Curs I de inginerie tisularaCULTURI DE CELULE

DefinitieCultura de celule - metoda de creştere a celulelor animale si umane în condiţii artificiale, in afara actiuniilor sistemice ale organismului.Istoric

• 1907 – Harrison: 1912 – Carrel (primii care au folosit metoda pentru studiul comportamentului celulelor animale in afara variatiilor sistemice si a stresului)

• Metoda la inceput – migrarea celulelor din fragmente de tesut nedezagregat (metoda folosita inca timp de 50 ani) Alte evenimente importante

• 1916 – metode de dezintegrare tisulara cu enzime hidrolitice• 1940 – introducerea antibioticileor in tehnica de lucru• 1952 – transplant de nucleu• 1955 – medii artificiale complexe• 1964 – celule stem de soarece (pluripotente)• 1966 – primul factor de crestere (NGF)• 1970 – aparitia primelor hote cu flux laminar• 1976 – medii sintetice, fara ser sanguin bovin• 1980 – dezvoltarea tehnicilor de inginerie genetica si inginerie tisulara• 1998 – cultura de celule umane stem• 2000+ - proiectul genomului uman

POSIBILE APLICATII

Avantajele studiilor in vitro (in cultura celulara)• Controlul mediului extracelular

– pH, temperatura, osmolaritate, gaze in atmosfera– Componente nutritive– Micromediu (celule-celule, celule-MEC)

• Omogenitatea materialului– Medii selective , clonare

• Economie, scara redusa, mecanizare– Caracterizare relativ usoara prin metode imunocitochimice– Volum redus, conservare, acces direct la celule, cost avantajos– Dispozitive automatizate

• Modelarea conditiilor in vitro– Reducerea numarului de animale utilizate

Limitari (dezavantaje)• Control permanent al produsului

– Manipulare in conditii sterile– Contaminare chimica– Contaminare microbiana

• Control permanent al mediului– Sterilitatea spatiului de lucru– Controlul incubatorului– Deseuri periculoase, cu risc biologic

• Cantitatea si pretul materialelor si a mediilor de cultura– Materiale de unica folosinta – Medii scumpe– Ser fetal de vitel

• Instabilitatea genetica– Dediferentiere. adaptarea, cresterea necontrolata selectiva

• Identificarea dificila a celulelor• Diferente majore intre comportamentul in vivo si in vitro Tipuri de culturi celulare• După sistemul de cultură

– Celule aderente– Celule în suspensie

• După tipul celulelor din cultură– Celule normale (nediferenţiate, epiteliale, conjunctive) – Celule tumorale

• După sursa celulară– Celule embrionare şi fetale– Celule din ţesuturi adulte (stem sau diferenţiate)

• După modul de iniţiere– Culturi primare– Culturi de linii celulare

• După dimensiunea culturii– Culturi în condiţii de laborator (petri, flacoane, tuburi, placi multicelulare)– Culturi la scară industrială (în bioreactoare)

Avantajele si dezavantajele diferitor tehnici de initiere a culturilor de celule

Recoltare• Celulele sunt obţinute din fragmente tisulare sau lichide fiziologice• Recoltarea se face în condiţii de asepsie

– Prin aspirare– Prin biopsie tisulară

• Celulele (ţesuturile) sunt transportate spre laborator într-un timp cât mai scurt, în recipiente speciale, la +40C, în mediu de cultură sau ser fiziologic steril

Izolarea celulelor primare• Metoda de izolare depinde de tipul materialului recoltat si de scopul urmarit

– Amestec celular în suspensie (măduvă hematopoietică, sânge sau alte fluide biologice)– Fragment de ţesut cu populaţie celulară mixtă şi MEC (piele, cartilaj, ficat, os etc)

Metode de izolare• Centrifugare (fluide)• Dispersie mecanică şi filtrare (tesuturi solide)• Dispersie enzimatică (cu ajutorul tripsinei, dispazei, colagenzei, elastazei)• Dispersie cu ajutorul chelatorilor de Ca2+(EDTA - acid etilen-diamid-tetraacetic)• Dispersie mixtă

1 – tratament mecanic2 – digestie enzimatică3 – filtrare4 - centrifugare

• Migrare din fragment de ţisut (tesut solid)• Perfuzia organelor întregi (ficat, rinichi, pancreas) cu soluţii tamponate de EDTA fără Ca2+ si Mg2+

Migrare din explant

Selecţia celulelor din amestecuri celulare

Aderenţa selectivă în culturăCelulele au proprietăţi de suprafaţă diferite, exprimând receptori de suprafaţă diferiţiModificând condiţiile de cultură şi suportul de cultură se pot crea condiţii pentru aderarea unui anumit tip de celulePe o suprafaţă acoperită cu fibronectină vor adera preponderent celulele precursoare (progenitoare), care exprimă în număr mare receptorii integrinici – β1 (progenitori keratinocite, condrocite)Tehnica de pre-plate permite selecţia populaţiei de celule stem din ţesutul muscular striat sau separarea fibroblastelor uşor aderente de alte populaţii celulare

Centrifugarea în gradient de concentraţie sau densitateSe bazează pe diferenţele de mărime şi densitate a celulelorSepararea cu ajutorul metodei de flow-citometrie

• Metoda separă câteva populaţii celulare simultan dintr-un amestec de mai multe tipuri celulare• Poate separa doar câteva celule din sute, în doar câteva secunde• Se separă în funcţie de:

– Mărime– Marcherii specifici (conjugaţi cu anticorpi specifici)– Cantitatea de proteine– Cantitatea de ADN nuclear

• Dezavantajul metodei – greu de asigurat condiţiile aseptice

Cursul IIBIOLOGIA CELULELOR IN CULTURA

Micromediul celular in vitro(asigura expresia functiei specifice in vitro)• Substratul de cultura

– Solid (material plastic sau sticla), – Semisolid (gel de agar sau colagen)– Lichid (pentru cultura in suspensie)

• Contactul cu alte celule

– de acelasi tip– de tip diferit

• Constituientii fizico-chimici si fiziologici ai mediului– Tipul si concentratia constituientilor nutritivi din mediu– Tipul si concentratia constituientilor moleculari ce regleaza activitatea functionala a celulalor– Sistemul de cultura (static, dinamic)

• Compozitia fazei gazoase– CO2, O2, N2,, amestec de gaze, imersia completa a celulelor in mediu lichid, interfata straturilor superficiale cu aerul

• Temperatura de incubareAdeziunea celulara

• Diviziunea majoritatii celulelor in cultura depinde de interactiunea cu suportul de cultura. • Pentru a se divide, celulele ancoraj-dependente se aplatizeaza, realizand contact cu suportul de cultura cu o suprafata cat mai mare (se

intind pe suprafata)• Majoritatea celulelor ancoraj-dependente formeaza monostraturi confluente• Celulele ancoraj-dependente pot deveni ancoraj-independente ca urmare a transformarilor genotipice si fenotipice• Celulele nu adera de suport direct, ci prin intermediul proteinelor sintetizate si eliberate in mediul extracelular de acestea, depuse pe

suport Molecule de adeziune

• Moleculele de adeziune sunt proteine transmembranare sau proteoglicani. Pot fi clasificate in trei categorii: – Proteine pentru adeziunea de tip celula-celula:

• CAM-proteine Ca-independente• Cadherine Ca-dependente

– Proteine pentru adeziunea de tip celula-MEC• Integrine (ligand ce contine arginina-glicina-asparagina – RGD)

– Proteoglicani (structuri transmembranare care nu interactioneaza cu RGD; pot avea rol si de receptori sau molecule asociate cu receptorii pentru factorii de crestere tisulara)

Matricea extracelulara (MEC)• MEC umple saptiile intercelulare din tesuturi• Componentele MEC sunt produse in celula, apoi sunt secretate si depuse pe suprafata acesteia• Compozitia MEC depinde de tipul celulelor din tesut

– (Ex. fibroblastele produc colagen tip I, condrocitele – colagen tip II, celulele epiteliale– laminina etc)

• Celulele aderate de MEC controleaza compozitia MEC si invers – compozitia matricii influenteaza fenotipul celularElementele structurale ale MEC

• Proteine structurale – colagen• Proteine de adeziune – fibronectina, laminina • Proteiglicani (GAG+proteine) - componenta polizaharidica cu un continut crescut de apa (hidrogel)

Interactiunea Adeziune – Citoschelet• Citoscheletul este o retea tridimensionala de proteine fibrilare cu numeroase functii (motilitate, diviziune, forma celulara si altele)• Elementele citoscheletului:

– Microfilamente de actina– Filamente intermediare– Microtubuli

• Moleculele de adeziune sunt legate direct sau prin intermediul altor molecule cu elementele citoscheletului• Interactiunea dintre moleculele de adeziune si citoschelet este implicata, printre altele, in fenomenele de motilitate celulara si diviziune

Motilitatea celulara in cultura• Celulele din cultura pot migra pe suprafata substratului. Migrarea are caracter diferit, in functie de tipul de celula• Cele mai mobile celule – fibroblastele in cultura (cu densitate celulara mica)

– Se stabileste o polaritate de migrare (intr-o anumita directie) prin extinderea de lamelipode)– La intalnirea unei alte celule, polaritatea se inverseaza– La atingerea unui monostrat confluent se produce inhibitia de contact (incetarea migrarii si a diviziunilor celulare)

• Mioblastele si celulele endoteliale au aceleasi caracteristici de motilitate in vvitro, iar la atingerea monostratului confluent se diferentiaza

• Majoritatea celulelor epiteliale sunt mai putin mobile, in special la densitate celulara mare– La o densitate mica, celula epiteliala va migra pana va intalni o alta celula (nu isi va schimba polaritatea ci se va opri)– Se pot aduna in conglomerate, care, uneori, se pot deplasa pe suport organizat

CICLUL CELULAR SI MECANISMELE DE REGLARE A CICLULUI CELULAR

Controlul proliferarii• Intrarea celulelor in ciclul celular este reglata de semnalele parvenite din micromediul celular • In cultura cu densitate celulara mica, marginile celulare sunt libere, determinand intinderea celulei pe substrat. Doar in starea sa intinsa

la la maxim, celulele intra in diviziune ca urmare a actiunii factorilor de crestere• Densitatea mare apropie marginile celulare, schimba fenotipul, reduce gradul de intindere si opreste diviziunea • Stimulatorii sau inhibitorii intacelulari ai proliferarii sunt moleculele citoplasmatice care se formeaza in urma fosforilarii domeniilor

intracelulare ale receptorilor pentru factorii de crestere si produsii de activitate ale unor gene, inclusiv oncogene.

