LUNA-GONZLEZ A. y ESTRADA U.

DEFORMACIN TRIDIMENSIONAL DE LA LEU-ENCEFALINA Y DEL RECEPTOR OPIOIDE MU AL ACOPLARSE

Facultad de Qumica Universidad de Guanajuato Col. Noria Alta s/ Tel. (473) 732-0006 ext. 8128 Fax (473) 732-0006 ext. 8108 lunag@quijote.ugto.mx

9/11/ 2007

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Deformacin Tridimensional de la Leu-encefalina y del Receptor Opioide Mu al Acoplarse Alejandro Luna-Gonzlez, Uriel Estrada. Facultad de Qumica, U. de Gto. Abstract Leu-enkephalin and Mu Opioid Receptor 3 D Deformation when Docking Introduction. The 3-D structure of Leu-enkephalin is known and the same is true for the Mu receptor, therefore docking programs allow to study this intimate relationship when they interact. The main purpose of this study was to determine which parts of the enkephalin fit the active zone of the receptor and the amino acids which configure the active cavity. Methods. Spartan-1.0.2 and Arguslab-4.0.1 molecular modeling software were used in order to determine the Leu-enkephalin basal equilibrium energy starting from its beta strand configuration form. Through an MMFF procedure followed by an semiempirical AM1 method having the enkephalin with a positive charge and a negative one at each end. Tyr 148 from the receptor was used as starting point for the docking procedure. The program oriented and fit the enkephalin in a 3D grid measuring x = 14,5 , y = 17,8 y z = 18,1 and 0,4 between each point. Results. Each amino acid of that ligand were coupled to 19 residues of the receptor. It is important to remark that the conformation of Leu-enkephalin at the lowest energy, 66.2 kcal/mol, is different to the one observed in the ligand-receptor interaction -12.6 kcal/mol. Conclusions. Differences observed in the neuropeptide conformations may be due to bending originated by the two opposite charges located at both terminal residues. When

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Leu-enkephalin is coupled to the receptor, shows a slightly more extended configuration and is located at the lower zone of the cavity likewise some antagonists do.

Resumen Introduccin Se conocen las estructuras de la Leu-encefalina y receptor Mu y los programas computarizados permiten estudiar esta relacin ntima cuando se acoplan. El objetivo principal de este estudio fue determinar cuales partes de la encefalina se acoplan con la zona activa del receptor. Tambin fue importante determinar cuales aminocidos configuran la cavidad activa del receptor. Mtodos Fue utilizado el software Spartan-1.0.2 y Arguslab-4.0.1 de modelaje molecular para determinar la energa basal de equilibrio para la Leu-encefalina a partir de su configuracin de hebra beta inicial. A travs de un procedimiento MMFF seguido del mtodo semiemprico AM1 teniendo la encefalina una carga positiva y una negativa en cada extremo. Fue utilizada la Tir 148 del receptor como sitio inicial del procedimiento de acoplamiento. El programa orient y acopl la Leu-encefalina en una zona de rejilla 3D con medidas de x=14.5 , y=14.5 y z= 18.1 de 0.4 entre cada punto. Resultados Todos los aminocidos del ligando fueron acoplados con el receptor. Es importante sealar que la conformacin de mnima energa de la Leu-encefalina, con 66.2 kcal/mol, es diferente de la observada en la interaccin ligando-receptor de -13.6 kcal/mol.Se observ la interaccin de los 5 aminocidos del ligando con 19 del receptor Mu. Conclusiones 4

Las diferencias observadas en las conformaciones del neuropptido pueden ser debido al doblez originado por las dos cargas opuestas en sus extremos. Por otro lado, cuando laLeuencefalina esta acoplada al receptor, tiene una configuracin ligeramente ms extendida y se ubica en la porcin baja de la cavidad del receptor igual que algunos antagonistas.

