de cobre (cu) y cinc (zn)
TRANSCRIPT
0
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN LETAL MEDIA (CL50-96) DE COBRE (Cu) Y CINC (Zn) MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLGICAS
(BIOENSAYOS), UTILIZANDO ALEVINOS DE ONCORHYNCHUS MYKISS (TRUCHA ARCO IRIS).
JUAN GUILLERMO BARRETO SOLANO
GUILLERMO ANDRES PERALTA PEREZ
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL & SANITARIA
BOGOT D. C.
2009
1
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN LETAL MEDIA (CL50-96) DE COBRE (Cu) Y CINC (Zn) MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLGICAS
(BIOENSAYOS), UTILIZANDO ALEVINOS DE ONCORHYNCHUS MYKISS (TRUCHA ARCO IRIS).
JUAN GUILLERMO BARRETO SOLANO
GUILLERMO ANDRES PERALTA PEREZ
TESIS DE GRADO PARA OPTAR AL TTULO DE INGENIERO AMBIENTAL Y SANITARIO
Director PEDRO MIGUEL ESCOBAR MALAVER
QUMICO INDUSTRIAL LIC. QUMICA Y BIOLOGA
Msc ALTA GESTIN AMBIENTAL
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL & SANITARIA
BOGOT D. C.
2009
2
Nota de aceptacin
-----------------------------------------
-----------------------------------------
-----------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------------
Director
-----------------------------------------------------------------------------------
Jurado 1
----------------------------------------------------------------------------------
Jurado 2
Bogot D. C. 7 de Septiembre de 2009
3
DEDICATORIA
A mi abuela Laura Montoya que desde el cielo nos cuida,
Muchas gracias por su cario y por su apoyo infinito
A mi mama Patricia Solano,
Que junto con mi abuela pese a las dificultades pudieron sacarnos adelante
A mi hermano Jos Alejandro Barreto,
Quien con su ejemplo fue una inspiracin en mi vida
A mi papa Alfredo Barreto,
Gracias por su apoyo moral
A mis amigos y amigas,
A todas las personas que han credo en m.
Muchas gracias a todos
Por su apoyo,
Por haberme dado la fortaleza en la consecucin de este gran logro .
JUAN
4
DEDICATORIA
Aunque este trabajo de grado apenas sea un objetivo ms; representa un
gran logro para mi formacin personal y profesional que es el ttulo.
Y por eso esta dedicatoria es por el conjunto de logros que representa.
A mi madre por su apoyo incondicional.
A mi Padre por animarme y apoyarme.
Margariteichon para que pueda respirar tranquila.
Mis hermanos MLU, CPP y Jose
A todas aquellas personas que confan, creen, me respetan, aprecian,
etc. a MI Persona.
Gracias a todos
GUILLERMO ANDRES
5
AGRADECIMIENTOS
A la comunidad del laboratorio de Ingeniera Ambiental y Sanitaria la cual nos ayud en el proceso de desarrollo de los bioensayos y las otras actividades que sin ser estrictamente de bioensayos fueron vitales para continuar durante la investigacin.
Al profesor Pedro Miguel Escobar Malaver director del proyecto quien nos apoy en el desarrollo de las pruebas y consecucin de los objetivos del proyecto con su amplio conocimiento en el tema de bioensayos.
A nuestras Madres y familiares que nos brindaron su apoyo incondicional en el proceso de conseguir el ttulo como ingenieros ambientales y sanitarios.
A nuestros compaeros quienes nos apoyaron, motivaron y colaboraron para obtener el fin.
A la comunidad lasallista por brindarnos las herramientas necesarias para desarrollar nuestro potencial humano y profesional.
A la empresa de cincado por explicarnos los procesos que desarrollaban, colaborarnos permitindonos ingresar en su espacio de trabajo y realizar la toma de muestras de las aguas residuales que fueron parte fundamental del proyecto.
i
CONTENIDO
pg.
INTRODUCCIN
1 OBJETIVOS4
2 JUSTIFICACIN5
3 MARCO TERICO.7
3.1 TRUCHA ARCO IRIS........................................................................ 7
3.1.1 ANATOMO-FISIOLOGA ............................................................ 8
3.1.2 ECOLOGA DE LA TRUCHA ................................................... 10
3.1.3 DESARROLLO DE LA TRUCHA ARCOIRIS ........................... 10
3.1.4 DISTRIBUCIN........................................................................ 11
3.1.5 ALIMENTACIN DE LA TRUCHA ARCO IRIS ....................... 11
3.1.6 COMPORTAMIENTO (etologa)............................................... 12
3.1.7 TOLERANCIA DE LA TRUCHA ARCO IRIS A LAS
DIFERENTES VARIABLES AMBIENTALES ......................................... 12
3.1.8 CRITERIOS DE SELECCIN DEL ORGANISMO DE PRUEBA
15
3.1.9 FUENTES DE OBTENCIN Y ESTUDIO DE LA TRUCHA
COMO ORGANISMO DE PRUEBA ...................................................... 17
3.2 BIOENSAYO ................................................................................... 17
3.2.1 TIPOS DE BIOENSAYO .......................................................... 17
3.2.2 TOXICIDAD .............................................................................. 18
3.2.3 PRUEBAS DE TOXICIDAD ...................................................... 19
3.2.4 TXICOS DE REFERENCIA ................................................... 20
3.2.5 CARTAS DE CONTROL DE CALIDAD .................................... 21
3.2.6 PREPARACIN DE SOLUCIONES DE CONTROL ................ 22
3.2.7 REPLICABILIDAD Y SENSIBILIDAD ....................................... 23
3.2.8 MTODOS ESTADSTICOS PARA EL ANLISIS DE
RESULTADOS DE PRUEBAS DE TOXICIDAD .................................... 24
3.2.9 ANLISIS DE REGRESIN Y ANLISIS PROBIT .................. 25
ii
3.3 METALES ....................................................................................... 27
3.3.2 METALES DE PRUEBA ........................................................... 29
3.3.3 COBRE .................................................................................... 29
3.3.4 CINC ........................................................................................ 33
3.4 GALVANOTECNIA ......................................................................... 37
3.4.1 Generalidades .......................................................................... 37
3.4.2 El Proceso Galvnico ............................................................... 37
3.4.3 Proceso de Galvanoplastia ...................................................... 38
3.4.4 Proceso de galvanostegia ........................................................ 39
3.4.5 CINCADO ................................................................................. 41
4 METODOLOGA...44
4.1 FASE I. DISEO EXPERIMENTAL ................................................ 44
4.2 FASE II. ACONDICIONAMIENTO .................................................. 44
4.2.1 RECINTO EXPERIMENTAL .................................................... 44
4.2.2 ADAPTACIN, ACLIMATACIN Y MANTENIMIENTO DE LOS
ACUARIOS ............................................................................................ 45
4.2.3 ORGANISMO DE PRUEBA (ADQUISICIN Y TRANSPORTE)
46
4.2.4 ACLIMATACIN DEL ORGANISMO DE PRUEBA .................. 47
4.2.5 ALIMENTACIN DEL ORGANISMO DE PRUEBA .................. 48
4.2.6 PREPARACIN DEL AGUA PARA LAS PRUEBAS
TOXICOLGICAS ................................................................................. 48
4.3 FASE III. PRUEBAS TOXICOLGICAS ......................................... 49
4.3.1 Montaje de las pruebas toxicolgicas ....................................... 50
4.3.2 Pruebas de sensibilidad ........................................................... 51
4.3.3 Pruebas preliminares y definitivas para cobre (Cu) utilizando
CuSO45H2O ......................................................................................... 51
soluciones de 100 ppm, 10 ppm y 1 ppm. Para la preparacin de las
distintas concentraciones que se requeran se usaron estas diluciones.
.............................................................................................................. 51
4.3.4 Pruebas preliminares y definitivas para cobre (Cu) utilizando
CuSO45H2O ......................................................................................... 51
4.3.5 Pruebas preliminares y pruebas definitivas para cinc (Zn)
utilizando ZnCl2 ..................................................................................... 51
iii
4.3.6 PRUEBAS DE TOXICIDAD EN LA INDUSTRIA ...................... 53
4.3.7 ANLISIS ESTADSTICOS ...................................................... 53
5 INDUSTRIA EVALUADA.56
6 RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS DE TOXICIDAD..56
6.1 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ....................................................... 57
6.1.1 Anlisis de varianza para las pruebas de sensibilidad de
K2Cr2O7. ................................................................................................ 57
6.1.2 Anlisis Probit para las pruebas de Sensibilidad con K2Cr2O7 59
6.2 PRUEBAS PRELIMINARES Y DEFINITIVAS PARA Cobre (Cu) a
partir de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO45H2O) ......................... 61
6.2.1 Anlisis de varianza para las pruebas de toxicidad de Cu ....... 62
6.2.2 Anlisis Probit para las pruebas de toxicidad de Cu. .............. 63
6.3 PRUEBAS PRELIMINARES Y PRUEBAS DEFINITIVAS PARA
CINC (Zn) A PARTIR DE (ZnCl2). ............................................................. 67
6.3.1 Anlisis de varianza para las pruebas de toxicidad de Zn ........ 67
6.4 PRUEBAS PRELIMINARES Y DEFINITIVAS DEL VERTIMIENTO
CRUDO DEL PROCESO DE CINCADO .................................................. 72
6.4.1 Anlisis de varianza para las pruebas de toxicidad con el
Vertimiento Crudo. ................................................................................ 73
6.4.2 Anlisis Probit para las pruebas de toxicidad de Vertimiento
Crudo 74
6.5 PRUEBAS PRELIMINARES Y DEFINITIVAS DEL VERTIMIENTO
TRATADO ................................................................................................ 77
6.5.1 Anlisis de varianza para las pruebas de toxicidad con el
Vertimiento Tratado. .............................................................................. 78
6.6 Anlisis Fsico-Qumicos del Vertimiento crudo y tratado. .............. 79
6.7 Obtencin de la carga txica e ndice toxicolgico del Vertimiento
Crudo. ....................................................................................................... 79
6.8 Obtencin de la carga txica e ndice toxicolgico del vertimiento
tratado. ..................................................................................................... 80
7 SELECCIN DE LA ALTERNATIVA DE TRATAMIENTO PARA EL
VERTIMIENTO DE LA INDUSTRIA DE CINCADO..82
7.1 TEST DE JARRAS ......................................................................... 86
7.2 DISEO DEL TRATAMIENTO PILOTO ......................................... 88
CRITERIOS DE DISEO ......................................................................... 88
iv
8 CONCLUSIONES.92
9 RECOMENDACIONES...94
10 BIBLIOGRAFA...96
ANEXOS.102
ANEXO A PROTOCOLO DE LABORATORIO ANLISIS PROBIT ........ 103
ANEXO B. PROTOCOLO LABORATORIO ANLISIS VARIANZA ........ 124
ANEXO C. PRUEBAS DE TOXICIDAD CON DICROMATO DE POTASIO
(K2Cr2O7) ................................................................................................ 132
ANEXO D. PRUEBAS DE TOXICIDAD CON COBRE (Cu) UTILIZANDO
SULFATO DE COBRE PENTAHIDRATADO (CuSO45H2O) ................ 153
ANEXO E. PRUEBAS DE TOXICIDAD CON CLORURO DE CINC (ZnCl2)
............................................................................................................... 166
ANEXO F. PRUEBAS DE TOXICIDAD CON EL VERTIMIENTO CRUDO
............................................................................................................... 180
ANEXO G. PRUEBAS DE TOXICIDAD CON EL VERTIMIENTO
TRATADO .............................................................................................. 189
ANEXO H. REGISTRO FOTOGRFICO ................................................ 195
ANEXO I. FACTURA DE COMPRA DE ALEVINOS DE TRUCHA ARCO
IRIS ......................................................................................................... 202
ANEXO J. CARACTERIZACIONES DE Cu Y Zn ANALIZADAS POR EL
LABORATORIO IVONNE BERNIER ...................................................... 205
ANEXO K. SEGMENTACIN DE EL VERTIMIENTO EN COBRE (Cu) Y
CINC (Zn) ............................................................................................... 208
ANEXO L. PLANO DEL DISEO PILOTO DE TRATAMIENTO ............. 211
ANEXO M. ALGUNOS RESULTADOS CL50-96 ....................................... 213
POR EL MTODO PROBIT. .................................................................. 213
ANEXO N. DISEO CAJA DE MEZCLA RAPIDA. ................................. 217
ANEXO O. HOJAS DE REGISTRO DE DATOS .................................... 220
v
LISTA DE ANEXOS
....................................................................................................................... pag.