Diferentierea in vitroConditiile necesare pentru diferentierea in vitro:

- densitate celulara mare- interactiuni celula-celula si celula-MEC bine exprimate- prezenta factorilor de diferentiere

Daca in cultura se urmareste diferentierea, este necesara definirea a doua tipuri de conditii – la inceput pentru proliferare si apoi pentru diferentiere

Caracteristicile de diferentiere se mentin in cultura pentru mai mult timp daca este creat sitemul de cultura 3D – geluri de colagen, celuloza, gelatina

Mediile pentru diferentiere sunt medii selective, fara ser fetal

Dediferentiere

• Dediferentierea este un fenomen specific culturilor celulare• Cauze:

– Selectia gresita a liniei progenitoare– Diviziunea excesiva a celulelor nediferentiete ale aceleeasi linii progenitoare – Absenta unor factori reglatori sau aplicarea incorecta a acestora – Absenta conexiunilor specifice de tip celula-MEC

Dediferentierea / Deadaptarea• Dediferentierea – pierderea unor functii specifice ca urmare a conversiei celulelor la un fenotip mai primitiv• De adaptarea - sistarea unor functii in lipsa unor stimuli corespunzatori (hormoni, interactiuni celula-celula, celula-MEC). Functiile

sunt reexprimate dupa aplicarea conditiilor de micromediu corespunzatoareSemnalizarea celulara

• Proliferarea, diferentierea si apoptoza in vivo sunt supuse reglajului micromediului tisular (factori crestere, interactiunea celule-celule, celule-MEC), dar si a celui sistemic

• Reglajul prin intermediul moleculelor solubile poate avea loc pe cale:– Endocrina - la distanta, prin intermediul sangelui– Paracrin - din aproape in aproape

• homocrin (intre celule de acelasi tip)• Heterocrin(intre celule de tip diferit)

– Autocrin – celula secretoare este aceeasi cu celula tinta

Cai de semnalizare intercelulara in vivo

Semnalizarea intercelulara in vitro• Intr-un monostrat celular in vitro se poate discuta doar de actiuni homocrine si autocrine• Evolutia culturilor initiate la densitate mica de multe ori esueaza, ca urmare a dilutiei unor factorilori cu actiune paracrina,• Una din solutii – cultura conditionata (pe strat de celule doica – feeder layer)

Evolutia celulelor in cultura• Cultura primara este prima etapa de evolutie a celulelor in conditii in vitro, care are loc dupa migrarea celulelor din explant sau dupa

dezagregarea enzimatica a tesutului• Dupa cultura primara urmeaza procedeele de subcultivare si selectie a celulelor care duc la obtinerea de liniil celulare

Evolutia celulelor in cultura primara

Evolutia celulelor in cultura de lunga durata

Rolul subculturilor

• Permit diviziunea continua a celulelor sensibile la inhibitia de contact• Permit mentinerea densitatii reduse, cu mentinerea fenotipului normal in culturile cu un risc de transformare spontana crescut, la o

densitate mare a celulelor (ex. fibroblastele de soarece)• Subcultura trebuie realizata la aproximativ 2/3 din panta fazei Log (inainte de a obtine monostratului confluent

Curs III

TIPURI DE CELULE SI SURSE CELULARE

Celulele implicate în regenerarea tisulară• Doar celulele nediferenţiate sau incomplet diferenţiate au proprietatea de a se divide (CELULE STEM)• Majoritatea celulelor dintr-un ţesut sunt celule diferenţiate, care si-au perdut proprietatea de diviziune• Toate ţesuturile au o rezervă de celuele nediferenţiate, care în anumite condiţii (stimuli specifici), se pot mobiliza în procesul de

diviziune celulară• Diviziunea are loc atata timp cât actionează stimulul specific de diviziune. După încetarea acţiunii acestuia, celulele noi formate vor

intra în procesul ireversibil de diferenţiere.

Celule stem• Sunt celulele cu 2 proprietăţi specifice

– Au abilitatea de a se multiplica (autoreplica), dând naştere unor copii identice cu celula mamă– Au abilitatea de a se transforma (diferenţia) în celule diferenţiate

• Se împart în funcţie de sursă, în 2 mari categorii:– Celule stem embrionare şi fetale (responsabile pentru dezvoltarea embrionară sau fetală)– Celule stem adulte (responsabile pentru creşterea, menţinerea, regenerarea şi repararea ţesuturilor diferentiate)

Autoreplicarea celulelor stem • Diviziune simetrică

– ambele celule vor evolua lafel• Ambele vor rămâne nediferenţiate • ambele se vor diferenţia

• Diviziune asimetrică– celulele formate vor evolua diferit

• Una se va diferenţia• Una va rămâne în stare nediferenţiată

• Diviziunea simetrică sau asimetrică depinde de:– Mecanismele intrinseci (factorii de polaritate, alte mecanisme interne)– Mecanisme extrinseci (pozitionarea asimetrică în raport cu mediul extracelular, ceea ce duce la acţiunea unor semnale diferite

asupra celor două celule

TIPUL CELULELOR STEM– Celulele stem totipotente

• pot forma un organism întreg (ovocitul fertilizat şi celulele formate după primele diviziuni ale zigotului)– Celulele stem pluripotente

• formează cele 3 foiţe germinative ale embrionului, inclusiv celulele germinale. • nu pot forma celulele placentei si a cordonul ombelical• Provin din masa celulară internă a blastocistului

– Celulele stem multipotente• Pot forma multiple celule (ex. celulele stem mezenchimale -osteoblaste, condrocite, miocite si adipocite

– Celule stem oligopotente• Pot forma un anumit numar de linii celulare specifice unui tesut (ex. celulele stem neurale pot forma un subset de

neuroni cerebrali; celulele stem hematopoietice pot forma subseturile de celule sanguine)– Celule stem unipotente

• Celule care fortează o singură linie celulară (ex. Spermatogoniile se diferenţiază doar în spermatozoizi)Celule stem, celule precursoare si celule diferenţiate

• încetarea semnalelor intrinseci si extrinseci care menţin celula stem în stare nediferenţiată• stadiu de precursor sau celulă tranzitorie de amplificare• Celulă diferenţiată, cu fncţii specializate pentru o perioadă prelungită de timp• Moarte celulară

Alte proprietăţi ale celulelor stem progenitoare• Rediferenţierea

– Revenirea la o etapă tranzitorie anterioară, la un fenotip mai puţin matur (ex. dediferenţierea condrocitelor în fibroblaste la trecerea de la sistemul de cultură 3D la 2D

• Transdiferenţierea (fenomen controversat)– Trecerea unei celule diferenţiate de la un fenotip la altul, fără a trece prin etapa de dediferenţiere (ex. transformarea celulelor

pancreatice în hepatocite) • Plasticitatea

– Abilitatea celulelor stem adulte dintr-un ţesut de a genera celule diferenţiate specifice altui tip de ţesut (ex. celulele stem hematopoietice pot forma, în afară de celulele sângelui, keratinocite, hepatocite, neuroni, cardiomiocite)

Celulele stem embrionare• Au fost izolate pentru prima data în 1981 de Evans şi Kaufman• Pot fi recoltate din embrion in stadiul blastomeric sau blastocitar de dezvoltare• Sunt transferate in sistem de cultură pe un strat de celule doică (fibroblaste)• Coloniile celulare formate sunt periodic dezintegrate si recultivate in mediu de cultură proaspăt

Etape de dezvoltare embrionară, în care se obtin celulele stem embrionare

Caracteristicile celulelor stem embrionare• Se pot autoreplica la infinit in prezenta GF specifici• Prezintă markeri specifici (Oct4, fosfataza alcalină, antigenul embrionar de tipul SSEA şi altele)• Diferenţierea in vitro incepe cu formarea corpilor embrioizi (agregate flotante, parţial diferenţiate)• Cultivarea embrioizilor in sistem de picătură suspendată, duce la o diferenţiere într-o maniera caracteristică pentru perioada post-

implantaţională timpurie• Metode in vivo care demonstreaza pluripotenţa celulelor SE:

• injectarea celulelor stem embrionare subcutanat, intrarenal sau teasticular, la şoricei imunodeficienţi. În zona de implantare se formează o tumoră benignă (teratoma), care va contine celule de diferite tipuri, provenite din toate foiţele embrionare

• obţinerea de animale himere (injectarea celulelor stem embrionare in interiorul blastocitului si apoi transferul intrauterin al blastocistului. Se constată o repartiţie uniformă a celulelor rezultate din celulelel stem injectate

