Ćwiczenia z biologii molekularnej

Click here to load reader

Post on 11-Jan-2017

240 views

Category:

Documents

3 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    1

    UNIWERSYTET MARII CURIE-SKODOWSKIEJ

    WYDZIA BIOLOGII I BIOTECHNOLOGII

    ZAKAD BIOLOGII MOLEKULARNEJ

    WICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ

    (zacznik do wicze)

    dla studentw II roku biologii oraz

    III roku mikrobiologii i biotechnologii

    LUBLIN 2015

    Wersja 1.3

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    2

    ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIA DNA W ELU AGAROZOWYM

    Agaroza to polisacharyd bdcy polimerem pochodnych galaktozy, otrzymywany

    przez oczyszczanie z agaru jadalnego. Agaroza jest atwo rozpuszczalna w wodzie,

    w temperaturze pokojowej odwracalnie tworzy el. Temperatura przejcia elu w zol

    (potocznie topnienie agarozy) jest wysza od temperatury zestalania.

    Elektroforeza DNA w elu agarozowym jest standardow metod pozwalajc

    rozdzieli, zidentyfikowa lub oczyci fragmenty DNA. Do zalet tej metody naley zaliczy

    jej prostot a take moliwo bezporedniej lokalizacji fragmentw DNA w elu przy

    pomocy barwnika interkalujcego bromku etydyny

    Czynniki wpywajce na tempo migracji DNA w elu agarozowym.

    Masa czsteczkowa DNA:

    Wiksze czsteczki DNA migruj wolniej ni czsteczki mae ze wzgldu na wiksze

    opory ruchu oraz wiksze trudnoci w penetrowaniu porw elu bdcego rodzajem sita

    molekularnego. Tempo migracji jest odwrotnie proporcjonalne do logarytmu dziesitnego

    iloci par zasad.

    Stenie agarozy:

    Zwikszajc stenie agarozy zwalnia si tempo migracji DNA w elu. Na podstawie

    prac dowiadczalnych ustalono optymalne stenie agarozy do rozdziaw fragmentw DNA

    o okrelonej wielkoci. Dane te przedstawiono w tabeli:

    Optymalne stenie agarowy

    Wielko czsteczki DNA (kb) Stenie agarozy (%w/v)

    5 - 60 0,3

    1 - 20 0,6

    0,8 - 10 0,7

    0,5 - 7 0,9

    0,4 - 6 1,2

    0,2 - 3 1,5

    0,1 - 2 2,0

    http://pl.wikipedia.org/wiki/Polisacharydhttp://pl.wikipedia.org/wiki/Galaktozahttp://pl.wikipedia.org/wiki/Agar

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    3

    Stosowane napicie prdu podczas elektroforezy:

    Przy niskich napiciach tempo migracji liniowych czsteczek kwasw nukleinowych

    jest wprost proporcjonalne do napicia. Zaleno ta przestaje obowizywa dla duych

    czsteczek DNA rozdzielanych przy zastosowaniu wysokich napi, dlatego te w czasie

    rozdziau czsteczek wikszych ni 2000 pz (2 kb) nie naley stosowa napicia wikszego

    ni 5 V/cm.

    Temperatura rozdziau:

    Temperatura w jakiej dokonuje si rozdziau w zakresie od 4C do temperatury

    pokojowej nie wpywa w istotnym stopniu na elektroforetyczne waciwoci DNA. Ma

    jednake wpyw na biern dyfuzj kwasw nukleinowych w elu, co moe mie wpyw

    (szczeglnie w przypadku wyszych temperatur a take mniejszych fragmentw DNA) na

    ostro prkw. Obnienie temperatury podczas rozdziau powoduje wyostrzenie

    poszczeglnych prkw. W celu przeprowadzenia elektroforezy w obnionej temperaturze

    naley zastosowa aparat z wymiennikiem ciepa.

    Bromek etydyny:

    Obecno bromku etydyny w buforze do elektroforezy (i elu) lub w barwniku do

    prbek zwalnia tempo przemieszczania si czsteczek o ok. 15%.

    Skad i sia jonowa buforu:

    W buforze o niskiej sile jonowej DNA przemieszcza si bardzo wolno. W wypadku

    stosowania buforu o duej sile jonowej wydzielana jest dua ilo ciepa, ktre moe

    spowodowa roztopienie agarozy i denaturacj DNA. Najpowszechniej stosowany jest bufor

    TAE.

    Elektroforez natywnego RNA przeprowadza si wedug tych samych zasad co

    elektroforez DNA. Jednake wikszo czsteczek RNA tworzy zoone struktury

    drugorzdowe co powoduje, e szybko migracji takich czsteczek RNA nie jest

    proporcjonalna do ich wielkoci. Ponadto, czsteczki takie mog tworzy kilka form

    widocznych na elu w postaci oddzielnych prkw. Tote, prbki RNA przed elektroforez

    czsto poddaje si denaturacji i elektroforez przeprowadza si w warunkach denaturujcych.