ANEXOS ......................................................................................................... 102
ANEXO A PROTOCOLO DE LABORATORIO ANLISIS PROBIT ............. 103
ANEXO B. PROTOCOLO LABORATORIO ANLISIS VARIANZA ............. 124
ANEXO C. PRUEBAS DE TOXICIDAD CON DICROMATO DE POTASIO (K2Cr2O7) ..................................................................................................... 132
ANEXO D. PRUEBAS DE TOXICIDAD CON SULFATO DE COBRE PENTAHIDRATADO (CuSO45H2O) .......................................................... 153
ANEXO E. PRUEBAS DE TOXICIDAD CON CLORURO DE CINC (ZnCl2) 166
ANEXO F. PRUEBAS DE TOXICIDAD CON EL VERTIMIENTO CRUDO .. 180
ANEXO G. PRUEBAS DE TOXICIDAD CON EL VERTIMIENTO TRATADO ................................................................................................... 189
ANEXO H. REGISTRO FOTOGRFICO ..................................................... 195
ANEXO I. FACTURA DE COMPRA DE ALEVINOS DE TRUCHA ARCO IRIS .............................................................................................................. 202
ANEXO J. CARACTERIZACIONES DE Cu Y Zn ANALIZADAS POR EL LABORATORIO IVONNE BERNIER ........................................................... 205
ANEXO K. SEGMENTACIN DE EL VERTIMIENTO EN COBRE (Cu) Y CINC (Zn) .................................................................................................... 208
ANEXO L. PLANO DEL DISEO PILOTO DE TRATAMIENTO .................. 211
ANEXO M. ALGUNOS RESULTADOS CL50-96 ............................................ 213
POR EL MTODO PROBIT. ....................................................................... 213
ANEXO N. DISEO CAJA DE MEZCLA RAPIDA. ...................................... 217
ANEXO O. HOJAS DE REGISTRO DE DATOS ......................................... 220
vi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 . Comparacin de algunos de los requerimientos para el crecimiento
y supervivencia de la trucha como sealan algunos autores. ...................... 16
Tabla 2. Algunas particularidades de los tipos de recubrimientos galvnicos
ms comunes. .............................................................................................. 39
Tabla 3. Procesos de la galvanoplastia ....................................................... 40
Tabla 4. Composicin nutricional del alimento Nutripez en Hojuelas ........... 48
Tabla 5. Modelo utilizado en las cartas de control de los bieonsayos. ......... 52
Tabla 6. Caractersticas de las unidades de tratamiento de la empresa de
cincado. ....................................................................................................... 55
Tabla 7. Resultados de una de las pruebas definitivas con lectura a las 96
horas del Dicromato de Potasio (K2Cr2O7). .................................................. 57
Tabla 8. F calculado vs. F terico para las pruebas definitivas de sensibilidad
con K2Cr2O7. +/- 0.1 ..................................................................................... 58
Tabla 9. Carta de control de sensibilidad de K2Cr2O7. +/- 0.1 ...................... 59
Tabla 10. Diferentes valores de sensibilidad de K2Cr2O7 de estudios
nacionales e internacionales en trucha arcoiris. .......................................... 61
Tabla 11. Resultados de las pruebas preliminares tomadas a las 96 h para
cobre (Cu). ................................................................................................... 62
Tabla 12. Resultados de una de las pruebas definitivas tomadas a las 96 h
para Cu. ....................................................................................................... 62
Tabla 13. F calculado vs. F terico para las pruebas definitivas con Cu. .... 63
Tabla 14. Carta de control para la prueba de toxicidad de Cu. .................... 64
Tabla 15. Diferentes valores de pruebas de toxicidad internacionales con
cobre (Cu) en trucha arcoris. ...................................................................... 66
Tabla 16. Comparacin con la legislacin ................................................... 66
Tabla 17. Resultados de una de las pruebas preliminares de toxicidad de
cinc (Zn). ...................................................................................................... 67
Tabla 18. Resultados de una de las pruebas definitivas de toxicidad de cinc
(Zn). ............................................................................................................. 68
Tabla 19. F calculado vs. F terico para las pruebas de toxicidad definitivas
con Zn. ......................................................................................................... 68
Tabla 20.Carta de control de la prueba de toxicidad de cinc (Zn). ............... 69
Tabla 21. Diferentes valores de pruebas de toxicidad de cinc (Zn) con trucha
arcoiris. ........................................................................................................ 70
Tabla 22. Comparacin con la legislacin. .................................................. 72
Tabla 23. Resultados de una de las pruebas preliminares del Vertimiento
Crudo. .......................................................................................................... 73
Tabla 24. Resultados de una de las pruebas definitivas con lectura a las 96
horas del Vertimiento Crudo. ....................................................................... 74
file:///C:\Documents%20and%20Settings\copietasn\Escritorio\TESIS_final_029_Intro.docx%23_Toc240258403
vii
Tabla 25. F calculado vs. F terico para las pruebas definitivas con
Vertimiento Crudo. ....................................................................................... 74
Tabla 26. Carta de control del vertimiento crudo. ........................................ 75
Tabla 27. Concentraciones Vertimiento Crudo y Tratado, % de Remocin y
Legislacin Antigua y Nueva. ....................................................................... 77
Tabla 28. Resultados de una de las pruebas preliminares con lectura a las
96 horas del Vertimiento tratado. ................................................................. 78
Tabla 29. F calculado vs. F terico para las pruebas con Vertimiento Tratado.
..................................................................................................................... 78
Tabla 30. Resultados de la caracterizacin del vertimiento crudo realizada el
27 de abril de 2009. ..................................................................................... 79
Tabla 31. Resultados de la caracterizacin del vertimiento tratado. ............ 80
Tabla 32. Rangos de ndices toxicolgicos. ................................................. 81
Tabla 33. Rangos de ndices toxicolgicos. ................................................ 81
Tabla 34. Tratamientos de metales pesados Ventajas y desventajas ......... 83
Tabla 35. Matriz de priorizacin de la alternativa de tratamiento. ................ 86
Tabla 36. Rango de calificacin ................................................................... 86
Tabla 37. Resultados del test de jarras ........................................................ 87
Tabla 38. Gradientes de velocidad .............................................................. 88
Tabla 39. Parmetros de diseo de un floculador ........................................ 88
Tabla 40. Hoja de clculo del clarifloculador ................................................ 89
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). .............................................................. 8 Figura 2. Partes del cuerpo de la trucha arco iris. ................................................................ 9 Figura 3. Zonas del agua donde predomina la trucha........................................................ 11 Figura 4. Ciclo de vida de la trucha arco iris. ....................................................................... 12 Figura 5. Curva de concentracin-respuesta obtenida por pruebas de toxicidad. ........ 20 Figura 6. Relacin entre el crecimiento y la concentracin de metales esenciales. ..... 28 Figura 7. Ciclo del cobre ......................................................................................................... 32 Figura 8. Ciclo del cinc. ........................................................................................................... 36 Figura 9. Esquema del proceso de Cincado ........................................................................ 41 Figura 10. Esquema Insumos y desechos en el cincado alcalino .................................... 42 Figura 11. Tratamiento y disposicin final del cinc ............................................................. 43 Figura 12. Esquema del laboratorio de bioensayos de la universidad de La Salle ....... 45 Figura 13. Foto Acuarios empleados para mantener las condiciones ptimas de vida de los alevinos de trucha arcoris (Oncorhynchus mykiss). .............................................. 46 Figura 14. Foto aclimatacin de los alevinos de trucha arco iris. ..................................... 47 Figura 15. Foto tanque de 250 L para la aireacin del agua de las pruebas. ................ 49 Figura 16. Foto Batera de ensayos. ..................................................................................... 50 Figura 17. Grfica Concentracin vs. Nmero de Pruebas de sensibilidad con K2Cr2O7. ..................................................................................................................................... 60 Figura 18. Grfica Concentracin vs. Nmero de Pruebas de toxicidad para Cu. ........ 65 Figura 19.Grfica Concentracin vs. Nmero de Pruebas de toxicidad de cinc (Zn). .. 71 Figura 20. Grfica Concentracin vs. Nmero de Pruebas del Vertimiento. .................. 76 Figura 21. Grfica Comparacin ndice toxicolgico Vertimiento Crudo vs. Vertimiento Tratado ................................................................................................................. 82 Figura 22. Esquema del diseo piloto................................................................................... 91
ix
GLOSARIO
Alevno o Alevn: cra de pez que incluye la fase comprendida entre la larva y el adulto y que en ciertos peces de agua dulce se utiliza para repoblar.
Batera de ensayos: combinacin de diversas pruebas de toxicidad con organismos representativos de cada uno de los niveles trficos.
