

lenwertes falsch positive Amplifikationsergebnisse zustande kommen. Aus diesem

Grund wurde das modifizierte Protokoll nicht weiter verwendet und stattdessen das Ori-

ginal-Protokoll als Leishmanien-PCR-Standard festgelegt (für die Leishmanien-PCR

wird deshalb im Folgenden auf den Zusatz „Original“ verzichtet).

Abbildung 5.9 zeigt die erfolgreiche Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Men-

gen an Ausgangs-Maus-DNA: die CT-Werte der Nidogen-PCR liegen für 100 ng/µl

DNA bei 22, 48; für 10 ng/µl bei 26,37 sowie für 1 ng/µl bei 30,19. Der gleichmäßige

Abstand zwischen den CT-Werten deutet auf eine sehr präzise Quantifizierungsfähigkeit

der PCR hin.

Abb. 5.9: Amplifikationskurve Leishmanien-PCR - hellblau dargestellt - und Maus-

PCR - jeweils hellgrün dargestellt - bei gleichbleibender Konzentration an Leishma-

nien-DNA (Leishmanien-DNA 10-5-Verdünnung einer Stammlösung mit 105 Leishma-

nien/µl - rechnerisch 1 Parasit/µl) und Zusatz verschiedener Maus-DNA-Mengen (100

ng/µl; 10 ng/µl; 1 ng/µl). Einzelnes Experiment; jeder Ansatz wurde als Einzelbestim-

mung durchgeführt.

5. ERGEBNISSE

55

Im Nachfolgenden wurden diverse Positivproben von Patienten mit bekannter Leishma-

niose aus der diagnostischen Abteilung unseres Institutes sowie Organproben Leishma-

nien-infizierter Mäuse mit den beschriebenen PCR-Methoden getestet. Bei allen Proben

kam es zu einem positiven Amplifikationsergebnis der Leishmanien-PCR, für murine

Gewebe außerdem der Nidogen-PCR (Daten sind nicht gezeigt). Des Weiteren wurde

die DNA vier verschiedener Leishmanien-Spezies (L. major, L. infantum, L. brazilien-

sis, L. tropica) in der Leishmanien-PCR evaluiert und ebenfalls immer detektiert (Daten

sind nicht gezeigt). Zudem wurden Proben von drei verschiedenen, im Labor üblicher-

weise verwendeten Mausstämmen (C3H/HeJ, C57BL/6, BALB/c) überprüft, in denen

allesamt zuverlässig das Vorhandensein von Nidogen-DNA nachgewiesen werden

konnte.

5.1.5 Generierung einer Standardkurve als Voraussetzung zur absoluten

Quantifizierung

Um Proben mit unbekannten DNA-Mengen quantifizieren zu können, ist als Ver-

gleichswert das Mitführen von bekannten Standards erforderlich. Es eignet sich hierfür

eine Verdünnungsreihe. Aus den CT-Werten der einzelnen Verdünnungsstufen kann

eine Standardkurve erstellt werden. Die ermittelten CT-Werte der Proben werden in die-

se Kurve eingetragen, woraus wiederum die Ausgangsmenge an DNA ermittelt werden

kann.

Da für die Leishmanien-Quantifizierung ein Plasmid als Standard mitgeführt werden

sollte (siehe 4.2.10), wurde für dieses eine Verdünnungsreihe, ausgehend von 1010

Plasmid-Kopien/µl, bis hin zu 10-2 Kopien/µl, angefertigt.

5. ERGEBNISSE

56

Abb. 5.10: Amplifikationskurve der Leishmanien-Plasmid-Verdünnungsreihe (Zielkon-

zentration 1010 bis 10-2 Plasmid-Kopien/µl) in der Leishmanien-PCR; keine Amplifika-

tion (=Nulllinie) für 10 -1 und 10-2 Kopien/µl. Eines von zwei repräsentativen Experimen-

ten; jeder Ansatz wurde als Einzelbestimmung durchgeführt.

Abb. 5.11: Errechnete Standardkurve der Leishmanien-Plasmid-Verdünnungsreihe

(Zielkonzentration 1010 bis 10-2 Plasmid-Kopien/µl). CT-Werte sind gegen Konzentration

an Plasmid-DNA aufgetragen. Durch StepOne® Software errechnete Daten: Regressi-

onslinie: -3,392x (Konzentration Leishmanien-Plasmid) + 40,579; Regressionskoeffi-

zient R2=0,998. Eines von zwei repräsentativen Experimenten; jeder Ansatz wurde als

Einzelbestimmung durchgeführt.

5. ERGEBNISSE

57

In Abbildung 5.10 sowie 5.11 erkennt man die entstehenden Amplifikationskurven und

die daraus resultierende Regressionslinie der Standardkurve. Es zeigte sich eine äußerst

genaue und zuverlässige Quantifizierung über einen sehr großen dynamischen Bereich

(dynamic range) von insgesamt 10 Zehnerpotenzen. Bei 100 Kopien/µl, also 4 Kopien

im PCR-Ansatz (da 4 µl pro PCR eingesetzt wurden), fand eine Amplifikation statt (CT

41,12 ± 0,22; Mittelwert ± Standardabweichung aus zwei Verdünnungsreihen); ab der

10-1 -Verdünnung mit statistisch 0,4 Kopien wurde das Ergebnis negativ, wie es bei

korrekter Amplifizierung zu erwarten war. Dies zeigt, dass selbst kleinste Mengen der

Zielsequenz nachgewiesen werden, während Proben ohne entsprechende Ziel-DNA

zuverlässig zu negativen Ergebnissen führen. Das aus der Standardkurve (Abb. 5.11)

errechnete Bestimmtheitsmaß R² (= Regressionskoeffizient) untermalt mit einem Wert

von 0,998 die äußerst präzise Quantifizierung: dieser Koeffizient wird aus der Regressi-

onslinie der Standardkurve errechnet und zeigt die Größe der Übereinstimmung zwi-

schen der Regressionslinie und den individuell ermittelten CT-Werten auf; ein Wert von

1,00 entspräche dabei einer perfekten Übereinstimmung zwischen Regressionslinie und

den einzelnen Datenpunkten [75]. Zudem wird von der StepOne® Software die Effizi-

enz der PCR-Amplifikation berechnet, diese beträgt hier 97,145%. Sie ergibt sich aus

der Neigung der Standardkurve (in diesem Fall -3,392); diese würde im Idealfall (bei

einer Effizienz von 100%) den Wert 3,322 annehmen (siehe Formel in 5.1.1 zur Errech-

nung der CT-Wert-Abstände).

Für alle nachfolgenden PCRs wurde als Standard eine Verdünnungsreihe eingesetzt, die

Leishmanien- und Maus-DNA in einem Ansatz vereint. Ausgehend von 100 ng/µl

Maus-DNA (photometrisch ermittelt) und 105 Kopien des Leishmanien-Plasmids/µl

wurden sechs dekadische Verdünnungen erstellt (siehe 4.2.10), welche von nun an als

Bezugsgröße der Quantifizierung eingesetzt wurden; die Standardkurve wurde in jedem

PCR-Lauf als Duplikat mitgeführt.

5. ERGEBNISSE

58

5.1.6 Vergleich der Sensitivität zwischen Kinetoplasten-PCR und 18S

rDNA real-time PCR

Mithilfe der beschriebenen real-time PCR nach Wortmann [115] wird das 18S rRNA-

Gen nachgewiesen, welches Literaturangaben zufolge in ca. 160-200-facher Kopienzahl

vorliegt [61, 84, 109]. In einer konventionell durchgeführten PCR zum Nachweis von

Leishmanien wird häufig Kinetoplasten-Minicircles DNA amplifiziert [86] die in einer

viel höheren Kopienzahl (10000 bis 20000 pro Leishmanien-Genom) vorliegt [7, 65].

Es stellte sich daher die Frage, ob die konventionelle PCR in ihrer Sensitivität, insbe-

sondere bei niedriger Parasitenlast, der real-time PCR demnach nicht überlegen wäre. In

diesem Fall wäre die Kinetoplasten-PCR als komplementäre Methode bei fraglich nega-

tiven Ergebnissen in der real-time PCR denkbar.

Um die Sensitivität beider Methoden zu vergleichen, wurden Verdünnungsreihen von L.

major-DNA angefertigt (11 dekadische Verdünnungen von 5x104 bis 5x10-6 Leishma-

nien/µl). Diese wurden jeweils mit humaner bzw. muriner DNA versetzt (Konzentration

über die Verdünnungsstufen hinweg gleichbleibend), um Bedingungen „echter“ Proben

nachzuahmen, bei denen nie reine Leishmanien-DNA vorliegt. Erwartungsgemäß soll-

ten in der TaqMan-PCR bis zu Verdünnungsstufe 8 positive Amplifikationsergebnisse

vorliegen, denn dies entspräche mit 5x10-3 Leishmanien/µl bei einem eingesetzten Vo-

lumen von 4 µl einer Anzahl von 3,2 18S rRNA-Genkopien. Für die Kinetoplasten-PCR

wären theoretisch positive Ergebnisse bis Verdünnungsstufe 10 (5x10-5 Leishmanien/µl)

möglich: bei angenommener Kopienzahl der Minicircles-DNA von 10000 und einer

eingesetzten Menge von 5 µl DNA sollten dann 2,5 Kopien im Ansatz vorliegen.

In der Auswertung zeigte die TaqMan-PCR sichere Amplifikationsergebnisse bis zu

Verdünnungsstufe 7 bei Zusatz humaner DNA bzw. bis Verdünnung 8 bei Zusatz muri-

ner DNA. Die Erwartungen zur Sensitivität wurden demnach erfüllt. Für die Auswer-

tung der Kinetoplasten-PCR wurden die PCR-Ansätze nach erfolgter Amplifikation auf

Agarosegel (2%) aufgetragen. Danach wurde eine Spannungsquelle (120 V) für 45 min

angelegt und die Amplifikate mittels Ethidiumbromid-Färbung und Fotografie unter

UV-Licht sichtbar gemacht.

5. ERGEBNISSE

59

Abb. 5.12: Analyse der Kinetoplasten-PCR, aufgetragen auf Agarosegel 2%, Gelelektrophorese für

45 min bei 120V; anschließende Färbung mit Ethidiumbromid. Legende: pUC= Größenmarker;

H2O= Negativkontrolle; P1 = Positivkontrolle (<0,1 Leishmanien/µl); P2 = Positivkontrolle (<0,01

Leishmanien/µl); 1-11= Verdünnungen der Leishmanien-DNA - dekadische Verdünnungen von

5x104 bis 5x10-6 Leishmanien/µl, versetzt mit jeweils 50 ng/µl muriner DNA; weißer Pfeil gibt Lauf-

höhe der nachzuweisenden Bande an; Foto invers dargestellt. Eines von zwei repräsentativen Expe-

rimenten; jeder Ansatz wurde als Einzelbestimmung durchgeführt.

Wie in Abbildung 5.12 erkennbar ist, war bis zur Verdünnungsstufe 7 ein spezifisches

Leishmania-Kinetoplasten-PCR Amplifikat nachweisbar. Bei höheren Verdünnungen

war dies hingegen nicht mehr eindeutig erkennbar; stattdessen wurden unspezifische

Banden sichtbar. Analoge Ergebnisse wurden erzielt, wenn anstelle von muriner DNA

humane DNA zu der Verdünnungsreihe zugegeben wurde (Daten sind nicht gezeigt).

