CystickáCystická fibrosafibrosa

CystickáCystická fibrosafibrosa• dědičné-autosomálně recesivní (AR) onemocnění• závažná a chronicky progredující choroba• střední délka života 36,8 let

MultiorgánovéMultiorgánové postižení:postižení:- Dýchací cestyDýchací cesty:: hustý hlen vede k obstrukci dýchacích cest

infekce a sekundární zánětlivý proces progresivní destrukce plic.

- PankreasPankreas: : pankreatická insuficience tuková a proteinová malabsorpci

- JátraJátra: : jaterní léze, fokální biliární cirhóza

- IntestinumIntestinum: : obstrukce střeva, Meconiový illeus (15-20% dětí)

- Reprodukční traktReprodukční trakt: : aabsence vas deferens, infertilita (95% mužů)

- - KůžeKůže: : malfunkce potních žláz, zvýšený obsah soli v potu

PříčinaPříčina cystickécystické fibrosyfibrosy

NBD-nucleotid vázající domény (ATP)R

NBD1 NBD2

TM1 TM2

Cl-

- mutace v genu CFTR

- CFTR kóduje chloridový kanál: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator – transport Cl- přes plasmatickou membránu epiteliáních buněk výstelky dýchacích cest a jiných žláz

- cAMP regulovaný chloridový kanál

R-regulační doména (cAMPdep.)

TM- transmembránové domény

lumen

cytoplasma

MutaceMutace CFTRCFTR genugenu • mutace jsou germinální (ve všech buňkách jedince)• somatické nebyly dosud popsány• ancestrální povaha mutací přenášeny z generace na

generaci• mutace de novo – velmi vzácně• distribuce mutací je populačně specifická

F508delF508del• nejčastější mutace v české populaci ~70%• delece tří bází v exonu 10• výpadek methioninu 508 v proteinu

RNBD1 NBD2

TM1 TM2

Cl-

…E   N   I I F  G   V    S  Y   D…  …..GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC TAT GAT….

…..GAA AAT ATC ATT GGT GTT TCC TAT GAT…. …E   N   I I G   V    S  Y   D… 

VyšetřeníVyšetření mutacemutace F508delF508del

• Obecný primer (C)

Normal specific primer (N)

Mutation specific primer (M)

M

C

TARGET SEQUENCE

N

VyšetřeníVyšetření mutacemutace F508delF508del

PCR reakce probíhá ve dvou zkumavkách:

PCR Mix 0 obsahuje primer obecný a „normální“ PCR Mix 1 obsahuje primer obecný a „mutovaný“

O/N O/NO/NO/M O/MO/M

1 2 1 2 1 2

Homozygotbez mutace

Heterozygotpřenašeč

Homozygots mutací

VyšetřeníVyšetření mutacemutace F508delF508del

STS gen (P3,4) – kontrola průběhu PCR

CFTR gen (P0,2) – obecný primer– primer specifický na sekvenci bez mutace

STS gen (P3,4) – kontrola průběhu PCR

CFTR gen (P1,2) – obecný primer– primer specifický na

sekvenci s mutací

PC R Mix

1

PC R Mix

0

NKDNAmarker

Pacient 1 2 3 + + +

+ - +

PCRPCR protoprotokkool-vyšetření mutacel-vyšetření mutace ΔΔF508F508

Detekce mutace způsobující cystickou fibrózu v CFTR genu pomocí sekvenčně specifických primerů

PCR Mix 0 / Mix 1:

• Voda 8,5µl

• Pufr 2,0µl

• dNTP mix 4,0µl

• Mg2+ (MgCl2) 2,0µl

• Primery M0 / M1 1,2µl• DNA 2,0µl

• Taq polymeráza 0,4 µl (na ledu)