curso validacion néstor

Curso: Técnicas Estadísticas Aplicadas al Sistema de Gestión de Laboratorios bajo la

ISO/IEC 17025

Tema: Validación de Métodos de ensayo analíticos con aplicaciones de MINITAB y

Excel

Expositor: José Camero Jiménez

Octubre 2007

http://images.google.com.pe/imgres?imgurl=http://www.inictel.gob.pe/htmls/images/CIP.jpg&imgrefurl=http://www.inictel.gob.pe/htmls/Dia%2520MundialTelecomunicaciones15Mayo.htm&h=225&w=216&sz=50&hl=es&start=1&tbnid=Y7mO_gDyfSmTnM:&tbnh=108&tbnw=104&prev=/images%3Fq%3DCOLEGIO%2BDE%2BINGENIEROS%2BDEL%2BPERU%26gbv%3D2%26svnum%3D10%26hl%3Des%26sa%3DX















VALIDACIÓN

VALIDAR :

“Confirmar el cumplimiento de los requisitos particulares para un uso especificado propuesto, por medio del examen y la presentación de evidencias objetivas”.

ISO 8402: 1994





















Validación de Métodos de Validación de Métodos de Ensayo:Ensayo:

Es un proceso mediante el cual se define requisitos analíticos, que aseguran que el método de ensayo bajo ciertas consideraciones ha desarrollado capacidades consistentes con la aplicación requerida.

(EURACHEM Guide. The fitness for purposse of analytical methods)

Guía para efectuar Validación de Métodos de Ensayos

INDECOPI





















¿ Cuando es necesario validar un método de ensayo?

Un método de ensayo se validad cuando es necesario verificar que los parámetros ejecutados son los adecuados para resolver un problema analítico en particular. El laboratorio debe validar :

1. Los métodos de ensayo no normalizados.

2. Los métodos de ensayo normalizados modificados, ampliados o aplicados a un alcance diferente al originalmente establecidos en la norma.

3. Cuando se requiera demostrar la equivalencia entre dos métodos de ensayo.





















PLANEAMIENTO DE VALIDACIÓN

PLANEAMIENTO DE VALIDACION

1

Definir Objetivo

2

Definir parámetros de validación

3

Definir procedimiento operacional

de validación

4

Definir los Ensayos de validación

5

Verificar compatibilidad

de equipos

6

Caracterizar materiales

7

Ejecutar ensayos preliminares

8

Ajustar los parámetros

de validación

9

Ejecutar los ensayos completos

10

Prepararprocedimiento

rutina

11

Definir criterios

de revalidación

12

Definir tipo y frecuencia

de verificación de control de calidad





















PARÁMETROS DE VALIDACIÓN

33

Selectividad / Especificidad

11Veracidad 55

Linealidad

44

LDM y LCM

22

Precisión

88

Robustez

66Rango de

Trabajo

77

Sensibilidad 99

Incertidumbre






















1. Veracidad:1. Veracidad:

Grado de concordancia existente entre el valor medio obtenido de una gran serie de resultados y un valor aceptado como referencia.

(ISO 5725 - 1)






















2. Precisión:2. Precisión:

Grado de coincidencia existente entre los resultados independientes de un ensayo, obtenidos en condiciones estipuladas.

(ISO 5725 - 1)






















2.1 Exactitud:2.1 Exactitud:

Grado de concordancia existente entre el resultado del ensayo y un valor aceptado de referencia.

(ISO 5725 - 1)





















VERACIDADVERACIDADP

REC

ISIO

NP

REC

ISIO

N- +- +

+ -

+ -

EXACT

ITUD

EXACT

ITUD






















3. Selectividad/Especificidad:3. Selectividad/Especificidad:

Es el grado por el cual un método puede determinar un analito particular dentro de una mezcla compleja, sin ser interferido por otros componentes de la mezcla.

(EURACHEM – Guide The fitness for purpose of analytical methods)






















4. Límite de Detección del 4. Límite de Detección del Método (LDM) y Límite de Método (LDM) y Límite de Cuantificación del Método Cuantificación del Método (LCM) :(LCM) :

4.1 LDM :4.1 LDM :Es la menor cantidad de un analito en una muestra la cual puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada con un valor exacto.























4. Límite de Detección del 4. Límite de Detección del Método (LDM) y Límite de Método (LDM) y Límite de Cuantificación del Método Cuantificación del Método (LCM) :(LCM) :

4.2 LCM :4.2 LCM :Es la concentración mínima que puede determinarse con un nivel aceptable de exactitud.























5. Linealidad:5. Linealidad:

Es la relación entre la concentración de analito y respuesta del método. Esta relación, denominada comúnmente curva patrón o curva de calibración.Define la capacidad del método para obtener los resultados de la prueba proporcionales a la concentración del analito.