Die Kinetoplasten-PCR war im durchgeführten Experiment also nicht -wie angenom-

men- in ihrer Sensitivität der real-time PCR überlegen, sondern kam dieser maximal

gleich. Einen Vorteil des Einsatzes der Kinetoplasten-PCR bei Organen mit niedriger

Parasitenbeladung sollte es diesen Ergebnissen zufolge also nicht geben.

5. ERGEBNISSE

60

5.1.7 Vergleich zwischen StepOne® Real-Time PCR System und 7900 HT

Fast Real-Time PCR System

Alle bisherigen Erkenntnisse zu Etablierung und Evaluierung der verschiedenen real-

time PCR-Systeme wurden mit dem StepOne® Real-Time PCR System gewonnen. Da

dieses PCR-Gerät maximal 48 verschiedene PCR-Reaktionen parallel erfassen und ana-

lysieren kann, während das 7900 HT Fast Real-Time PCR System 384 simultane Ampli-

fikationen durchführen kann, sollte überprüft werden, ob die etablierte Leishmania 18S

rDNA–PCR und die murine Nidogen-PCR auf das real-time Gerät mit der größeren

Kapazität übertragbar war. Dies geschah insbesondere in Hinblick auf zukünftige Maus-

infektionsexperimente, welche eine große Menge an Proben erwarten ließen.

Um Ablauf der Amplifikation und Sensitivität beider Geräte vergleichen zu können,

sollten nun einige Proben mit dem 7900 HT Fast Real-Time PCR System amplifiziert

werden, die zuvor schon mittels StepOne® Real-Time PCR System quantifiziert worden

waren. Es bot sich an, die für den Vergleich mit der Kinetoplasten-PCR (siehe 5.1.6)

hergestellten Verdünnungsreihen (5x104 bis 5x10-6 Leishmanien/µl plus Zusatz muriner

bzw. humaner DNA) hier erneut zu verwenden, da damit auch die Sensitivität des neuen

Gerätes sehr gut evaluiert werden konnte. Es erfolgte eine absolute Quantifizierung der

einzelnen Verdünnungsstufen; die Basis hierfür bot das Mitführen der Standardkurve

(siehe 5.1.5). In Abbildung 5.13 ist der Vergleich der Resultate beider PCR-Geräte für

die einzelnen Verdünnungsstufen dargestellt (gezeigt sind 5x104 bis 5x10-2 Leishma-

nien/µl mit Zusatz muriner DNA).

5. ERGEBNISSE

61

Abb. 5.13: Vergleich der Auswertung einer dekadischen Leishmanien-Verdünnungsreihe (5x104 bis

5x10-2 Leishmanien/µl, versetzt mit jeweils 50 ng/µl muriner DNA) zwischen StepOne® Real-Time

PCR System (schwarze Balken) und 7900 HT Fast Real-Time PCR System (weiße Balken); angezeigt

sind die mithilfe der Standardkurve ermittelten Quantitäten (Angabe in Plasmid-Kopien/µl) für die

jeweils untersuchten Verdünnungsstufen (Angabe in Leishmanien/µl); - eines von zwei repräsenta-

tiven Experimenten, jeder Ansatz wurde als Einzelbestimmung durchgeführt.

Erkennbar ist, dass die ermittelten Quantitäten zwischen beiden TaqMan-Geräten ver-

gleichbar sind, ebenso wie die Sensitivität bei geringen DNA-Mengen. In einem zwei-

ten Experiment, dem die Verdünnungsreihe mit Zusatz humaner DNA zugrunde lag,

konnten diese Schlussfolgerungen bestätigt werden (Daten sind nicht gezeigt).

Die Bedingungen für einen Umstieg auf das 7900 HT Fast Real-Time PCR System wa-

ren demzufolge gewährleistet und die Vortestungen, bestehend aus Etablierung und

Evaluierung einer geeigneten real-time PCR, wurden als abgeschlossen betrachtet.

5. ERGEBNISSE

62

5.2 Vergleich zwischen DiffQuik® und real-time PCR für in

vitro-Pulsinfektionen muriner Knochenmarksmakropha-

gen

Nach Etablierung der Leishmanien/Maus-Duplex-PCR im real-time-Verfahren sollte

das PCR-System in einer in vitro-Anwendung getestet werden. Hierbei wurde unter-

sucht, ob die Bestimmung der Parasitenbeladung einer Leishmania-infizierten Makro-

phagenkultur mittels real-time PCR vergleichbare Ergebnisse liefert wie die mikrosko-

pische Ermittlung der Parasitenlast und Infektionsrate nach DiffQuik®-Färbung.

Im hier durchgeführten Versuch wurden Zellkulturen von C57BL/6 BM-MΦ mit

Leishmania-Promastigoten infiziert (MOI = 10) und danach entweder in Medium für

24-72h inkubiert oder mit IFN-γ ± TNF stimuliert, da diese Zytokinkombination be-

kanntermaßen die Expression von iNOS-Enzym und in der Folge die Produktion von

NO in den Makrophagen anregt, und dadurch die Parasiten in Abhängigkeit von der

freigesetzten NO-Menge abtötet [26, 48].

Für die mikroskopische Auswertung wurden die BM-MΦ in ChamberSlides ausgesät;

für die real-time PCR wurden 24-well-Plates verwendet, da eine größere Zellzahl benö-

tigt wurde, um ausreichend DNA für die anschließende PCR einsetzen zu können.

Nach mikroskopischer Auszählung wurden folgende Infektionsraten ermittelt (Abbil-

dung 5.14A):

5. ERGEBNISSE

63

Nach Ablauf der Pulsinfektion für 24h und anschließenden 48-stündigen Inkubation

sind ohne Zugabe von Stimulanzien ca. 50% aller Makrophagen infiziert (Medium + L.

major). Wie erwartet, reduzierte sich die Infektionsrate bei simultaner Zugabe von IFN-

γ und TNF-α auf unter 5%. In einem zweiten Experiment wurde zudem die Wirksam-

keit bei alleiniger Zugabe von IFN-γ (in unterschiedlich hohen Konzentrationen) bzw.

TNF-α untersucht: auch das Vorliegen von IFN-γ allein führte bei 20 ng/ml noch zu

einer leichten Abnahme der Infektionsrate, wohingegen bei den geringeren Konzentrati-

onen [2 bzw. 0,2 ng/ml] bzw. alleiniger Gabe von TNF-α kein Einfluss auf die Infekti-

onsrate mehr erkennbar war. Analoge Schlussfolgerungen lassen sich für die Angabe

der Parasitenlast pro infizierter Zelle ziehen (Abb. 5.14B).

Für eine bessere Vergleichbarkeit mit den TaqMan-Ergebnissen wurde auf Basis der

Infektionsrate und der Parasitenzahl pro infiziertem MΦ die Anzahl der Leishmanien in

Abb. 5.14: Infektion von C57BL/6 BM-MΦ mit L. major-Promastigoten (MOI=10; Pulsinfektion

für 24h, Gesamtdauer der Inkubation 72h); Zugabe von IFN-γ und TNF-α in unterschiedlich hohen

Dosierungen [Angabe in ng/ml]. Die ersten beiden Ansätze ohne Zugabe von Leishmanien (Nega-

tivkontrollen). Dargestellt sind Ergebnisse nach DiffQuik®-Färbung und anschließender mikro-

skopischer Auszählung; Mittelwert ± SD zweier unabhängiger Experimente für die ersten vier An-

sätze.

=nicht messbar

A: Angabe der MΦ-Infektionsraten [%]

B: Angabe von Leishmanien pro infizierte MΦ

5. ERGEBNISSE

64

der gesamten MΦ-Kultur, und davon ausgehend der Quotient Leishmanien/MΦ gesamt

errechnet, da mittels real-time PCR nur die Gesamtzahl aller MΦ (Menge der vorlie-

genden Maus-DNA) ermittelbar ist.

Zur Angleichung der Einheiten wurden die TaqMan-Ergebnisse (Angabe in Plasmid-

Kopien bezogen auf Maus-DNA) umgerechnet und der Einheit Leishmanien/MΦ ange-

glichen. Zunächst erhält man aus den TaqMan-Werten durch Kürzen der Einheiten die

Angabe (L.)-Plasmidkopien pro ng (Maus-DNA):

Einheitenangleichung aus TaqMan: � �� = �� ⇒ ��

(Leis= Angabe der Leishmanien in Kopien/µl; Nido= Angabe der Maus-DNA in ng/µl)

Danach war die Umrechnung von Plasmid-Kopien in Leishmanien erforderlich. In der

Literatur lassen sich Näherungswerte von 160-200 Kopien der 18S rDNA je Parasit fin-

den [61, 84, 109]. Der Einfachheit halber wurde von 200 Kopien ausgegangen. Mit der

Annahme, dass 200 ng murine DNA ca. 105 Nidogen-Kopien enthalten [91] (entspricht

beim Vorliegen des doppelten Chromosomensatzes 5x104 Zellen), ergibt sich eine Zell-

zahl von 250 MΦ pro ng DNA. Demzufolge können die TaqMan-Ergebnisse nach fol-

gender Formel in die Einheit Leishmanien/MΦ umgerechnet werden:

�� ÷ 250�Zellen$ ÷ 200�Plasmidkopien$ = . ∗ �012 3456789�54�:;

Annahme: 1 Parasit enthält 200 Kopien (der 18S rDNA); 1 ng (Maus-DNA) enthält

250 MΦ-Zellen (siehe oben)

Entsprechend diesen Umrechnungen sind die Parasitenbeladungen für beide Methoden

vergleichend in Abbildung 5.15 dargestellt.

5. ERGEBNISSE

65

Zunächst einmal lässt sich feststellen, dass die TaqMan-Ergebnisse glaubwürdige Werte

zwischen 0 und 10 Parasiten/MΦ liefern; auch sind die Werte der ersten beiden Ansät-

ze, denen keine Leishmanien hinzugefügt wurden, korrekterweise gleich null. Für reines

Medium ohne Zugabe von Stimulanzien wird laut TaqMan ein Wert von 0,5 L./MΦ

ermittelt, im Ansatz mit IFN-γ + TNF-α hingegen ist eine höhere Beladung (1,3 L./MΦ)

erkennbar. Dies steht im Gegensatz zu den DiffQuik®-Ergebnissen, denn mikrosko-

pisch betrachtet kommt es hier zu einer nahezu vollständigen Elimination der Parasiten.

Auch entspricht ein solches Ergebnis nicht den Erwartungen, da die Gabe der Stimulan-

zien ja zu einer Abtötung von Erregern führen soll. Die niedrigste Leishmanienbeladung

liegt laut TaqMan in den Ansätzen mit den gering konzentrierten Immunstimulanzien

vor, welche den DiffQuik®-Ergebnissen zufolge keine Abtötung bewirken, sondern in

Abb. 5.15: Parasitenlast nach Infektion von C57BL/6-BM-MΦ mit L. major-Promastigoten

(MOI=10; Pulsinfektion für 24h, Gesamtdauer der Inkubation 72h); Zugabe von IFN-γ und TNF-α

in unterschiedlich hohen Dosierungen [Angabe in ng/ml], Ergebnisse in Leishmanien/MΦ (gesamt).