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    4

    Materiay i odczynniki

    1. Bufor prbkowy do elektroforezy RNA 2x stony:

    95% formamid

    0,025 % SDS

    0,025% bkit bromofenolowy

    0,025% bromek etydyny

    0,5 mM EDTA, w wodzie

    2. Bufor prbkowy do elektroforezy DNA:

    10 mM Tris-HCl, pH 8,0

    30 % glicerol

    0,04% bkit bromofenolowy

    3. Bufor TAE 50 x stony:

    242 g Tris

    57,1 ml kw. octowy lodowaty

    100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0

    dopeni H2O do 1000 ml

    4. Agaroza

    5. Bromek etydyny 10 mg/ml

    6. Markery do elektroforezy kwasw nukleinowych

    7. Zestaw do elektroforezy kwasw nukleinowych

    Wykonanie wiczenia

    Uwaga! Prac z bromkiem etydyny wykonywa w rkawicach ochronnych.

    Zgodnie z zaleceniami prowadzcego wiczenia, przygotowa 100 ml 0,7% lub 1%

    roztworu agarozy w buforze TAE. W tym celu odpowiednio 0,7 g lub 1 g agarozy rozpuci

    w 100 ml buforu TAE ( 2 ml 50x stonego buforu TAE + 98 ml H2O). Agaroz gotowa

    przez ok. 2 minuty w celu dobrego rozpuszczenia. Nastpnie roztwr agarozy schodzi do

    temp. 60-700C i doda 5 l roztworu bromku etydyny. Dokadnie wymiesza, wyla na pytk

    i pozostawi do zastygnicia.

    Badane prbki DNA lub RNA zawiesi w buforze prbkowym do elektroforezy,

    odpowiednio, DNA lub RNA. Pytk z zastygnitym elem agarozowym umieci w aparacie

    do elektroforezy. Aparat napeni buforem elektrodowym (1x stony TAE). Na el nanosi

    po 5-30 l prbek kwasw nukleinowych. Rozdzia prowadzi przy napiciu 100V dopki

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    5

    czoo barwnika nie dotrze do 3/4 dugoci elu. Po zakoczonej elektroforezie obserwowa

    rozdzielone kwasy nukleinowe pod lamp UV.

    ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIA BIAEK W ELU

    POLIAKRYLAMIDOWYM

    el poliakrylamidowy posiada nastpujce cechy: jest bezbarwny, pozbawiony

    adunkw, odznacza si du wytrzymaoci mechaniczn, atwy w przygotowaniu

    i formowaniu w odpowiednich naczyniach. el poliakrylamidowy to acuchy akrylamidu

    (H2C=CH-CO-NH2) poczone wizaniami poprzecznymi za pomoc N,N-metyleno-bis-

    akrylamidu (H2C=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2). W ten sposb tworzy si sie, przez

    oczka

    ktrej migruj rozdzielane czsteczki. Wielko oczek sieci elu zaley od

    stenia akrylamidu oraz bisakrylamidu. Polimeryzacja elu odbywa si w obecnoci

    nadsiarczanu amonu (APS) oraz N,N,N,N-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).

    Elektroforeza w elu poliakrylamidowym (PAGE) umoliwia rozdzia czsteczek

    biakowych rnicych si wielkoci i adunkiem elektrycznym. Rozdzia ten mona

    prowadzi w warunkach niedenaturujcych oraz w warunkach denaturujcych. Elektroforeza

    biaek w warunkach denaturujcych okrelana skrtem SDS-PAGE odbywa si w obecnoci

    soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), ktry jest detergentem jonowym. SDS czc si

    z grupami hydrofobowymi aminokwasw nadaje biakom adunek ujemny. Sprawia to, e

    migruj one w kierunku dodatniej anody. Ilo zwizanego SDS jest proporcjonalna do

    wielkoci czsteczek biakowych. Dziki temu rozdzielaj si one w elu pod wzgldem masy

    czsteczkowej. Polipeptydy o niszej masie czsteczkowej migruj szybciej, za wiksze

    wolniej. Metoda SDS-PAGE stosowana jest midzy innymi do: identyfikacji i monitorowania

    skadu mieszaniny biaek, sprawdzania jednorodnoci (homogennoci) biaek, oznaczania

    masy czsteczkowej biaek, analizy struktury podjednostkowej aktywnych biologicznie

    kompleksw biakowych.

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    6

    Elektroforeza w warunkach niedenaturujcych (PAGE)

    Materiay i odczynniki

    1. 30% roztwr akrylamidu + 0,8% roztwr bisakrylamidu

    2. 1,5M roztwr Tris-HCl pH 8,8

    3. 0,5M roztwr Tris-HCl pH 6,8

    4. 10% roztwr APS (nadsiarczanu amonu)

    5. TEMED

    6. 1% roztwr bkitu bromofenolowego

    7. 30% roztwr sacharozy

    8. Bufor elektrodowy:

    Glicyna 14,4 g

    Tris 3,0 g

    uzupeni wod do1000 ml

    9. Wzorce biakowe

    10. Zestaw do elektroforezy biaek

    Przygotowanie elu i prbek biakowych

    Umyte i odtuszczone specjalne pytki szklane do elektroforezy, zoy zgodnie ze

    wskazwkami prowadzcego wiczenia. Przygotowa 2 rodzaje eli poliakrylamidowych

    wedug przepisu:

    Uwaga! Prac z akrylamidem wykonywa w rkawicach ochronnych.

    Roztwory dodawa wg przedstawionej kolejnoci.

    TEMED inicjator polimeryzacji, dodawa jako ostatni skadnik,

    bezporednio przed wylaniem mieszaniny midzy pytki !