Biocenosis: conjunto de organismos de especies diversas, vegetales o animales, que viven y se reproducen en un determinado biotopo.
Bioensayo: Proceso experimental mediante el cual se determinan las caractersticas y la fuerza de una sustancia potencialmente txica o de un desecho metabolito, a travs del estudio de sus efectos sobre organismos cuidadosamente escogidos y bajo condiciones especficas de laboratorio1.
Biomagnificacin: tendencia de algunos productos qumicos a acumularse a lo largo de la cadena trfica, exhibiendo concentraciones sucesivamente mayores al ascender el nivel trfico. La concentracin del producto en el organismo consumidor es mayor que la concentracin del mismo producto en el organismo consumido.
Biotopo: territorio o espacio vital cuyas condiciones ambientales son las adecuadas para que en l se desarrolle una determinada comunidad de seres vivos.
Cadena aliemantaria: sucesin entre los organismos vivos que se nutren unos de otros en un orden determinado.
Carta de control: tabla utilizada para seguir cambios en el tiempo del punto final medio para un compuesto txico de referencia en un organismo en particular.
Cincado: recubrimiento de cinc que se le realiza a los metales mejorando su aspecto visual y para protegerlos de la corrosin y oxidacin.
CL50 (Concentracin letal media): concentracin en la que un contaminante causa la muerte del 50 % de los organismos en exposicin con el mismo.
Contaminacin: la contaminacin es cualquier, sustancia o forma de energa que puede provocar algn dao o desequilibrio, irreversible o no, en el medio inicial.
1 Mata & Quevedo, Diccionario de la biodiversidad disponible en lnea en: www.inbio.ac.cr
http://www.inbio.ac.cr/
x
Control: tratamiento que duplica todos los factores que puedan afectar el resultado, excepto la condicin que est siendo investigada (control negativo o Blanco).
Control positivo: tratamiento que evala la respuesta txica con una sustancia de referencia, utilizada para controlar la sensibilidad de los organismos en el momento en el cual se evala.
Ecotoxicologa: ciencia que estudia los efectos txicos provocados por los contaminantes sobre los ecosistemas.
Estado de oxidacin o nmero de oxidacin: se define como la suma de cargas positivas y negativas de un tomo, lo cual indirectamente indica el nmero de electrones que el tomo ha aceptado o cedido. El estado de oxidacin es una aproximacin conceptual, til por ejemplo cuando se producen procesos de oxidacin y reduccin (procesos rdox).
Los protones de un tomo tienen carga positiva, y esta carga se ve compensada por la carga negativa de los electrones; si el nmero de protones y de electrones es el mismo el tomo es elctricamente neutro.
Etologa: parte de la biologa que estudia el comportamiento de los animales.
Ictiologa: la ictiologa, generalmente definida como "el estudio de los peces" o "la rama de la zoologa que trata de los peces".
Poiquilotermia: incapacidad de regulacin de la temperatura del cuerpo, por lo que esta vara de acuerdo con la temperatura ambiental.
Poiquilotrmico: se dice de los animales llamados de sangre fra. Perteneciente o realtivo a la poiquilotermia.
Poiquilotermo: poiquilotrmico
Pruebas de toxicidad: Una prueba de toxicidad es un ensayo en el cual un organismo o grupo de organismos son expuestos a un agente (qumico, fsico o biolgico) para establecer y medir una respuesta previamente seleccionada. Esta respuesta se valora mediante la cuantificacin del cambio en la caracterstica (coloracin, inanicin, etc.) o la ocurrencia de un determinado fenmeno (muerte, inhibicin en el crecimiento, etc.).
Red trfica: conjunto de relaciones entre cadenas alimentarias, que existen en las especies de una comunidad biolgica, y que representa el flujo de materia y energa que atraviesa el ecosistema.
Tolerancia: se refiere al porcentaje de organismos de una poblacin que se ver afectada a una cierta dosis. As, la distribucin de tolerancias es una cierta distribucin de frecuencias o probabilidades de tolerancias a las distintas dosis del txico.
xi
Toxicidad aguda: efecto adverso (letal o subletal) inducido sobre los organismos en prueba durante un perodo de exposicin al material de ensayo, usualmente de pocos das.
Valencia (qumica): el mximo nmero de tomos univalentes (originalmente tomos de hidrgeno o cloro) que pueden combinarse con un tomo del elemento en consideracin, o con un fragmento, o para el cual un tomo de este elemento puede ser sustituido.
Xenobitico: se deriva del griego "xeno" ("extrao") y "bio" ("vida"). Se aplica a los compuestos cuya estructura qumica en la naturaleza es poco frecuente o inexistente debido a que la mayora de ellos son compuestos sintetizados por el hombre en el laboratorio. La mayora han aparecido en el medio ambiente durante los ltimos 100 aos
xii
ABSTRACT
This investigation was to determine the median lethal concentration (LC50-96) to:
The reference toxicant potassium dichromate (K2Cr2O7), which will determine the sensitivity of species to the toxics. (initial stage)
Copper (Cu), which uses copper sulfate pentahydrate (CuSO4 5H2O) AR.
Zinc (Zn), which uses zinc chloride (ZnCl2) AR.
Dumping from the zinc process (before treatment and after treatment), with the presence of copper (Cu) and zinc (Zn).
The determination of the median lethal concentrations LC50-96 was performed by bioassay, which consisted of toxicological testing at different concentrations (five) and control for a total of six lines of test. Where was search to assess the relative strength of toxic metal agents of [copper (Cu) and zinc (Zn)] on aquatic organism. In this case using rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) fingerling for their degree of sensitivity to organic pollution and slight changes in their ecosystem, historic translocation across continents, easily adaptable to artificial feeding, high degree of domestication and interesting life cycle. Each test was made in quadruplicate in Fishbowls (24 total) and were used in 5 fingerling rainbow trout per aquarium for a total of 120 fingerlings per test. The tests were not renewed (Do not supply food or aeration during the experiment) and had a duration of 96 hours. The test be based on observing the number of dead fish on control and at different concentrations (five) at (3, 6, 24, 48, 72 and 96) hours of exposure, these readings were taken on a sheets of control. The final reading was at 96 hours that was used Probit statistical analysis and thus determined the LC50-96 (dose-response) only for the definitive tests, which are those observed a mortality rate of 0% for the lowest concentration and 100% for the highest concentration in a phased manner across the five (5) concentrations. When found the range of the definitive tests was ten (10) replicas to verify the accuracy of the test. Was also carried out a pilot design of industrial waste water treatment (clarifier) by a discharged zinc industry to remove the pollutant load to the dumping of industry and thus realizing achieve an environmentally safe for aquatic ecosystems.
xiii
RESUMEN
El trabajo de grado consisti en determinar las Concentraciones Letales medias (CL50-96) para:
El txico de referencia dicromato de potasio (K2Cr2O7), con el cual se determin la sensibilidad de la especie a los txicos. (etapa inicial)
Cobre (Cu), en forma de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO45H2O) grado analtico.
Cinc (Zn), en forma de cloruro de cinc (ZnCl2) grado analtico.
El Vertimiento procedente del proceso de una industria de cincado (antes del tratamiento y post-tratamiento), en la cual se encontraban presentes los metales en estudio (Cu y Zn).
La determinacin de estas Concentraciones Letales medias CL50-96 se realiz mediante bioensayos, que consistieron en hacer pruebas toxicolgicas a diferentes concentraciones (cinco) y un blanco para un total de seis lneas de prueba. Donde se busc evaluar la potencia relativa de los agentes metlicos txicos [cobre (Cu) y cinc (Zn)] sobre organismos acuticos. En este caso se utilizaron alevinos de trucha arco iris (Onchorhynchus mykiss) por su grado de sensibilidad a las contaminaciones orgnicas y a los cambios leves en sus ecosistemas, histrica de la traslocacin a travs de los continentes, fcil adaptacin alimentacin artificial, alto grado de domesticacin y sus interesante ciclo de vida.
Cada prueba se hizo por cuadruplicado en peceras (24 en total) y en cada pecera se utilizaron 5 alevinos de trucha arcoiris para un total de 120 alevinos por prueba. Las pruebas fueron sin renovacin (No se suministro aireacin ni alimento durante el experimento) y tuvieron una duracin de 96 horas.
Las pruebas consistieron en observar el nmero de peces muertos en el blanco y en las diferentes concentraciones (cinco) a las (3, 6, 24, 48, 72 y 96) horas de exposicin, llevndose registro de estas lecturas en hojas de control. Las lecturas definitivas fueron las de las 96 horas, datos que se utilizaron para hacer el anlisis estadstico con el programa Probit y de esta manera se determin la CL50-96 (relacin dosis-respuesta) para las pruebas definitivas, las cuales son en las que se observa un porcentaje de mortalidad entre 0 % para la concentracin ms baja y 100 % para la de mayor concentracin; de forma escalonada entre las cinco (5) concentraciones. Cuando se hall el rango de las pruebas definitivas se realizaron diez (10) rplicas de la prueba definitiva para comprobar la exactitud de la prueba.
Adicionalmente se realiz un diseo piloto de un tratamiento de aguas residuales industriales (clarifloculador) para remover la carga contaminante al vertimiento de la industria y de esta manera lograr alcanzar una concentracin ambientalmente segura para los ecosistemas acuticos.
1
INTRODUCCIN
Los procesos de desarrollo del mundo actual dependen en gran medida de productos qumicos para satisfacer sus necesidades en general, como por ejemplo: alimentarias, en salud, ambientales, industriales, agrcolas, y de la vida diaria en general.
Muchos de estos productos qumicos (xenobiticos) al cumplir su vida til presentan un riesgo para el entorno deteriorndolo de manera intrnseca cuando algunos de estos compuestos sobrepasan la capacidad de resiliencia del entorno, afectando los factores biticos y abiticos, generando un entorno ambientalmente inseguro y de esta manera alterando directamente la biocenosis que sinrgicamente a su vez afecta la salud humana (egocntricamente hablando).
A pesar de la evidencia de tiempo atrs, que se tiene acerca de la relacin de los efectos txicos de los xenobiticos sobre el entorno, la biocenosis y la salud humana; las polticas ambientales, la gestin ambiental efectiva y la conciencia de la poblacin en algunas naciones tienen una visin precaria y no muy responsable con el medio ambiente.
En pases desarrollados estas falencias son parcialmente compensadas con los resultados de las pruebas de toxicidad con organismos vivos (bioensayos) que son utilizadas para saber el grado de peligrosidad de una sustancia para el entorno, la biocenosis y la salud humana, adems de las metodologas convencionales para el control y el monitoreo ambiental.