Celule stem adulte• Sunt celulele nediferentiate (nespecializate) localizate în ţesuturile diferenţiate• Au fost descoperite cu aproximativ 50 de ani in urma. În 1961 si 1963 apar primele publicaţii care relatau prezenta a doua tipuri de

celule stem în măduva hematopoietică– Celule stem hematopoietice, cele din care iau nastere elementele figurate ale sangelui– Celule medulare stromale (celule stem mezenchimale), o populaţie heterogenă de celule precursoare, care se pot diferenţia în

celule osoase, cartilaj, adipocite si celulele tesutului conjunctiv al măduvei hematopoietice • Până în prezent, celule cu proprietati asemanatoare celulelor stem mezenchimale au fost descoperite în toate ţesuturile diferenţiate (cord,

ficat, pancreas, creier, pulpa dentara, epiderm etc.) Plasticitatea celulelor stem adulte

Surse celulare usor accesibile de celule stem adulte – Măduva hematopoietică– Sângele periferic, după mobilizarea celulelor stem din măduva hematopoietică cu ajutorul tratamentelor cu citokine (G-CSF)– Placenta şi cordonul ombelical – sursa celulara productiva si uşor de recoltat– Ţesut adipos obţinut prin liposucţie

Caracteristicile moleculare ale celulelor stem adulte• Celulele stem se identifică cu markeri de suprafaţă • Combinaţia specifică a unor markeri sau absenţa unor markeri stau la baza identifiicării şi purificării unui anumit tip de celule dintr-un

amestec celular• Majoritatea markerilor specifici sunt proteine membranare din categoria proteinelor CD (Claster of differenţiation)• Celulele stem hematopoietice sunt o populaţie heterogenă, caracterizată de CD34, CD43, CD45RO, CD45RA, CD59, CD90, CD109,

CD117, CD133, CD166 si altele • Markerul caracteristic pentru toate celulele stem hematopoietice este CD34, iar în funţie de prezenta acestuia impreună cu unul sau mai

mulţi alţi markeri, defineşte şi permite izolarea unei subpopulaţii foarte pure de celule stem hematopoietice.• Celulele stem mezenhimale, spre deosebire de celulele stem hematopoietice, au ca marker specific proteina STRO-1, iar markerul

CD34 este absent. • Încă nu a fost izolată o linie foarte pură de celule stem mezenchimale pluripotente.

Capacitatea funcţională a celulelor stem mezenchimale umane• Demonstratii in vitro (culturi de celule)• In vitro celulele stem mezenchimale pot genera adipocite, condrocite si procese de mineralizare specifice osului• Primele celule stem mezenchimale au fost izolate de Friedenstein, în 1979, din grasime, prin centrifugarea în gradient de densitate.• Doar 0,001-0,01% din celulele zolate s-au doveedit a fi cele stem• După o amplificare prin multiplicare in vitro, au fost obtinute culturi de celule diferenţiate de tipul celor adipoase, condroide şi osteoide

Micromediul celulelor stem• Fiecare celulă stem adultă are o localizare anatomică specifică în ţesut – nişă celulară• Nişa reprezintă micromediul celular, care adăposteşte, protejează şi reglează balanţa dintre celulele active şi cele în repaos• Nişa celulară determină menţinerea rezervei de celule stem, diferenţierea precursorilor şi eliberarea celulelor diferenţiate• Factorii care acţionează asupra celulelor stem în nişă sunt:

– celulele asemănătoare din nişă şi alte tipuri de celule stem– MEC– Factorii reglatori solubili şi cei asociaţi MEC

Senescenţa replicativă a celulelor stem

• Celulele stem mezenchimale au o viaţă replicativă mai scurtă decât a celulelor stem embrionare – 50-70 diviziuni celulare• Senescenţa replicativă este determinată de scurtarea telomerelor - regiunea terminală a cromizomului, alcătuită din terminaţia repetitivă

de tipul TTAGGG• La fiecare diviziune celulară, se pierde o parte din secvenţa repetitivă, din cauză replicării incomplete• Scurtarea treptată a telomerelor duce la alterarea progresivă a ADN şi implicit la moartea celulară•

Imortalizarea celulelor stem • Celuele stem embrionare exprimă un nivel crescut de telomerază, enzimă care adaugă secvenţe repetitive la capătul terminal al

telomerului• Majoritatea celulelor au expresie foarte mică sau chiar nedetectabilă a telomerazei• Imortalizarea artificială în cultură se poate induce cu virusul SV40, care in urma infectării celulare, integrează în genomul celulei gazdă

o gena vitală de imortalizare• Imortalizarea prin restabilirea activităţii telomerazice cu hTERT (human telomerase revers trenscriptase)

– hTERT este subunitatea catalitică a telomerazei si poate fi introdusă în celulă cu ajutorul vectorilor retrovirali– Tratarea celulelor stem mezenchimale cu hTERM prelungeşte si stabilizează fenotipul nediferenţiat

Curs IVCULTURA PRIMARA

Generalitati• Definitie:

– Cultura celulara initiata cu celule migrate din fragmente celulare, dispersate din tesuturi dezagregate prin fragmentare sau digestie celulara, pana la momentul subcultivarii lor

• Evenimentele principale:– Recoltarea tesutului– Fragmentarea/dezagregarea tesutului– Repartizarea celulelor in vase de cultura

Enzimele de dezagregare tisulara • Tripsina • Colagenaza• Elastaza • Pronaza • Dispaza• DNAza• Hialuronidaza

Individual sau in diferite combinatii:Ex1. Tripsina+pronaza (+DNAza):Combinatie eficienta dar care poate afecta celuleleEx2. Colagenaza+dispaza (+DNAza):Mai putin afecteaza viabilitatea celulara dar nu realizeaza o dezagregare completa a tesutuluiEx3. Colagenaza+hialuronidaza (+DNAza)- DNAza inlatura ADNul eliberat din celulele lezate, care intefera proteoliza si incurajeaza reagregarea celularaConditii si recomandari

• Inlaturarea grasimii si a fragmentelor de tesut necrozat• Folosirea unui instrumentar cat mai ascutit pentru minimizarea lezarii• Enzimele utilizate la dezagregare trebuie inlaturate eficient, prin mai multe centrifugari• Cultura primara se initiaza cu un numar de celule mult mai mare in comparatie cu subcultura (o parte mica de celule vor adera pe

supostul de cultura)• Sunt folosite medii de cultura mai bogate in constituenti organici (Ham F12) si ser fetal de vitel• Pentru celule specializate sunt recomandate medii selective• Tesuturile embrionare se dezagrega mai usor decat tesuturile adulte , iar viabilitatea celulara este mai mare• Tesuturile recoltate pot fi pastrate in mediu de cultura special (de transport)

Izolarea tesuturilor embrionare animale• Tesut embrionar de soarece

– Cultura fibroblatica nediferentiata, folosita frecvent pentru obtinerea straturilor doica (feeder) si studii de proliferare (inclusv citotoxicitate)

– Recoltarea se face in ziua 12-13 de gestatie (>50% din perioada gestationala- 19-21 zile) pentru a avea embrioni destul de mari, dar cu un raport bun de celule nediferentiate

• Tesut embrionar de pui– Embrionii sunt mai mari (se recolteaza la 10 zile de incubare a oualor de pui) – Celulele embrionare sunt folosite pentru studii de proliferare, straturi doica si suport pentru propagarile virale– Embrionii recoltati in perioade de gestatie mai mari sunt utilizati pentru obtinerea de celule specializate (hepatocite,

cardiomiocite sau celule epiteliale pulmonare Recoltarea tesuturilor embrionare de soarece

Recoltarea tesuturilor embrionare de pui

Cultura primara prin explantCultura prin explant este indicata pentru fragmente tisulare mici, ale caror celule se pot pierde in urma tratamentelor enzimatice

Dezagregare enzimatica la cald

• Durata intregului proces 3-4 ore• Pentru evitarea reagregarii celulare, la suspensiile celulare inainte de centrifugare poate fi adaugata DNaza• Tehnica este folosita pentru digestia relativ rapida a unor fragmente tisulare mari (embrioni intregi de soarece sau pui)• Nu este o tehnica potrivita pentru tesuturile adulte. Digestia prelungita pentru dezagregarea tesutului fibros poate afecta celulele

epiteliale

Metoda de tripsinizare la rece• Durata intregului proces – aprox. 6-18 ore• Consta in mentinerea fragmentelor celulare in solutie de tripsina pentru 6-18 ore la temperatura de +4oC (la gheata), urmata de

expunerea amestecului la 37oC pentru 20-30 min. • La rece are loc doar difuzia enzimei in intreaga structura a tesutului, iar digestia propriu-zisa la cald a tesutului are loc in doar 20-40

min • Avantaj

– minimizeaza leziunilor celulare si munca laborioasa – Supravietuirea diferitor tipuri de celule

• Metoda potrivita pentru fragmente de tesuturi nu foarte mari (organe embrionare)

Dispersia enzimatica utilizand colagenaza• Colagenaza este utilizata pentru dispersia tesuturilor prea froase sau prea sensibile la tripsina• Este o metoda frecvent utilizata pentru dezagregarea tumorilor (in general al epiteliilor)

Dezagregare mecanicaUtilizarePentru tesuturi moi:- splina, -ficat embrionar,- tesut cerebral, - tumori moi

Curs VSUBCULTURA CELULARA SI LINIILE CELULARE

Notiuni generale• Cresterea celulelor din cultura primara duce la epuizarea substratului si oprirea diviziunilor produsa de “inhibitia de contact”• Odata subcultivata (pasaj celular) cultura devine linie celulara• O linie celulara contine mai multe tipuri de descendente celulare, cu fenotip asemanator sau diferit• Prin selectia unui singur tip de descendenta celulara prin clonare se obtin o tulpina celulara (susa celulara) • Linie celulara continua – o linie celulara transformata in vitro• Tulpina celulara continua (susa celulara continua) – un anumit tip (fenotip) celular, selectata prin clonare si caracterizata,

necontaminata cu alte tipuri celulare• Foarte multe linii celulare sunt linii contaminate (contin mai multe tipuri celulare)