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    7

    el separujcy

    ODCZYNNIK el 10%

    (8 ml)

    el 10%

    (8 ml) z

    edestyn

    el 12%

    (8 ml)

    el 13,8%

    (8 ml)

    el 15%

    (8 ml)

    H2O

    30% akrylamid + 1% bisakrylamid

    1,5 M Tris-HCl, pH 8,8

    10% APS

    1% edestyna

    TEMED

    3,1 ml

    2,7 ml

    2,0 ml

    80 l

    -

    8 l

    2,3 ml

    2,7 ml

    2,0 ml

    80 l

    0,8 ml

    8 l

    2,6 ml

    3,2 ml

    2,0 ml

    80 l

    -

    8 l

    2,2 ml

    3,6 ml

    2,0 ml

    80 l

    -

    8 l

    1,8 ml

    4,0 ml

    2,0 ml

    80 l

    -

    8 l

    el zagszczajcy

    ODCZYNNIK na 2,5 ml elu na 5,0 ml elu

    H2O

    30% akrylamid + 1% bisakrylamid

    0,5 M Tris-HCl, pH 6,8

    10% APS

    TEMED

    1,3 ml

    0,5 ml

    0,625 ml

    25 l

    2,5 l

    2,6 ml

    1,0 ml

    1,25 ml

    50 l

    5 l

    Polimeryzacj elu wykona midzy przygotowanymi pytkami szklanymi, zgodnie ze

    wskazwkami prowadzcego wiczenia.

    Prbki do analizy przygotowa w nastpujcy sposb: do kadej probwki

    zawierajcej analizowane biaka lub wzorce biakowe (130 g biaka w objtoci 30l)

    doda po 10l 30% sacharozy i 1l 1% bkitu bromofenolowego. Dokadnie wymiesza

    i bez ogrzewania uywa do dowiadcze..

    Pytki ze spolimeryzowanym elem poliakrylamidowym umieci w aparacie do

    elektroforezy. Aparat napeni buforem elektrodowym. Przygotowane prbki ostronie

    nanie do studzienek w elu zagszczajcym. Podczy elektrody do zasilacza. Rozdzia

    elektroforetyczny prowadzi pod napiciem 120 V tak dugo, a barwnik przesunie si do

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    8

    koca elu separujcego. Wyczy zasilacz, wyj pytki z elem, a nastpnie przeprowadzi

    kolejno barwienie i odbarwianie elu.

    Elektroforeza w warunkach denaturujcych (SDS-PAGE)

    Materiay i odczynniki

    1. 30% roztwr akrylamidu + 0,8% roztwr bisakrylamidu

    2. 1,5M roztwr Tris - HCl pH 8,8

    3. 0,5M roztwr Tris - HCl pH 6,8

    4. 10% roztwr SDS

    5. 10% roztwr APS

    6. TEMED

    7. Bufor prbkowy (4x stony) :

    1,25M roztwr Tris-HCl pH 6,8 0,5ml

    Glicerol 1,0ml

    10% roztwr SDS 2,0ml

    DTT 154mg

    H2O 1,3ml

    1% roztwr bkitu bromofenolowego 200l

    8. Bufor elektrodowy:

    Glicyna 14,4g

    Tris 3,0g

    SDS 1,0g

    uzupeni wod do 1000ml

    9. Wzorce biakowe

    10. Zestaw do elektroforezy biaek

    Przygotowanie elu i prbek biakowych

    Umyte i odtuszczone specjalne pytki szklane do elektroforezy zoy zgodnie ze

    wskazwkami prowadzcego wiczenia. Przygotowa el poliakrylamidowy wedug

    przepisu:

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    9

    Uwaga! Prac z akrylamidem wykonywa w rkawicach ochronnych.

    Roztwory dodawa wg przedstawionej kolejnoci.

    TEMED inicjator polimeryzacji, dodawa jako ostatni skadnik,

    bezporednio przed wylaniem mieszaniny midzy pytki !

    el separujcy

    ODCZYNNIK el 10%

    (8 ml)

    el 12%

    (8 ml)

    el 13,8%

    (8 ml)

    el 15%

    (8 ml)

    H2O

    30% akrylamid + 1%bisakrylamid

    1,5 M Tris-HCl, pH 8,8

    10% SDS

    10% APS

    TEMED

    3,1 ml

    2,7 ml

    2,0 ml

    80 l

    80 l

    8 l

    2,6 ml

    3,2 ml

    2,0 ml

    80 l

    80 l

    8 l

    2,2 ml

    3,6 ml

    2,0 ml

    80 l

    80 l

    8 l

    1,8 ml

    4,0 ml

    2,0 ml

    80 l

    80 l

    8 l

    el zagszczajcy

    ODCZYNNIK na 2,5 ml elu na 5,0 ml elu

    H2O

    30% akrylamid + 1%bisakrylamid

    0,5 M Tris-HCl, pH 6,8

    10% SDS

    10% APS

    TEMED

    1,3 ml

    0,5 ml

    0,625 ml

    25 l

    25 l

    2,5 l

    2,6 ml

    1,0 ml

    1,25 ml

    50 l

    50 l

    5 l

    Polimeryzacj elu wykona midzy przygotowanymi pytkami szklanymi, zgodnie ze

    wskazwkami prowadzcego wiczenia .

    Prbki do analizy przygotowa w nastpujcy sposb: do kadej probwki

    zawierajcej analizowane biaka lub wzorce biakowe (1-30 g biaka w objtoci 30 l)

    doda po 10 l buforu prbkowego (4x stonego) i wymiesza. Nastpnie, prbki ogrzewa

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    10

    przez 3 min. w temp. 900C. Bufor prbkowy zawierajcy SDS i DTT niszczy struktur

    natywn biaek w podwyszonej temperaturze.