Histricamente, el uso de mtodos biolgicos para deteccin de sustancias nocivas o peligrosas se registra desde 1776 cuando se realizaron pruebas de glifosato con ratas para hallar la concentracin limite, a comienzos del siglo en 1893 se realizaron unas diluciones de bioensayos para un estudio de Glycosylated Triketide Delta Lactones, Universite Catolique de Louvain, en el siglo XX, en el ao de 1922 se utilizaron en un estudio de endocrinolgico, Fundacin Rockefeller , en 1930 se desarrollo el primer bioensayo para probar el Prolactin en mamferos, Universidad de Missouri, el uso de bioensayos con peces se inicia hacia 1940 y las pruebas con invertebrados y algas se reportan a lo largo de la dcada del 50. Actualmente, las evaluaciones toxicolgicas integran diferentes niveles poblacionales, comunidades o ecosistemas que permiten identificar los elementos biolgicos en riesgo.
El concepto de bioensayo o prueba de toxicidad se deriva de la toxicologa clsica. Su definicin ha sido m odificada, adaptada y extendida al diagnstico y manejo ambiental. Estas tcnicas bioanalticas son consideradas complementarias de los anlisis fisicoqumicos convencionales y son alternativas eficaces para la prediccin de niveles seguros de concentracin.
2
En Colombia existe una normatividad sobre gestin, conservacin y control de los recursos naturales y el medio ambiente. Sin embargo no hay una gestin ambiental efectiva para su cumplimiento, ni una conciencia, ni un compromiso ciudadano para hacerla cumplir. En el pas el uso de los bioensayos es una prctica no muy difundida y la cantidad de estos anlisis es todava precaria para la demanda real del mercado.
El control y cumplimiento de las normas es llevado a cabo por distintas entidades gubernamentales; en el caso especifico del recurso agua este control implica efectuar caracterizaciones fsicas, qumicas y bacteriolgicas de las diferentes fuentes, donde lo datos obtenidos se comparan con los parmetros de referencia de las normas, variando de acuerdo con el uso del recurso.
Haciendo referencia a las pruebas de toxicidad en las normas, el decreto 1594 de 1984 Usos del agua y residuos lquidos en el artculo 45 define los criterios de calidad admisible para la preservacin de fauna y flora, y en l se enumeran las diferentes sustancias de inters sanitario con sus respectivos valores de concentracin letal media hallados. En l artculo 46 se hace referencia a que la autoridad ambiental competente deber establecer mediante pruebas de toxicidad (bioensayos) los valores de concentracin letal media. En la Resolucin 357 de 2009 se establecen los valores de referencia para los vertimientos realizados a la red de alcantarillado en el distrito capital y adems se nombran los valores de CL50-96 como los objetivos de calidad de aguas de la cuenca del rio Bogot para el ao 2020 en el Acuerdo 43 de la CAR de 2006. Esta investigacin es un bioensayo en el que se determina la concentracin letal media (CL50-96) de cobre (Cu) y cinc (Zn) utilizando trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), se realiza un diseo de un tratamiento piloto a escala de laboratorio para el vertimiento de una industria de galvanotecnia que contiene los metales de inters [cobre (Cu) y cinc (Zn)] al cual se determina la concentracin letal media (Cl50-96) antes del tratamiento y post-tratamiento.
En los ensayos se us como organismo de prueba alevinos de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) que es una especie de trucha nativa de la costa pacifica de Amrica del norte introducida en lagos y arroyos de todo el mundo y que en Colombia fue introducida hacia 1939.
Esta especie de trucha es propicia para las pruebas de toxicidad por diversos motivos entre ellos que no tolera las poluciones acuticas, es muy sensible a las contaminaciones orgnicas y que se tiene gran conocimiento de su biologa, cra, alimentacin y manejo.
Por otro lado el cobre (Cu) y cinc (Zn) son dos metales (xenobiticos) generalmente vertidos en actividades industriales y que por sus
3
caractersticas en concentraciones nocivas pueden generar graves afectaciones al medio ambiente y a la salud en los seres humanos.
La investigacin se realiz en varias fases primero se hizo el diseo experimental, segundo la fase de acondicionamiento que consisti en preparar el laboratorio para mantener en condiciones ptimas de vida los alevinos de trucha y tercero se realizaron las pruebas toxicolgicas fase en la que se montaron las bateras de ensayo.
Los resultados fueron analizados mediante mtodos estadsticos y se compararon los resultados con otros estudios similares realizados.
Este documento contiene la teora de la trucha arco iris, de los bioensayos y de las industrias de galvanotecnia, la explicacin fase a fase de la investigacin en la metodologa y los resultados y anlisis de resultados del bioensayo.
4
1 OBJETIVOS
General
Determinar la concentracin letal media (CL50) de cobre (Cu) y cinc (Zn) mediante pruebas toxicolgicas (bioensayos), utilizando alevinos de Oncorhynchus mykiss (trucha arco iris).
Especficos
Determinar la sensibilidad de los alevinos de Oncorhynchus mykiss expuestos al Dicromato de Potasio.
Realizar los anlisis fisicoqumicos de la muestra ambiental de la industria de Galvanotecnia.
Determinar la CL50 de los vertimientos de la industria de Galvanotecnia antes y despus del pretratamiento a nivel de laboratorio.
Proponer y disear a escala de laboratorio el pretratamiento para disminuir los niveles de toxicidad del efluente de la industria de Galvanotecnia.
5
2 JUSTIFICACIN
La investigacin se realiz para saber la concentracin que causa el 50 % de muertes de una poblacin de alevinos de trucha arco iris (Onchorhynchus Mykiss) en 96 horas al ser expuestas a Cobre (Cu) y Cinc (Zn) mediante pruebas toxicolgicas (bioensayos).
Los bioensayos se realizan para estimar la sensibilidad de los organismos hacia los txicos en este caso Cobre(Cu) y Cinc (Zn), a su vez se utilizan como criterios de calidad ambiental para hacer la legislacin actual (Decreto 1594 de 1984 y Resolucin 357 de 2009) mas rigurosa y por otro lado si se usan conjuntamente con las mediciones qumicas y ecolgicas permiten identificar, cuantificar y generar criterios para la descarga de contaminantes txicos (vertimientos) y garantizar la calidad ambiental de los ecosistemas acuticos2.
Si la legislacin ambiental de vertimientos actual (Decreto 1594 de 1984 y Resolucin 357 de 2009) se modificara hacindola ms estricta el estado disminuira sus gastos en saneamiento hdrico debido a que no tendra que invertir en medidas correctivas de los efectos negativos de la contaminacin.
El aporte social a travs de la obtencin de datos como las concentraciones letales de metales pesados como cinc (Zn) y cobre (Cu) es de gran utilidad para mejorar la normatividad colombiana de vertimientos, de esta manera impactando positivamente en la sociedad incrementando la calidad de vida de la misma.
En la medida que se controlen o prohban vertimientos con concentraciones de cinc (Zn), cobre (Cu) y otros metales pesados sobre cuerpos de agua se lograr mejorar la calidad de vida del ser humano creando un equilibrio entre el medio ambiente y el hombre en pro de un desarrollo sustentable y se protegern los intereses sociales que representan los recursos naturales los cuales son el sustento para gran parte de la poblacin colombiana, tambin se deben proteger ya que son invaluables para el desarrollo y de la humanidad.
Los resultados obtenidos de este trabajo de investigacin se adecuan a la realidad y condiciones nacionales de los ecosistemas acuticos protegiendo de una manera ms efectiva la calidad del recurso hdrico y la cadena trfica de los diversos ecosistemas. Adems permiten evaluar y fortalecer los mecanismos de calidad y control ambiental permitiendo tener un control efectivo sobre los vertimientos industriales.
2Adaptado de: DAZ B. Maria C., SOBRERO Cecilia, PICA G. Yolanda, Captulo 6. Aseguramiento y
Control de Calidad de Bioensayos, ENSAYOS TOXICOLGICOS Y MTODOS DE EVALUACIN DE CALIDAD DE AGUAS Estandarizacin, intercalibracin, resultados y aplicaciones, Mxico: IMTA
(Instituto Mexicano de Tecnologa del Agua), 2004. Canada: IDRC (The International Development Research Centre), 2004.
6
La prevencin y ms an la correccin de los efectos negativos de la contaminacin son muy costosos es as que pases como Estados Unidos, Japn y los europeos han incorporado a su rigurosa legislacin de control de calidad del ambiente criterios que surgen de los bioensayos3.
Los resultados de esta investigacin servirn de soporte para ser parte de un compilado de estudios que el programa de Ingeniera Ambiental Y Sanitaria similares con metales pesados que sern presentados ante la autoridad ambiental competente en un proyecto para modificar las leyes actuales sobre usos de agua y residuos lquidos especficamente en lo referente a las sustancias de inters sanitario, volvindolas mas responsables con su entorno y ambientalmente seguras para los que viven y circundan en el radio de accin de las descargas contaminantes .
3 PAGGI, Juan C. - DE PAGGI, Susana J. Daphnia Magna: El "Canario" De Las Aguas -Investigadores del Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET)-Instituto Nacional de Limnologa (INALI)-Santo Tom (Santa Fe), Argentina.
7
3 MARCO TERICO
Este captulo que incluye una definicin de trucha arco iris y una descripcin de su anatomo-fisiologa, ecologa, desarrollo, distribucin, alimentacin, comportamiento, tolerancia a las diferentes variables ambientales y criterios de seleccin; adems incluye la definicin de bioensayo, tipos de bioensayo, pruebas de toxicidad, txicos de referencia, cartas de control de calidad, preparacin de las soluciones de control, replicabilidad y sensibilidad, mtodos estadsticos para el anlisis de resultados de pruebas de toxicidad, anlisis de regresin y anlisis Probit; por otro lado una introduccin breve a los metales y metales de prueba; finalmente una descripcin de el sector de galvanotecnia, las generalidades, el proceso galvnico, el proceso de galvanoplastia, galvanostegia y cincado.
3.1 TRUCHA ARCO IRIS
Taxonoma: la trucha comn europea fue denominada como Salmo trutta, Salmo es el gnero y al aadir trutta (epteto especfico) define la especie. Este sistema binomial se ha ampliado para incluir las subespecies en un sistema trinomial, as Salmo trutta fario es una variedad o subespecie del tronco Salmo trutta.
La trucha se denomina salmo per debido al Orden, el taxn mayor situado inmediatamente por encima del nivel familiar, se forma con la adicin de iformes al tronco aun gnero, de ah Salmoniformes.
