curs 3-4 [compatibility mode]
DESCRIPTION
Analiza instrumentalaTRANSCRIPT
-
10/17/2010
1
ELEMENTE DE ANALIZ INSTRUMENTAL
CURSURILE 3-4
PROF. DR. SILVIA IMRE
UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE DIN TRGU-MURESPECIALIZAREA NUTRIIE I
DIETETIC
1
2
II.1. Generaliti
II.2. Proprieti ale produsului rezultat n urma pregtirii probei
II.3. Bazele fizico-chimice ale metodelor de pregtire a probelor
II.4. Clasificarea metodelor de pregtire a probelor
II.5. Procedee de separare prin transfer de faz: Extracia lichid-lichid, extracia n faz solid
II.6. Procedee de separare prin ruptur de faz: Sublimarea, liofilizarea, distilarea
II.7. Tendine actuale
CAPITOLUL II. METODE DE PRELUCRARE A PROBELOR N VEDEREA ANALIZRII
II.1. Generaliti
Obiectivele analizei
instrumentale
Identificarea (ex. Prezena proteinelor n urin)
Dozarea(ex. determinarea glicemiei)
3
-
10/17/2010
2
ndeprtarea compuilor carepot afectadeterminarea(Ex. Precipitarea
proteinelor
din plasm)
n cazul metodelorde analizcu specificitateredus(ex. Refractometria)
n cazulprobelor n careanaliii sunt n cantitiprea mici pentru tipulde metod de analizales
4
Tipuri de probe Caracterizare
Medicamente:
Comprimate, capsule, geluri, creme, unguente, supozitoare, soluii medicamentoase, suspensii, emulsii farmaceutice
Amestecuri solide, semisolide, lichide omogene, sisteme heterogene
Identificarea i dozarea substanei active
Probe biologice (plasm, urin, fecale, lichid cefalorahidian etc.)
Studii de metabolism, biodisponibilitate, determinarea unor parametri biochimici etc.
Alimente
Etc.
Amestecuri solide, semisolide, lichide omogene, sisteme heterogene
Caracterizarea calitativ-cantitativ a nutrientului
5
Repetabilitate
Reproductibilitate
Randament(regsire)suficient scopului
determinrii
Principii de baz ale dezvoltrii unei metode de pregtire a unei probe pentru analiz
6
-
10/17/2010
3
SOLUIE
final
de analizat
1. Concentraia analitului este n domeniul de msur al instrumentului
2. Puritatea probei corespunde tehnicii instrumentale alese (ex. cromatografie)
3. Regsirea analitului este cantitativ i reproductibil de la o prob la alta
4. Analitul este stabil pn la efectuarea msurtorii (stabilitate n timpul preparrii i post-preparativ)
5. Solventul soluiei finale de analizat este compatibil cu tipul de metod instrumental ales
II.2. Proprieti ale produsului rezultat n urma pregtirii probei farmaceutice
Prelucrarea probei7
Concentraia probei finale de analizat
Instrumentele msoar cu exactitate i precizie atunci cnd semnalul msurat se ncadreaz ntre anumite valori i care corespund unor intervale de concentraii specifice fiecrui analit n parte semnalul s fie n domeniul de msur de ncredere al aparatului.