6. Rango de Trabajo:6. Rango de Trabajo:

Es el intervalo entre la más alta y más baja concentración del analito de la muestra, para la cual se ha demostrado que el método analítico tiene un nivel apropiado de precisión, veracidad y linealidad.

(Text on validation of analytical procedures. ICH Harmonized Tripartite Guideline)






















7. Sensibilidad:7. Sensibilidad:

Es el cambio en la respuesta de un instrumento de medida dividido por el cambio correspondiente en el estímulo.

(Text on validation of analytical procedures. ICH Harmonized Tripartite Guideline)






















8. Robustez:8. Robustez:

Es la medida de la resistencia de un método al cambio de respuesta cuando se introducen pequeñas variaciones en el procedimiento.(EURACHEM – Guide The fitness for purpose of analytical methods)






















9. Incertidumbre:9. Incertidumbre:

Un parámetro asociado con el resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser atribuidos razonablemente al mensurando.(EURACHEM – Cuantificación de la Incertidumbre en Mediciones Analíticas )





















DETERMINACIÓN DE VERACIDAD

1 CASO : Repeticiones en Muestra de Referencia Certificada (MRC)

MRCMRC

Repetición 1Repetición 1



Repetición 4Repetición 4...Repetición nRepetición n

Se determina por :

• Prueba T-Student.

• Prueba de Wilcoxon.





















Prueba T-Student

nx

t erimental

exp

T experimental : Se determina de la siguiente manera:

Existe diferencia significativas si :

tablaerimental tt exp

T tabla : Se determina de la siguiente manera:

2

1,1

ntabla tt





















Repeticiones ppm Repeticiones ppm Repeticiones ppm1 863 11 851 21 8582 849 12 849 22 8583 856 13 864 23 8694 868 14 865 24 8645 861 15 856 25 8716 860 16 862 26 8687 872 17 860 27 8568 878 18 848 28 8699 853 19 864 29 872

10 868 20 862 30 875

Determinación de Fierro en MRC con 866 ppm

Ejemplo: Determinar veracidad en los siguientes resultados de ensayo con una MRC de 866ppm de fierro





















Prueba de Normalidad

Av erage: 862.3StDev : 7.91398N: 30

Anderson-Darling Normality TestA-Squared: 0.201P-Value: 0.870

848 858 868 878

.001

.01

.05

.20

.50

.80

.95

.99

.999

Pro

babi

lity

Fierro

Normal Probability Plot





















Test of mu = 866.00 vs mu not = 866.00

Variable N Mean StDev SE Mean T PFierro 30 862.30 7.91 1.44 -2.56 0.016

T-Test of the Mean

Conclusión: Los resultados de las repeticiones no son veraces al 95% de confianza.





















Repeticiones %Grasa Repeticiones %Grasa Repeticiones %Grasa1 8.57 11 8.21 21 8.352 8.58 12 8.53 22 8.293 8.54 13 8.55 23 8.454 8.22 14 8.28 24 8.315 8.27 15 8.48 25 8.216 8.53 16 8.22 26 8.527 8.46 17 8.22 27 8.568 8.46 18 8.4 28 8.579 8.27 19 8.22 29 8.36

10 8.39 20 8.38 30 8.23

Determinación de %Grasa en MRC con 8.4%

Ejemplo: Determinar veracidad en los siguientes resultados de ensayo con una MRC de 8.4% de grasa






















Av erage: 8.38767StDev : 0.134079N: 30


8.2 8.3 8.4 8.5

.001

.01

.05

.20

.50

.80

.95

.99

.999

Pro

babi

lity

%Grasa






















Test of median = 8.400 versus median not = 8.400

N for Wilcoxon Estimated N Test Statistic P Median%Grasa 30 29 187.0 0.517 8.390

Wilcoxon Signed Rank Test

Conclusión: Los resultados de las repeticiones son veraces al 95% de confianza.






















2 CASO :2 CASO : Repeticiones en Muestra en un método estandarizado y el método a validar.

MuestrMuestraa

Se determina por :

• Prueba T-Student dos muestras.

• Prueba de Mann Whitney.





...Repetición nRepetición n





...

Repetición nRepetición n

Método EstandarizadoMétodo Estandarizado Método a ValidarMétodo a Validar





















Pruebas para dos poblaciones Varianzas desconocidas S2

1 y S22

Pruebas para dos poblaciones Varianzas desconocidas S2

1 y S22

H0: 1 = 2 Ha: 1 2

H0: 1 - 2 = 0 Ha: 1 2

Comparamos con 0.

Pero, ¿cuál es la desviación estándar de ?