Varsta cultuii celulare• Numarul de pasaje – numarul subculturilor celulare realizate • Numarul de generatii – numarul de dublari a populatiei celulare – numar care indica varsta culturii • Linii celulare limitate (finite) – linii celulare cu durata de viata limitata la un anumit numar de generatii (aproximativ 20-80, in functie

de tipul celulelor)Nomenclatura

• Cod (nume) – ex. Normal Human Brain (NHB)• Numarul liniei daca din aceeasi sursa au fost selectate mai multe linii – Ex. NHB1, NHB2 etc• Numarul clonei, daca exista mai multe (NHB1-1, NHB2-1 etc)• Numarul pasajelor dupa ultima dezghetare NHB1-1/p3• Laboratorul din care provine (Ex. WI – Wistar Institute, NCI – national cancer institute etc)

Mentinerea de rutina a liniilor celulare• Intretinerea liniilor celulare in cultura are loc prin schimbarea perioadica a mediului de cultura• Frecventa de schimbare a mediului depinde de tipul celulelor (viteza de multiplicare)• In cazul celulelor transformate, cu o crestre rapida, pasajul celular se face la aproximativ fiecare 7 zile, iar schimbarea mediului se face

la 4 zile dupa subcultivare• In cazul celulelor cu o crestere mai lenta (in special pentru cele netransformate) pasajul se realizeaza la fiecare 2,3 sau chiar 4

saptammani, iar schimbarea mediului intre perioadele de subcultivarese face saptamanalAlegerea momentului de schimb al mediului

Ciclul de crestere si numarul de dilutii

Verificarea de rutina a calitatii liniilor celulare• Verificarea pH

– Majoritatea celulelor isi opresc cresterea la pH 7–6,5– Majoritatea celulelor isi pierd viabilitatea la pH 6,5-6. – Acidifierea mediului de cultura poate fi urmarita folosind indicatorul pH din mediu (phenol red), care la acidifiere vireaza de la

rosu la portocaliu sau galben • Determinarea concentratiei celulare (se rasfrange si asupra pHului)• Morfologia celulara. Semne de deteriorare a culturii:

– Vacuolizarea– Granulatiile in jurul nucleului– Aspectul sferic

• Adaptarea grosimii stratului de mediu, in functie de consumul de O2– Culturi consumatoare de O2 – 2 mm– Culturi cu un consum scazut de O2 – 5 mm

Morfologie celulara anormala

CLONAREA SI SELECTIAAplicatii

• Obtinerea unor culturi celulare omogene• Propagarea in vitro a unui anumit fenotip sau genotip celular • Eliminarea contaminarii celulelor diferentiate cu celule nespecializate • Utilizarea ca test de supravietuire celulara la optimizarea conditiilor de cultura• Test de chimiosensibilitate si radiosensibilitate

METODE DE CLONARE CELULARA• In monostrat (in flacoane de cultura, vase Petri sau placi multicelulare)• In suspensie, prin imobilizarea celulelor in geluri sau solutii vascoase (ex. Methocel)

Particularitati de clonare• Eficienta de clonare a diferitor tipuri de celule difera• Eficienta de clonare cea mai mare este caracteristica pentru liniile celulare transformate• Eficienta de clonare a liniilor cu durata de viata limitata este mai mica. Pentru obtinerea unor clone din astfel de linii celulare este

nevoie de timp si multe generatii celulare. Riscuri – senescenta celulara • Eficienta de clonare in culturile primare este foarte mica, de cele mai multe ori = 0

Clonarea celulelor in monostrat• Clonarea prin dilutie - principala metoda de clonare celulara

– Poate fi realizata in recipiente de cultura cu suprafata mai mare (Petri, flacoane)– Poate fi realizata in placi de microtitrare (placi multicelulare)

Tehnica de clonare prin dilutie celulara pe suprafete de cultura mari

Eficienta de clonare in functie de densitatea celulara

Eficienta de clonare estimata

Per ml Per cm2 Petri de 6 cm Petri de 9 cm

0,1 % 1x104 2x103 40,000 100,000

1,0 % 1x103 200 4000 10,000

10 % 100 20 400 1000

50 20 4 80 200

100 10 2 40 100

Tehnica de clonare prin dilutie celulara in microplaci de titrare

Cresterea eficientei de clonare• Optimizarea conditiilor de cultura

– Medii potrivite (bogate in substante organice si energetice)– Adaugarea de hormoni (insulina, dexametazina)– Adaugarea de metaboliti intermediari (keto-acizi)– Ajustarea concentratiei de CO2– Tratarea substratului (polilizina, fibronectina)– Tripsinizarea (la 4oC, cu enzima de inalta puritate)

• Folosirea stratului de celule feeder (doica)

Clonarea pe strat feeder (doica)

Clonarea in suspensie

• Metoda aplicata pentru celulele hematopoietice si fibroblaste transformate

• Cresterea in mediu agarizat (semisolid) permite mentinerea celulelor coloniei impreuna si impiedica trans-contaminarea cu celule din colonii diferite

IZOLAREA COLONIILOR• In placutile de microtitrare, izolarea coloniilor se face prin simpla tripsinizare a camerelor individuale• Separarea coloniilor de pe suprafete de cultura mai mari se face de cele mai multe ori cu ajutorul inelelor de ceramica sau inox

Inele de clonare

Izolarea clonelor cu ajutorul inelelor de clonare

Izolarea clonelor in suspensie

Alte metode de selectie celulara• Selectia prin adeziune la substrat

– Subcultura din 30 in 30 min a celulelor pornind de la o cultura primara va duce la adeziunea selectiva mai intai a macrofagelor, apoi a fibroblastelor si la sfarsit a celulelor epiteliale

• Selectia folosind substrat de adeziune diferit (componente MEC sau sarcina electrica)– Colagenul si fibronectina favorizeaza adeziunea celulelor epiteliale

• Selectia prin desprindere selectiva de pe substrat– Se bazeaza pe proprietatea diferita de desprindere a celulelor de pe substrat ca urmare a tripsinizarii sau colagenizarii

(fibroblastele sunt mai usor desprinse de tripsina, in timp ce EDTA desprinde mai usor celulele epiteliale. Dispaza II desprinde celulele epiteliale de pe stratul feeder, care ramane aderat de substrat)

I. - CLASIFICAREA BIOMATERIALELOR SE POATE FACE DUPA MAI MULTE CRITERII:1.In functie de natura tesutului la a carui refacere contribuie:- Pentru tesuturi tari: oase, dinti, cartilagii- Pentru tesuturi moi: piele artificiala, vase de singe, ficat, ochi, inima, ligamente2. Dupa forma de prezentare a biomaterialului - fluide injectabile - capsule- filme poroase - filme fibroase - placi compacte - tuburi- fire-fibre - geluri3. Dupa natura chimica a materialului: Biomateriale polimerice;Biomateriale metalice; Biomateriale ceramice;Biomateriale compozite4. Dupa comportarea in mediu biologic - resorbabile- partial resorbabile- neresorbabile

II. - PROPRIETATILE INTRINSECI ALE MATERIALELOR Dimensiune; Masa molecular; Difuzivitate; Coeficient de sedimentare; Absorbtia luminii; Fluorescenta; Presiunea osmotic; Sarcina electrica; Solubilitate; Coeficient de partitie;

PROPRIETATILE MATERIALELOR -proprietati electrice si electrochimice: pH, potential elctrocinetic, constanta dielectrica;-proprietati optice: indice de refractie, activitate optica;-proprietati termice: temperaturi de tranzitie, caldura specifica, conductibilitate termica, dilatare termica;-proprietati reologice: reologia solutiilor(vâscozitate, indice de curgere) sau in stare solida (modul de elasticitate, timp de relaxare, coeficient de pierdere);-proprietati de interactiune: solubilitate, sorbtie, permeabilitate;-proprietati chimice: functionalitate, reactivitate chimica, rezistenta chimica. PROPRIETATILE DE SUPRAFATA

- Suprafetele sunt diferite decat materialele in masa - Suprafetele pot fi reactive- Pot fi mai usor contaminate- Structura suprafetei este mobila (se poate modifica in functie de mediul cu care vine in contact)

Rugozitate Omogenitate Ordonare (structura cristalina sau dezordonata) Hidrofilie – hidrofobie Adeziune - Bioadeziune

III. - FENOMENE LA INTERFATA BIOMATERIAL-ORGANISM Interactiunea biomaterial-organism poate fi reprezentata schematic sub forma:

Unul dintre cele mai importante fenomene care au loc la suprafata de separatie este fenomenul de sorbtie. Sorbtia este un fenomen fizico-chimic caracteristic amestecurilor formate din cel putin doua faze sau doua componente, si se datoreste fortelor de legatura dintre particulele chimice.