Probele prea concentrate diluare cu un solvent potrivit analitului (s fie solubil), dar potrivit i metodei instrumentale
Probele prea diluate concentrare prin:
ndeprtarea unei pri de solvent prin nclzire i/sau evapoare la vid
evaporare la sec i reluare cu un volum mic de solvent
extracie (lichid-lichid, n faz solid etc.) urmat de concentrare prin una din metodele de mai sus 8
Selectivitatea Constituenii matriciali ai soluiei rezultate n
urma prelucrrii probei farmaceutice s nu interfereze determinarea analitului; exemple de interferene: Absorbii semnificative la aceeai lungime de und
cu cea a analitului (metode spectrofotometrice) Substane interferente cu caracter acido-bazic n
cazul n care se urmrete determinarea analiilor cu caracter acido-bazic printr-o metod volumetric acido-bazic
Proteinele plasmatice i alte macromolecule etc.9
-
10/17/2010
4
Regsirea sau randamentul de prelucrare a probei
S fie 100% n cazul controlului substanelor i formelor farmaceutice
S fie consistent i reproductibil n cazul probelor biologice (se accept valori sub 100%)
Un randament de prelucrare (extracie) mare exactitate i precizie adecvate
10
11
Regsirea sau randamentul de prelucrare a probei
Se exprim folosind: O prob standard matrice martor (blanc) + analit adugat n
cantitate cunoscut; ex. Plasm blanc marcat cu analitul de determinat; se prelucreaz proba, se ajunge la proba final de analizat i se msoar semnalul S1
O soluie standard de analit obinut ntr-un solvent potrivit (ex. ap, metanol, etanol etc.) cu o concentraie egal cu concentraia ateptat n proba final de analizat; se msoar soluia n aceleai condiii obinndu-se semnalul S0
12
Prelucrarea probei
Prob
standard
matrice/blanc
analitSoluia
final de
analizat
Soluia
standard
Substan de referin + solvent
S1 S0
Msurare instrumental
Obinerea soluiei standard
-
10/17/2010
5
Stabilitatea post-preparativ a analitului n soluia final de analizat: Trebuie asigurat pentru a nu interveni procese
degradative post-preparative care pot conduce la rezultate false
Se poate asigura prin: Ajustri de pH Modificarea compoziiei solvenilor soluiei finale Meninerea probei la temperaturi sczute pn la
momentul msurtorii
13
Compatibilitatea cu metoda instrumental n spectrofotometrie solventul soluiei finale de analizat s
nu absoarb n domeniul spectral de absorbie al analitului n cromatografia de lichide - solventul probei:
s fie miscibil cu faza mobil lichid pe ct posibil s aib o compoziie asemntoare cu faza mobil
pentru a reduce efectul de interferen spectral (n cazul metodelor HPLC cu detecie n
UV, de fluorescen) efectul asupra formei picului cromatografic
Solventul (natura, pH) soluiei finale de analizat i al soluiilor standard de calibrare s fie identic
14
II.3. Bazele fizico-chimice ale metodelor de pregtire a probelor pentru analiz
PRINCIPII DECHIMIE FIZIC
INTERACIUNIFIZICO-CHIMICE
SOLUBILITATEAECHILIBRUL DE
FAZ
15
-
10/17/2010
6
Tipuri de interaciuni
Exemple de tehnici de preparare, caracteristici
Ionice Purificare pe rini schimbtoare de ioni
Afectate de: pH, trie ionic
Dipol-dipol Extracie n faz solid normal (adsorbie)
Afecteaz regsirea analiilor care se adsorb pe particulele solide ale probei
Legturi de hidrogen
Extracie n faz solid normal
Influenate de pH, solveni, prezena apei
Hidrofobe Extracie lichid-lichid
! Tipurile de interaciuni - descrise n cursurile de: Elemente de
Chimie Bioanorganic, Elemente de Chimie organic
Interaciuni fizico-chimice
16
Soluie
Na+(aq) + Cl-(aq) NaCl(s)
Precipitat
Solubilitatea (solidelor) Este concentraia solutului atunci cnd acesta se
afl n echilibru cu substana solid (soluie saturat)
Exemplu:
17
La pregtirea probelor solide i semisolide, concentraia soluiei finale de analit extras trebuie s fie sub limita de solubilitate a acestuia pentru a avea o regsire reproductibil (dac ne aflm la limita de solubilitate, o parte din analit rmne nesolubilizat n proba iniial),
Factori care influeneaz solubilitatea:
Natura solventului, amestecuri de solveni (ap, metanol, acetonitril etc.)
pH, tria ionic (dat de sruri)
Temperatura etc.