Die ersten beiden Ansätze ohne Zugabe von Leishmanien (Negativkontrollen); Mittelwert ± SD

zwei unabhängiger Experimente für die ersten vier Ansätze.

Dargestellt sind Ergebnisse nach mikroskopischer Auswertung (DiffQuik®) bzw. TaqMan.

=nicht messbar

5. ERGEBNISSE

66

der Leishmanienbeladung pro MΦ sogar höhere Werte zeigen als bei den in Medium

gehaltenen Kulturen (z.B. Medium [2 Leishmanien/MΦ] versus TNF-α Stimulation [4

Leishmanien/MΦ]).

In der Zusammenschau führen diese Vergleiche zu der Schlussfolgerung, dass die Er-

gebnisse der real-time PCR nicht mit der mikroskopischen Auszählung korrelieren.

5.3 Vergleich zwischen Limiting Dilution Analysis und real-

time PCR für in vivo-Infektionsexperimente

5.3.1 Vergleich der Parasitenlast von BALB/c-bzw. C57BL/6-Mäusen mit-

tels LDA und TaqMan nach subkutaner Infektion mit L. major

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war die Evaluierung, ob die real-time PCR-

Methode für die Quantifizierung der Leishmanienlast in Organen von infizierten Mäu-

sen einsetzbar sei und sich mit den Ergebnissen aus der etablierten Limiting Dilution

Analysis (LDA) als vergleichbar erweisen würde.

In einem ersten Experiment wurden hierzu resistente C57BL/6 und suszeptible BALB/c

Mäuse mit 3x106 L. major-Promastigoten pro Hinterpfote infiziert.

Als Parameter für den klinischen Verlauf wurde die Schwellung der infizierten Fußhaut

gemessen (Abb. 5.16).

5. ERGEBNISSE

67

Wie in der Literatur bereits beschrieben [39], entwickelten BALB/c Mäuse eine pro-

gressive stetig fortschreitende Erkrankung, während C57BL/6 Mäuse nur vorüberge-

hend ein Anschwellen der infizierten Haut zeigten und nach mehreren Wochen klinisch

wieder völlig ausheilten.

Um über den Befall verschiedener Organe während der Akutphase der Infektion eine

Aussage zu gewinnen, wurde die Tiere 28 Tage nach Infektion (post infectionem, = p.i.)

getötet, die infizierte Fußhaut, die drainierenden poplitealen Lymphknoten sowie die

Milz zu Homogenaten bzw. Einzelzellsuspensionen aufgearbeitet und anschließend die

Leishmanienbeladung im Organ einmal mit Hilfe der real time PCR-Methode und in

Abb. 5.16: Verlauf der Fußschwellung bei BALB/c- und C57BL/6-Mäusen nach erfolgter Infektion

mit L. major; die Mäuse wurden s.c. mit 3 x 106 L. major-Promastigoten je Hinterpfote infiziert.

Dargestellt ist die prozentuale Zunahme der Fußdicke zum jeweiligen Zeitpunkt nach Infektion

(p.i.). Angabe von Mittelwert ± SD von anfänglich 12 Mäusen, davon vier BALB/c-Mäuse und acht

C57/BL6-Mäuse, von diesen wurden vier Mäuse mit den BALB/c-Mäusen an Tag 28 aus dem Ex-

periment genommen; vier weitere Mäuse wurden bis Tag 140 untersucht (Ende des Experiments);

einzelnes Experiment.

5. ERGEBNISSE

68

einem parallelen Ansatz mit Hilfe der LDA bestimmt. Um eine Aussage über Parasiten-

beladung in der Persistenzphase nach klinischer Ausheilung zu gewinnen, wurden

C57BL/6-Mäuse auch 140 Tage p.i. entsprechend obiger Angaben analysiert.

Pro Zeitpunkt und Mausstamm wurden je vier Mäuse untersucht, um ein repräsentatives

Ergebnis der Parasitenlastbestimmung zu erhalten.

Für den Vergleich der Parasitenbeladungen mussten zunächst einige Umrechnungen

erfolgen, denn die Einheiten der beiden Methoden sind verschieden: die LDA-

Ergebnisse sind in Leishmanien/Gramm Maus-Gewebe bzw. Leishmanien/Zellen ange-

geben; die Quantifizierung mittels Standardkurve (TaqMan) ergibt eine Angabe in

Leishmanien-Plasmidkopien pro ng Maus-DNA. Eine Umrechnung der TaqMan –Werte

in Leishmanien pro Mauszelle erfolgte analog dem in 3.2. beschriebenen Schema ent-

sprechend der Annahme, dass 200 ng murine DNA ca. 105 Nidogen-Kopien bzw. 5x 104

Zellen entspricht [91], woraus eine Zellzahl von 250 pro ng DNA folgt. Für die Um-

rechnung von Leishmanien-Kopien in Leishmanien wurde mit einem Näherungswert

von 200 Kopien je Parasit gerechnet [61, 84, 109]; da dies aber ein ungenauer Wert ist,

wurden die Ergebnisse hier zusätzlich in Plasmidkopien angegeben.

Für Organe, bei denen keine mikroskopische Zellzahl-Bestimmung möglich ist (hier:

Fuß, im folgenden Experiment außerdem Leber) sollte die Leishmanien-Zahl bezogen

auf 1g des jeweiligen Organgewebes angegeben werden. Hierfür wurde das im TaqMan

eingesetzte Organgewicht bestimmt und davon ausgehend die Anzahl der Leishmanien

für 1g des Gewebes berechnet. Somit konnte eine Umrechnung der TaqMan-Ergebnisse

und Angleichung an die LDA-Einheiten erfolgen.

In Abbildung 5.17 ist die Parasitenlast in der Hautläsion, dem Lymphknoten und der

Milz nach L. major-Infektion nach LD- und TaqMan-Analyse dargestellt. Die TaqMan-

Ergebnisse sind sowohl in Leishmanien als auch Leishmanien-Plasmidkopien pro Or-

ganzellen bzw. –gewicht gezeigt.

5. ERGEBNISSE

69

Abb. 5.17: Parasitenlast verschiedener Organe nach Infektion mit L. major. BALB/c- und C57BL/6-

Mäuse wurden beidseitig mit 3x106 L. major-Promastigoten subkutan infiziert. 28 (BALB/c und

C57BL/6 im Vergleich) bzw. 140 Tage (nur C57BL/6) nach der Infektion wurde die Parasitenbela-

dung in der Fußhaut, dem drainierenden Lymphknoten (LK) und der Milz mittels LD- und Taq-

Man-Analyse ermittelt. Gegenübergestellt sind die Messergebnisse von BALB/c - und C57BL/6 -

Mäusen. Die TaqMan-Ergebnisse sind jeweils in Leishmanien-Genkopien (Mittelreihe) und errech-

neter Leishmanienzahl (rechte Reihe, siehe Erklärungen im Text) angegeben und auf das Gewicht

des Gewebes (Gramm) bzw. Zellen des Zielorgans bezogen. Signifikante Unterschiede im t-Test

zwischen BALB/c- und C57BL/6-Mäusen (p<0,05) sind mit #, zwischen frühem und spätem Zeit-

punkt bei C57BL/6 mit * gekennzeichnet; Angabe von Mittelwert ± SD mit vier Mäusen je Gruppe

und Zeitpunkt; einzelnes Experiment.

Wie erwartet, wurde in Fuß, Lymphknoten sowie Milzgewebe von BALB/c-Mäusen

während der Akutphase der Infektion (d28 p.i.) eine signifikant erhöhte Leishmanienlast

im Vergleich zu C57BL/6-Mäusen bei der LD-Analyse ermittelt. Ein signifikanter Un-

terschied zwischen den beiden Mausstämmen zu diesem Infektionszeitpunkt konnte

5. ERGEBNISSE

70

auch mit Hilfe der TaqMan-Analyse erhoben werden. Ebenso zeigte sich für den

C57BL/6-Stamm in Fuß und Lymphknoten sowohl bei TaqMan als auch LDA eine sig-

nifikante Abnahme der Parasitenlast zum späten Infektionszeitpunkt (d140 p.i.), wäh-

rend dies bei der Milz für beide Methoden nicht zutraf. Im Milzgewebe ließen sich al-

lerdings insgesamt viel geringere Werte als in den anderen Organen feststellen. Insge-

samt zeigten die Bestimmung der Parasitenbeladung mittels LDA oder TaqMan über-

wiegend große Übereinstimmung, die in der LDA gewonnenen Aussagen zu signifikan-

ten Unterschieden zwischen den beiden Mausstämmen bzw. Zeitpunkten lassen sich im

TaqMan sogar zu 100% reproduzieren. Lediglich bei zwei Vergleichen ergaben sich

signifikante Unterschiede zwischen beiden Methoden: die Parasitenlast des Fußes in

BALB/c-Mäusen lag in der LD-Analyse um etwa zwei Zehnerpotenzen über den Taq-

Man-Werten. Für Lymphknoten ergaben sich in C57BL/6-Mäusen d28 p.i. um ca. eine

Zehnerpotenz erhöhte Werte in der TaqMan-Analyse. Für alle anderen Zeitpunkte sowie

Milzgewebe konnten keine signifikanten Abweichungen festgestellt werden. Damit

ergibt sich, dass in 77,8% der verglichenen Wertepaare keine signifikanten Abweichun-

gen zwischen den absoluten Werten beider Methoden auftreten.

5.3.2 Vergleich der Parasitenlast von BALB/c-bzw. C57BL/6-Mäusen mit-

tels LDA und TaqMan nach subkutaner Infektion mit L. infantum

In einem weiteren Experiment wurden BALB/c- und C57BL/6-Versuchstiere mit Pro-

mastigoten der Spezies L. infantum, welche beim Menschen eine viszerale Infektion

hervorrief [10], und nach intravenöser Injektion auch im Mausmodell eine viszerale

Leishmaniose auslöste (unpublizierte Daten, Ulrike Schleicher und Christian Bogdan),

subkutan in beide Hinterpfoten infiziert. Diese Injektionsart wurde bewusst gewählt, da

sie gegenüber einer i.v.-Injektion eher dem natürlichen Infektionsweg, nämlich einem

Stich durch die Sandmücke, entspricht. Da die allermeisten Daten aus der Literatur im

Mausmodell der viszeralen Leishmaniose nach intravenöser Injektion der Promastigoten

erhoben wurden [2, 35], sollte bei diesem Experiment auch evaluiert werden, ob eine

systemische Leishmaniose nach subkutaner Applikation der viszerotropen Erreger aus-

gelöst werden kann. Es wurde eine Infektionsdosis von 106 Parasiten je Fuß festgelegt.

Literaturdaten weisen darauf hin, dass es -im Gegensatz zur L. major-Infektion -im zeit-

lichen Verlauf einer L. infantum-Infektion keine signifikanten Unterschiede zwischen

BALB/c- und C57BL/6-Mäusen gibt [46, 55].

5. ERGEBNISSE

71

Zu untersuchende Organe waren neben Fußhaut, Lymphknoten und Milz auch das Kno-

chenmark und die Leber. Die Parasitenlast wurde an fünf Zeitpunkten (Tag 10, 28, 59,

118 und 174 nach Infektion) erfasst, wobei pro Zeitpunkt je zwei BALB/c- und zwei

C57BL/6-Mäuse untersucht wurden. Zur Vergleichbarkeit der Ergebnisse von LDA und

TaqMan erfolgte auch hier eine Anpassung der Einheiten, indem analog zu dem bei

5.3.1. beschriebenen Vorgehen die TaqMan-Ergebnisse in Leishmanien/Gramm (für

Fuß und Leber) bzw. Leishmanien/Zellen (für Lymphknoten, Milz und Knochenmark)

umgerechnet wurden.