    Pytki ze spolimeryzowanym elem poliakrylamidowym umieci w aparacie do

    elektroforezy. Aparat napeni buforem elektrodowym. Przygotowane prbki biakowe

    ostronie nanie do studzienek w elu zagszczajcym. Rozdzia prowadzi pod napiciem

    150V tak dugo, a barwnik przesunie si do koca elu separujcego. Wyczy zasilacz,

    wyj pytki z elem do wybarwienia .

    Barwienie biaek po elektroforezie

    Celem uwidocznienia oraz identyfikacji rozdzielonych prkw biakowych, el

    poliakrylamidowy po elektroforezie poddaje si barwieniu. Najczciej stosuje si tu roztwr

    barwnika Coomassie lub barwienie metod srebrow .

    A. Barwienie bkitem Coomassie

    Odczynniki

    Mieszanina barwica:

    Metanol 400 ml

    Kwas octowy 100 ml

    H2O 500 ml

    Bkit Coomassie 2,5 g

    Odbarwiacz:

    Metanol 400 ml

    Kwas octowy 100 ml

    H2O 500 ml

    Wykonanie wiczenia

    Wyjty el poliakrylamidowy umieci w roztworze barwnika na okres okoo

    15-30 min. Po tym czasie, zla barwnik, el przepuka wod a nastpnie odbarwia go

    roztworem odbarwiajcym tak dugo, a widoczne stan si rozdzielone prki biaka. Po

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    11

    wybarwieniu el wysuszy. Barwienie bkitem Coomassie pozwala na wykrycie prkw

    biakowych zawierajcych okoo 0,1 g biaka.

    B. Barwienie srebrem

    Jest to metoda 10-100 razy czulsza od metody barwienia biaek bkitem Coomassie.

    W metodzie srebrowej wikszo biaek ulega zabarwieniu na kolor czarny lub brzowy.

    Lipoproteiny wybarwiaj si na niebiesko, a glikoproteiny na brzowo lub czerwono.

    METODA I

    Odczynniki

    Nr 1. 10% roztwr kwasu trichlorooctowego (TCA)

    Nr 2. 2% roztwr bkitu Coomassie G - 250

    Nr 3. Roztwr do barwienia koloidalnego:

    (NH4)2SO4 70 g

    85% H3PO4 23,6 ml

    Metanol 200 ml

    uzupeni wod do 950 ml

    Nr 4. 0,2 mM roztwr DTT: 10 l 2M DTT w 100 ml H2O

    Nr 5. 0,1% roztwr AgNO3: 50 mg AgNO3 w 50 ml H2O

    Nr 6. 3% roztwr Na2CO3 + 0,018% HCHO: 7,5 g Na2CO3

    125 l 37% HCHO w 250 ml H2O

    Nr 7. 20% kwas cytrynowy: 5 g kw. cytrynowego w 25 ml H2O

    Uwaga! Odczynniki nr 4, 5, 6 przygotowa bezporednio przed uyciem.

    Barwienie wykonywa w kuwecie przeznaczonej wycznie do tego celu.

    Wykonanie wiczenia

    1. el poliakrylamidowy po elektroforezie utrwala przez 1 godz. w 50ml 10% TCA .

    2. Puka 3 x 5 min w 100 ml wody destylowanej.

    3.Barwi el przez 1godz. w 50 ml roztworu do barwienia koloidalnego, zawierajcego

    2,5 ml 2% bkitu Coomassie.

    4. Puka 3 x 5 min. w 100 ml wody destylowanej.

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    12

    5. Puka 10 min. w 50 ml wody destylowanej, w gorcej ani wodnej stale mieszajc.

    6. Doda 50 ml 0,2M DTT i miesza przez nastpne10 min. w gorcej ani wodnej.

    7. Przepuka el w 100 ml wody destylowanej.

    8. Barwi w 50 ml 0,1% AgNO3 w gorcej ani wodnej przez 10 min. stale mieszajc.

    9. Przepuka el 100 ml wody destylowanej.

    10. Doda 50ml roztworu wywoywacza barwy (odczynnik nr 6) na okoo 30 sek., nastpnie

    zla go i powtrnie doda 50 ml wieego wywoywacza. Cao dokadnie miesza. Z chwil

    pojawienia si pierwszych prkw biakowych doda pozosta porcj wywoywacza i

    cao miesza do momentu pojawienia si wyranych prkw biakowych.

    11. Zatrzyma barwienie przez dodanie 25 ml 20% kw. cytrynowego (odczynnik nr 7).

    METODA II

    Odczynniki

    1. Roztwr A (50% metanol, 10% kw. octowy)

    2. 30% etanol

    3. Roztwr B (20 mg tiosiarczanu sodu na 100 ml H2O)

    4. Roztwr C ( 5 ml 25% glutaraldehydu + 95 ml H2O)

    5. Roztwr D (200 mg AgNO3 + 75 l 37% formaldehydu + 100 ml H2O)

    6. Roztwr E (6g Na2CO3 + 50 l 37% formaldehydu + 200 l tiosiarczanu z wyj.

    roztworu 20 mg na 10 ml H2O dopeni wod do 100 ml)

    Uwaga! Roztwory B, C, D i E przygotowa bezporednio przed uyciem.

    Barwienie wykonywa w kuwecie przeznaczonej wycznie do tego celu.