Ex. solubilitatea acizilor carboxilici n soluii apoase este mai mare la un pH > pKa + 2 (se afl n forma ionizat)
18
-
10/17/2010
7
Echilibrul de faz Important n cazul metodelor de prelucrare a probelor
prin extracie lichid-lichid
Dou faze total nemiscibile notate cu 1 i, respectiv, 2
Analitul (solutul) A se repartizeaz ntre cele dou faze pn la echilibru:
A1 A2 La echilibru, viteza cu care A trece din faza 1 n 2 este
egal cu viteza cu care A trece din faza 2 n 1
19
Echilibrul de faz
Constanta de echilibru sau de repartiie va fi:
unde KD constanta de repartiie, cA1 i cA2 sunt concentraiile lui A n faza 1 i, respectiv, faza 2, dup stabilirea echilibrului
20
21
A
Faza 1
Faza 2
CA1
CA2
Repartizarea
ntre cele dou
faze
Dou faze
nemiscibile
(ex. Ulei Ap)
La echilibru:
-
10/17/2010
8
n practic, se urmrete trecerea n proporie ct mai mare a analitului n una din faze analitul se msoar, astfel, dup extracie n una dintre faze.
Factori care influeneaz echilibrul de faz:
Natura celor dou faze
pH-ul fazei apoase (n cazul analiilor cu caracter acido-bazic)
Temperatura
Tria ionic a fazei apoase
Volumul celor dou faze 22
a. Tehnici de separare prin transfer de faz substana de separat este transferat din faza probei de analizat ntr-o faz nemiscibil cu aceasta (extracia lichid-lichid), pe un suport solid (extracia n faz solid) sau prin utilizarea unei membrane semipermeabile (dializ)b. Tehnici de separare prin ruptur de faz bazate fie pe schimbri de faz ale substanei de separat (distilarea, sublimarea, liofilizarea), fie pe precipitarea principiului activ (n urma concentrrii prin evaporarea solventului sau adugarea unui reactiv sau solvent n care acesta nu este solubil)Aplicarea unuia sau altuia dintre procedeele mai sus amintite se face n
concordan cu urmtoarele proprieti ale substanelor de separat:
solubilitatea; volatilitatea; caracterul acid/bazic/amfoter sau neutru; caracterul
polar sau nepolar; stabilitatea substanei n cursul prelucrrii
II.4. Clasificarea tehnicilor de pregtire a probelor pentru analiz
23
II.5. Tehnici de separare prin transfer de faz
II.5.1. Extracia lichid-lichid
Principiul de separare n extracia lichidlichid se bazeaz pe inegalitatea de solubilitate a componenilor n acelai solvent.
Extracia lichid-lichid - transferul unui analit din soluia probei, de obicei o faz apoas, ntr-un solvent organic nemiscibil cu apa, cnd se realizeaz o distribuie a analitului ntre cele dou faze.
Faza 2 - solvent de extracie A2
Faza 1 - proba A124
-
10/17/2010
9
EXTRACIA SIMPL
Extracia simpl se poate realiza cu ajutorul unei plnii de separare (figura de mai jos), comportnd introducerea probei, a solventului de extracie, a reactivilor pentru ajustarea pH-ului, agitare energic, repaus pentru separarea fazelor i decantarea prin scurgerea extractului.
Separarea cantitativ nu este posibil printr-o singur extracie, dar se poate realiza o astfel de separare prin 3-4 extracii succesive.
25
Plnii de separare
! Poziia solventului de extracie:- faza superioar (ex. eter etilic)- faza inferioar (ex. clorurura de metilen)
Ustensile de laborator
Procedura de laborator: adugare prob lichid i solvent de extracie
-
10/17/2010
10
Procedura de laborator: nchidere plnie, agitare energic, repaus pentru separarea fazelor
Separarea fazelor
Extraction Movie.
Dintre solveni organici cei mai utlizai sunt: Hidrocarburi lichide: n-hexan, n-heptan, benzen, toluen, xilen; Derivai halogenai: diclormetan, cloroform, tetraclorura de carbon; Cetone: acetona, metilizobutilcetona; Eteri: eter etilic, dioxan, terbutileter; Ali solveni: dimetilformamida etc.