21 xx

21 xx





















Varianza de : Varianza de :

Si las poblaciones son independientes:

Así:

21 xx

)()()( 2121 xVarxVarxxVar

)()()( 2121 xVarxVarxxVar

)()()( 2121 xVarxVarxxDesvEst

2

22

1

21

nn





















)11

()(21

2

2

22

1

21

21 nnnnxxVar

2

11

21 )(

1

1 1

xxn

sn

ii

¡Pero σ2 es desconocido, y debemos estimarlo!

Si sólo tenemos las x el mejor estimador de σ2 es:

Si sólo tenemos las y, el mejor estimador de σ 2 es:

2

12

22 )(

1

1 2

yyn

sn

ii

Varianza de : Varianza de : 21 xx





















Estimar la varianza común S2Estimar la varianza común S2

Combinamos los dos estimadores y tenemos

para estimar la varianza común 2.

2

1

2

121

2 )()(2

1 21

yyxxnn

sn

ii

n

ii





















Prueba t para dos poblaciones independientes

Prueba t para dos poblaciones independientes

21

2121

11

)()(

nns

xxt

(Varianza común desconocida)

Con los supuestos de antes, t tiene una distribución t con n1+ n2 - 2 grados de libertad.





















Met. Valid Met. Stan. Met. Valid Met. Stan. Met. Valid Met. Stan.499 501 510 492 499 493491 502 490 504 504 505511 504 499 500 493 499501 500 495 506 498 491511 510 507 502 506 482518 481 492 500 495 496502 501 507 502 498 486505 512 505 510 501 489503 523 495 497 500 495497 506 495 516 500 496

Determinación de Fierro en ppm en muestra no certificada

Ejemplo: Determinar veracidad en los siguientes resultados de ensayo con una muestra no certificada analizada en 30 repeticiones por el método a validar y un método estandarizado





















Av erage: 500.9StDev : 6.61946N: 30


490 500 510

.001

.01

.05

.20

.50

.80

.95

.99

.999

Pro

babi

lity

MetVal























Av erage: 500.033StDev : 9.34947N: 30


480 485 490 495 500 505 510 515 520 525

.001

.01

.05

.20

.50

.80

.95

.99

.999

Pro

babi

lity

MetStan























Two sample T for MetVal vs MetStan N Mean StDev SE MeanMetVal 30 500.90 6.62 1.2MetStan 30 500.03 9.35 1.7

95% CI for mu MetVal - mu MetStan: ( -3.3, 5.1)T-Test mu MetVal = mu MetStan (vs not =): T = 0.41 P = 0.68 DF = 58Both use Pooled StDev = 8.10

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Conclusión: Los resultados del método son veraces al 95% de confianza.





















Met. Valid Met. Stan. Met. Valid Met. Stan. Met. Valid Met. Stan.7.64 7.44 7.56 7.46 7.78 7.517.48 7.48 7.71 7.59 7.58 7.567.57 7.52 7.69 7.68 7.49 7.747.52 7.61 7.52 7.69 7.55 7.467.55 7.52 7.74 7.78 7.63 7.787.57 7.63 7.69 7.78 7.42 7.497.79 7.42 7.47 7.55 7.62 7.767.77 7.46 7.48 7.55 7.74 7.557.55 7.54 7.62 7.61 7.46 7.827.45 7.71 7.4 7.48 7.58 7.73

Determinación de % Grasa en muestra no certificada

Ejemplo: Determinar veracidad en los siguientes resultados de ensayo con una muestra no certificada analizada en 30 repeticiones por el método a validar y un método estandarizado





















Av erage: 7.58733StDev : 0.111446N: 30


7.4 7.5 7.6 7.7 7.8

.001

.01

.05

.20

.50

.80

.95

.99

.999P

roba

bilit

y

MetVal























Av erage: 7.59667StDev : 0.121267N: 30


7.4 7.5 7.6 7.7 7.8

.001

.01

.05

.20

.50

.80

.95

.99

.999

Pro

babi

lity

MetStan























Mann-Whitney Confidence Interval and Test

Conclusión: Los resultados del método son veraces al 95% de confianza.

MetVal N = 30 Median = 7.5700MetStan N = 30 Median = 7.5550Point estimate for ETA1-ETA2 is 0.000095.2 Percent CI for ETA1-ETA2 is (-0.0700,0.0600)W = 910.0Test of ETA1 = ETA2 vs ETA1 not = ETA2 is significant at 0.9470The test is significant at 0.9469 (adjusted for ties)

Cannot reject at alpha = 0.05






















3 CASO : Repeticiones en diferentes muestras de un método estandarizado y el método a validar.

MuestrMuestra 1a 1 Se determina por :

• Prueba T-Student de las diferencias o Recta de Regresión.

•Prueba Wilcoxon de las diferencias.