Die Fußdicke der infizierten Mäuse wurde regelmäßig gemessen und dokumentiert, ihr

Verlauf ist in Abbildung 5.18 dargestellt.

Abb. 5.18: Verlauf der Fußschwellung bei BALB/c- und C57BL/6-Mäusen nach erfolgter L. infan-

tum-Infektion; die Mäuse wurden s.c. mit 106 L. infantum-Promastigoten je Hinterpfote infiziert

Dargestellt ist die prozentuale Zunahme der Fußdicke zum jeweiligen Zeitpunkt nach Infektion

(p.i.); Angabe von Mittelwert ± SD mit anfänglich zehn Mäusen je Gruppe, von diesen wurden je-

weils zwei Mäuse pro Zeitpunkt (Tag 10, 28, 59, 118 und 174 p.i.) aus dem Experiment genommen;

einzelnes Experiment.

Erkennbar ist eine nur mäßige Zunahme der Schwellung bei BALB/c-Mäusen (graue

Kurve), welche nach einem Maximum um Tag 21 wieder abnimmt und den Ausgangs-

5. ERGEBNISSE

72

wert erreicht. Bei C57BL/6-Mäusen (schwarze Kurve) ist ein stärkeres Anschwellen

(ca. 40% über Ausgangsniveau) erkennbar, welches ab der vierten Woche p.i. jedoch

genauso rasch wieder abebbt.

Die Ergebnisse der Parasitenlastbestimmung mittels LDA bzw. TaqMan sind in Abbil-

dung 5.19 dargestellt. Da die Werte der in Leishmanien umgerechneten Angaben (Taq-

Man) in 5.3.1 den LD-Ergebnissen sehr gut entsprachen, wurde hier auf die Angabe der

Leishmanien-Kopien (pro g bzw. Zellen) verzichtet.

5. ERGEBNISSE

73

5. ERGEBNISSE

74

Abb. 5.19: Parasitenlast verschiedener Organe nach Infektion mit L. infantum. BALB/c- und

C57BL/6-Mäuse wurden beidseitig mit 106 L. infantum-Promastigoten subkutan infiziert. An je-

weils fünf Zeitpunkten (Tag 10, 28, 59, 118 und 174 p.i) wurde die Parasitenbeladung in der Fuß-

haut, dem drainierenden Lymphknoten (LK), der Milz, der Leber und dem Knochenmark (KM)

mittels LD- und TaqMan-Analyse ermittelt. Gegenübergestellt sind die Messergebnisse von BALB/c

- bzw. C57BL/6 - Mäusen mittels LDA (linke Reihe) und TaqMan (rechte Reihe) in Leishmanien

pro Gramm Gewebe bzw. Zellen des Zielorgans. Signifikante Unterschiede im t-Test zwischen

BALB/c- und C57BL/6-Mäusen (p<0,05) in der LDA sind mit #, zwischen zwei benachbarten Zeit-

punkten mit * gekennzeichnet; Angabe von Mittelwert ± SD für vier (LDA) bzw. zwei (TaqMan)

Mäuse je Stamm und Zeitpunkt; einzelnes Experiment.

Eine Aussage zu Signifikanzen war nur für LDA-Werte möglich, da in einem zweiten

unabhängigen Experiment LD-Analysen für zwei weitere Mäuse pro Stamm und Zeit-

punkt durchgeführt wurden und somit eine ausreichende Zahl an Werten zur Durchfüh-

rung der statistischen Analyse gegeben war.

Die TaqMan-Ergebnisse wurden im Bezug auf Quantität und zeitlichen Verlauf mit den

LDA-Resultaten verglichen. Es ist erkennbar, dass die Kurven im zeitlichen Verlauf mit

Ausnahme der infizierten Haut in den meisten Fällen relativ gut einander entsprechen,

die absoluten Werte in der TaqMan-Messung aber durchgehend niedriger sind und zwi-

schen ein bis drei Zehnerpotenzen unter den LDA-Werten liegen.

Zu den einzelnen Organen lassen sich folgende Aussagen treffen:

Am Ort der Infektion in der Fußhaut stagnierte die Zahl der Parasiten bis d28 p.i. in

beiden Mausstämmen, danach kam es im weiteren Verlauf der Infektion zu einer Parasi-

tenabnahme, die in C57BL/6 Mäusen im Vergleich zu BALB/c Mäusen sehr viel deutli-

cher ausgeprägt war (LD-Analyse). Weder die Abnahme der Parasiten im zeitlichen

Verlauf noch der Unterschied zwischen C57BL/6 und BALB/c konnte in der TaqMan-

Analyse in ähnlicher Weise beobachtetet werden.

In den LD-Analysen kam es im drainierenden Lymphknoten von C57BL/6-Mäusen ab

d10 p.i. zu einer kontinuierlichen Abnahme der Parasitenbeladung um Faktor 10 im

weiteren Verlauf der Infektion. Im Gegensatz dazu fiel die Parasitenlast bei BALB/c-

Mäusen nur kurzfristig ab (d28 p.i.), erreichte aber zu späteren Zeitpunkten wieder das

Niveau von d10 p.i.. Diese Resultate finden sich auch bei den TaqMan-Analysen wie-

der, allerdings sind die Unterschiede im Vergleich zur LDA geringer ausgeprägt.

5. ERGEBNISSE

75

Im Gegensatz dazu wurde in der Milz in beiden Mausstämmen eine Zunahme der

Leishmanienzahl im zeitlichen Verlauf detektiert, die bei den C57BL/6-Tieren zwei log-

Stufen, bei den BALB/c-Mäusen sogar 3 log-Stufen umfasste (LDA). Ähnliche Ergeb-

nisse wurden auch mit der TaqMan-Methode erzielt. Eine Zunahme der Parasiten im

Verlauf der Infektion war mit beiden Methoden auch im Knochenmark von C57BL/6-

und BALB/c-Mäusen zu messen. Während der Anstieg der Parasitenzahl in C57BL/6-

Tieren bereits an d28 p.i. erkenntlich war, zeigte er sich in BALB/c-Mäusen erst am

letzten Messzeitpunkt (d174 p.i.). Jedoch ist bei beiden Methoden gleichermaßen eine

im Vergleich zu den anderen Organen niedrigere Parasitenlast erkennbar.

In der Leber wurde mit Hilfe der LD-Analysen für C57BL/6-Mäuse im zeitlichen Ver-

lauf ein kontinuierlicher Abfall auf ca. 102-103 Leishmanien/Gramm Lebergewebe fest-

gestellt. Auch bei BALB/c-Mäusen war im Gesamtverlauf eine Abnahme der Parasiten-

beladung erkennbar. In den TaqMan-Analysen hingegen war eine kontinuierliche Ab-

nahme der Parasitenzahl nicht zu beobachten. Die Parasitenbeladung war hier bei bei-

den Mausstämmen nur zwischenzeitlich reduziert, erreichte zum letzten Messzeitpunkt

aber wieder das Ausgangsniveau von d10 p.i..

In der Zusammenschau ergeben sich für den Infektionsverlauf folgende Schlussfolge-

rungen: i) die subkutane Injektion von viszerotropen L. infantum-Promastigoten in die

Fußhaut führt zu einer systemischen Leishmaniose. ii) In Analogie zum intravenösen

Infektionsmodell der viszeralen Leishmaniose kommt es auch nach s.c.-Infektion zur

kontinuierlichen Proliferation der Erreger in der Milz, während die Parasiten in der Le-

ber nach anfänglichem Wachstum kontrolliert werden können. iii) Eine starke Vermeh-

rung der Leishmanien am ursprünglichen Infektionsort (Fußhaut) und im drainierenden

Lymphknoten findet im Verlauf der Infektion nicht statt. iv) C57BL/6- und BALB/c-

Mäuse zeigen einen ähnlichen Infektionsverlauf.

6. DISKUSSION

76

6 DISKUSSION

Die herkömmliche Diagnostik der Leishmaniose und insbesondere die Quantifizierung

von Leishmanien-infizierten Geweben beruht auf der direkten Kultivierung oder dem

mikroskopischen Nachweis der Parasiten [116]. Die PCR-Methodik und insbesondere

die weiterentwickelte Form der real-time PCR zeigten bereits in experimentellen wie

klinischen Untersuchungen ihre Überlegenheit gegenüber diesen traditionellen Nach-

weismethoden, bezüglich Sensitivität [7, 106], Arbeitsaufwand und Schnelligkeit [30,

64, 116].

In der vorliegenden Arbeit wurde eine quantitative real-time PCR zur Detektion von

Leishmania-DNA und Wirtszell-DNA der Maus etabliert. Die Wirtszell-PCR diente

hierbei als Bezugsgröße zur Quantifizierung. Beide PCR-Systeme wurden auf ihre An-

wendung im Duplex-Verfahren überprüft.

Nach der Etablierung war es ein weiteres Ziel die Anwendbarkeit der PCR zur Quantifi-

zierung von Leishmania-Beladungen zu testen; einerseits für in vitro-Infektionsexperi-

mente mit murinen BM-MΦ, andererseits für ex vivo-Analysen zur Bestimmung der

Leishmanienbeladung in Gewebe von infizierten Mäusen. Zur Validierung der PCR

erfolgte jeweils der Vergleich mit den etablierten, standardmäßig eingesetzten Metho-

den.

6.1 Etablierung eines real-time PCR-Systems zur Quantifizie-

rung von Leishmanien

6.1.1 Leishmanien-PCR

Für die Detektion von Leishmanien-DNA mittels real-time PCR wurde das von Wort-

mann et al. [115] publizierte Primer/Sonden-System verwendet. Dieses lieferte Hinwei-

se auf hohe Spezifität und Sensitivität, sowie Differenzierung zwischen verschiedenen

DNA-Mengen: der CT-Wert, welcher bei der real-time PCR die Grundlage der Quantifi-

zierung bildet, wurde bei sehr hohen DNA-Konzentrationen bereits nach wenigen Amp-

lifikationszyklen erreicht; CT-Werte um 35-40 Zyklen deuteten auf geringe Mengen an

Leishmanien-DNA hin.

6. DISKUSSION

77

Zunächst wurden die Primer- und Sondenkonzentrationen neu evaluiert. Die Ergebnisse

experimenteller Untersuchungen ergaben optimale Amplifikations- und Detektionsbe-

dingungen bei Konzentrationen von jeweils 400 nm (Primer) und 200 nm (Sonde). Es

zeigte sich wie erwartet eine hohe Spezifität: Zusätze von Fremd-DNA hatten keinen

nennenswerten Einfluss auf die Amplifikation der Leishmanien-DNA. Bei Proben, die

das entsprechende Zielgen nicht enthielten, konnten keine falsch-positiven Ergebnisse

festgestellt werden. Dies bedeutet, dass die gewählte Gensequenz spezifisch für das

Leishmaniengenom ist [47, 115]. Die hohe Sensitivität zeigte sich darin, dass selbst

Proben mit rechnerisch weniger als zehn Genkopien im Ausgangsvolumen sicher als

positiv erkannt wurden. Auch für andere real-time PCR-Protokolle wurde eine entspre-

chende Sensitivität beschrieben [94, 116], was die Vorzüge dieser weiterentwickelten

PCR-Methode unterstreicht.