Introduccin El avance de los programas computarizados actuales permite visualizar las estructuras tridimensionales de los opioides y la interaccin ligando-receptor (L-R), y calcular las distancias interatmicas de esta unin molecular ntima. Estos adelantos tcnicos pueden ahora emplearse para estudiar el acoplamiento de ambas molculas y la conformacin activa del ligando. Hasta la fecha no existe informacin acerca de las estructuras de los receptores opioides con estudios de cristalografa de rayos X, razn por la cual los modelos tericos son una herramienta muy importante para estudiar y analizar la relacin estructura-funcin. El estudio continuo de dichas relaciones permite desarrollar modelos tiles ms realistas de los complejos L-R para elucidar los determinantes moleculares de la afinidad del ligando y su selectividad, para comprender el mecanismo de la funcin de agonistas y antagonistas (1). La investigacin acerca de los receptores opioides ha llevado al conocimiento amplio de los mecanismos que se ponen en marcha por la unin L-R involucrada en la analgesia. Como resultado de esto, se estima que los opioides actan modificando las permeabilidades inicas como la conductancia al potasio de las membranas nerviosas, lo cual a su vez da como resultado la hiperpolarizacin y la depresin de la excitabilidad en el sistema neuronal, y por consiguiente alteraciones en los sistemas centrales de 5

neurotransmisores

principalmente

colinrgicos,

adrenrgicos,

serotoninrgicos

y

dopaminrgicos, etc. (2,3). Los agentes que actan a nivel de los receptores opioides Mu han sido utilizados para aliviar el dolor como analgsicos, lo cual los convierte en medicamentos muy importantes para mejorar la calidad de vida de las personas. Sin embargo poseen una serie efectos secundarios o txicos importantes como son la depresin respiratoria y con el uso crnico el desarrollo de tolerancia y dependencia fsica. Las propiedades tridimensionales estructurales de los ligandos opioides peptdicos estn definidas en trminos de los ngulos de torsin Psi, Fi, Ji y Omega entre los tomos de nitrgeno, carbono de carbonilo, carbono de metino C alfa, como son mostrados en la Figura 1 y las caractersticas funcionales de la cadena lateral hidrocarbonada en la secuencia de aminocidos (4). 1. El ngulo psi es el arco medido entre los planos imaginarios al tomar como referencia los 4 tomos consecutivos del esqueleto peptdico entre los tomos de nitrgeno (Ni) a nitrgeno (Ni+1) de los residuos. 2. El Fi entre los grupos carbonilo (COi) y (COi+1). 3. El omega de carbono Alfa (CAlfa) a carbono Alfa (C Alfa+1). 4. El Ji del carbonilo (COi)

a carbono Beta (CBeta). Cada uno de los ocho planos que forman los cuatro ngulos diedros, tambin denominados de torsin, son construidos con tres tomos consecutivos de la cadena y el ngulo corresponde al formado entre las dos superficies producidas al colocar el enlace de la porcin media en la lnea de interseccin comn a ambos y cada uno de los dos tomos restantes en la porcin media paralela opuesta (Figura 1).

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Figura 1 ngulo de torsin Psi en un pptido. Ntese que para los dems ngulos los tomos estn de acuerdo a lo explicado en el prrafo anterior. Para los pptidos un giro Beta se caracteriza por cuatro residuos consecutivos de aminocidos, llamados i, i+1, i+2, i+3, si la distancia entre el tomo de carbono Alfa del residuo i y el i+3 es menor de 7 y si los dos residuos centrales no son helicoidales o son rompedores de hlice. Cada tipo de giro es clasificado de acuerdo a los ngulos Fi y Psi. El Cuadro I muestra los valores comparativos ideales para los giros Beta tipo I y II (5). Los giros Beta tipo II tienen una mayor preferencia (76%) para ubicar los residuos de glicina y D-aminocidos en la posicin i+1 debido a una menor interferencia estrica (6). Cuadro I ngulos de torsin ideales para los pptidos con un giro Beta Giro Beta Tipo I Tipo II Tipo IIFii+1