..

..

..


Método

Estandarizado

Método a

Validar

MuestrMuestra 2a 2

MuestrMuestra na n
























Met. Valid Met. Stan. Met. Valid Met. Stan. Met. Valid Met. Stan.50 52 324 330 120 11658 59 60 58 142 14868 70 74 72 174 16975 74 486 490 202 198278 281 146 151 246 251224 226 165 169 284 291381 385 83 79 358 349428 434 90 88 401 396336 330 102 104 468 47176 80 112 114 500 496

Determinación de un analito en ppm en 30 muestras no certificada

Ejemplo: Determinar veracidad en los siguientes resultados de ensayo con 30 muestras no certificada analizada en 1 repetición por el método a validar y un método estandarizado





















Av erage: -0.666667StDev : 4.31783N: 30


-5 0 5

.001

.01

.05

.20

.50

.80

.95

.99

.999

Pro

babi

lity

Diferencia























Wilcoxon Signed Rank Test

Conclusión: Los resultados del método son veraces 95% de confianza.

Test of median = 0.000000 versus median not = 0.000000

N for Wilcoxon Estimated N Test Statistic P MedianDiferenc 30 30 188.5 0.371 -0.5000





















Asumiendo que las diferencias son normales:T-Test of the Mean


Test of mu = 0.000 vs mu not = 0.000

Variable N Mean StDev SE Mean T PDiferenc 30 -0.667 4.318 0.788 -0.85 0.40





















Regression Analysis

Predictor Coef StDev T P

Constant 0.472 1.453 0.32 0.748

Met.Val 1.00090 0.00558 179.29 0.000

Analysis of Variance

Source DF SS MS F P

Regression 1 620128 620128 32144.76 0.000

Residual Error 28 540 19

Total 29 620668

The regression equation is

Met.Stan = 0.47 + 1.00 Met.Val






















DETERMINACIÓN DE PRECISIÓN

1 CASO : Repeticiones en Muestra de Referencia Certificada (MRC)

MRCMRC




Repetición 4Repetición 4...Repetición nRepetición n

Se determina por :

• RSD de Horwitz.





















RSD Horwitz

%100exp x

RSD erimental

RSD experimental : Se determina de la siguiente manera:

Existe diferencia significativa si :

Horwitzerimental RSDRSD exp

RSD Horwitz : Se determina de la siguiente manera:

)log(5.012 iónConcentracHorwitzRSD





















Repeticiones ppm Repeticiones ppm Repeticiones ppm1 863 11 851 21 8582 849 12 849 22 8583 856 13 864 23 8694 868 14 865 24 8645 861 15 856 25 8716 860 16 862 26 8687 872 17 860 27 8568 878 18 848 28 8699 853 19 864 29 872

10 868 20 862 30 875

Determinación de Fierro en MRC con 866 ppm

Ejemplo: Determinar la precisión en los siguientes resultados de ensayo con una MRC de 866ppm de fierro





















7.91862.3

0.918%866

5.8%

Desviación EstandarPromedio

RSD experimentalMRC

RSD Horwitz

RSD Horwitz

Conclusión: Los resultados del método son precisos.





















DETERMINACIÓN DE PRECISIÓN

2 CASO : Repeticiones en Muestra en un método estandarizado y el método a validar.

MuestrMuestraa

Se determina por :

• Prueba F.

• Prueba de Levene.





...Repetición nRepetición n

Método Estandarizado Método a Validar





...






















Prueba F

),(),(

22

21

22

21

exp SSMinSSMax

F erimental

F experimental : Se determina de la siguiente manera:

Existe diferencia significativa si :

Tablaerimental FF exp

F tabla : Se determina de la siguiente manera:

)1,.,.( rdenomidanoglnumeradorglTabla FF





















5 6 7 8 9 10 11 12 13

95% Conf idence Interv als f or Sigmas

2

1

480 490 500 510 520

Resultados

F-Te

Test Statistic: 1.995

P-Value : 0.068

t Levene's Te

Test Statistic: 1.626

P-Value : 0.207

Factor Lev els

1

2

Homogeneity of Variance Test for Resultados





















REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD DE LOS RESULTADOS DE ENSAYOS


DEFINICIONESCondiciones de Repetibilidad

Condiciones en las que un mismo operador obtiene resultados de ensayo independientes con el mismo método en muestras idénticas en el mismo laboratorios y utilizando el mismo equipo dentro de pequeños intervalos de tiempo. ( ISO 5725-1, 3.14)





















Condiciones de Reproducibilidad

Condiciones en las que se obtiene resultados de ensayo con el mismo método en muestras idénticas, con operadores diferentes y utilizando equipos diferentes. ( ISO 5725-1, 3.18)








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