Die präzise Quantifizierungsfähigkeit umfasst eine weite Spanne an DNA-

Ausgangskonzentrationen (Minimum elf dekadische Potenzen). So kommt es unter Vo-

raussetzung optimaler Effizienz im PCR-Ablauf bei Einsatz der doppelten bzw. zehnfa-

chen DNA-Menge zu einer Linksverschiebung des CT-Wertes um einen Zyklus bzw.

rund 3,32 Zyklen. Mehrere dekadische Verdünnungsreihen zeigten in der Testung einen

konstant bleibenden CT-Abstand zwischen drei und vier Zyklen innerhalb der einzelnen

Verdünnungsstufen. Der extrem große Wertebereich der konstanten Quantifizierung

wurde mit einer Präparation des Leishmania 18S rDNA-Positiv-Kontrollplasmids aus E.

coli erreicht, welches für die Standardkurve hergestellt wurde. Die hohe Spannbreite

(dynamic range) der exakten Quantifizierung mit dem Leishmanien-Kontrollplasmid

sollte in der praktischen Anwendung, d.h. für Gewebeproben aus infizierten Mäusen,

ausreichend sein, um eine hohe Leishmanienlast in der Akutphase einer Infektion eben-

so sicher wie sehr niedrige Parasitenspiegel in der Persistenzphase erfassen zu können.

Verschiedene Leishmanienspezies (L. major, L. infantum, L. tropica, L. braziliensis)

zeigten in der Testung mit der von Wortmann beschriebenen PCR [115] allesamt ein

positives Amplifikationsresultat. Es wurde zusätzlich eine zweite, vom Original-

Protokoll leicht abweichende Leishmanien-PCR getestet. Differenzen in der Basenab-

folge bei einigen Leishmanienspezies sollten besser toleriert werden mithilfe einer ver-

änderten Sonde und einer daraus resultierenden abgewandelten Primersequenz. Trotz

der vermeintlichen Optimierung zeigte die Anwendung der modifizierten PCR eine er-

6. DISKUSSION

78

höhte Störanfälligkeit in Form von Fluoreszenzschwankungen bei negativen Proben.

Dieser entscheidende Nachteil im Vergleich zur Original-PCR führte zu der Entschei-

dung, das modifizierte PCR-System nicht weiter zu verwenden. In der Publikation von

Wortmann [115] wurden insgesamt 27 verschiedene Spezies überprüft und lieferten

ebenfalls durchweg positive Ergebnisse. Die befürchteten Basenfehlpaarungen führen in

der praktischen Testung also offenbar nicht zu Sensitivitätsverlusten. Die 18S rDNA-

PCR sollte somit universell zum Nachweis von Leishmaniosen geeignet sein [107].

Als Bezugsgröße zur Quantifizierung wurde eine Standardkurve aus Proben mit be-

kannten Konzentrationen erstellt. Mit dieser Methode kann die absolute DNA-Menge in

einer Probe ermittelt werden. Für die Generierung der Standardkurve wurde anstelle von

kompletten Organismen ein Plasmid mit der Zielsequenz der 18S rDNA verwendet, da

sich bei der Generierung des Standards ausgehend von einer Leishmanienkultur zwei

potentielle Fehlerquellen ergeben: die Parasitenzahl wird mikroskopisch ausgezählt und

kann keine zu 100% genauen Ergebnisse liefern; zudem geht bei der DNA-Extraktion

ein gewisser Anteil verloren geht, dessen Größe nicht bekannt ist. Der Fehler bei der

Plasmid-Verdünnungsreihe wurde als geringer eingeschätzt, weshalb diese als Referenz

für alle Experimente gewählt wurde.

Die Quantitäten der eingesetzten Proben wurden demzufolge in Plasmid-Kopien/µl er-

mittelt. Zum Vergleich der PCR mit anderen Methoden war aber eine Angabe in

Leishmanien erforderlich. Die Umrechnung gestaltete sich hierbei als schwierig, da die

ribosomalen Gene repetitive Sequenzen darstellen und die exakte Kopienzahl nicht be-

kannt ist; zudem könnten die Anzahl zwischen den einzelnen Spezies variieren. Litera-

turangaben sprechen von 160-200 Kopien pro Leishmaniengenom [61, 84, 109], biswei-

len wurden aber auch Werte unter 100 angegeben [47, 58]. Eine absolut genaue Um-

rechnung von Genkopien in Leishmanien ist demzufolge nicht möglich. Diese Schwie-

rigkeit könnte durch Verwendung eines anderen DNA-Abschnittes, mit bekannter Ko-

pienzahl, umgangen werden. Beispielsweise wurde ein real-time PCR-Protokoll basie-

rend auf dem DNA-Polymerase-Gen, einem Single-Copy-Gen, beschrieben [12]. Hier

wäre allerdings aufgrund der geringeren Kopienzahl ein Sensitivitätsverlust der PCR zu

befürchten, was bei Proben mit niedrigen Mengen an Leishmanien-DNA zu falsch nega-

tiven Ergebnissen führen könnte. Die beschriebene Problematik bezieht sich nur auf das

Ermitteln der genauen Parasitenzahl, was für den Vergleich der zu etablierenden PCR

6. DISKUSSION

79

mit anderen Nachweismethoden notwendig war. Für praktische Fragestellungen, wie

z.B. zeitliche Verläufe oder Vergleiche verschiedener Organgewebe, wäre die Umrech-

nung von Plasmid-Kopien in Leishmanien nicht unbedingt erforderlich, da sich bei-

spielsweise eine Verdopplung der Parasitenlast mit beiden Maßeinheiten gleichermaßen

feststellen ließe.

Für die Minicircle-Sequenz der Kinetoplasten-DNA wurden neben dem konventionellen

Schema auch real-time PCR-Protokolle beschrieben [69, 87], welche aufgrund der hö-

heren Kopienzahl (10000-20000 [86]) eventuell eine noch zuverlässigere Detektion sehr

geringer Leishmanienmengen (<zehn Parasiten im Ansatz) liefern könnten. Da die An-

gabe der Kopienzahlen aber noch ungenauer ist als bei der 18S rDNA, und selbst inner-

halb von Individuen einer Spezies stark schwanken kann, würde die Genauigkeit der

Quantifizierung abnehmen. Die hohe Variabilität der Zielsequenz verbunden mit der

geringen Menge von in öffentlichen Datenbanken zugänglichen Sequenzen würde hier

auch eine zuverlässige Methodenvalidierung erschweren, sodass der Einsatz solcher

PCR-Protokolle eher auf die Infektionsforschung beschränkt bleibt, wenn beispielswei-

se eine bereits bekannte Leishmanienspezies im Versuchstier nachgewiesen bzw. quan-

tifiziert werden soll. Für diagnostische Zwecke sind solche Protokolle weniger geeignet.

Mit der 18S rDNA-PCR nach Wortmann [115] wurde demnach eine geeignete Methode

für die vorliegenden Fragestellungen gewählt, die zudem einen guten Mittelweg zwi-

schen Sensitivität und präziser Quantifizierung gewährleistet.

6.1.2 Duplex der Leishmanien-PCR mit λ-bzw. Maus-PCR

Um bei einem negativen PCR-Ergebnis eine Amplifikationshemmung oder den Verlust

von DNA beim Aufreinigungsprozess ausschließen zu können, hat sich der Einsatz ei-

ner internen Inhibitionskontrolle bewährt [82]. Diese Kontrollreaktion läuft unter exakt

denselben Bedingungen ab und weist bei einem positiven Amplifikationsergebnis nach,

dass die DNA-Isolierung korrekt durchgeführt wurde und das gewonnene DNA-Eluat

keine PCR-Inhibitoren enthielt.

In der diagnostischen Abteilung unseres Instituts hat sich der Einsatz des Bakteriopha-

gen Lambda zu diesem Zweck bereits bewährt. Von Vorteil ist, dass der Lambdaphage

in der klinischen Diagnostik keine Rolle spielt, sodass die Zugabe von Lambda-DNA

keine störende Quelle der DNA-Kontamination darstellt. Zudem ist der Phage sehr gut

untersucht und seine komplette Genomsequenz bekannt. Zwei alternative Pri-

6. DISKUSSION

80

mer/Sonden-Systeme (Lambda C und Lambda D) waren auf Kompatibilität im Duplex

mit der Leishmanien-PCR überprüft worden. Für den genannten Zweck erwiesen sich

beide PCRs in der Testung als gut geeignet. Die Lambda C-PCR zeigte im Gegensatz zu

Lambda D größere Schwankungen in der Grundfluoreszenz. Die Gefahr hierbei wäre

ein falsch positives Ergebnis bei Überschreiten des CT-Wertes. Aus diesem Grund wur-

de die Lambda D-PCR als Standard-PCR für die interne Positivkontrolle festgelegt. Als

Alternative zum Lambdaphagen wäre prinzipiell auch die Verwendung eines murinen

Zielgens möglich (so bietet die später etablierte Nidogen-PCR auch gleichzeitig eine

interne Positivkontrolle), allerdings ist je nach Organ-und Zellsubstanz ein unterschied-

lich starkes Signal der Kontroll-PCR zu erwarten. Im Hinblick auf Untersuchungen von

Proben mit wenig Zellmaterial ist eine stets sichere Amplifikation des Kontrollgens

fraglich.

Zur Quantifizierung von Leishmania-Lasten in Mausexperimenten war es erforderlich,

in jeder Probe zusätzlich die Menge an muriner DNA zu messen, da diese als Bezugs-

größe zur Bestimmung der Parasitenbeladung dienen sollte. Hierzu wurde eine PCR

basierend auf dem Single-Copy-Gen Nidogen etabliert. Anhand der bekannten Kopien-

zahl (zwei pro Mauszelle) sollte so eine exakte Bestimmung der Zellzahl im murinen

Gewebe möglich sein. Auch hier war die PCR im Duplextest mit der Leishmanien-PCR

sehr gut kompatibel und zeigte ein gutes Quantifizierungspotential. Der Ablauf von

zwei PCRs in einem Ansatz (Duplex) führt nicht nur zu präziseren Ergebnissen (Weg-

fall von Schwankungen beim Pipettieren), sondern sorgt zusätzlich zu Einsparungen an

Material und Chemikalien. Zudem werden weniger Ansätze benötigt, sodass mehr Pro-

ben in einem PCR-Lauf untersucht werden können.

Zur Bestimmung der Parasitenbeladung in einer definierten Menge an Mausgewebe ist

eine absolute Quantifizierung bei jedem PCR-Lauf, und damit das Mitführen eines

Standards, erforderlich. Die Standardreihe wurde ebenfalls im Duplex angelegt und ent-

hielt sechs dekadische Verdünnungen (Leishmanien-DNA: 105-100 Plasmidkopien/µl;

genomische Maus-DNA: 102-10-3 ng/µl). Alternativ kann im real-time PCR-Verfahren

auch relativ nach der ∆CT- oder ∆ ∆CT-Methode quantifiziert werden. In diesem Fall

wird die Expression des/der untersuchten Gens/Gene auf ein nicht reguliertes House-

keeping-Gen (=endogene Kontrolle) normalisiert (∆CT-Methode) und danach ggf. auf

eine der untersuchten Proben kalibriert (∆ ∆CT-Methode) [12, 64]. Letztendlich kann

6. DISKUSSION

81

mit dieser Methode das Expressionslevel eines untersuchten Gens in verschiedenen

Proben sehr gut gegeneinander verglichen und relative Unterschiede aufgezeigt werden,

die Angabe einer absoluten Menge für das exprimierte Gen ist jedoch nicht möglich.