- 60 30 - 60 30 60 30

Psii+1 - 30 30 120 30 - 120 30

Fii+2

- 90 30 90 30 - 80 30

Psii+2 0 30 0 30 60 30

La Leu-encefalina tiene afinidad por el receptor opioide Mu considerado mediador de los efectos analgsicos de casi todos los opioides (7). El receptor Mu es uno de los 7

cuatro tipos de receptores identificados en base a sus propiedades farmacolgicas (Mu, Kapa, Delta, Sigma), los primeros tres han sido clonados exitosamente y no hay datos suficientes para los receptores aunque si las referencias para su actividad farmacolgica. Adems el Mu es clasificado dentro de la superfamilia de receptores acoplados a protena G (GPCRs) y especficamente al subgrupo de la rodopsina, a esa clase pertenecen cerca del 90% de los GPCRs. Estos receptores tienen varios centenares de protenas integrales que transducen seales luminosas o qumicas a travs de la membrana celular y comparten una estructura tridimensional comn. Poseen una forma heptahelicoidal de dominio transmembranal demostrada mediante su estudio por tcnicas de criomicroscopia electrnica (EM) de baja resolucin de 6 a 9 en rodopsina bovina, de rana y calamar. En la Figura 2 se representa la estructura completa del receptor opioide Mu. Estas macromolculas estructural y evolutivamente son las mejor conservadas, involucradas virtualmente en muchos procesos fisiolgicos. Son clasificadas de varias formas: la ms antigua integra los grupos de a) rodopsina/Beta-adrenrgicos, b) secretina/pptido vasointestinal (VIP) con un 25-50% de homologa con la rodopsina y c) la familia de receptores metabotrpicos de glutamato (mGLU) (8). nicamente est disponible la estructura cristalina del receptor de luz rodopsina, solubilizada con detergentes. Los resultados de clonacin, estudios de homologa y el anlisis de hidropata de las secuencias de aminocidos indican la presencia de siete dominios transmembranales (TMDs) separados por asas intra y extracelulares, caractersticas de los GPCRs (9). Algunos modelos han sido construidos en base a los mapas EM de baja resolucin de la rodopsina y unos cuantos mediante limitaciones derivadas experimentalmente para empacar juntas las siete hlices ideales con conformaciones arbitrarias de las cadenas laterales (10). La mayora de los modelos 8

considera la ubicacin del sitio activo de los ligandos opioides en el interior del cmulo de las hlices, aunque una porcin muy importante del receptor se localiza en la zona externa de la membrana (11). El siguiente dibujo muestra un corte longitudinal de la secuencia del receptor Mu.

Figura 2. Representacin de la secuencia de la estructura del receptor opioide Mu.

Las lneas slidas negras representan los lmites aproximados externo e interno de la membrana celular. Los crculos negros representan la ubicacin de los residuos de aminocidos conservados en la superfamilia de los receptores aminrgicos. Los crculos grises indican los residuos conservados entre los receptores Mu, Delta y Kapa. Las hlices transmembranales estn designadas con nmeros romanos. Los nmeros arbigos designan la posicin de los residuos en el dominio transmembranal. Los nmeros de los residuos en itlicas sealan la secuencia de la cadena peptdica total, e indican el sitio y trmino del residuo en el presente modelo de receptor. Adems se muestran los sitios de glicosilacin 9

en la porcin N-inicial y palmoilacin en la seccin del carboxilo terminal. IL = asa intracelular; EL = asa extracelular (12). El receptor opioide Mu es uno de los blancos biomacromoleculares de 410 residuos de aminocidos para la accin de algunos agentes analgsicos de tipo morfinoide. Consiste en una protena integral que transduce las seales qumicas a travs de la membrana celular y comparte una estructura tridimensional en comn con la superfamilia de GPCRs. Posee siete dominios transmembranales (I, II, III, IV, V, VI, VII) con 25, 25, 24, 25, 25, 25 y 22 residuos de aminocidos respectivamente, adems de tres asas extracelulares EL-I, EL-II, EL-III de las cuales las dos primeras estn unidas por un puente disulfuro entre los residuos Cis 140 y Cis 217, la porcin de la cadena inicial que contiene el grupo amino est ubicada extracelularmente e integrada por 168 residuos. En el interior de la clula se encuentran tres asas IL-I, IL-II, IL-III y la cadena que contiene el carboxilo terminal. Este modelo de receptor Mu presenta en su estructura superficial una gran cavidad profunda ubicada en la porcin extracelular de los dominios transmembranales entre las hlices III, IV, V, VI y VII. Esta cavidad est parcialmente cubierta por las asas extracelulares.

Objetivos Estudiar las caractersticas estructurales de la conformacin activa de la Leu-encefalina al interactuar con el receptor opioide Mu y averiguar cuales son los residuos de la zona activa donde se lleva a cabo el acoplamiento del opioide.