La contactul dintre doua faze se produce o concentrare a substantelor repartizate intre aceste doua faze, la suprafata de separatie, urmata aproape intotdeauna si de o concentrare in interiorul fazelor respective, mecanismul concentrarii fiind cel mai adesea fizic ( adsorbtia fizica sau absorbtia) si chimic ( adsorbtie specifica, chemosorbtie). IV. - INTERACTIUNEA BIOMATERIALELOR CU PROTEINELEMultitudinea de proteine existente la nivelul corpului uman si varietatea de structura si proprietati ale acestora, determina manifestarea unor interactiuni complexe cu biomaterialul, interactiuni care vor afecta si procesele biologice de la nivelul celulelor sau ale matricii extracelulare. Se constata prezenta atât a proteinelor fibrilare (colagenul, elastina, laminina), cât si a proteinelor globulare( albumina, imunoglobulina), deci o varietate de structuri chimice proteice si o multitudine de tipuri de amestecuri proteice. Pentru a studia , in aceste conditii, fenomenul de adsorbtie al proteinelor la suprafata biomaterialelor, trebuie abordate procesele atât din punct de vedere termodinamic cât si din punct de vedere cinetic. V. - MECANISMUL ADSORBTIEI COMPETITIVE A PROTEINELOR NU! Luând in considerare efectul Vroman, s-a incercat elaborarea unui mecanism de adsorbtie al proteinelor la suprafata biomaterialelor, cât mai realist. Aceasta presupune stabilirea influentei fortelor de interactiune care se manifesta la interfata biomaterial – proteina si intre proteinele adsorbite si cele in curs de adsorbtie.De exemplu, pentru o suprafata hidrofoba si proteina in stare hidrofoba. Atât suprafata cât si proteina vor fi inconjurare de molecule de apa aranjate nefavorabil dpdv energetic:Molecula proteica se va deplasa ca urmare a agitatiei termice si se va ciocni cu suprafata. Acesta ciocnire va avea ca rezultat indepartarea stratului de molecule de apa dintre proteina si suprafata. Daca energia rezultata in urma acestui proces este mai mare decât energia termica a moleculei proteice, aceasta va ramâne pe suprafata. In caz contrar se intoarce in solutie.Contributia interactiunilor electrostatice la mecanismul de adsorbtie, conform estimarilor cantitative, este secundara iar fortele Van der Waals sunt neglijabile.Ce se poate spune despre procesul de desorbtie?Asa cum am amintit , moleculele proteice adsorbite pot fi inlocuite de alte molecule proteice. O confirmare a acestui fapt o constituie si studiile de circulatie a unor solutii tampon peste suprafetele cu proteine adsorbite, când fenomenul de desorbtie nu se produce.Prezenta moleculelor proteice in solutie diminueaza interactiunile dintre molecula proteica adsorbita si suprafata prin efecte asupra retelelor moleculelor de apa dispuse in jurul acestora. Acesta va determina modificarea balantei dintre fortele entropice si cele hidrofobe, producându-se desorbtia. In cazul prezentat, daca o molecula este adsorbita pe suprafata, si alte doua molecule proteice se afla in solutie, ca urmare a interactiunilor dintre proteinele aflate in solutie si molecula adsorbita pot aparea doua situatii:

• intensitatea interactiunilor proteina adsorbita - proteina din solutie este mai mare decât intensitatea interactiunilor proteina- suprafata => desorbtia;

• intensitatea interactiunilor proteina adsorbita - proteina din solutie este mai mica decât intensitatea interactiunilor proteina- suprafata si proteina ramâne pe suprafata.

Interactiunile electristatice au si ele o contributie, viteza de desorbtie fiind dependenta de concentratia la suprafata a proteinei si concentratia totala a amestecului proteic. Constanta vitezei de desorbtie va reflecta interctiunile hidrofobe, electrostatice si entropice intre molecula proteica adsorbita si suprafata, când este inconjurata de alte molecule proteice.

V. - MECANISMUL ADSORBTIEI COMPETITIVE A PROTEINELOR Acest mecanism complex de adsorbtie in amestecuri de proteine este strict dependent de vitezele diferite de transfer de masa ale proteinelor si adsorbtia competitiva la suprafata.In momentul in care o suprafata si un amestec de proteine vin in contact, initial toate proteinele sunt distribuite uniform in solutie. La contactul cu suprafata, proteinele se vor adsorbi formând un strat proteic pe biomaterial. Formarea mai multor straturi presupune manifestarea unor interactiuni puternice intre proteine si este posibila in cazul proteinelor care in solutie se afla sub forma de agregate (insulina). Proteinele cu afinitatea de suprafata cea mai mare (cel mai mare k) se vor adsorbi preferential. Totusi, procesul este limitat de transportul de masa si prima proteina adsorbita va fi una cu cea mai mare viteza de transport. Eventual, proteina cu urmatoarea valoare a vitezei de difuzie isi va creste concentratia la suprafata, dar va putea inlocui prima proteina adsorbita numai daca afinitatea de suprafata este mai mare. Procesul continua pâna când proteina cu afinitatea cea mai mare acopera suprafata, este adsorbita si mentine echilibrul.

VI. - INTERACTIUNEA BIOMATERIALULUI CU FLUIDUL SANGUIN Notiuni introductive privind functiile sângelui

Sângele este un tesut lichid, eterogen, alcatuit din doua faze, una propriuzis lichida-plasma, care este o solutie apoasa de proteine si saruri minerale, tamponata la pH=7.35- si cealalta solida, corpusculara, reprezentata prin eriltrocite, leucocite si trombocite, suspendate in partea lichida.

Data fiind pozitia sângelui in ansamblul functional al sistemelor lichide din organism- lichid interstitial, intracelular, intravascular- sângele are de indeplinit câteva roluri, care, in esenta se pot concentra in doua functii fundamentale:

functia de transport;functia reglatoare homeostatica.Functia de transport

Aceasta consta in vehicularea, in dublu sens, intrare si iesire, a tuturor substantelor necesare vietii celulare sau a celor rezultate din metabolismul intermediar. Dintre principalele substante transportate sunt in primul rând cele legate de respiratie, oxigenul

transportat de la plamân la tesuturi si CO2 in sens invers. Fiecare eritrocit contine 28milioane molecule de hemoglobina, proteina transportoare de oxigen. Urmeaza apoi substantele nutritive- aminoacizi, acizi grasi, vitamine- provenite din tractul digestiv, precum si produsele finale ale metabolismului intermediar( uree, acid uric) vehiculate pentru eliminare prin rinichi, plamân, pieele, intestin- precum si hormonii transferati de la glandele endocrine catre tesuturi tinta. Proteinele plasmatice transportate pot lega substante cu proprietati hidrofobe, dispunând de o suprafata functionala de 700000m2.

Prin proteinele transportate si proteinele plasmatice de tipul imunoglobulinelor si prin leucocitele sale, sângele ia parte la procesul de aparare specifica organismului. Prin proteinele anticorpi, limfocite, macrofage si plasmocite, sangele asigura desfasurarea proceselor imune fata de agenti infectiosi- virusuri sau bacterii- sau proteine straine.

Functia de transport are deci trei componente principale: respiratorie, nutritiva si de aparare.Functia reglatoare homeostatica

Se realizeaza cu urmatoarele componente: izoionie- pastrarea constanta a concentratiilor si raporturilor ionice ( cationi Na+, K+, Ca2+, Mg2+; anioni Cl-, H2PO4

-, HCO3-) si

a echilibrului acido-bazic cu mentinerea concentratiei ionilor de hidrogen la pH=7.35izotonie- mentinerea la nivel constant a presiunii osmotice a sângelui, proportionala cu numarul de molecule de compusi

nedisociati si cu numarul de ioni ai electrolitilor care se gasesc in solutie, dintre care ionii de Na+, Cl-, HCO3- raspund de 85% din

presiunea osmotica totala. Orice marire a presiunii osmotice intr-unul dintre sectoarele hidrice ( intramuscular, extracelular, intracelular) trebuie sa fie compensata, in conditii fiziologice, prin modificari de volum hidric. Izotonia este corelata cu mentinerea constanta a tebloului sanguin. Datorita continutului sau proteic, in special nivelul de concentratie al albuminelor serice, sângele exercita o presiunee coloid-osmotica datorita careia faza lichida este mentinuta in sistemul vasculat;

izotermia- mentinerea constanta a tempereaturii corpului. Se realizeaza datorita fazei lichide a sângelui. Caldura specifica, foarte ridicata a apei, face posibila distribuirea in intregul organism a caldurii ce s-ar putea produce prin reactiile exoterme la nivelul organelor metabolice extrem de active, cum ar fi, de exemplu, ficatul

Elementele sângelui Eritrocitele- formate din 60% apa si 40% substanta solida- se compune din:componente minerale(K+, Na+, Ca2+);componente organice hemoglobinice;componente organice nehemoglobinice;enzime.Leucocitele- formate din:granulocite ( neutrofile, eozinofile, bazofile);monocitul.Trombocitele ( globulinele)Plasma: proteine; lipide; compusi anorganici; enzime.Proteinele plasmatice

Sunt un amestec eterogen de aproape 100 componente cu proprietati fizico-chimice si functii diferite. Greutatile moleculare variaza intre 60000 si 130000.

Functiile proteinelor plasmatice sunt:- mentin volumul normal si prresiunea coloid-osmotica a sângelui, precum si schimburile dintre capilare si tesuturi- albuminele

sunt preponderent raspunzatoare de aceasta functie;- transporta hormoni, metale, lipide, vitamine, pigmenti, coloranti, medicamente;participa la procesele de aparare specifica si nespecifica a organismului prin: imunoglobuline, properdina, transferina si la

fenomenele de coagulare si fibrinoliza;- participa la mentinerea echilibrului acido-bazic al sângelui, ca sistem tampon, datorita caracterului lor amfoter;- influenteaza vâscozitatea si microcirculatia, contribuind la realizarea unui mediu protector pentru eritrocite, favorizându-le in

acelasi timp mobilitatea;- reprezinta o rezerva proteica importanta in situatiile in care aportul proteic scade

RELATIA BIOMATERIAL- FLUID SANGUIN Relatia biomaterial- fluid sanguin urmareste, in primul rând, asigurarea biocompatibilitatii materialului cu functie de

proteza sau implant.