Genau diese Angabe war jedoch bei der Frage nach der Zahl der Leishmanien im infi-

zierten Gewebe notwendig. Aus diesem Grund kam zur Beantwortung der Fragestellung

nur eine real-time PCR mit absoluter Quantifizierung in Frage. Um die Ergebnisse ver-

schiedener PCR-Läufe vergleichbar zu machen, ist das Anlegen von Aliquots der Stan-

dardkurven-Chemikalien unbedingt erforderlich. Durch zu häufiges Auftauen und Ein-

frieren einer Stammlösung wäre nämlich ein allmählicher Verlust an DNA zu befürch-

ten, womit die Genauigkeit der Quantifizierung beeinträchtigt werden könnte.

Da die in dieser Arbeit etablierte 18S rDNA Leishmanien-PCR ein mehrfach abgesi-

chertes negatives Resultat mit humanen DNA-Proben (von Leishmania-negativen Pro-

banden) aufwies, ließe sich dieses PCR-Verfahren sehr wahrscheinlich auch recht gut in

einem Duplex-System zur Quantifizierung von Leishmanien in humanen Gewebe ein-

setzen. Die Schritte zur Etablierung und Verifizierung der Leishmania-Human-Duplex-

PCR könnten entsprechend dem hier beschriebenen Vorgehen übernommen werden.

Denkbar wäre beispielsweise ein Einsatz dieses PCR-Verfahrens bei der medikamentö-

sen Behandlung einer Leishmaniose, um die Wirksamkeit der gewählten Therapieform

sowie den zeitlichen Verlauf der Erkrankung nachzuvollziehen [116]. So konnte exemp-

larisch in einer Studie zu HIV-infizierten Patienten mit viszeraler Leishmaniose nach-

gewiesen werden, dass Rezidive assoziiert waren mit persistierend hohen Leishmanien-

DNA-Spiegeln im venösen Blut [11].

6.1.3 Vergleich zwischen konventioneller und real-time PCR

Die quantitative real-time PCR bietet gegenüber konventionellen PCR-Methoden eine

Reihe von Vorteilen: so werden in einem abgeschlossenen System (closed tube concept)

nacheinander Amplifikation, Detektion und Quantifizierung der Zielsequenz durchge-

führt. Dies sorgt für eine Verringerung des Arbeitsaufwandes; andererseits wird das

Kontaminationsrisiko [106, 110] vermindert (z.B. durch ein über den Elektrophorese-

puffer verschlepptes PCR-Produkt). Ein zusätzlicher Erregernachweis, welcher bei der

konventionellen Methode vonnöten ist (z.B. durch eine nested PCR), entfällt, da mittels

Hybridisierung der TaqMan-Sonden die Spezifität des Produktes bereits nachgewiesen

wird. Außerdem läuft die real-time PCR durch die Automatisierung um ein Vielfaches

6. DISKUSSION

82

schneller ab [30, 64]. Der Umgang mit kanzerogenen Farbstoffen wie Ethidiumbromid

fällt weg, da die Agarose-Gel-Auswertung nicht mehr nötig ist. Die Vorzüge der kon-

ventionellen PCR bleiben dennoch erhalten: beispielsweise die hohe Sensitivität oder

auch die Verwendbarkeit verschiedener Ausgangsmaterialien (Organ-oder Blutproben,

Zellkulturen usw.). Nachteilig hingegen ist der relativ hohe Preis für die benötigten re-

al-time-PCR-Geräte und Reagenzien (z.B. Sonden, PCR-Mix).

In der vorliegenden Arbeit galt es zu überprüfen, ob trotz optimierter real-time PCR-

Bedingungen die konventionelle Kinetoplasten-PCR der 18S rDNA-TaqMan PCR über-

legen sein könnte, da die nachzuweisende Sequenz der Kinetoplasten-PCR, die Mini-

circle-DNA, in viel höherer Kopienzahl vorliegt (10000-20000 [86] pro Leishmanien-

genom) als die 18S rDNA (160-200 Kopien [61, 84, 109]). Zur Untersuchung dieser

Fragestellung wurde ermittelt, bis zu welcher Verdünnungsstufe eine mit Leishmanien-

DNA versetzte Probe sicher als positiv erkannt werden konnte. Dabei zeigte sich, dass

die Kinetoplasten-PCR zwar an die Sensitivität der real-time PCR herankam, diese aber

nicht überbieten konnte. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die konventionelle PCR-

Methode der real-time PCR bei Verwendung der gleichen Zielstruktur deutlich unterle-

gen wäre. Die erhöhte Sensitivität und Spezifität bei der real-time PCR liegt unter ande-

rem darin begründet, dass neben den beiden Primern mit der Sonde noch ein zusätzli-

ches Oligonukleotid hybridisiert.

Für eine zuverlässige Quantifizierung mit der herkömmlichen PCR-Methode wäre zu-

dem ein vielfach größerer Arbeitsaufwand erforderlich [64]: so müsste von jeder Probe

eine Verdünnungsreihe hergestellt werden und diese nach dem PCR-Lauf mittels Aga-

rose-Gel-Auswertung auf das Vorliegen einer entsprechenden Bande in den jeweiligen

Verdünnungsstufen untersucht werden. All dies würde zu einem enormen Anstieg an

zeitlichem Aufwand und an Materialverbrauch führen, sodass die real-time PCR für

unsere Fragestellungen der herkömmlichen Methode in vielen Aspekten klar überlegen

ist [64].

6. DISKUSSION

83

6.2 Leishmania real-time PCR im praktischen Gebrauch für

in vitro/in vivo-Experimente

6.2.1 Anwendung der Leishmania real-time PCR bei in vitro-

Infektionsexperimenten

Nach Etablierung des Leishmanien/Maus-Duplex-PCR-Systems sollte dieses zunächst

für in vitro-Bedingungen getestet werden und mit der mikroskopischen Auswertung

nach DiffQuik®-Färbung verglichen werden. Dazu wurden murine BM-MΦ mit Leish-

manien-Promastigoten infiziert und unter Zugabe verschiedener Mengen an Immunsti-

mulanzien kultiviert, um unterschiedlich starke Abtötungen der Parasiten zu provozie-

ren. Es wurde überprüft, ob PCR-Signal und mikroskopische Auszählung bei der Quan-

tifizierung der Leishmanien miteinander korrelieren.

Die real-time PCR-basierte Methode böte gegenüber der Mikroskopie-Methode mehre-

re Vorteile: i) die Durchführung wäre schneller und weniger subjektiv durch den Expe-

rimentator beeinflussbar, ii) sie zeigt eine höhere Sensitivität [18, 83, 106, 116]. Nach-

teilig wäre hingegen, dass mittels PCR keine Bestimmung der Infektionsrate (Anteil

infizierter MΦ) möglich ist, sondern lediglich die Angabe von Promastigoten im Bezug

auf die Gesamtzahl der MΦ. Außerdem benötigt man eine höhere Anzahl an Zellen, um

ausreichend DNA für die PCR zu gewinnen. Bei Durchführung umfangreicher Experi-

mente müssten daher bei der PCR-Methode höhere Kosten für Verbrauchsmaterialien

und Chemikalien (z.B. Immunstimulanzien) einkalkuliert werden.

Zur mikroskopischen Auswertung von MΦ-Infektionsexperimenten gibt es zahlreiche

Publikationen, die der Validierung unserer Ergebnisse dienten. Der Vergleich der in

dieser Arbeit erzielten Resultate und den in der Literatur beschriebenen Daten zur mik-

roskopischen Leishmanienanalyse lieferte hierbei große Übereinstimmung. Wie publi-

ziert [8] führte die Zugabe von IFN-γ nur bei höheren Konzentrationen (20 U/ml; ent-

spricht 24 ng/ml) zu einer Senkung der Parasitenlast. In Analogie beobachteten wir bei

2 ng/ml (1,66 U/ml) nur eine minimale Reduktion der Parasitenbeladung, während die

Anzahl an intrazellulären Leishmanien bei 20 ng/ml IFN-γ (16,6 U/ml) um die Hälfte

verringert war. Durch Zugabe von IFN-γ plus TNF-α konnte die Kapazität der MΦ, in-

trazelluläre Pathogene wirksam abzutöten, wie beschrieben deutlich gesteigert werden

6. DISKUSSION

84

[8, 29, 100]. Im Gegensatz dazu stimulierte TNF allein MΦ nicht zum Abtöten von

Leishmanien [8].

Keine Übereinstimmung gab es beim Vergleich der mikroskopischen Auswertung mit

dem TaqMan-PCR Methode. Die höchsten Parasitenbeladungen wurden laut PCR in

den beiden Ansätzen gefunden, die den Literaturdaten und unserer DiffQuik®-Färbung

zufolge zur stärksten Abtötung der Promastigoten geführt hatten (Zugabe von TNF-α +

IFN-γ bzw. IFN-γ 20 ng/ml). Die niedrigsten Werte wurden im TaqMan-Verfahren für

die Proben gemessen, welche in der mikroskopischen Auswertung keinen abtötenden

Effekt erzielten (IFN-γ 2 bzw. 0,2 ng/ml) bzw. die Parasitenbeladung sogar erhöhten

(TNF-α ohne Zusatz von IFN-γ). Somit lässt sich schlussfolgern, dass die Ergebnisse

der mikroskopischen Auswertung nicht mit dem Signal der real-time PCR korrelieren.

Möglicherweise ist die Abtötung der Parasiten nach einem Zeitraum von wenigen Ta-

gen (hier: 72h) nicht detektierbar, weil die DNA abgestorbener Parasiten immer noch in

den Proben vorliegt und an die PCR-Primer bzw. Sonden bindet [12, 94]. So lieferten

beispielsweise Narbengewebe von ausgeheilter kutaner Leishmaniose in bis zu 80% ein

positives PCR-Resultat, obwohl die Erkrankung schon Jahre zurücklag und die Patien-

ten klinisch gesund waren [93]. Möglicherweise ist die freigesetzte DNA abgestorbener

Parasiten sogar besser detektierbar, da das Erbgut in den noch lebenden Organismen im

Zuge der DNA-Extraktion zu einem höheren Anteil mit dem restlichen Zellmaterial

ausgewaschen werden könnte. Dies würde auch erklären, warum die Ansätze mit der

stärksten Parasiten-Abtötung die höchsten PCR-Signale lieferten.

Um den Nachweis von Leishmania auf das Erbgut lebender Parasiten zu beschränken,

wäre es bei Experimenten dieser Art vorzuziehen, RNA anstelle von DNA zu messen

[59, 83]. Dies ist mit Hilfe der RT-(reverse transcription) real-time PCR möglich. Hier-

bei wird zunächst ein komplementärer DNA-Strang (cDNA) an die RNA synthetisiert,

welche dann als Matrize zur Amplifikation dient. Diese Methode ist zwar im Bezug auf

ihre Sensitivität der DNA-basierten real-time PCR sogar überlegen [106] und würde die

vorliegende Problematik beheben, aber sie könnte bei der Quantifizierung zu Problemen

führen, da von der vorliegenden RNA-Menge nur ungenaue Rückschlüsse auf die exak-

te Zellzahl der Parasiten erfolgen können.