    Wykonanie wiczenia

    1. el poliakrylamidowy po elektroforezie utrwala przez 3 x 1 godz. lub przez noc

    w 100 ml roztworu A.

    2. Doda 100 ml 30% etanolu i miesza przez 1 godz.

    3. Doda 100 ml roztworu B i miesza przez 1 min.

    4. Doda 100 ml roztworu C i miesza przez 30 min.

    5. Puka 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.

    6. Barwi w 100 ml roztworu D, stale mieszajc przez 20 min.

    7. Puka 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    13

    8. Doda 100 ml roztworu E (wywoywacza barwy) i miesza do momentu pojawienia

    si wyranych prkw biakowych.

    9. Puka 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.

    10. Zatrzyma barwienie przez dodanie 100 ml roztworu A na 10 min.

    11. Przepuka el wod i wysuszy.

    ILOCIOWE OZNACZANIE BIAKA

    METODY SPEKTROFOTOMETRYCZNE

    Biaka charakteryzuj si zdolnoci absorpcji promieniowania ultrafioletowego,

    ktrej maksimum przypada na fale o dugoci 280nm oraz 235nm. Wie si to z obecnoci

    aminokwasw aromatycznych (tyrozyna, tryptofan) oraz wiza peptydowych w acuchu

    polipeptydowym. Na warto absorpcji mog wpywa zanieczyszczenia kwasami

    nukleinowymi, dla ktrych maksimum absorpcji promieni UV przypada na fale o dugoci

    260nm.

    Metoda Beavena i Holidaya

    Zasada metody polega na spektrofotometrycznym pomiarze absorpcji promieni UV o

    dugoci 280 nm oraz 260 nm, przez jednocentymetrow warstw badanego roztworu biaka.

    Uzyskane wartoci podstawia si do wzoru i oblicza stenie biaka w mg/ml:

    Cbiaka(mg/ml) = 1,55 A280 - 0,76 A260

    Metoda ta obarczona jest pewnym bdem, wynikajcym z rnej zawartoci

    aminokwasw aromatycznych w rnych biakach oraz zanieczyszcze kwasami

    nukleinowymi.

    Metoda Whitakera i Granuma

    Jest to metoda spektrofotometrycznego oznaczenia stenia biaka, w ktrej wykonuje

    si pomiar absorpcji promieni UV o dugoci fali 280 nm oraz 235 nm. Otrzymane wartoci

    absorpcji podstawia si do wzoru i oblicza stenie biaka w mg/ml.

    2,51A-A C 280235ml)biaka(mg/

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    14

    W oznaczeniach stenia biaka t metod nie przeszkadza obecno kwasw

    nukleinowych, dla ktrych warto absorpcji fal wietlnych o dugoci 235 nm i 280 nm jest

    taka sama.

    Odczynniki

    Roztwory badanych biaek.

    Wykonanie wiczenia

    Przeprowadzi spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany

    roztwr biaka przy trzech dugociach fal 235 nm, 260 nm oraz 280 nm. Pomiar wykona

    wzgldem prby kontrolnej (bufor lub H2O dest. bez biaka). Jeli zaistnieje konieczno,

    (tzn. wielko absorpcji przekracza 1), naley prbk biaka rozcieczy, a nastpnie

    uwzgldni to przy obliczaniu jego stenia. Znajc warto absorpcji (A) obliczy stenie

    biaka wedug podanych wyej wzorw.

    METODA KOLORYMETRYCZNA

    Metoda Bradford

    Metoda ta pozwala na szybkie oznaczenie stenia biaka w roztworze. W metodzie

    Bradford wykorzystywana jest zdolno biaka do tworzenia kompleksu z barwnikiem

    zwanym bkitem Coomassie (Coomassie Brilliant Blue). Bkit Coomassie

    w rodowisku kwanym posiada zabarwienie brunatne, ktre zmienia si na bkitne w reakcji

    z biakiem. Natenie barwy jest proporcjonalne do stenia biaka. Absorpcj powstaego

    kompleksu barwnego odczytuje si w zakresie wiata widzialnego przy dugoci fali 595 nm.

    Odczynniki

    1. Odczynnik Bradford (preparat handlowy)

    2. Roztwr wzorcowy albuminy woowej o steniu 100g/ml

    3. Roztwr badanego biaka

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    15

    Wykonanie wiczenia

    a) wykrelenie krzywej wzorcowej

    Przygotowa 8 ponumerowanych probwek, do ktrych odmierzy (wedug tabeli)

    nastpujce iloci roztworu biaka wzorcowego i wody destylowanej:

    Nr probwki 1 2 3 4 5 6 7 8

    Wzorzec albuminowy (l) 20 40 80 100 120 160 200 0

    Woda (l) 780 760 720 700 680 640 600 800

    Ilo biaka w prbie (g) 2 4 8 10 12 16 20 0

    Do wszystkich probwek doda po 0,2 ml odczynnika Bradford i dokadnie wymiesza.

    Po upywie 5 min, zmierzy absorpcj w kolorymetrze przy dugoci fali 595nm.

    Pomiarw dokonywa wzgldem prby kontrolnej (nr 8). Wykreli krzyw wzorcow

    odkadajc na osi odcitych (X) stenia biaka, a na osi rzdnych (Y) wartoci absorpcji.

    b) wykonanie pomiaru w badanej prbce biaka.