Antiguamente el nombre genrico de la trucha era salmo para designar especies de la costa de Amrica del norte, pero segn los taxonomistas la truchas nativas de las cuencas del Pacfico- Norte se encuentran genricamente ms cerca del salmn del Pacfico Oncorhynchus, en la actualidad debido a los trabajos presentados en Junio de 1988 por la American Society of Ichthyologist and Herpetologists a la American Fisheries Societys Committee on Names of Fishes se acept Oncorhynchus, como nombre genrico ms apropiado para designar a todas las truchas nativas de la cuenca del Pacfico4.
Clasificacin cientfica: la trucha arco iris pertenece a la familia Salmnidos, dentro del orden Salmoniformes. Se clasifica como Oncorhynchus mykiss.
4Basado en: BLANCO CACHAFEIRO, M. Carmen. La trucha: Cra industrial. Mundi-Prensa Libros, 1995,
503 p. [publicacin en lnea]. Disponible desde Internet en:
http://books.google.com.co/books?id=wRQIRsvUbu0C&printsec=frontcover3 Pg 37
http://books.google.com.co/books?id=wRQIRsvUbu0C&printsec=frontcover3
8
Nombre comn de una especie de trucha muy apreciada por los pescadores. Es originaria de Norteamrica, pero ha sido introducida en arroyos y lagos de agua fra de todo el mundo.
Es un pez, con el dorso verdoso y los flancos ms claros y con una banda irisada que recorre todo su cuerpo. Presenta numerosas manchas negras en el dorso, flancos y sobre las aletas dorsal, adiposa y caudal. Su tamao depende de la abundancia de comida y de la temperatura del agua. En algunos arroyos, los adultos miden entre (25 30) cm. y pesan 0,5 kg, mientras que en otros alcanzan los 114 cm y los 15 kg, Los ejemplares que emigran al mar miden entre (50 - 75) cm y pesan entre (3,5 - 5,5) kg, aunque se han capturado ejemplares de hasta 19 kg.
Figura 1. Trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 5.
Fuente: Eric Engbretson, U.S. Fish and Wildlife Service. 2009
Las truchas, son peces que ocupan en la naturaleza, espacios acuticos con aguas puras y cristalinas, que habitan en cauces con notables desniveles topogrficos, que originan rpidos, saltos y cascadas, tpicos de los ros de alta montaa. La trucha arco iris prefiere las corrientes moderadas y ocupa generalmente los tramos medios, donde el ro se ensancha con fondos pedregosos y moderada vegetacin.
3.1.1 ANATOMO-FISIOLOGA
3.1.1.1 Esqueleto
La trucha tiene un esqueleto seo, siendo la columna vertebral el eje del cuerpo. La trucha posee de 28 a 29 vrtebras firmemente unidas mediante tejido conectivo; as la columna puede ser fcilmente curvada. Los peces poseen unas costillas intramusculares falsas, eso minsculos huesecillos en forma de Y.
5 "Trucha arco iris," Enciclopedia Microsoft Encarta Online 2008 http://es.encarta.msn.com 1997-2008 Microsoft Corporation.
http://es.encarta.msn.com/encyclopedia_961543635/Trucha_arco_iris.html
http://es.encarta.msn.com/encyclopedia_961543635/Trucha_arco_iris.html
9
Figura 2. Partes del cuerpo de la trucha arco iris.
Fuente: Adaptado de STEPHEN DRUMMOND SEDGWICK, 1988 y Notas de Ictiologa, DeNauticos, 2006.
3.1.1.2 Respiracin
El agua contiene solamente alrededor del 5% de la cantidad de oxgeno que hay disponible en el aire. Este nivel es todava mas bajo cuando aumenta la temperatura del agua. Por lo tanto el aparato respiratorio de los peces se ha adaptado para ser ms eficiente. El rgano principal son las branquias o agallas. Estn formadas por unas laminillas cubiertas por un fino epitelio por el cual se produce el intercambio gaseoso; la toma de oxigeno y la eliminacin de dixido de carbono. Este epitelio si fuese extendido tendra una superficie 10 veces mayor que la del cuerpo del pez. Las branquias de la trucha consisten en dos conjuntos de cuatro arcos branquiales. Debido a la gran fragilidad de las branquias estn protegidas por el oprculo (Pieza generalmente redonda, que, a modo de tapadera, sirve para cerrar ciertas aberturas; p. ej., las de las agallas de la mayor parte de los peces, la concha de muchos moluscos univalvos o las cpsulas de varios frutos.). El flujo de agua a las branquias es continuo y unidireccional, establecido por un sistema de bombeo. El resultado es que agua entra por la boca y sale por el oprculo pasando a travs de las branquias, donde se produce el intercambio gaseoso.
Sistema circulatorio - excretor
La trucha tiene un sistema circulatorio sencillo. El corazn bombea sangre hacia las branquias para su oxigenacin y de ah va por los capilares a los tejidos. La sangre venosa retorna al corazn. El corazn consta de tres cmaras, el seno, la aurcula y el ventrculo. En todo cuerpo animal hay un aporte constante de materiales, as como un barrido de deshechos en los tejidos. El principal producto residual de la trucha es el amoniaco (NH3), que es eliminado en una alta proporcin por las branquias as como el anhdrido carbnico (CO2). Otras partes ms pequeas de sustancias nitrogenadas y otros productos degradados son filtrados por el rin.
10
El rin es un rgano oscuro alargado, ubicado inmediatamente por debajo de la espina dorsal y por encima de la vejiga natatoria: se extiende desde la cabeza hasta el comienzo de la cola. Del rin salen los urteres por lo que es conducida la orina hacia la vejiga urinaria y de ah al seno urogenital.
Para los peces de agua dulce el rin es ms importante que para los de agua salada, ya que por ellos se elimina el exceso de agua. La concentracin salina del agua es mucho ms baja que la de las clulas de la trucha; por lo que el agua tiende a difundir en las branquias hacia la sangre. Esta agua debe ser eliminada, funcin que compete al rin, las sales son en gran parte reabsorbidas por lo que la orina, abundante, es mas diluida que la sangre6.
3.1.2 ECOLOGA DE LA TRUCHA
3.1.2.1 Hbitat
Los ros se pueden dividir en cuatro franjas, de acuerdo con la rapidez de la corriente, que se denominaran segn la especie predominante as: zona de Salmnidos, zona del Tmalo, zona de los Barbos y zona de las Bremas. No todos los ros tienen estas cuatro zonas y por supuesto hay lugares de transicin entre ellas donde conviven los distintos peces ver Figura 3. Zonas del agua donde predomina la trucha. Los salmnidos, especialmente la trucha arco-iris, pero tambin el tmalo, gobio, madrilla, locha y el piscardo predominan en la zona del tmalo que son zonas un poco mas bajas, en las que el ros son un poco mas profundos y con el agua un poco mas lenta y clida7.
3.1.3 DESARROLLO DE LA TRUCHA ARCOIRIS
El desarrollo de la trucha arco iris ocurre en varias etapas que van desde ser alevinos hasta alcanzar la edad madura como se puede ver en la Figura 4. Ciclo de vida de la trucha arco iris.
Una caracterstica muy peculiar de los salmnidos, es que sus rganos sexuales presentan en los primeros perodos de vida, una cierta indiferenciacin, es decir no es posible determinar microscpicamente si la glndula sexual de un ejemplar es testculo u ovario.
6 Red Pirineos-Pesca 2001. Anatoma y fisiologa de la trucha. [web en lnea]. [con acceso el 14 de Diciembre de 2008]. 7 Id. Ecologa de la trucha: hbitat y alimentacin.
http://www.revistaaquatic.com/asociaciones/PirineosPesca/sp/index.htm
11
Figura 3. Zonas del agua donde predomina la trucha.
Fuente: Red Pirineos-Pesca, 2001
Este fenmeno es denominado gonocorismo indiferenciado y lo presentan truchas y salmones en los primeros meses de vida, de tal forma, que aproximadamente hasta los cuatro meses estos rganos no adquieren la estructura histolgica y funcional tpica8.
3.1.4 DISTRIBUCIN
Desde el pacifico oriental a Alaska y a baja California. Este es uno de los peces ms ampliamente introducido en el mundo por lo menos en 50 pases, lo cual hace su presencia virtualmente global. En los pases tropicales donde ha sido introducido solo se encuentra por encima de los 1200 m.s.n.m.m (metros sobre el nivel medio del mar).
3.1.5 ALIMENTACIN DE LA TRUCHA ARCO IRIS
La mayora de los adultos consume insectos, moluscos, crustceos, huevos de peces, y otros pequeos peces (incluyendo otras truchas). La mayora de los jvenes se alimentan de zooplancton. Las poblaciones ocenicas son vulnerables a los peces grandes, pinnpedos y Odontocetos. Las
8 BLANCO CACHAFEIRO, M. Carmen. Op. Cit. P. 43.
12
poblaciones de agua dulce son depredadas por grandes peces, nutrias, osos, y pjaros.
Figura 4. Ciclo de vida de la trucha arcoiris
Fuente: Adaptado de Taupo for Tomorrow, Tongariro National Trout Centre , [web en lnea] disponible
en: .
3.1.6 COMPORTAMIENTO (etologa)
Los adultos defienden agresivamente los territorios de alimentacin. Todas las poblaciones de truchas arco iris son oportunistas con respecto a la migracin, ya que son capaces de migrar, o por lo menos para adaptarse al agua del mar de acuerdo a los factores ambientales. Demostrando la versatilidad de adaptacin y comportamiento de esta especie9.
3.1.7 TOLERANCIA DE LA TRUCHA ARCO IRIS A LAS DIFERENTES VARIABLES AMBIENTALES
9 GrzimeK`s Animal Life Encyclopedya, 2nd Edition. Volumes 4-5, Fishes I II, Edited by Michael
Hutchins; Dennis A Thoney, Paul V. Loiselle, and Neil Schalger. Farmington Hills, MI: Gale Group, 2003. Pg 414
http://www.taupofortomorrow.co.nz/fishery/trout.php
13
3.1.7.1 Temperatura: La trucha arco iris, como todos los peces, no tiene capacidad propia para regular su temperatura corporal, pues esta depende totalmente del medio acutico en el que viva. Es pues la trucha un animal poiquilotermo, a diferencia de los llamados homeotermos, como los mamferos, que tienen siempre su propia temperatura, con independencia del medio en el que se encuentren.
De esta peculiar caracterstica biolgica se resalta la extraordinaria importancia que tiene en salmonicultura, la temperatura del agua que abastece una piscifactora. Esta tiene una incidencia directa sobre la biologa de los salmnidos, condiciona la maduracin de las gnadas de los reproductores existentes en la instalacin, el tiempo de incubacin de los huevos hasta su eclosin, as como sobre el ritmo mensual de crecimiento de alevinos y adultos, y especialmente sobre el grado de actividad metablica. Indirectamente influye de forma fundamental en el agua de cultivo, pues la concentracin de oxgeno disuelto en ella, la concentracin de productos metablicos [amonaco (NH3)], el tiempo y grado de descomposicin de los materiales depositados en el fondo de los estanques, dependen precisamente de la temperatura.