6. DISKUSSION

85

In der Zusammenschau sind demnach die aktuellen PCR-Methoden und -Protokolle

keine adäquate Alternative zur herkömmlichen mikroskopischen Auswertung bei in

vitro-Pulsinfektionsexperimenten.

6.2.2 Anwendung der real-time PCR zur ex vivo-Analyse von Mausgewebe

nach Infektion mit Leishmania

Neben den in vitro-Infektionsexperimeneten mit Mφ wurde die real-time PCR zur Para-

sitenlastbestimmung auch in Leishmanien-infiziertem murinen Gewebe getestet und mit

der Standardmethode, der Limiting Dilution Analysis, verglichen. Da Infektionsverläufe

zumeist über einen längeren Zeitraum beobachtet werden, sollte eine Beeinträchtigung

der Ergebnisse durch Amplifikation von DNA abgestorbener Parasiten, die innerhalb

eines kurzen Zeitraumes akkumulieren, hier weniger zu Buche schlagen.

a. Infektion mit L. major

Nach subkutaner Infektion von L. major-Promastigoten in hoher Dosis entwickelten

suszeptible BALB/c- und resistente C57BL/6-Mäuse einen Krankheitsverlauf, der mit

Angaben in der Literatur sehr gut korrelierte. Die Fußschwellung als Parameter der lo-

kalen Infektion zeigte bei BALB/c-Mäusen beständig steigende Werte und nahm bis

zum letzten Messzeitpunkt an Tag 28 p.i. um ca. 85% zu [101, 111]. Ein Maximum der

Schwellung konnte bei C57BL/6 zwischen Tag 15 und 30 verzeichnet werden. Hier

nahm die Dicke um maximal 60% zu und sank anschließend wieder, nahezu bis auf

Ausgangswerte, ab [111, 112].

Zur Validierung der Parasitenlasten einzelner Organe wurden die Werte aus unserer LD-

Analyse zunächst mit publizierten Daten abgeglichen. Die Parasitenlast im Fuß stimmte

dabei sowohl an Tag 28 p.i. (BALB/c und C57BL/6) als auch Tag 140 p.i. (C57BL/6)

sehr gut Angaben aus der Literatur überein [20] [72]. Im poplitealen Lymphknoten und

der Milz lagen die Werte für die Parasitenbeladung im durchgeführten Experiment et-

was niedriger im Vergleich zu den veröffentlichten Ergebnissen anderer Labore (z.B.

BALB/c poplitealer Lymphknoten 4×103 nach 14 Tagen laut Literatur [111], eigenes

Experiment 102 Leishmanien/103 Zellen am Tag 28 p.i., C57BL/6 siehe [111] [112]).

Die Unterschiede zwischen unseren und Literaturdaten sind jedoch für alle Wertepaare

kleiner als zwei dekadische Potenzen und bekräftigen die Ergebnisse, nach denen für

BALB/c in allen Organen eine signifikant höhere Beladung mit Leishmanien festgestellt

6. DISKUSSION

86

wurde, während die Parasitenlast bei C57BL/6 in der Langzeitmessung auf einem nied-

rigen Niveau persistierte. Grundlegende Ergebnisse zum Mausmodell der kutanen

Leishmaniose nach L. major Infektion konnten also reproduziert werden.

Die real-time PCR-Ergebnisse zeigten eine sehr gute Übereinstimmung mit der An-

zucht-Methode, da sowohl die signifikanten Unterschiede zwischen beiden Stämmen

wie auch der zeitliche Verlauf bei C57BL/6 für alle Organe der LDA entsprachen. Le-

diglich in der Milz ergab sich nach TaqMan-Messung zum späteren Zeitpunkt ein An-

stieg, der so in der LDA nicht beobachtet wurde (Abb. 5.15). Es ist aber zu erwähnen,

dass in zwei von vier Mäusen keine Leishmanien-DNA mehr nachgewiesen werden

konnte, während in den anderen beiden Mäusen eine im Vergleich zur LD-Analyse sig-

nifikant erhöhte Leishmanienzahl detektiert wurde (maximal zwei Zehnerpotenzen Un-

terschied). Insgesamt war die Varianz zum Tag 140 p.i. in der PCR-Gruppe demnach

recht groß und es lässt sich keine abschließende eindeutige Aussage bzgl. eines Unter-

schiedes zur LD-Gruppe bilden. Hierzu wären weitere Wiederholungsexperimente nö-

tig, um die Fallzahlen zu erhöhen und so eine statistische Analyse auf eine breitere Ba-

sis zu stellen.

Unabhängig von dieser einzigen Diskrepanz lässt sich aber schlussfolgern, dass die re-

al-time PCR meist äquivalente Ergebnisse lieferte und geeignet ist, die LD-Analyse zu

ersetzen.

In einem zweiten Infektionsexperiment mit einer anderen Leishmanienspezies, L. infan-

tum, sollte überprüft werden, ob die gute Übereinstimmung beider Methoden reprodu-

zierbar ist.

b. Infektion mit L. infantum

In diesem abschließenden Versuch wurden C57BL/6- und BALB/c-Mäusen L. infan-

tum-Promastigoten eines viszerotropen Stammes [2] subkutan in beide Hinterpfoten

injiziert.

Zunächst wurde mit der Messung der Fußdicke der zeitliche Verlauf der lokalen Infek-

tion überprüft. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Kurve für C57BL/6 derjeni-

gen nach L. major-Infektion sehr ähnlich war mit einem Maximum vier Wochen nach

Infektion (Anstieg der Fußdicke um knapp 40%) und darauffolgender Abschwellung.

Bei BALB/c-Mäusen war fast gar keine Schwellung zu erkennen; die Zunahme betrug

6. DISKUSSION

87

maximal 15% nach 21 Tagen, woraufhin wieder die Ausgangswerte erreicht wurden.

Für die Parasitenlasten der untersuchten Organe wurden erneut die Ergebnisse der An-

zuchtmethode durch Abgleich mit publizierten Daten validiert, bevor sie mit TaqMan-

Messungen verglichen wurden. Für einige Werte wurde eine Einheiten-Umrechnung

vorgenommen, da sich in der Literatur meist Angaben bezogen aufs Gesamtorgan fin-

den lassen. Die Daten werden auch hinsichtlich der Injektionsarten der viszerotropen

Leishmanien (subkutan versus intravenös) diskutiert.

Leber: In unserem Experiment kam es im zeitlichen Verlauf bei beiden Stämme zu ab-

nehmenden Kurven um etwa zwei dekadische Potenzen; signifikante Unterschiede zwi-

schen C57BL/6 und BALB/c bestanden nicht.

Eine solche Abnahme der Parasitenbeladung in der Leber wurde sowohl für s.c. als auch

i.v.-Infektion mit L. infantum / L. chagasi bereits publiziert [2, 60, 76], und ist auch bei

i.v.-Infektion mit der Spezies L. donovani [27] beschrieben worden, welche ebenso eine

viszerale Verlaufsform auslöst. Für eine Infektionsdosis von 106 Parasiten sind in der

Literatur Werte um 105 Leishmanien pro Organ [2] in der frühen Infektionsphase be-

schrieben. Dies entspricht in etwa unseren Werten, ebenso wie der Abfall auf unter 104

im Verlauf [2]. In der Publikation von Oliveira et.al. [76] hingegen wurden selbst bei

höherer Infektionsdosis (107) nie Werte über 103 Parasiten ermittelt. Im Vergleich hier-

zu kommt es bei beiden Spezies nach intravenöser Infektion zu höheren Parasitenbela-

dungen gegenüber der subkutanen Infektion (bis zu 107 bei L. infantum) [2, 60, 76].

Beim zeitlichen Verlauf scheint außerdem die eingesetzte Infektionsdosis eine entschei-

dende Rolle zu spielen: so kommt es bei niedrigen Dosen (103 Leishmanien) zu einer

kontinuierlichen Abnahme der Parasitenlast; bei höheren Dosen (105) hingegen zu ei-

nem anfänglichen Anstieg auf ein Maximum um Tag 8-15 p.i. [16, 60], dem ein erneu-

ter Abfall der Parasitenbeladung folgt. Dieser sogenannte „Leberknick“ verschiebt sich

bei weiterer Dosissteigerung in der Zeitachse zunehmend nach hinten (Tag 45 p.i. bei

107 injizierten Parasiten [76]). Möglicherweise liefert eine begrenzte Kapazität des Im-

munsystems die Erklärung für dieses beobachtete Phänomen. Bereits publizierte Daten

bekräftigen unser Ergebnis, dass zwischen beiden Mausstämmen zu keinem Zeitpunkt

signifikante Differenzen ermittelt werden konnten [46].

6. DISKUSSION

88

Milz: In der Milz konnte bei beiden Mausstämmen im Infektionsverlauf eine stetige

Zunahme der Parasitenbeladung detektiert werden. Anfänglich gemessene Werte (pro g

Gewebe) lagen unter den Werten für Leber, am letzten Messzeitpunkt aber deutlich da-

rüber. Dieser grundsätzlich unterschiedliche Infektionsverlauf zwischen Leber- und

Milzgewebe wird auch in der Literatur wiederholt beschrieben, sowohl für L. infan-

tum/chagasi [2, 60, 76] als auch L. donovani, sowohl beim intravenösen wie auch sub-

kutanen Infektionsweg. Im Vergleich der absoluten Werte ist anfangs eine gute Über-

einstimmung mit Literaturdaten erkennbar (103 – 104 Parasiten/Organ nach einer Woche

[2, 76], jedoch war der Anstieg der Parasitenzahl in den hier beschriebenen Experimen-

ten rasanter (106 bis 107 Parasiten an Tag 59 im Vergleich zu 104 bis 105 [2, 76]). Die

Parasitenzahlen nach i.v.-Injektion waren im Vergleich zur durchgeführten s.c.-

Infektion in Abhängigkeit vom Zeitpunkt signifikant höher [2], gleich [60] oder leicht

erniedrigt [76]. In jedem Fall zeigten sich beim Vergleich der selbst erhobenen Daten

der s.c.-Infektion versus Literaturdaten der i.v.-Infektion mehr Unterschiede als bei der

Gegenüberstellung s.c.-Infektion eigener versus publizierter Daten.

Knochenmark: Für BALB/c war ab Tag 28 p.i. ein leichter Anstieg zu verzeichnen,

während bei C57BL/6 einem Maximum zum zweiten Messpunkt ein stetiges Absinken

der Parasitenlast folgte. Signifikante Unterschiede wurden weder im zeitlichen Verlauf

noch zwischen den beiden Stämmen gemessen. Literaturdaten zufolge kommt es zu

einem Anstieg der Parasitenlast zwischen Tag 7 und 14 p.i., auf den ein langsames Ab-

sinken folgt [16]. Diese Kurve konnten wir für C57BL/6-Mäuse gut nachvollziehen;

auch gibt es einen vergleichbaren Maximalwert von 103 Parasiten/Organ. Die Verlaufs-

kurve von BALB/c ähnelt mehr den von Oliveira et al. [76] beschriebenen Daten, wo-

nach es zu einem kontinuierlichen Anstieg der Parasitenlast kommt. Die in dieser Publi-

kation genannten Werte für L. chagasi stimmen mit unseren Angaben (zwischen 100

und 103 L./Organ) überein. Auffallend ist, dass im Knochenmark eine stets geringere

Parasitenlast als in den anderen Organen vorliegt; dies gilt sowohl für das vorliegende

Experiment als auch publizierte Daten [16, 60, 76].