    Do dwch probwek odmierzy 2 20 l badanego roztworu biaka (zgodnie z zaleceniami

    prowadzcego wiczenia) i uzupeni wod do objtoci 0,8 ml. Do wszystkich probwek

    doda po 0,2 ml odczynnika Bradford i dokadnie wymiesza. Po upywie 5 min, zmierzy

    absorpcj w kolorymetrze przy dugoci fali 595 nm.

    Stenie biaka odczyta z przygotowanej krzywej wzorcowej.

    ILOCIOWE OZNACZANIE KWASW NUKLEINOWYCH

    METODA SPEKTROFOTOMETRYCZNA

    Kwasy nukleinowe charakteryzuj si zdolnoci absorpcji promieniowania

    ultrafioletowego, ktrej maksimum przypada na fale o dugoci 260 nm. Na warto absorpcji

    mog wpywa zanieczyszczenia biakami, dla ktrych maksimum absorpcji promieni UV

    przypada na fale o dugoci 280 nm i 235 nm. Zasada metody polega na

    spektrofotometrycznym pomiarze absorpcji promieni UV o dugoci 260 nm, przez

    jednocentymetrow warstw badanego roztworu kwasu nukleinowego i obliczeniu jego

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    16

    stenia wiedzc e, absorpcja (A) o wartoci A = 1 odpowiada okoo 50 g/ml

    dwuniciowego dsDNA, okoo 33 g/ml jednoniciowego ssDNA oraz okoo 40 g/ml

    jednoniciowego ssRNA i 20 -30 g/ml oligonukleotydw.

    Przykad oznaczenia stenia RNA

    Objto prbki RNA: 100 l

    Rozcieczenie: 10 l prbki RNA + 490 l dest. wody (rozcieczenie 1/50)

    A260 rozcieczonej prbki = 0.55

    Stenie RNA = 40 g/ml x A260 x rozcieczenie

    = 40 g/ml x 0.55 x 50

    = 1100 g/ml

    Cakowita ilo RNA = stenie x objto prbki w ml

    = 1100 g/ml x 0,1

    = 110 g RNA

    Poniewa tak roztwory DNA jak i RNA czciowo absorbuj wiato przy dugoci fali

    280 nm, a roztwory biaek czciowo pochaniaj wiato rwnie przy dugoci fali 260 nm,

    stosunek odczytu przy dugoci fali 260 nm i 280 nm (A260/A280) informuje o czystoci

    kwasw nukleinowych. W przypadku dobrej izolacji warto A260/A280 dla DNA wynosi 1,8

    2,0, a dla RNA 1,9 2,1.

    Odczynniki

    Roztwory badanych kwasw nukleinowych.

    Wykonanie wiczenia

    Przeprowadzi spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany

    roztwr kwasu nukleinowego przy dwch dugociach fal 260 nm oraz 280 nm. Pomiar

    wykona wzgldem prby kontrolnej (bufor lub H2O). Jeli zaistnieje konieczno (tzn.

    wielko absorpcji przekracza 1), naley prbk kwasu nukleinowego rozcieczy (najlepiej

    wod), a nastpnie uwzgldni to przy obliczaniu jego stenia. Znajc warto absorpcji (A)

    obliczy czysto i stenie badanego kwasu nukleinowego.

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    17

    ILOCIOWE OZNACZANIE RYBOSOMW

    Stenie rybosomw w zawiesinie oznacza si spektrofotometrycznie przez pomiar

    absorpcji przy dugoci fali 260 nm. Otrzyman warto absorpcji podstawia si do wzoru i

    oblicza stenie rybosomw w mg/ml.

    C rybosomw w mg/ml = ( A260 X rozcieczenie ) : 11

    Odczynniki

    Roztwory badanych rybosomw

    Wykonanie wiczenia

    Przeprowadzi spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany

    roztwr rybosomw przy dugoci fali 260 nm. Pomiar wykona wzgldem prby kontrolnej

    (bufor lub H2O). Jeli zaistnieje konieczno, (tzn. wielko absorpcji przekracza 1), naley

    prbk rybosomw rozcieczy (zwykle konieczne jest rozcieczenie 1000 lub 2000-krotne).

    Znajc warto absorpcji (A) obliczy stenie rybosomw wedug podanego wyej wzoru.

    WYSALANIE BIAEK

    Dziki obecnoci grup polarnych w biakach, nastpuje wizanie czsteczek wody,

    ktre wytwarzaj tzw. paszcz hydratacyjny. Dodanie niektrych soli (np. siarczanu amonu

    bd siarczanu magnezu) do roztworu biaka, powoduje jego odwodnienie, co prowadzi do

    wytrcenia biaka z roztworu. Proces ten nosi nazw wysalania. Wysolone biako mona

    ponownie rozpuci w wodzie lub w odpowiednim buforze bez straty jego waciwoci

    biologicznych. Dziki temu wysalanie biaek stosuje si czsto w praktyce jako jeden

    z etapw ich agodnego wydzielania z roztworu. Aby uzyska okrelony stopie nasycenia

    siarczanem amonu, naley dokadnie zna objto badanego roztworu i na podstawie

    zaczonej tabeli (patrz strona 54) odway potrzebn ilo gramw soli. Podczas procedury

    wysalania biaek wana jest znajomo temperatury roztworu. Wytrcone biaka obserwuje

    si jako bezpostaciowe lub kaczkowate osady zawierajce pewn ilo soli, ktra wpywa

    ujemnie na pomiar stenia biaka. Usunicie soli z roztworu biaka moliwe jest poprzez

    dializ.