Los cambios bruscos de temperatura son muy mal tolerados, por los organismos que se cultivan a nivel industrial por lo que se requieren aguas estables, con escasas variaciones trmicas diarias.
La temperatura del agua interviene en el grado de actividad metablica de las truchas, en aguas fras las truchas apenas ingieren alimento y su crecimiento es lento, en temperaturas altas la trucha es muy voraz10.
3.1.7.2 Salinidad
La salinidad puede ser importante no slo para la supervivencia de la trucha, sino tambin debido a la intrusin de aguas salinas en la parte alta de algunos sistemas fluviales. Los efectos de la salinidad que se presentan en la trucha son de dos clases, tanto directos como el balance inico (por ejemplo, cambios en la tasa de crecimiento y/o supervivencia), y los indirectos (por ejemplo, cambios en el tipo y la disponibilidad de presas o la claridad del agua)11.
10 BLANCO CACHAFEIRO, M. Carmen. Op. Cit. Pg. 61, 40.
11 MOLONY, Brett, Environmental requirements and tolerances of Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and Brown trout (Salmo trutta) with special reference to Western Australia: A review, Published
by Department of Fisheries Perth, Western Australia November 2001, 5 p.
14
3.1.7.3 pH
Los ros con aguas alcalinas, suelen albergar una fauna salmoncola superior, pues la alcalinidad o riqueza mineral, promueve la existencia de animales acuticos de los que se alimenta la trucha, a diferencia de las aguas cidas, que son ms pobres desde el punto de vista biolgico. Sin embargo, en salmonicultura se prefieren las aguas ligeramente cidas, pues los productos txicos, procedentes de la alimentacin artificial de los peces, muestran, en estas condiciones, efectos amortiguados12.
Edwards (1978) declar que el pH > 9 puede matar a los salmnidos, especialmente sensible en el huevo y matar en las etapas tempranas.
3.1.7.4 Oxgeno Disuelto
Uno de los factores ms importantes que determinan la supervivencia de la trucha es la concentracin de oxgeno disuelto en el agua. Para muchas especies de salmnidos, la exposicin a bajos niveles de oxgeno disuelto aprox. menor a (5,0 - 6,0) mg/L puede causar la muerte (y Doudoroff Shumway 1970, en Weithman y Haas 1984). La concentracin de oxgeno ha sido identificado como factor critico para la supervivencia de O. mykiss en el desove (Rubin, 1998). Una correlacin es que el aumento de temperatura del agua, trae consigo una disminucin de concentracin de OD, que a su vez la trucha necesita para vivir.
Como consecuencia se aumentan con ella las necesidades de la trucha de oxgeno, pues como hemos visto, los peces al ser animales poiquilotermos, su actividad metablica es proporcional a la temperatura del agua, dentro de unos lmites (Wieniaski, 1971). Esta actividad esta concatenada con el aumento de la degradacin orgnica, que se acelera con las altas temperaturas y como resultado de esta combinacin de factores se aumenta el consumo de oxigeno (DBO y DQO).
La cantidad de peces finales en un criadero es menor, asimismo aumenta el riesgo de incidencia de las patologas en los peces, esto debido a que con la mayor temperatura hay mayor proliferacin de microorganismos incluyendo los agentes patgenos. 3.1.7.5 Amonaco
El amonaco (NH3) es la forma ms comn de residuos nitrogenados producidos por los peces. La Toxicidad del amonaco depende de la cantidad de amoniaco no-ionizado presente, que a su vez depende de l pH, la temperatura y la salinidad del agua. En condiciones naturales, el amonaco no presenta mayor problema para el crecimiento de los peces, ya
12 Id. P. 5.
15
que se puede diluir en grandes cuerpos de agua y tiene una reduccin de la toxicidad en las aguas cidas o neutras (Barton 1996). En las condiciones de cultivo intensivo o en aguas altamente alcalinas (pH > 9), el amonaco puede tener efectos sub-letales, como una reduccin de la tasa de crecimiento, o pueden ser muy txicos (Stickney 1991) en el total de los niveles de amoniaco por encima de 0,02 mg NH3NL
-1 (Hellawell 1986). Los problemas con el Amonaco tambin pueden ser frecuentes en ros y embalses donde el amonaco se utiliza como abono en las zonas de captacin (por ejemplo, las zonas de agricultura). El amonaco se mide normalmente (como NH3-N), y el nitrito (NO2-N) que son los compuestos nitrogenados ms txicos para los peces. En las aguas naturales es extrao encontrar el nitrito, ya que se convierte en nitrato (NO3-N), por descomposicin bacteriana (Stickney, 2000). El nitrato es mucho menos txico que el amonaco, pero combinado con el nitrito es uno de los compuestos nitrogenados ms txicos para los peces de agua dulce (Westin 1974).
A diferencia de muchos otros compuestos, el amonaco es ms txico en aguas alcalinas. Esto se debe a la desionizacin de la forma ms inerte del amonaco (amonio - NH4
+) a la forma mas txica (NH3) en aguas alcalinas (Barton 1996), usualmente con pH > 8 (Stevensen 1987; Stickney, 1991)13. 3.1.7.6 Dureza del agua
La dureza del agua es el total de "sales" (iones) de calcio y magnesio medidos en el agua (Wedemeyer 1996) pero en general se expresa en trminos del carbonato de calcio total (CaCO3) en el agua, por lo menos en aguas con bajos o nulos niveles de cloro. La dureza del agua es un parmetro importante en la cra de los salmnidos, debido a los efectos de solubilidad en otros iones14.
Las variables ambientales mencionadas anteriormente son primordiales para el crecimiento y supervivencia de la trucha; varios autores sealan diferentes valores a estos parmetros reflejando las diferencias geogrficas entre las distintas poblaciones como se puede ver en la tabla 1. 3.1.8 CRITERIOS DE SELECCIN DEL ORGANISMO DE PRUEBA
Las truchas arco iris tiene mejor crecimiento que las comunes y se adaptan fcilmente a la alimentacin artificial, siendo ste, entre otros, los motivos de ser una tpica especie de cultivo.
13 Molony, Brett, Op. Cit. P. 8.
14 Id. P. 9.
16
Tabla 1 . Comparacin de algunos de los requerimientos para el crecimiento y supervivencia de la trucha como sealan algunos autores.
Parmetro Sedgwick
(1985) Stevenson
(1987) Barton (1996)
Wedemeyer (1996)
Brannon (1991)
Temperatura(0C)
10 - 15 (G) (Mejor < 21,
letal > 25 27 (S)
10 - 16 (G) (Mejor debajo
de 20, letal > 25 (S))
10 - 22 (G) > 26.5 (S))
9- 16 (G) ( 7 (S) 7.0 (G)
Calcio (dureza) (mg/L
>150(G) 10- 400(G) 50 - 200 (S) > 50 mejor (G) (4
-160 (S))
Fuente: Adaptado de Molony, Brett, Ibid. P. 28.
Las truchas toleran mal las poluciones acuticas y son muy sensibles a las contaminaciones orgnicas, as como a numerosos productos que de forma accidental se encuentran ocasionalmente en las aguas15.
Los salmnidos y especialmente la trucha arco iris hoy en da se considera una especie de alto grado de domesticacin, debido al conocimiento que se tiene de su biologa, cra, alimentacin, manejo, etc. Las truchas de criaderos se denominan domsticas para diferenciarlas de aquellas otras que viven libremente en el medio natural16.
Los salmnidos son el grupo de peces de los ms estudiados en todo el mundo debido a su alto valor, la tasa de crecimiento, biolgicamente interesante ciclo de vida y la historia de la translocacin a travs de muchos continentes. Como resultado, hay un gran volumen de literatura disponible sobre la biologa y la ecologa de este grupo de peces. Muchos de estos estudios son tiles para las investigaciones preliminares de la translocacin potencial de cepas especficas de trucha a los nuevos lugares que puedan estar en los extremos de tolerancia de la trucha17.
15 BLANCO CACHAFEIRO, M. Carmen, Op. Cit. P. 40.
16 Id. P. 55.
17 Molony, Brett, Op. Cit. P. 2.
17
3.1.9 FUENTES DE OBTENCIN Y ESTUDIO DE LA TRUCHA COMO ORGANISMO DE PRUEBA
Utilizar organismos provenientes directamente del hbitat natural puede distorsionar los resultados obtenidos por fuentes de variabilidad no previstas, como nutricin, dinmica de la poblacin, estrs por depredacin, etc. (Sosnowski et al.,1979). Estas variables pueden ser controladas o eliminadas con las poblaciones de laboratorio; adems, el entrecruzamiento consanguneo que ocurre a lo largo del tiempo en esas poblaciones, resulta en una considerable reduccin de la variabilidad gentica (Lewontin, 1974).
Por otra parte, a causa de la complejidad del medio ambiente acutico y de las comunidades biolgicas que lo integran es difcil establecer el grado de deterioro que afecta a las especies o comunidades acuticas. Por esta razn es conveniente realizar bioensayos utilizando organismos vivos en condiciones controladas de laboratorio. Sin embargo, el objetivo primordial de un bioensayo es reflejar la realidad de cmo afectara a los organismos vivos en su medio natural y para ello es recomendable paralelamente investigar continuamente las comunidades en su propio hbitat (Villamar, 1996)18.
3.2 BIOENSAYO
Definicin 1: Uso de organismo(s) vivo(s) como un agente de prueba para la detectar la presencia o concentracin de un compuesto qumico o un efecto ambiental adverso, usndolo como bioindicador.
Definicin 2: Proceso experimental mediante el cual se determinan las caractersticas y la fuerza de una sustancia potencialmente txica o de un desecho metabolito, a travs del estudio de sus efectos sobre organismos cuidadosamente escogidos y bajo condiciones especficas de laboratorio. (Mata & Quevedo 1998).19
3.2.1 TIPOS DE BIOENSAYO
Los bioensayos se clasifican principalmente en bioensayos de toxicidad aguda y crnica.
18 Mac-Quhae, Csar Augusto Bioensayos de toxicidad aguda en neonatos de Moina macrocopa
(Straus, 1820) (Crustcea: branchiopoda) expuestos a soluciones de hidrxido de sodio (NaOH),
Universidad de Oriente, Ncleo Nueva Esparta, Venezuela, 2002
19 Diccionario de la Biodiversidad, Instituto Nacional de la Biodiversidad Costa Rica. [publicacin en lnea]. Disponible desde Internet en: http://atilla.inbio.ac.cr
http://atilla.inbio.ac.cr/
18
Bioensayos de toxicidad aguda
Son aquellos que cuantifican la alteracin causada por alguna sustancia txica, sobre los organismos de una especie; esta alteracin es observada sobre parmetros que alteran funciones vitales de un organismo, ya sea mortalidad, inmovilidad o alteracin en la tasa de crecimiento.