Avantaje:- separare selectiv, cu randamente bune, dac se alege judicios solventul sau amestecul de solveni, dac se regleaz pH-ul corespunztor, sau dac se face o derivatizare pre-extracie a analitului ce trec ntr-un compus mai uor i mai selectiv extractibil ntr-un anumit solvent- nu este stnjenit de adsorbie, de coloizi sau de culoarea soluiilor- echilibrele de extracie se stabilesc relativ repede- separarea fazelor nemiscibile se face rapid n plnia de separare i mult mai uor dect filtrarea- se pot realiza concentrri ale analiilor de sute sau mii de ori- se poate aplica att pentru separarea unor cantiti mari de substan, ct mai ales pentru concentrarea urmelor i ultraurmelor de substane 30
-
10/17/2010
11
II.5.2 Extracia n faz solidAceast tehnic se bazeaz pe adsorbia diferit a componenilor dintr-o prob, pe o faz staionar solid i reluarea lor pe rnd de pe suportul solid.Extracia n faz solid (Solid-Phase Extraction SPE) se poate aplica tuturor tipurilor de probe lichide i solide.
Principiul
extraciei
n faz
solid
31
32
33http://www.waters.com/webassets/cms/category/media/other_images/primer_d_%20solidphase.jpg
-
10/17/2010
12
Aparat de extracie n faz solid cu
mai multe locuri 34
Extracia SPE prezint unele avantaje fa de extracia lichidlichid dintre care se pot meniona:
se utilizeaz coloane mici de extracie, numite cartue de extracie, care conin o faz staionar solid, evident insolubil in faza de eluie care este utilizat; este o metod mai selectiv datorit naturii fazelor utilizate (staionar i mobil); necesit volume mult mai mici de prob;se simplific mult matricea n care se afl analitul dup extracie, deoarece are loc mai nti fixarea analitului pe faza staionar, apoi se ndeprteaz marea majoritate a componenilor indezirabili din prob; n final, se scoate analitul rmas n faza staionar folosind un solvent potrivit; simplitatea i rapiditatea metodei.
35
II.6. PROCEDEE DE SEPARARE PRIN SCHIMBRI DE STARE
II.6.1. SublimareaSublimarea = trecerea unei substane din stare solid n stare gazoas la presiuneCapacitatea de sublimare cu T (temperaturii) i p (presiunii).Se obin substane extrem de pure.
II.6.2. LiofilizareaSe aplic mai ales n cazul analiilor uor degradabili prin nclzire.Liofilizarea = uscare la rece, cu pstrarea integritii probei. Const n nghearea rapid a probei dup care se elimin solventul prin sublimare n vid naintat, cnd solventul este transformat direct n vapori.Utilizri:- pstrarea timp ndelungat a culturilor microbiene, enzimelor, esuturi sau probe biologice- pstrarea unor medicamente (pulberi liofilizate) 36
-
10/17/2010
13
II.6.3. Distilarea
Distilarea = metod de separare bazat pe diferena de volatilitate a componenilor dintr-o prob; const n volatilizarea succesiv a analiilor i condensarea acestora, colectarea acestora fcndu-se separat.
Distilarea poate fi:
- simpl
- fracionat
Recapitulare noiuni: distilare simpl, fracionat, amestecuri azeotrope de la Elemente de Chimie Bioanorganic
37
Tendine actualen pregtirea
probelorpentru analiz
Automatizareatotal
Instrumente
analitice
mai specifice
Eliminareacomplet apregtiriiprobelor
Miniaturizarea
tehnicii
de pregtire
a probelor
38
II.7. Tendine actuale
Automatizarea (total) a pregtirii probelor
Extractor n faz solid cuplat la un sistem cromatografic
Sistem automat de prelucrare a probelor
39
-
10/17/2010
14
HPLC cuplat cu detector de spectrometrie de mas
Instrumente de analiz specifice
40
Miniaturizare (nanotehnologie)
41
Analiz direct fr pregtire prealabil a probei
Dispozitiv de reflectan total atenuat
(ATR Attenuated Total Relectance)
- permite analiza spectrometric n IR a probelor ca atare
- se msoar radiaia reflectat 42