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    18

    DIALIZA BIAEK

    Metoda dializy pozwala m.in. na usunicie soli i innych zwizkw

    niskoczsteczkowych z roztworu biaka oraz zmian buforu w ktrym biako jest zawieszone.

    Materiay i odczynniki

    2% roztwr wglanu sodu

    0,5 M roztwr EDTA, pH 8,0

    Rozwr badanego biaka

    Roztwr dializacyjny (zgodnie z zaleceniami prowadzcego)

    Celulozowe we do dializy

    Zaciski do wy dializacyjnych

    Wykonanie wiczenia

    1. Uci potrzebn dugo wa dializacyjnego i gotowa przez 10 minut w 200 ml

    2% roztworu wglanu sodu z dodatkiem 1 mM EDTA w celu usunicia metali

    cikich i siarczkw. Dugo wa obliczy nastpujco:

    - dugo dializowana (mm) = [poj.(w l) x 3,2] / [szer. wa2 (w mm

    2)]

    - doda 10 % dugoci dializowanej

    - doda 4 cm na zaciski

    2. Po ozibieniu, dokadnie przepuka we wod destylowan (tak przygotowane

    we mona przechowywa w wodzie z dodatkiem substancji konserwujcych, np.

    NaN3 w 40C).

    3. Jeden koniec przygotowanego wa zamkn zaciskiem tak, aby wystawa on co

    najmniej na 1 cm. Otrzymany woreczek wypeni wod destylowan w celu

    sprawdzenia jego szczelnoci.

    4. Po wylaniu wody, napeni woreczek roztworem biaka przygotowanym do dializy.

    Z niewypenionej czci woreczka usun powietrze ciskajc delikatnie woreczek

    nad pynem.

    5. Zamkn zaciskiem drugi koniec wa i umieci woreczek w roztworze

    dializacyjnym. Dializ naley prowadzi, przy staym mieszaniu, w temperaturze 40C.

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    19

    6. Roztwr dializacyjny powinien by zmieniany co najmniej 3 razy w trakcie trwania

    dializy. Zaleca si wymian po upywie 2-4 godzin, 6-8 godzin i 10-14 godzin.

    Cakowita objto roztworu powinna by ok. 100 razy wiksza ni objto prbki

    biakowej.

    7. Po zakoczeniu dializy, zdj jeden zacisk, otworzy woreczek i usun roztwr

    za pomoc pipety.

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    20

    TABELA WYSYCE (NH4)2SO4 (temp. pokojowa)

    Kocowe nasycenie siarczanem amonu w %

    10 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100

    Nasycenie

    pocztkowe

    %

    Ilo gramw siarczanu amonu, ktr naley doda do 1 dm3 roztworu

    0 56 114 144 176 196 209 243 727 313 351 390 430 472 516 561 662 767

    10 57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 694

    20 29 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 619

    25 30 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 583

    30 19 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 546

    33 12 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 522

    35 31 63 94 129 164 200 238 278 319 411 506

    40 31 63 97 132 168 205 245 285 375 469

    45 32 65 99 134 171 210 250 339 431

    50 33 66 101 137 176 214 302 392

    55 33 67 103 141 179 264 353

    60 34 69 105 143 227 314

    65 34 70 107 190 275

    70 35 72 153 237

    75 36 115 198

    80 77 157

    90 79

    Uwaga ! Przystpujc do wysalania biaek w temperaturze 40C naley pomnoy

    wyliczon z Tabeli ilo gramw siarczanu amonu przez wspczynnik 0,92, ktry

    uwzgldnia zmniejszon rozpuszczalno tego zwizku w niszej temperaturze.

    Przykad : Jeeli procedur wysalania biaka (0% - 50% nasycenia) prowadzimy w temp. 40C,

    wwczas na 1 dm3 roztworu biaka naley przygotowa odwak 288g (313 g 0,92)

    siarczanu amonu. By zwikszy nasycenie siarczanem amonu od 50% do 100%, naley

    odway dodatkowo 360g (392 g 0,92) soli.

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    21

    Tabela 1

    Symbole wielokrotnoci i uamkw dziesitnych

    Symbol Okrelenie Przeliczenie

    T

    G

    M

    k

    h

    dk

    d

    c

    m

    n

    p

    Tera-

    Giga-

    Mega-

    Kilo-

    Hekto-

    Deka-

    Deci-

    Centi-

    Mili-

    Mikro-

    Nano-

    Piko-

    1012

    109

    106

    103

    102

    101

    10-1

    10-2

    10-3

    10-6

    10-9

    10-12

    1 000 000 000 000

    1 000 000 000

    1 000 000

    1 000

    100

    10

    0,1

    0,01

    0,001

    0,000 001

    0,000 000 001

    0,000 000 000 001

    Tabela 2

    Przybliona molowo i ciar waciwy stonych kwasw

    Zwizek Procent

    wagowy

    Molowo

    M

    Otrzymanie

    molowego

    roztworu (ml/l)

    Cir

    waciwy

    Kwas azotowy

    Kwas fosforowy

    Kwas nadchlorowy

    Kwas nadchlorowy

    Kwas octowy

    Kwas siarkowy

    Kwas solny

    70

    85

    60

    70

    99,5

    96

    37

    15,7

    14,8

    9,2

    11,6

    17,4

    18

    12

    64

    68

    109

    86

    58

    56

    84

    1,42

    1,70

    1,54

    1,67

    1,05

    1,84

    1,19

    Tabela 3

    Barwy promieniowania widzialnego

    Przybliony zakres

    dugoci fali

    (m)