Bioensayos de toxicidad crnica
Cuantifican los efectos en el desarrollo, reproduccin o viabilidad poblacional de una especie determinada expuesta a un toxico, por un tiempo no inferior al 20% de su ciclo de vida.
Existen muchas formas de determinar la toxicidad, para medir la respuesta de los organismos a los xenobiticos, y aunque los efectos bioquimicos, fisiolgicos, reproductivos y de comportamiento son de gran utilidad, el indicador comnmente ms utilizado es la muerte del organismo de prueba. Para ensayos agudos uno de los valores mas utilizados es la CL50 [concentracin de un xenobitico que causa al 50 % de la poblacin en un tiempo determinado generalmente (48 96) horas].
Para ensayos crnicos aunque tambin para los agudos se pueden estimar la concentracin segura o a la cual no se observa efecto en trminos biolgicos de la siguiente manera:
La concentracin ms alta a la cual no se observa efecto (NOEC) La concentracin ms baja a la que se observa efecto (LOEC) La concentracin efectiva (CE) correspondiente a una estimacin de
la concentracin del txico que puede causar un efecto adverso observable mediante una respuesta discreta en un porcentaje dado de organismos
Concentracin letal (CL), la cual corresponde a la concentracin del Txico o efluente o muestra que causa la muerte a un determinado Porcentaje de la poblacin expuesta
Concentracin inhibitoria (CI), la cual corresponde a la concentracin del txico o muestra o efluente que puede producir una reduccin de una respuesta biolgica en una poblacin expuesta.
3.2.2 TOXICIDAD
Es la capacidad de una sustancia de ejercer un efecto nocivo sobre los organismos o la biocenosis y el efecto generado depender de la duracin y la frecuencia al txico. La toxicidad evaluada en un ensayo biolgico es el resultado de la interaccin entre la sustancia y el sistema vivo. Sin embargo hay que tener en cuenta que el potencial nocivo de una sustancia toxica puede ser contrarrestado por el sistema biolgico a travs de diferentes estrategias como reacciones metablicas de detoxificacin o excrecin.
19
Adems debe considerarse que el efecto txico de una sustancia sobre los sistemas biolgicos es el resultado de la accin combinada de todas las sustancias presentes en el medio, incluso aquellas que no son txicas por naturaleza, pero que afectan las propiedades qumicas o fsicas del sistema y en consecuencia, las condiciones de vida de los organismos. Por ejemplo en los sistemas acuticos existen sustancias que agotan el oxgeno, o que son coloreadas o que impiden la propagacin de la luz (caso del material particulado). Tambin se debe tener en cuenta aquellos efectos no directamente relacionados con la sustancia txica como el dao producido por cambios en la temperatura o por radiacin20. 3.2.3 PRUEBAS DE TOXICIDAD
Una prueba de toxicidad es un ensayo en el cual un organismo o grupo de organismos son expuestos a un agente (qumico, fsico o biolgico) para establecer y medir una respuesta previamente seleccionada. Esta respuesta se valora mediante la cuantificacin del cambio en la caracterstica (coloracin, inanicin, etc.) o la ocurrencia de un determinado fenmeno (muerte, inhibicin en el crecimiento, etc.).
Los anlisis de toxicidad son herramientas que al ser usadas conjuntamente con las mediciones qumicas y ecolgicas, permiten identificar, cuantificar y generar criterios para el control de la descarga de contaminantes txicos21.
La relacin concentracin-respuesta en toxicologa es la relacin cuantitativa entre la concentracin del compuesto qumico al cual esta expuesto el organismo y la magnitud del efecto nocivo que se produce.
La respuesta gradual es cuando se obtiene una respuesta de magnitud definida para cada concentracin. La curva concentracin-respuesta se construye graficando en la ordenada las respuestas (R) observadas en el organismo, y en la abscisa las concentraciones (C [ ]) a las que fue expuesto. Ver Figura 5. Curva de concentracin-respuesta obtenida por pruebas de toxicidad.
La estadstica desempea un papel importante no slo para su clculo, sino para la planificacin y ejecucin de las pruebas de toxicidad y para el anlisis e interpretacin de los resultados obtenidos en ellas. Por tanto, el diseo experimental, el muestreo, la modelacin, la recoleccin de datos, las pruebas y los anlisis deben ceirse a principios estadsticos estrictos. En general, los mtodos de anlisis de los resultados estn bien documentados,
20 Daz Bez Mara Consuelo, Bustos Lpez Martha, Espinosa Ramrez Adriana Janneth, Adaptado de
Pruebas de toxicidad acutica: Fundamentos y mtodos, Unibiblos - U. Nal. Colombia, 2004, p. ##. 21
Castillo, Gabriela, (ed.). 2004 ENSAYOS TOXICOLGICOS Y MTODOS DE EVALUACIN DE CALIDAD DE AGUAS Estandarizacin, intercalibracin, resultados y aplicaciones, Captulo 6, Aseguramiento y Control de Calidad de Bioensayos, IDRC/IMTA. [publicacin en lnea]. Disponible desde Internet en: www.idrc.ca
http://www.idrc.ca/
20
son aplicables a la mayora de los datos obtenidos en este tipo de pruebas y pueden ser manejados por personas sin entrenamiento estadstico22.
Figura 4. Curva de concentracin-respuesta obtenida por pruebas de toxicidad.
Fuente: Daz Bez Mara Consuelo, Bustos Lpez Martha, Espinosa Ramrez Adriana Janneth, Pruebas de toxicidad acutica: Fundamentos y mtodos, Unibiblos - U. Nal. Colombia, 2004, p. 90.
3.2.4 TXICOS DE REFERENCIA
Un txico de referencia es un compuesto qumico orgnico o inorgnico utilizado en pruebas de toxicidad con fines de control de calidad analtica de los organismos a utilizar en las pruebas
En la literatura se mencionan muchos compuestos que pueden emplearse como txicos de referencia; la US EPA (1993) cita el empleo de cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), cloruro de cadmio (CdCl2), dicromato de potasio (K2Cr2O7), sulfato de cobre (CuSO4) y dodecil sulfato de sodio (SDS); CETESB (Brasil) cita el empleo del dicromato de potasio (K2Cr2O7); Enviroment Canada recomienda cinc (Zn+2) como txico de referencia inorgnico y fenol para las sustancias orgnicas.
Sin embargo, estos compuestos pueden sustituirse por otros, dependiendo de la especie de prueba, la matriz utilizada y los puntos finales medidos.
La precisin de los resultados de las pruebas de toxicidad en el laboratorio es calculada a travs de la confeccin de cartas o grficos de control. Este grfico es una herramienta que permite determinar la variabilidad de los
22 Castillo, Gabriela, (ed.). 2004 ENSAYOS TOXICOLGICOS Y MTODOS DE EVALUACIN DE
CALIDAD DE AGUAS Estandarizacin, intercalibracin, resultados y aplicaciones, Captulo 5, Mtodos estadsticos para la el anlisis de resultados de toxicidad, IDRC/IMTA. [publicacin en lnea]. Disponible desde Internet en: www.idrc.ca
http://www.idrc.ca/
21
resultados y, en consecuencia, definir la aptitud de un laboratorio para obtener resultados confiables.
3.2.5 CARTAS DE CONTROL DE CALIDAD
La carta de control es la herramienta de registro que brinda los elementos de juicio para establecer los intervalos aceptables de variacin de la respuesta de los organismos de prueba a un txico de referencia, con un margen de confianza del 95%. Esta carta es el medio de referencia para evidenciar el control de la sensibilidad de la especie empleada, de la estabilidad de la respuesta biolgica y de la repetitividad (exactitud) de los resultados obtenidos.
La carta de control se genera a partir de los resultados de pruebas sucesivas al txico de referencia seleccionado, para el cual se obtiene el valor de la concentracin de efecto medio (CL50/CI50/CE50). Inicialmente sta puede ser construida con un mnimo de cinco datos y posteriormente se debe continuar realizando ensayos con el txico para ingresar mensualmente nuevos valores hasta completar una serie de veinte resultados.
Los valores se van integrando a manera de puntos en un grfico que relaciona el nmero de ensayo, ubicado en el eje X o abscisa, y el valor de la concentracin de efecto medio (CL50/CI50/CE50), en el eje Y u ordenada . Posteriormente, los valores son empleados para el clculo del valor promedio y la desviacin estndar () de la poblacin de datos. Con estos parmetros estadsticos se calculan los valores lmite (superior e inferior) que definen el intervalo de variacin aceptable o intervalos de confianza (95%) en el que debern encontrarse los valores de CL50/CI50/CE50 obtenidos para futuros ensayos con el txico de referencia.
Los valores del lmite superior e inferior se obtienen al adicionar o sustraer del promedio, respectivamente, dos desviaciones estndar de acuerdo con:
Concentracin lmite superior: promedio + 2
Concentracin lmite inferior: promedio 2
Con la solucin estndar del txico se preparan diluciones para obtener una serie de concentraciones, de manera que se logre obtener al menos dos valores de efecto mayor al 50% y dos ms, menores a dicho porcentaje. En general, es de esperar que la serie de concentraciones utilizada produzca a travs del tiempo la misma respuesta en cada concentracin. La carta de control es utilizada para evaluar la tendencia de los resultados, por lo que el promedio acumulado y los lmites de confianza son calculados nuevamente con cada nuevo dato obtenido. Despus de dos aos de coleccin de datos o de veinte evaluaciones, la carta control se mantiene usando solamente los veinte datos ms recientes. En general, se recomienda realizar pruebas
22
mensuales con los txicos seleccionados; sin embargo, algunos laboratorios prefieren llevar a cabo ensayos con mayor frecuencia.
Valores de la CL50/CI50/CE50 fuera del intervalo establecido son indicativos de algn cambio en la consistencia metodolgica o de alteracin de la sensibilidad de los organismos. En el caso de anlisis de puntos finales como la CL50, CI50 y la CE50, se espera que por azar y con una probabilidad asociada de P0.05, slo uno de los veinte ensayos se encuentre por fuera de los lmites establecidos.
Si en ms de un ensayo con los txicos de referencia el valor se encuentra por fuera de los lmites, los resultados de las pruebas efectuadas deben considerarse provisionales y sujetos a confirmacin. Si el problema persiste y el valor de CL50/CI50/CE50 del txico de referencia se aleja significativamente del intervalo esperado, deber realizarse una revisin de la sensibilidad de los organismos de prueba y eliminar los datos generados bajo estas circunstancias.