Poplitealer drainierender Lymphknoten: Im gesamten Zeitraum des Experiments kam es

nur zu geringfügigen Schwankungen innerhalb einer Zehnerpotenz; ein geringes Absin-

ken der Parasitenlast (signifikant bei BALB/c) konnte an Tag 28 beobachtet werden. Es

wurden signifikant höhere Werte für BALB/c an den Tagen 118 und 174 gemessen, die

6. DISKUSSION

89

sich in absoluten Zahlen ausgedrückt aber nur auf ca. eine Zehnerpotenz bemessen. Da-

bei wurden - auf das Gesamtorgan bezogen - über den gesamten Infektionsverlauf Wer-

te zwischen 104 und 105 Leishmanien gemessen. Dies entspricht in etwa den Angaben

in der Literatur [2]. Die von Ahmed et al. publizierte Verlaufskurve für Lymphknoten

zeigt zudem den gleichen kleinen Knick nach unten etwa drei Wochen p.i., mit nachfol-

gendem Wiederanstieg auf Ausgangswerte. Für L. donovani (s.c.-Infektion) entsprach

die Verlaufskurve dem für L. infantum beschriebenen Verlauf, jedoch wurden trotz hö-

herer Infektionsdosis (5x106) um ca. zwei bis drei Zehnerpotenzen niedrigere Werte

gemessen [66].

Fuß: Hier ist eine langsame, aber signifikante Abnahme der Parasitenlast erkennbar, von

anfangs knapp 106 Parasiten/g Gewebe bis auf 104 (BALB/c) bzw. 102 (C57BL/6). Auch

in der Literatur werden sinkende Parasitenlasten für den Injektionsort bei s.c.-Infektion

beschrieben [2]; wobei der stärkste Abfall mit über 102 Parasiten/Organ schon etwas

früher (zwischen Woche 1 und 3 p.i.) als in unserem Experiment beobachtet wurde. Für

L. donovani (ebenfalls s.c.-Infektion) ist hingegen ein anfänglicher Anstieg bis Tag 14

beschrieben, auf den dann aber ein starker Abfall der Parasitenlast folgt [66]. Dabei

waren die Werte bei gleicher Infektionsdosis aber stets niedriger als nach L. infantum-

Infektion. Sowohl in unseren Beobachtungen wie auch in den publizierten Daten lässt

sich eine abnehmende Parasitenbeladung an der Injektionsstelle nach s.c.-Applikation

von Leishmania über den Verlauf der Infektion hinweg feststellen.

Zusammenfassend wurden in den hier durchgeführten Experimenten nach s.c.-Infektion

mit einer hohen Dosis von L. infantum-Promastigoten in den verschiedenen Organen für

den zeitlichen Verlauf der Parasitenlast stark voneinander abweichende Resultate er-

zielt, die den Daten aus der Literatur entsprechen [2, 76],. So stehen die sinkenden Wer-

te in Leber und Fuß im Kontrast zur Milz, in der ein stetiger Anstieg zu verzeichnen ist.

Die gleiche Dichotomie in der Parasitenbeladung zwischen den verschiedenen Organen

ist auch nach i.v.-Infektion von L. infantum oder L. donovani zu beobachten [113]. Un-

terschiede in der Immunantwort der Leber und der Milz werden als Ursache für den

differenten Verlauf diskutiert [87, 113].

Der Vergleich des generellen Krankheitsverlaufs mit dem i.v.-Infektionsweg führte zu

unterschiedlichen und sogar gegensätzlichen Beobachtungen: so wurden sowohl be-

6. DISKUSSION

90

schleunigte [51] als auch verlangsamte [76] Krankheitsverläufe in der Gegenüberstel-

lung mit der subkutanen Infektion festgestellt.

Zwischen den beiden Mausstämmen waren hingegen nur marginale Differenzen er-

kennbar, was die Daten aus der Literatur bestätigt [46, 55]. Die Tatsache, dass nach L.

infantum-Infektion bei gleicher oder sogar niedrigerer Dosis höhere Werte als für L.

donovani-Infektionen messbar waren [2, 16, 76], könnte auf das bereits bekannte,

schnellere Wachstum von L. donovani zurück zu führen sein, welches letztlich auch zu

einer beschleunigten Resolution in der Leber führt [113].

Der Verlauf der humanen viszeralen Leishmaniose entspricht einer disseminierten In-

fektion [42], welche nahezu immer letal endet. Die im Mausmodell eingesetzten Stäm-

me BALB/c und C57BL/6 spiegeln die Viszeralisation mit steigenden Parasitenbela-

dungen von Milz und Leber im Anfangsstadium der Infektion gut wider. Die Eindäm-

mung der Parasitenvermehrung und Selbst-Limitierung, die im Mausmodell z.B. in der

Leber zu beobachten ist, ist jedoch grundsätzlich verschieden vom Verlauf beim Men-

schen [55], sodass das der Verlauf der Erkrankung bei der viszeralen Leishmaniose zwi-

schen Maus und Mensch nur begrenzt vergleichbar ist.

Im Methodenvergleich zwischen LDA und TaqMan ergaben sich für die Infektionsver-

läufe in den verschiedenen Organen recht ähnliche Ergebnisse. So zeigte sich beispiels-

weise in der Milz ein Ansteigen der Werte, in den drainierenden Lymphknoten des Fu-

ßes eine konstante Parasitenlast. Einzelne Wertepaare wichen allerdings von den LD-

Resultaten ab: so zeigte sich ein Wiederanstieg in der Leber zum letzten Messzeitpunkt,

nachdem für die vorherigen Wertepaare ein Abfall erkennbar war, was wiederum den

Ergebnissen der Anzuchtmethode entsprach. Derartige Abweichungen sind aber mit

hoher Wahrscheinlichkeit auf die geringe Anzahl an Versuchstieren (zwei pro Messung)

zurückzuführen. Ein weiteres Beispiel liefern die Ergebnisse der letzten beiden Werte

für den Fuß: die wieder ansteigende Tendenz steht im Widerspruch mit dem beobachte-

ten Absinken der Parasitenlast in der LDA. Eine erhöhte Anzahl an Versuchstieren wäre

nötig, um diesen Effekt wirklich beurteilen und statistisch auswerten zu können.

Allerdings ist für alle Organe im Vergleich mit der LDA erkennbar, dass die Werte der

TaqMan-Messung gleichbleibend niedriger sind und um ca. ein bis zwei dekadische

6. DISKUSSION

91

Potenzen unter den LDA-Werten liegen. Dies steht im Kontrast zu den Ergebnissen des

vorher beschriebenen Infektionsexperiments mit L. major, wo im quantitativen Ver-

gleich der Ergebnisse diese Tendenz nicht auftrat. Der Effekt könnte demnach mit der

Leishmanienspezies zusammenhängen. Eine unterschiedliche Kopienzahl der 18S

rDNA je nach Spezies wäre durchaus denkbar. Diese Vermutung wird durch der Be-

obachtung bekräftigt, dass Probenmessungen von Leishmanienkulturen beider Spezies

(nach mikroskopischer Auszählung je 105 Parasiten/µl) in unseren Vortestungen unter-

schiedliche Quantitäten erbrachten: 1,06×107 Kopien/µl (L.m.) gegenüber 1,17×106 Ko-

pien/µl (L.i.) ergeben einen Unterschied von einer dekadischen Potenz. Bei Annahme

einer hundertprozentigen Effizienz der DNA-Aufreinigung und –Amplifikation, würde

dies Werte von 106 Kopien/Parasit für L. major, aber nur 11,7 Kopien für L. infantum

ergeben. Es bestehen also Hinweise, dass die Kopienzahl von 200 pro Organismus [61,

84, 109] in diesem Fall zu hoch gegriffen ist und nach unten korrigiert werden müsste.

Davon abgesehen bekräftigen die Ergebnisse der beiden in vivo-Experimente das große

Potential der real-time PCR-Methodik; durch weitere Entwicklung könnte hier ein der

Anzuchtmethode ebenbürtiges bzw. sogar überlegenes Verfahren etabliert werden, mit

dessen Hilfe man sehr genaue Parasitenlast-Quantifizierungen durchführen könnte. Eine

praktische Anwendung der Quantifizierung von Parasitenlasten wäre unter anderem bei

der Wirksamkeitsevaluierung verschiedener Medikamente denkbar [11]. So ist bei-

spielsweise bekannt, dass einige Leishmanienspezies auf Reservemedikamente wie Ke-

toconazol (L. mexicana) oder Fluconazol (L. major) sehr gut ansprechen [3, 74]. Der

Nachweis einer sinkenden Parasitenlast könnte bei der Erfolgsüberwachung einer sol-

chen alternativen Therapie nützlich sein, ebenso bei der Überprüfung der Wirkung neu

entwickelter Impfstoffe [106].

7. LITERATURVERZEICHNIS

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8. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

100

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS °C Grad Celsius µm Mikrometer Abb. Abbildung MΦ Makrophage bidest. zweifach destilliert MGB Minor groove binder BM- MΦ aus Knochenmark generierte µm Mikrometer Makrophagen MgCl2 Magnesiumchlorid bp Basenpaare min Minute ca. zirka Mio. Million CL Kutane Leishmaniose mRNA messenger RNA CT Schwellenwertzyklus n Nano- (Threshold Cycle) NFQ Non fluorescent quencher DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s nm Nanometer Medium ns nicht signifikant DNA Desoxyribonukleinsäure o.g. oben genannt dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate p Ergebniswahrscheinlichkeit et al. und andere Autoren PBS Phosphate buffered saline FAM Carboxyfluorescein PCR Polymerase Chain Reaction FCS Fötales Kälberserum p.i. post infectionem g Gramm pUC DNA-Größenstandard ges. gesamt rDNA ribosomale DNA ggf. gegebenenfalls rmM- Rekombinanter muriner Makropha- h Stunde CSF genkolonie-stimulierender Faktor

HIV human immunodeficiency virus Rn normalized reporter value IFN Interferon RNA Ribonukleinsäure IPC Internal positive control RPMI Kultivierungsmedium

i.v. intravenös rRNA ribosomale RNA KM Knochenmark s.c. subkutan λ Lambda SD Standardabweichung l Liter sek Sekunde L. Leishmania SSU small subunit LDA Limiting dilution Analysis TAMRA Carboxytetramethylrhodamin L.i. Leishmania infantum TE Tetramethylammoniumchlorid LK Lymphknoten TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer L.m. Leishmania major TNF Tumor-Nekrose-Faktor

log logarithmisch U/min Umdrehungen pro Minute m Milli- VIC Trichlorophenylcarboxyfluorescein M Mol VL Viszerale Leishmaniose µ Mikro- v/v Volumen-Volumen-Verhältnis

der medizinischen fakultät der friedrich-alexander ... · als dissertation genehmigt von der...

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