Contactul dintre fluidul sanguin si suprafata unui implant declanseaza in primul rând adsorbtia superficiala a proteinelor serice, urmata de aderarea, deformarea si eliberarea plachetelor deci se produce coagularea sângelui.

Fazele si factorii principali ai coagularii

In esenta, fenomenul de coagulare a sângelui consta in transformarea fibrinogenului in fibrina. Particularitatile specifice procesului sunt:

- numarul mare de activatori si inhibitori care intervin;- existenta, ca precursori, a majoritatii factorilor coagularii;- preponderent, factorii coagularii sunt proteaze care rezulta in urma proteolizei limitate din formele lor inactive;- transformarea factorilor coagularii din forme inactive in forme active se face prin autocataliza, determinata de propriile lor

produse;- unii dintre factori, ca de exemplu Ca2+ au actiune multipla, intervenind aproape in toti timpii coagularii;- procesul complex se desfasoara in cascada. Faza de latenta este formata de o avalansa de transformari accelerate ale factorilor

coagularii, prin forme inactive si forme active.

Fibrinogenul este o proteina cu forma moleculara alungita, una dintre cel mai putin solubila proteina a sistemului sanguine. Are o masa moleculara medie de 330000-340000Da si un pHizoelectric de 5.3. Este alcatuit din 6 lanturi peptidice, grupate câte doua, perechile diferind intre ele prin aminoacidul N-terminal si anume: o pereche are tirozina ca aminoacid terminal, a doua are acidul piroglutamic, iar a treia alanina.

Acest factor contine componente glucidice: hexoze, aminozaharuri, acid sialic, oxidarea glucidelor facându-l inapt pentru fenomenul coagularii.

Fiziologic, transformarea fibrinogenului in fibrina se petrece in 2-3 secunde sub actiunea trombinei. Transformarea fibrinogenului in fibrina este un fenomen de proteoliza limitata, in cursul careia se formeaza doua lanturi polipeptidice diferite: fibrinopeptidele A si B, conform reactiei:

Fibrinogen---à fibrina + fibrinopeptide A si BPolimerizarea monomerilor de fibrina se face pe doua directii:- longitudinala- cu formarea fibrelor sau fibrilelor primare;- transversala- cu producerea fibrelor secundare de fibrina, datorita puntilor de hidrogen ce se stabilesc intre tirozina si histidina

dintre doua fibre primare.Mecanismul coagularii sângeluiCoagularea sângelui se desfasoara pe doua cai care se deosebesc dupa originea tisulara sau sanguinea a factorului de declansare a

procesului in cascada. Calea extrinsica, scurta, cu durate de ordinul secundelor, are doua etape importante: generarea protrombinazei si producerea

trombinei. Trombina actioneaza asupra fibrinogenului transformându-l in fibrina. Fibrina formata in aceasta faza este foarte fragila. Calea intrinsica- pe aceasta cale, mai lenta, a carei durata este de ordinul minutelor sunt intâlnite patru etape:- generarea protrombinazei;- producerea trombinei;- transformarea fibrinogenului in fibrina si stabilizarea acesteia;

- sinereza si retractia cheagului.

In calea intrinsica sunt implicati numai factori sanguini. Procesul este declansat prin activare afactorului XII(factorul Hageman), ca urmare a fenomenului de suprafata de hemosorbtie, pe care-l sufera acest factor de contact la nivelul leziunilor vasculare sau prin contact cu o suprafata straina. Legarea factorului Hageman sau a kininogenului de masa moleculara mare la suprafata unui biomaterial(si in special la suprafete incarcate negativ) face mai usoara activarea acestuia.

Factorul Hageman si kininogenul de masa moleculara mare contin in catena macromoleculara zone bogarte in aminoacidul histidina.

In aceste zone secventa de aminoacizi care se repeta este (Gly-His-X) sau (His-Gly-X). Acest aminoacid cu pK> 10, la valoarea de pH a fluidului sanguine este incarcat pozitiv la N.

Zonele incarcate pozitiv vor fi atrase de catre suprafataAtractia si asocierea aminoacizilor cu grupele negative ale suprafetei determina modificari conformationale ale factorului XII,

respective ale kininogenului. Astfel, legatura peptidica din dreptul unor aminoacizi devine sensibila la actiunea hidrolitica a enzimelor. In cazul factorului Hageman, desfacrea legaturii peptidice se realizeaza la nivelul aminoacizilor Arg 353-Val354.

Fragmentul proteic rezultat in urma hidrolizei reprezinta factorul Hageman activat, proteina cu conformatie si incarcare electrica diferita de a compusului macromolecular de plecare, si, implicit cu posibilitati de interactiune diferite cu proteinele plasmatice. Urmeaza o serie de pasi care conduc la formarea polimerului de fibrina, instabil, trecut in forma stabila sub actiunea factorului XIII. Fibrina devine insolubila prin constituirea unor punti disulfidice intre glicina terminala a unui monomer si gruparea unui monomer vecin. Urmeaza apoi sinereza cheagului prin expulzarea apei din ochiurile gelului, cu micsorarea spatiilor dintre fibrile. Retractia cheagului se produce numai in prezenta trombocitelor functional normale, care actioneaza prin intermediul factorului I plachetar. In punctele nodale ale retelei de fibrina plachetele functioneaza ca centri mecanici.

Sângele contine si factori inhibitori ai coagularii, care reduc viteza acestui proces. Din grupul antitrombinelor fac parte: fibrina, antitrombina I, heparina sau antitrombina II si antitrombinele III, IV si VII. Anticoagulantele cu aplicare terapeutica mai folosite sunt heparina si antagonistii vitaminei K.

Heparina are ca unitate de repetitie cantitati echimoleculare de resturi de D-glucozamina si acid D-glucuronic. Continutul de sulfat variaza intre 5 si 6,5 resturi de sulfat de tetrazaharida. Are caracter acid, fiind puternic sulfatata.

Heparina inhiba direct atât activitatea factorului X, cat si actiunea enzimatica a trombinei deja formate. Actiunea sa depinde de gradul de sulfatare.

FibrinolizaFibrinoliza este ultima faza a hemostazei, ce are ca efect eliminarea fragmentelor de cheag si a depozitelor de fibrina. Se

realizeaza prin mecanism enzimatic fiind catalizata de plasmina sau fibrinolizina. Aceasta scindeaza fibrina in fragmente polipeptidice mici, solubile, care nu mai pot forma retele coerente. Plasminogenul poate fi activat in sistem intra si extravascular. Activatorii se gasesc in sânge si in toate fluidele biologice ale organismului.

Produsele secundare ale fibrinolizei inhiba formare trombinei si polimerizarea monomerilor de fibrina. Plasminogenul poate fi inhibat sau activat. Streptokinaza, proteina streptococcia neenzimatica formeaza cu plasminogenul un complex, prin interactiuni hidrofobe, care transforma moleculele de plasminogen in plasmina. In urina se gaseste urokinaza, activator al plasminogenului care provine din sânge sau tesuturi.

Ca inhibitori ai procesului pot fi mentionate proteinele cu o activitate antiplasmatica, ca a2- macroglobulina sau antitrombina III.

VI. - LP2 BIOMATERIALE CERAMICE Produsele ceramice sunt cele mai vechi materiale artificiale. Dintre domeniile de utilizare, cele mai semnificative sunt:

- implanturi în sistemul osos;- adezivi în proteze dentare;- confecţionarea unor medii retardante;- suporturi pentru adeziune celulară;- medii filtrante pentru lichide biologice.

Din punct de vedere al caracteristicilor de interactiune ceramicele biologice pot fi clasificate:1.inerte2.cu suprafaţă reactivă3.resorbabileÎn cazul bioceramicilor resorbabile variaţia în timp a reactivităţii relative a acestora urmăreşte o dependenţă gaussiană: în

primul interval de timp reactivitatea creşte pe seama existenţei unor componente (funcţii) disponibile de a reacţiona cu mediul; după un anumit interval de timp, când procesul de resorbţie este avansat reactivitatea înregistrată se diminuează. Pentru bioceramicele reactive la suprafaţă, reactivitate relativă are valori mai mici, iar maximul se atinge, de obicei, la intervale de timp mai mari.

Bioceramicele inerte au o reactivitate practic nesemnificativă care se manifestă la intervale de timp foarte mari. 1.Bioceramici inerte Aceste materiale sunt caracterizate de lipsa oricărei modificări în ţesut, iar produsele de degradare (în cazul în care se formează)

sunt uşor îndepărtate în procesele de reglare naturală ale organismului.În cazul acestor materiale, ţesutul uman poate forma membrane fibroase de dimensiuni micronice în jurul implantului, membrana

fiind susţinută prin blocare mecanică cauzată de rugozitatea suprafeţei.Ceramici inerte tipice:

- oxizi de aluminiu- carbon LTI (izotopic de joasă temperatură)- pentru valve cardiace şi acoperiri de proteze.

Oxizii de aluminiu – au o structură care se formează prin aranjarea oxigenului într-o formă hexagonală în jurul aluminiului. Oxizii de aluminiu au o structură cristalină.

Se utilizează pentru proteze articulare ca urmare a durităţii ridicate, uzurii reduse şi biocompatibilităţii lor. Dezavantaje: friabilitate şi dificultăţi în fabricare.