En este caso, se debe revisar cuidadosamente el procedimiento y repetir las pruebas con unos nuevos organismos.
El comportamiento de los grficos de control puede cambiar en el tiempo, reducindose los intervalos de variacin en la medida en que se adquiere habilidad en el manejo de los procedimientos de prueba. Bajo este esquema tambin es factible que se obtengan valores fuera de los nuevos lmites; sin embargo, la incidencia de estos casos no deber ser mayor del 5 por ciento.
3.2.6 PREPARACIN DE SOLUCIONES DE CONTROL
3.2.6.1 Control positivo
Generalmente, como control positivo se utiliza una solucin del txico con una concentracin cercana a la CL50/CI50/CE50. Para su elaboracin, se prepara inicialmente una solucin estndar con una alta concentracin a partir de la cual se preparan soluciones menos concentradas, utilizando como diluente el medio recomendado para cada prueba. En todos estos procedimientos se debe emplear material volumtrico. Estas diluciones deben prepararse hasta obtener una concentracin cercana al valor promedio de la CL50/CI50/CE50, obtenida en cada laboratorio.
Preparacin de las soluciones para determinacin de la CL50/CI50/CE50 del txico de referencia:
Cada laboratorio debe conocer el patrn de respuesta de sus organismos al txico de referencia, lo cual permitir determinar las concentraciones ptimas para elaborar la curva dosis-respuesta.
23
Para determinar el volumen de solucin estndar necesario para la preparacin de la concentracin de inters, puede emplearse la siguiente regla:
FFii CVCV
Donde:
Vi y Vf corresponden a los volmenes inciales y finales, y Ci y Cf a las concentraciones inciales y finales.
Se recomienda hacer chequeos peridicos de la concentracin del txico, dado que fenmenos de volatilizacin, evaporacin, etctera, pueden afectar la concentracin del compuesto en la solucin.
Preservacin de las soluciones del txico de referencia:
Las soluciones del txico deben mantenerse en frascos mbar o protegidos de la luz con cubierta de papel aluminio a una temperatura de 4C 2C (refrigeracin). En estas condiciones de preservacin, la solucin de prueba puede perdurar por ms de 45 das y la solucin estndar por ms de seis meses. Mientras no se detecten resultados fuera de los lmites normales de respuesta indicado por la carta control del txico de referencia, los patrones podrn usarse por un prolongado periodo de tiempo. Sin embargo, se sugiere efectuar su renovacin a los 45 das y seis meses, respectivamente. Es importante tambin realizar la valoracin qumica de la solucin de prueba.
Blanco de procedimiento
Se recomienda incluir un blanco de procedimiento por cada batera de ensayos. La preparacin del blanco depende del mtodo aplicado, sin embargo se debe seguir todo el protocolo establecido para la muestra. La toxicidad resultante en este blanco no debe exceder el 10% (APHA, 1998); en caso contrario los resultados quedan invalidados, pues la respuesta estara indicando interferencias producto del procesamiento de la muestra. Los resultados de toxicidad para el blanco no deben mostrar efecto, de lo contrario los resultados reportados para las muestras no son aceptables23.
3.2.7 REPLICABILIDAD Y SENSIBILIDAD
La sensibilidad de las pruebas depende del nmero de rplicas por concentracin, nivel de significancia establecido y tipo de anlisis estadstico
23 Castillo, Gabriela, (ed.). 2004 ENSAYOS TOXICOLGICOS Y MTODOS DE EVALUACIN DE
CALIDAD DE AGUAS Estandarizacin, intercalibracin, resultados y aplicaciones, IDRC/IMTA. [publicacin en lnea]. Disponible desde Internet en: www.idrc.ca
http://www.idrc.ca/
24
que se lleve a cabo. Por esta razn, cuando la variabilidad permanece constante, la sensibilidad de la prueba puede incrementarse aumentando el nmero de rplicas. Sin embargo, el mnimo nmero de rplicas variar con los objetivos de la prueba y el mtodo estadstico seleccionado para el anlisis de los datos.
Existen muchos factores que pueden afectar el xito y la precisin de un ensayo de toxicidad; los ms importantes son:
Experiencia y habilidad del analista.
Edad, condicin y sensibilidad de los organismos de prueba.
Calidad del agua de dilucin.
Control de temperatura.
Calidad y cantidad de alimento suministrado a los organismos.
Por tanto, los resultados dependen del origen y tipo de las especies utilizadas y de las condiciones bajo las cuales se llevan a cabo las pruebas, tales como temperatura, oxgeno disuelto, alimento y calidad del agua de dilucin. Igualmente, la replicabilidad y precisin sern funcin del nmero de organismos utilizados por concentracin24. 3.2.8 MTODOS ESTADSTICOS PARA EL ANLISIS DE
RESULTADOS DE PRUEBAS DE TOXICIDAD
En la toxicologa la estadstica es bsica para la planificacin y la ejecucin de las pruebas de toxicidad y para el anlisis y la interpretacin de los resultados obtenidos. Por tanto, el diseo experimental, el muestreo, la recoleccin de datos, las pruebas y los anlisis deben ceirse a principios estadsticos estrictos. El anlisis de relaciones entre dos o ms variables necesario en la mayora de los casos, requiere la utilizacin de tcnicas estadsticas de regresin. Sin embargo, antes de ser aplicadas, se requiere la seleccin de la ecuacin matemtica con la que se relacionaran y la definicin del tipo de variables.
Las variables cuantitativas son procesadas en forma directa a travs del anlisis estadstico de regresin, mientras que las cualitativas deben ser transformadas antes de ser analizadas. Este ltimo caso se presenta en los ensayos donde se evala la mortalidad ya que slo pueden existir los
24 Castillo, Gabriela, (ed.). 2004 ENSAYOS TOXICOLGICOS Y MTODOS DE EVALUACIN DE
CALIDAD DE AGUAS Estandarizacin, intercalibracin, resultados y aplicaciones, IDRC/IMTA. [publicacin en lnea]. Disponible desde Internet en: www.idrc.ca
http://www.idrc.ca/
25
estados vivo o muerto (variable cualitativa) y debe ser expresada como porcentaje de muertos antes de ser analizada.
En las pruebas de toxicidad, los ms utilizados son los de tipo emprico o descriptivo (es un modelo que intenta describir cuantitativamente los patrones de las observaciones sin basarse en los procesos subyacentes o mecnica del proceso) de forma rectilnea, a los cuales se llega muchas veces luego de haber trasformado una o las dos variables estudiadas (variable cualitativa). La utilizacin de transformaciones no slo altera la forma de la relacin estudiada, sino que tambin modifica el comportamiento de las variables con respecto a los supuestos del mtodo estadstico a ser aplicado.
La seleccin del mtodo para estimar valores de CL50 en pruebas de toxicidad aguda con mltiples concentraciones depender de la forma de la distribucin de tolerancias. En general se recomiendan los siguientes cuatro mtodos para la estimacin de CL50 (USEPA, 1994):
El mtodo Probit (paramtrico)
El mtodo de Litchfield-Wilcoxon (grfico)
El mtodo de Spearman-Karber (no paramtrico)
El mtodo grfico.
3.2.9 ANLISIS DE REGRESIN Y ANLISIS PROBIT
Para el clculo de las CL50/ CE50/ CI50, generalmente se usa el anlisis Probit (con o sin ajuste). En un experimento tpico de pruebas de toxicidad aguda se tiene la siguiente situacin:
Concentracin de la sustancia o dosis (d)
Nmero de individuos expuestos (n)
Nmero de organismos muertos o afectados (r)
Porcentaje de efecto (p)25
100*n
rp
La representacin grfica de p vs. d, o relacin dosis-respuesta, genera una curva parablica que muchas veces presenta dificultades en la construccin
25 Daz Bez Mara Consuelo, Bustos Lpez Martha, Espinosa Ramrez Adriana Janneth, Adaptado de
Pruebas de toxicidad acutica: Fundamentos y mtodos, Unibiblos - U. Nal. Colombia, 2004
26
de un modelo lineal. Una forma de abordar este problema es transformando d a una escala logartmica (X = log10 (d), lo cual mostrar una relacin dosis-respuesta de forma S o sigmoidea normal; de esta manera la distribucin de p vs. X ser de tipo normal.
Posteriormente, mediante las tablas de Probit se transforma p (porcentaje de efecto) a unidades Probit [buscando en una tabla de distribucin normal el valor de z correspondiente a una probabilidad acumulada igual a p y sumndole a continuacin cinco (5) unidades], se obtiene una distribucin de puntos en un sistema bivariado de tipo lineal, los cuales se procesan segn un anlisis de regresin tpico. Vale la pena enfatizar que el Probit es una transformacin sobre la tasa de efecto (p), y la ecuacin generada es de la forma:
y = a + bx
Donde:
y (expresado en unidades probit) = z + 5
z = variable normal estndar = z0 tal que la Prob (z z0) = p
a y b son los estimadores de los parmetros ; la recta de regresin
as, cuando p = 50% entonces y = 5, por lo tanto:
x5 = log10 CL50, entonces CL50 = 10x5
El procedimiento Probit permite encontrar estimadores m-verosmiles de parmetros de regresin y de tasas naturales (por ejemplo, tasas de mortalidad) de respuesta para ensayos biolgicos cuantales, analizando porcentajes de efecto vs. dosis; dentro del marco de la regresin26.
3.2.9.1 Mtodo grfico
Adems de los mtodos anteriores, se puede utilizar el mtodo grfico para estimar la CL50/CE50/CI50. De forma similar, se parte de los datos obtenidos en las pruebas de toxicidad aguda, y utilizando papel logartmico se grafican en el eje de las X las concentraciones (mg/L) y en el eje de las Y el porcentaje de mortalidad. Se colocan los puntos de los porcentajes de mortalidad observados (en escala lineal) en funcin de las concentraciones probadas (en escala logartmica); se conectan los puntos obtenidos ms cercanos al 50% del efecto observado, o sea, a la mayor concentracin que
26 Castillo, Gabriela, (ed.). 2004 ENSAYOS TOXICOLGICOS Y MTODOS DE EVALUACIN DE
CALIDAD DE AGUAS Estandarizacin, intercalibracin, resultados y aplicaciones, IDRC/IMTA. [publicacin en lnea]. Disponible desde Internet en: www.idrc.ca
http://www.idrc.ca/
27
no causa efecto txico y a la menor concentracin que causa efecto txico. A partir de la recta trazada, se obtiene el punto de corte correspondiente