Mtodos

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Se usaron los programas de modelaje molecular Spartan 1.0.2 y Arguslab 4.0.1 para calcular las geometras de equilibrio en estado basal de la Leu-encefalina mediante un procedimiento inicial de mecnica molecular de campos de fuerza (MMFF), seguido del clculo por el mtodo semiemprico Austin 1 (AM1) con una carga positiva y otra negativa en sus extremos. Se seleccion la cavidad activa del modelo de receptor opioide Mu humano, propuesto por Pogozheva (13), con los residuos involucrados en la interaccin LR. Mediante el algoritmo de ajuste y bsqueda exhaustiva Argusdock, el programa orient y acomod la Leu-encefalina, de forma flexible con libre giro en sus enlaces diferentes al grupo peptdico, con el receptor en 500 ensayos sucesivos. Para los clculos eligi por omisin una zona de clculo con dimensiones de x = 14.5 , y = 17.8 , z = 18.1 y una rejilla de cuadrcula tridimensional con 0.4 de separacin (14,15). Fue calculada la diferencia de energa libre de la interaccin de tipo van der Waals mediante el programa en lnea de anlisis energtico de sistemas receptor ligando Program of Energetics Analysis of Receptor Ligand System PEARLS la cual result de -2.8 kcal/mol (16). Adicionalmente, para esclarecer la funcin del hidroxilo de la tirosina 1, ya que puede ser aceptor o donador de puente de hidrgeno, este grupo se sustituy por un tomo de flor, al compuesto resultante se le denomin Leu-encefalina-F y fue acoplada con el receptor opioide Mu para observar que tan significativa es la diferencia de energa libre. Resultados La Leu-encefalina adopt una conformacin doblada en la porcin media del opioide para interactuar con el receptor Mu, acercando sus grupos aromticos hasta una distancia de 4.3 pero sin tocarse y los ubic orientados de forma casi perpendicular con la diferencia de

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energa libre ms favorable de -13.6 kcal/mol. El residuo de tirosina present el ngulo Ji de 59.1, la fenilalanina de 118.4 y de 66.4 la leucina. Los grupos funcionales del posible patrn farmacofrico del receptor opioide Mu mostraron las distancias de 6.4 entre el hidroxilo de la tirosina y el grupo amonio; 4.2 entre el hidroxilo de la tirosina y el grupo aromtico del residuo de la fenilalanina. El ordenamiento puede ser representado con un mnimo de tres puntos ubicados en los centroides de los grupos hidroxilo de la tirosina y fenilalanina; y el tercero en el amino de la tirosina (17,18). En el cuadro siguiente se muestran las caractersticas de los ngulos conformacionales.

Cuadro II. ngulos de torsin de la Leu-encefalina. Aminocido Tir 1 Gli 2 Gli 3 Fen 4 Leu 5 Conformacin de mnima energa Psi o Fi o 65.2 106.2 74.9 -74.7 164.71 -66.5 -156.1 58.1 Conformacin activa Psi o Fi o 64.5 3.1 121 120.2 60.5 114.7 119.6 58.4 -

La Leu-encefalina tiene en su posicin i+1 un residuo de glicina de tal forma que es de esperarse una fuerte preferencia para un giro Beta tipo II. Debido a que la distancia con el carbono Alfa del residuo i+3 es mayor a 7 muy probablemente la conformacin no es de tipo Beta ideal, situacin que tampoco se presenta en muchas protenas. La distancia entre los dos carbonos Alfa para un giro 41 Beta result de 12.9 y difiere de una conformacin de giro Beta ideal. Sin embargo medida a