Ceramici inerte: Oxizii de aluminiu (Alumina)• Aplicatii

– ortopedice: • cap femural • suruburi si placute osoase • acoperiri poroase pentru parti ale femurului • spaceri porosi (specifici in chirurgia de revizie)• proteza de genunchi

– dentare: coroane si punti • Ceramici inerte: Alumina• Istoric:

– din anii 70 s-au implantat mai mult de 2.5 milioane de dispozitive de cap femural. – Implanturile alumina-pe-alumina au fost monitorizate de FDA

2.Bioceramici reactive la suprafaţă În cazul acestor materiale pot avea loc reacţii slabe şi selective cu anumite ţesuturi sau legături chimice între ţesut şi implant.

Implantul este protejat faţă de degradări ulterioare ca urmare a stratului de “ pasivare” format.Bioceramici reactive:

- bioglass: Na2O-CaO-CaF2-P2O5-SiO2 - apatită: Ca10(PO4)6(OH)2 - fosfati de calciu

Bioceramici reactive la suprafaţă sunt utilizate pentru realizarea unor implanturi de dimensiuni reduse (unele se dezvoltă la tensiuni mici) şi pentru acoperirea unor implanturi, pentru a le îmbogăţii legarea de ţesut. Acoperirea suprafeţelor însă, poate conduce la rupturi ca urmare a oboselii substratului şi dacă acoperirea nu prezintă rezistenţă bună.

Hidroxiapatita (HA) Compoziţia minerală a oaselor şi dinţilor este constituită, în primul rând din apatite pe bază de fosfaţi de calciu. Deoarece

cristalele de hidroxiapatită obţinute prin sinteză sunt aproape identice cu cele naturale, biomaterialele pe bază de HA au o biocompatibilitate crescută.

Formula chimică: [Ca10(PO4)6(OH)2] Ionii OH dintr-o astfel de moleculă sunt distribuiţi în colţurile planului şi sunt asociaţi cu 6 din cei 10 ioni de calciu .Aceste configuraţii conduc la interacţiuni foarte puternice în reţea. Ca urmare a capacităţii de a lega chimic direct cu ţesuturile

tari, hidroxiapatita poate îmbunătăţii remodelarea osoasă.De asemenea capacitatea de degradare este scăzută la suprafaţă.Totuşi, când degradarea are loc, pot apărea fisuri şi pierderi de material. Dacă mici particule (microscopice) se desprind din

material, acestea pot migra în organism şi pot determina complicaţii. Sticlele ceramice Aceste materiale au fost descoperite în anul 1960 şi încă din acel timp s-au dezvoltat două tipuri de produse bioimplantabile

(Bioglass şi Ceravital). Ambele produse se caracterizează prin rezistenţă crescută la rupere, rezistenţă la abraziune şi, în plus, coeficient termic de expansiune redus. Sticlele ceramice, ca urmare a friabilităţii lor s-au utilizat ca:

- agent de ranforsare pentru cimenturile osoase- materiale de acoperire.

Procese la interfaţa ceramicelor cu suprafaţa reactivă - Ceramicele pe bază de fosfaţi de calciu şi sticlele ceramice prezintă proprietăţi fizico-chimice de suprafaţă specifice, proprietăţi

care permit manifestarea unor reacţii chimice cu componentele mediului în care este introdus implantul şi care vor afecta într-o măsură mai mare sau mai mică procesul de funcţionare al celulelor.

- Principalele procese care se pot manifesta la interfaţa ceramică bioactivă- ţesut sunt: - (1)- dizolvarea ceramicei- (2)- precipitarea din soluţie pe materialul ceramic- (3)- schimbul de ioni si rearanjări structurale la interfaţa ceramică-ţesut- (4)- interdifuzia din stratul vecin suprafeţei în materialul ceramic- (5)- efecte mediatizante ale soluţiei asupra activităţi celulare- (6)- depunerea de fază minerală (a) sau a fazei organice (b) la suprafaţa ceramică, fără o integrare în suprafaţa ceramică- (7)- depunerea cu integrare în suprafaţă- (8)- chemotaxa la suprafaţa ceramică- (9)- ataşarea celulelor şi proliferarea- (10)- diferenţierea celulară- (11)- formarea matrici extracelulare.

Modificări ale suprafeţei ca urmare a reacţiei (dizolvarea, precipitarea şi reacţii schimbătoare de ioni).Aproape toate ceramicele pe bază de fosfaţi de calciu precum şi hidroxiapatitele stoechiometrice (şi în special acestea) au viteză

redusă de dizolvare. Faţă de aceste reacţii cinetice cu viteză redusă, studiile efectuate in vitro au arătat ca şi fenomenele de precipitare au loc cu viteze scăzute. Totuşi precipitatul care se formează pe suprafaţă nu este echivalent cu hidroxiapatita biologică, dar este o fază precursoare în care raportul Ca/P este mai mic decât 1,67. Astfel, când acest material (precipitatul) va reacţiona cu ţesutul osos înconjurător, viteza de reacţie va fi foarte mică. In aceelaşi timp se vor produce două procese competitive:

- formarea tesutului osos înafara suprafeţei hidroxiapatitei folosite ca implant (ca urmare a aportului suplimentar de ioni de Ca2+ şi PO4

3- rezultaţi prin dizolvare);- legarea la suprafaţă.

Efecte ale reacţiilor de suprafaţă asupra funcţionării celulelorStudiile efectuate in vitro asupra unor sticle bioceramice în vederea evidenţierii efectului reacţiilor de la suprafaţa (dizolvare, precipitare) asupra activităţii celulelor (urmărind activitatea fosfatazei alcaline şi sinteza colagenului de tipI îin osteoblaste) au arătat faptul că reacţiile de la suprafaţă pot modifica în mod esenţial activitatea celulelor numai dacă produsele formate sunt oxizi care iniţiază reacţii adverse în procesul de formare al osului mineralizat (vor functiona ca impurităţi). Ceramici bioactive: Sticla ceramica

• Sticla:– material anorganic care racit din topitura formeaza solid fara cristalizare – solid amorf

• Sticla ceramica etse un solid policristalin obtinut prin cristalizarea controlata a sticlei – Compozitia include SiO2, CaO si Na2O

– Bioactivitatea depinde de cantitatile relative de SiO2, CaO si Na2O– Nu poate fi utilizata in aplicatii de legatura – Ideal ca ciment osos si acoperiri - ca urmare a activitatii biologice

3.Bioceramici resorbabileBioceramicele resorbabile sunt materiale care sunt menţinute un interval de timp în organism, după care are loc înlocuirea lor prin formarea unui nou ţesut osos. Subprodusele rezultate prin dizolvarea sau descompunerea acestora sunt utilizate în procesul de reconstrucţie a ţesutului osos propriu organismului. Suprafaţa biomaterialului se modifică incontinuu, interfaţa biomaterial-tesut se deplasează continuu spre interiorul materialului până la consumul integral al acestuia. Aceste tipuri de materiale bioceramice constituie o soluţie atât pentru asigurarea tolerabilităţii în timp (la intervale mari de timp unele implanturi, ca urmare a unor procese de oxidare sunt respinse de organism) cât şi pentru realizarea unor culturi tisulare osoase”in vitro”, cu celule specifice.Ceramici biodegradabile: Fosfati de calciu

• Aproape toate ceramicile bioresorbabile sunt variatii de fosfat de calciu • Utilizari

– materiale de reparatie pentru os afectat de traume sau boli – material de umplere dupa rezectie osoasa a tumorilor de os – repararea si fixarea de vertrebre – repararea discurilor herniate – repararea de defecte maxilofaciale si dentare – implanturi oculare

eliberare controlata de medicamente• Degradarea este cauzata de:

– dizolvarea fiziologica (depinde de pH mediu, tip de fosfat de calciu)– dezintegare fizica – factori biologici (fagocitoza etc.)

• Forma de fosfat de calciu depinde de raportul Ca:P – 5:3 hidroxiapatita, Ca10(PO4)6(OH)2

– 3:2 b-fosfat tricalcic Ca3(PO4)2

• Modul de elasticitate ridicat (40-117 GPa)• Modulul de elasticitate tesuturi:

– Smalt: 74 GPa – Dentina: 21 GPa – Os: 12-18 GPa – Asamblarea structurala a osului mineral- inlocuiri osoase – Acoperiri de implanturi metalice care sa promoveze cresterea osoasa – Diferite forme exista in functie de raportul Ca/P, prezenta apei, impuritati si temperatura

MATERIALE METALICEIn cele mai multe aplicaţii metalele sunt utilizate fie într-o formă fin divizată ( în tehnologia de obţinere a biomaterialelor- ca şi catalizatori) sau sub formă masivă ( forma policristalină). De altfel, la nivel microscopic, cele mai multe materiale, cu unele excepţii (câteva specii într-adevăr amorfe), pot fi considerate agregate de cristalite. Chimia suprafeţei unui asemenea material este dependentă în mod esenţial de natura şi tipul suprafeţelor expuse din aceste cristalite.

Cele mai multe metale există doar într-una din formele structurale ale cristalului metalic:-hcp- structura hexagonală împachetată-bcc- structura cubică centrată-fcc- structura cubică cu feţe centrateStructura hexagonală împachetată şi structura cubică cu feţe centrate

Cele două tipuri de structură se bazează pe împachetarea straturilor de atomi, unde atomii sunt aranjaţi într-o manieră hexagonală pentru un strat individual. Atomii următorului strat al structurii va sta, în mod preferenţial în adânciturile primului strat, rezultând o apropiere a atomilor în cele două straturi. Dacă considerăm al treilea strat de atomi acesta poate fi poziţionat în două moduri:1. atomii celui de-al treileastrat stau peste cei din primul strat-conduc la o formă caracteristică ….ABABAB a secvenţei de împachetare….(A-stratul cu număr impar, B- stratul de atomi de nr.par)- structură hexagonală împachetată2.atomi din al treilea strat se poziţionează lateral faţă de cei din primul şi al doilea strat, după care în al patrulea strat poziţia atomilor se repetă- apare secvenţa de împachetare ….ABCABC….- structura cubică cu feţe centrateCa urmare a originii lor aceste două forme de structuri au trăsături comune: atomii sunt strâns împachetaţi; fiecare atom are 12 atomi vecini.Caracteristicile suprafeţei structurii hexagonale împachetate sunt:

- secvenţa de împachetare …ABAB… conduce la unitatea celulară tridimensională de formă hexagonală;- este caracteristică metalelor: Co, Zn, Ti, Ru;- toţi atomii suprafeţei sunt echivalenţi şi au NC=9;

- un punct(NC=1);- situsuri de legare între două puncte(NC=2);- puncte în adâncitură(NC=3).