    Barwa Barwa

    dopeniajca

    400-450

    450-480

    480-490

    490-500

    500-560

    560-575

    575-590

    590-625

    625-750

    fioletowa

    niebieska

    zielononiebieska

    niebieskozielona

    zielona

    tozielona

    ta

    pomaraczowa

    czerwona

    tozielona

    ta

    pomaraczowa

    czerwona

    purpurowa

    fioletowa

    niebieska

    zielononiebieska

    niebieskozielona

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    22

    WYKAZ STOSOWANYCH SKRTW

    APS - nadsiarczan amonowy (ang. Ammonium Persulphate)

    -MET - -merkaptoetanol (ang. -Mercaptoethanol)

    DEPC - pirowglan dietylu (ang. Diethyl Pyrocarbonate)

    DMEM - podoe do hodowli komrkowych (ang. Dulbecco/Vogt modified Eagles

    Minimal Essential Medium)

    dsDNA - dwuniciwy DNA (ang. double stranded DNA)

    DTT - ditiotreitol (ang. Dithiothreitol)

    EDTA - kwas etylenodwuaminoczterooctowy (ang. Ethylenediaminetetraacetic Acid)

    HeLa - linia komrkowa wywodzca si z komrek raka szyjki macicy Henrietty

    Lacks (ang. Henrietta Lacks cell)

    LB - podoe do hodowli bakterii (ang. Luria-Bertani medium)

    NIH 3T3 - linia komrkowa fibroblastw mysich (ang. National Institute of Health,

    3-day Transfer, inoculum 3 x 105 cells)

    PAGE - elektroforeza w elu poliakrylamidowym (ang. Polyacrylamide Gel

    Electrophoresis)

    PMSF - sulfofluorek fenylometanu (ang. Phenylmethylsulphonyl Fluoride)

    RPMI - podoe do hodowli komrkowych (ang. Roswell Park Memorial Institute

    medium)

    SD - podoe do hodowli drody (ang. synthetic defined)

    SDS - sl sodowa siarczanu dodecylu (ang. Sodium Dodecyl Sulphate)

    SDS-PAGE - elektroforeza w elu poliakrylamidowym w obecnoci SDS (ang. Sodium

    Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

    ssDNA - jednoniciowy DNA (ang. single stranded DNA)

    TAE - bufor do elektroforezy DNA/RNA (ang. Tris- Acetate-EDTA)

    TCA - kwas trjchlorooctowy (ang. Trichloroacetic Acid)

    TEMED - N,N,N,N-czterometyletylenodiamina (ang. N,N,N,N-

    tetramethylethylenediamine)

    Tris - trjhydroksymetyloaminometan; 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol

    UV - promieniowanie ultrafioletowe (ang. Ultraviolet )

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    23

    WYKAZ WYBRANYCH SUBSTANCJI CHEMICZNYCH STOSOWANYCH

    NA WICZENIACH

    Aceton wykorzystywany do wytrcania biaka z roztworu oraz przepukiwania osadw

    biaek

    APS inicjator polimeryzacji akrylamidu i N,N'-metylenobisakrylamidu

    -MET substancja redukujca, m. in. mostki dwusiarczkowe w biakach

    Bkit bromofenolowy barwnik stosowany w buforach do prbek DNA, RNA i biaek

    poddawanych elektroforezie elowej

    Bromek etydyny barwnik wykorzystywany do barwienia kwasw nukleinowych

    po elektroforezie elowej, silny mutagen.

    DEPC inhibitor RNaz

    DTT substancja redukujca, m. in. mostki dwusiarczkowe w biakach

    EDTA chelator jonw dwuwartociowych, substancja hamujca nukleazy

    Fenol stosowany do ekstrakcji kwasw nukleinowych, substancja denaturujca biaka,

    silnie rca i toksyczna

    NaH2PO4 substancja buforujca, utrzymuje pH roztworu

    NaCl substancja zapewniajca si jonow roztworu

    PMSF nieodwracalny inhibitor proteaz serynowych

    SDS anionowy detergent, upynniajcy wszystkie bony komrkowe i denaturujcy biaka,

    nadajcy biakom ujemny adunek wypadkowy

    TCA silny kwas, stosowany do wytrcania biaka z roztworu

    TEMED katalizator polimeryzacji akrylamidu i N,N'-metylenobisakrylamidu

    Tris (w formie Tris-HCl, Tris-octan, Tris-glicyna) substancja buforujca, utrzymuje pH

    roztworu w zakresie 7-9

    Triton X-100 detergent uywany do lizy bon komrkowych.

  • Zakad Biologii Molekularnej UMCS, wrzesie 2015

    24

    LITERATURA

    1. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., Biochemia, PWN, Warszawa, 2005

    2. Brown T.A., Genomy, PWN, Warszawa, 2009

    3. Kyszejko-Stefanowicz L., Cytobiochemia, PWN, Warszawa, 2002

    4. Sambrook J., Russell D.W., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor

    Laboratory Press, 2001

    5. Tuner P.C. i inni, Krtkie wykady. Biologia molekularna, PWN, Warszawa, 2007

    6. Prace oryginalne i artykuy przegldowe wskazane przez prowadzcego wiczenia.