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partir de la glicina 2 para un 25 Beta se observ una distancia de 7.7 ms cercana a la tpica. El anillo aromtico de la tirosina de la Leu-encefalina presenta contacto a distancia de puente de hidrgeno 3.1 con las cadenas laterales de Tir 148 y Met 151 de la hlice III, adems con Ile 322 de la hlice VII y las cadenas de Fen 237 y Trp 293, estos dos ltimos ubicados a mayor profundidad en la cavidad al igual que las anteriores presentan una interaccin de tipo hidrofbica. La Tir 1 presenta la formacin de un puente de hidrgeno a la distancia de 3.5 entre su grupo hidroxilo y el de la Tir 326. Los grupos metilo del residuo de la leucina terminal del neuropptido muestran contactos hidrofbicos con 4 aminocidos del receptor opioide Mu, Asp 216, Glu 212, Ile 215 y Lis 141. La interaccin con ms contribucin al acoplamiento en este grupo es de tipo hidrofbica con la cadena lateral de Ile 215. Al acoplar Leu-encefalina-F con el receptor Mu no disminuy notablemente la afinidad por el receptor, la diferencia de energa libre fue del mismo orden de magnitud como puede observarse en el Cuadro III. Cuadro III. Diferencias de energa libre. Ligando Leu-encefalina Leu-encefalina-F Blanco Receptor Mu Receptor Mu Energa kcal/mol -13.6 -13.4

Las principales cadenas laterales de aminocidos del receptor involucrados en la interaccin L-R fueron Asp 147, Tir 148, Met 151, Asn 230, Trp 293, His 297, Trp 318, Ile 13

322 y Tir 326. La diferencia de energa libre para la interaccin de van der Waals result de -2.8 kcal/mol. En el Cuadro IV son presentados los residuos del receptor opioide Mu que interactan con el ligando. Cuadro IV Aminocidos del receptor Mu que interactan con la Leu-encefalina. Aminocido H-II Tir 1 H-III Asp 147 Tir 148, Met 151 H-V Lis 233 Fen 237 H-VI Trp 293 H-VII Ile 322 Tir 326 EL-II

Gli 2

Asn 230 Lis 233 Ile 234 Tir 148 Gln 124 Ile 144 Asp 147 Tir 148 Lis 141 Asn 230 Lis 233

Val 300

Trp 318

Gli 3 Fen 4

Trp 318 Trp 318 Ile 322 Glu 212 Ile 215 Asp 216

Leu 5

Discusin Es necesario sealar que la Leu-encefalina tiene al menos tres conformaciones distintas las cuales deben tenerse en cuenta. Primera, la obtenida de su estado cristalino por rayos X, en donde la cadena peptdica se observa totalmente extendida (19). Segunda, la correspondiente a la conformacin de mnima energa en estado aislado, la cual presenta un doblez en la porcin media correspondiente a las glicinas 2 y 3, con la aproximacin de sus

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extremos con las cargas opuestas correspondientes a los grupos amonio y carboxilo respectivamente. Tercera, la conformacin denominada activa, resultante del acoplamiento del ligando con el receptor y diferente de las anteriores por estar an ms doblada porque se aproximan sus grupos aromticos, observada en los resultados de este estudio. A priori fue considerada improbable una conformacin activa de acoplamiento con el receptor diferente a la de mnima energa calculada o de la estructura cristalina obtenida por cristalografa de rayos X. En el presente informe resulta evidente su diferencia mediante la observacin directa de la representacin de la estructura de la Leu-encefalina en su conformacin activa acoplada al receptor. En virtud de las caractersticas del software utilizado para realizar el acoplamiento, los residuos y el esqueleto hidrocarbonado del receptor permanecen fijos. La nica molcula que sufre cambios conformacionales durante el procedimiento es el ligando. Sin embargo, se supone que las variaciones ocurren tambin en los residuos del sitio activo del receptor para transducir la seal y producir el efecto biolgico. Las caractersticas en los residuos de los aminocidos tirosina, fenilalanina y leucina de la Leu-encefalina sugieren la conformacin de tipo Beta, ya sea fuerte o inicial en la estructura secundaria del opioide. Adems, la presencia de la secuencia Gli-Gli le confiere la propiedad estructural de permitir un mayor doblez debido a la ausencia de grupos voluminosos. Precisamente por la presencia intermedia en la estructura de los residuos de glicina en las posiciones 2 y 3 con caractersticas fuertes de romper la hlice Alfa (5). Adems, ubic el grupo alquilo de la Leu 5 en la parte exterior alejado de los anillos aromticos. Tambin se mantienen separadas espacialmente las cadenas laterales del residuo aliftico de los anillos aromticos del ligando (20). El doblez del ligando presenta una apariencia intermedia entre los giros Beta tipo II y II. Se observa una mayor similitud 15

al giro 25 Beta tipo II. Parecida al 25 Beta referida en resultados experimentales con micelas acuosas de dodecilsulfato de sodio estudiadas por RMN. Diferente a la obtenida utilizando disolventes orgnicos y mezclas crioprotectivas que sugieren un giro 41 Beta en disolucin (21,22). Estos resultados de la interaccin de la Leu-encefalina con el receptor apoyan la propuesta de algunos autores al sugerir que el aminocido Asp 147 no interacta electrostticamente con el grupo amino libre formando un par inico, sino ms bien con el OH de la tirosina. Tal situacin tiene el respaldo experimental de los resultados de mutaciones en Asp 147 del receptor Mu opioide que no afectan notablemente la afinidad de diprenorfina o naloxona (10). Para la Leu-encefalina, a partir de nuestros resultados computacionales, se observ que la porcin aromtica de la tirosina del pptido opioide interactu con los residuos conservados en la base de la cavidad ubicada entre las hlices III y V. El grupo hidroxilo de la tirosina y su amonio libre presentan interacciones con residuos de la hlice III, ubicado en el tercio externo de la porcin transmembranal de la cadena helicoidal y la lisina Lis 233 de la hlice V. La distancia entre estos dos grupos del ligando, considerados puntos importantes farmacofricos, fue de 6.4 en la conformacin activa. En comparacin con los ligandos tpicos como la morfina result menor a la calculada entre el grupo amino y el hidroxilo aromtico de la morfina de 7.1 y diferente de la conformacin de mnima energa calculada. Adems es importante considerar la posibilidad de un cierto grado de tolerancia estructural en la cavidad activa del receptor opioide. La cual permite la interaccin con una gran variedad de agentes opioides y opiceos con diversas conformaciones y propiedades estructurales (23,24). Informado en estudios con alcaloides pequeos, como la morfina que 16

pueden ser acoplados con varias posiciones alternativas en la cavidad activa, donde todas las opciones proporcionan contactos entre el N+ y Asp 147 (Asp II:7) y permiten la formacin de puentes de hidrgeno entre el ligando y los grupos polares (10). Al realizar la sustitucin del hidroxilo de la tirosina del ligando por un tomo de flor y su acoplamiento con el receptor opioide Mu fue observado un cambio mnimo en la diferencia de energa libre. Resultado compatible con la idea de que existe una interaccin importante con el grupo His 297 (His VI:20), probablemente de puente de hidrgeno con N1. Aunque nosotros no observamos dicha interaccin con His 297 sino ms bien con Tir 148 (Tir III:8) como ocurre con algunos derivados de morfina sustituidos con grupos voluminosos y considerados de propiedades antagonistas, los cuales se ubican en la porcin espacial baja de la cavidad del receptor (13).

Conclusiones 1. La Leu-encefalina al acoplarse al receptor Mu adopt una conformacin activa doblada formando un giro en el cual aproxim los grupos aromticos de los residuos Tir 1 y Fen 4 a una distancia de 4.3 . El pentapptido es estructuralmente flexible y puede adoptar un gran nmero de conformaciones diferentes debido a sus enlaces con libre giro. 2. El ligando mostr interaccin con 19 residuos del receptor: Ile 144, Asp 147, Tir 148, Met 151, Fen 152, Glu 212, Ser 214, Ile 215, Asn 230, Lis 233, Ile 234, Fen 237, Trp 293, His 297, Glu 299, Val 300, Trp 318, Ile 322, Tir 326 localizados en la mayor cavidad del receptor. Es favorecido el proceso de acoplamiento donde el hidroxilo de la Tir 1 del ligando interacta con la Tir 148 y la formacin del puente de hidrgeno con el hidroxilo de la Tir 326. Debido a la interaccin con His 297 y con los residuos de aminocidos Fen 152

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y Fen 237; ubicados estos dos ltimos en la zona ms profunda de la cavidad, se sugiere que su comportamiento es parecido al de un antagonista Mu. 3. Los resultados apoyan la idea de la existencia de un patrn farmacofrico con cierto grado de versatilidad en la ubicacin espacial de los grupos importantes amonio, aromtico e hidroxilo de agonistas y antagonistas Mu al acoplarse.

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