Structura cubică cu feţe centrateSecvenţa de împachetare ….ABCABC… a structurii cubice cu feţe centrate conduce la la o structură tridimensională cu simetrie cubică(de aici şi denumirea). Celula unitară este cubică dar nu trebuie uitat faptul că originea structurii este o împachetare de straturi cu simetrie hexagonală.Metalele care prezintă această structură: Pt, Rh, Pd.Caracteristicile suprafeţei sunt:

- toţi atomii suprafeţei sunt echivalenţi;- suprafaţa este relativ netedă;- suprafaţa are diferite puncte de adsorbţie pentru molecule care au diferite semetrii locale şi leagă la diferite numere de

coordinare:- punct unic(NC=1);- situsuri legate, între 2 atomi(NC=2);- situsuri de adâncitură, între 4 atomi(NC=4)

Structura cubică centratăAre foarte puţine lucruri în comun cu structura cubică cu feţe centrate, cu excepţia naturii cubice a celulei unitare. Această

structură nu este o structură împachetată(fig.15). Metale care prezintă această structură sunt: Fe, W, Mo.Ca urmare a densităţii mici de împachetare a structurii, suprafaţa tinde, de asemenea, să aibă o natură deschisă, cu atomii suprafeţei adesea prezentând numere diferite de coordinare.Apar două posibilităţi: periodicitate de atom şi periodicitate de strat.Efectele electronice şi cele geometrice determină modul în care interacţionează suprafaţa materialului cu mediul. Se pot forma mai multe sisteme de interacţiune:Materiale metalice in medicina

Otel inox Aliaje pe baza de cobalt Aliaje pe baza de Ti

Otelurile inox Cel mai uzual: 316L

– Fe 60-65 wt%– Cr 17-19 wt %– Ni 12-14 wt%

Continut de carbon redus - 0.03 wt%:– buna rezistenta la coroziune in vivo.

De ce Cr?– Rezistenta la coroziune prin formarea de oxid la suprafata

De ce Ni?– Imbunatateste rezistenta prin crestera fazei cubice centrata

Aliaje pe baza de cobaltCele mai obisnuite pentru aplicatii chirurgicale:

– ASTM F75– ASTM F799 – ASTM F790 – ASTM F 562

Aliaje pe baza de titan Bune proprietati mecanice

Buna rezistenta la coroziune ca urmare a stratului de TiO2 format la suprafataMateriale dentare: Nitinol

• NI ckel-TItanium-Naval Ordinance Lab

• Aliaj cu memorie a formei (SMA): abilitatea de a reveni la o forma predeterminata cand este incalzitAplicatii in ortodontie

• Forma se fixeaza prin inmuiere la 500 °C.• Temperatura de transformare se ajusteaza prin modificare fractiei Ni-Ti• Rezistenta scazuta peste valoarea de temp. de transformare, se deformeaza usor si recapata forma ‘memorata’

Alte utilizari ale metalelor

Tuburi medicaleStenturiCatetere

Valve mecanice

- minge in cusca si - cu disc basculant

Materiale: aliaje Co-Cr, Ti, C pirolitic.Miscarea componentului mobil (mingea in cusca sau discul basculant) raspunde la schimbarile de presiune sau curgere in inima.

àIncidenta de trombo-embolism este de 2-5% chiar si cu tratament adecvat cu anticoagulante. Este necesara o terapie continua cu anticoagulant - riscuri de hemoragii.àValva minge in cusca tip Starr-Edwards, in care inelul interior s-a acoperit cu polimer a redus incidenta de tromboembolism.Valva cu disc basculant Bjork-Shiley - testata clinic in 1969.

Discul de fixare si inelul interior sunt facute din aliaje cobalt-crom, discul mobil din carbon pirolitic si inelul exterior din poli(tetrafluoroetilena) (ePTFE) expandata.

StenturiStent - dispozitiv din material inert, proiectat sa serveasca ca suport temporar sau permanent pentru mentinerea sau cresterea lumenului vasului de sange. àIntrodus prima data in anii ‘60. àTipuri de stenturi: (1) primele variante - diametru initial redus care expandeaza la o dimensiune predeterminata cand constrangerea este eliminta(2) stenturi cu memorie termica - Nitinol - utilizeaza memoria aliajului dupa incalzire (3) stent balon-expandabil, care se bazeaza pe principiul deformarii plastice a metalului peste limita sa elastica.

VII. - C3 METODELE INGINERIEI TISULARE:• -insamantarea unor celule normale, prelevate de la un donator (de obicei insusi pacientul care necesita protezarea) si

proliferate in vitro, pe suporturi tridimensionale biodegradabile, care sa asigure ghidarea corespunzatoare a generarii unei noi matrici, prin activitatea metabolica normala a celulelor. Se obtin tesuturi artificiale ce urmeaza a fi implantat in corpul pacientului.

• -regenerarea in situ a tesutului lezat, prin injectatea unui suport insamantat sau nu cu celule care sa stimuleze refacerea tesuturilor gazda. Pe masura constituirii noii matrici, suportul se biodegradeaza, integrandu-se complet in sistemul-gazda; SUPORTURI PENTRU INGINERIE TISULARA In proiectarea suporturilor pentru inginerie tisulara se urmaresc:

- parametrii fizico-chimici care intervin imediat dupa implantare;- parametrii biologici care intervin

Astfel, imediat dupa contactul cu plaga, implantul trebuie sa prezinte adeziune cu tesutul gazda. Datele empirice au evidentiat urmatoarea cerinta pentru un implant care este capabil de a inlocui un tesut:

Tb/ Tv =1Tb - timpul necesar biodegradarii implantului;Tv-timpul de cicatrizare (vindecare), in care are loc sinteza tesutului nou.

Mediul poros in ingineria tisulara Materiale colagenice: -fibra de colagen, colagen, gelatin, celulozaBiopolimeri: Chitina ,Chitosan Aplicatii:cartilaj; tesut osos; piele artificiala Polimeri sintetici biodegradabili

IX. - CARACTERISTICI DE DIFUZIE PRIN MEMBRANE Mecanismele ce caracterizeaza procesele de membrana fac parte din fenomenele de transport ale substantei prin membrana sunt

tipic ireversibile, fiind insotite de producere de entropie. Difuzia prin mediul poros: - difuzia fluidului din mediul A prin stratul limita exterior mediului poros (difuzia externa) la interfata cu membrana de polimeri:- sorbtia fluidului in interiorul stratului microporos;- difuzia fluidului prin stratul limita exterior mediului poros in mediul B.

Difuzia face parte din grupul de fenomene moleculare de transport cauzate de miscarea termica a moleculelor fluidelor si le asigura o repartitie uniforma in spatiul considerat.

In functie de dimensiunile si structura porilor, difuzia prin mediul poros poate avea loc in trei moduri :- difuzia dupa legea lui Fick;- difuzia Knudsen;- difuzia de suprafata. a) Difuzia Fick are loc atunci când diametrul porilor este mare. Descrierea cantitativa a procesului de difuzie care tine cont de

miscarea dezordonata a moleculelor este data de legea a II-a lui Fick si reda variatia in timp a concentratiei in orice punct fiind proportionala cu variatia in spatiu a gradientului de concentratie:

b) Difuzia Knudsen are loc atunci când dimensiunile porilor si drumul liber mijlociu al moleculelor care difuzeaza sunt apropiate ( de acelasi ordin de marime), particulele se vor ciocni mai frecvent cu peretele porului decât intre ele, astfel incât fluxul de difuzie nu va mai fi afectat de prezenta altor specii moleculare, deoarece ciocnirile moleculelor intre ele sunt neglijabile. Acest mecanism este preponderent pentru diametre ale porilor mai mici de 50Ao.

c) Difuzia de suprafata apare atunci când pe suprafata interna a mediului poros se adsoarbe o parte din difuzat. Daca adsorbtia este de natura fizica, moleculele adsorbite au o anumita mobilitate si daca concentratia substantei adsorbite variaza de la un punct la altul se creaza un gradient de concentratie care va crea un fenomen identic cu difuzia obisnuita, care va fi cu atât mai intens cu cât mobilitatea moleculelor adsorbite este mai mare.

INGINERIA TISULARA A FICATULUI - Organ complex din punct de vedere structural si metabolic- Aprox. 5000 transplanturi 2004 (USA)- Lista actuala de asteptare: aprox. 19000 pacienti - Ingineria tisulara - actual - dispozitive extracorporale care functioneaza ca o ‘punte pana la transplant’Functiile ficatului:1.Producerea de proteine( albumina, toti factorii de coagulare a sangelui cu exceptia FVII, alfa si beta-globuline 2. Detoxificare si metabolizare medicamente 3. Stocare (glicogen, fier, lipide, vitamine)4. Producerea bilei 5. Metabolismul bilirubinei 6. Metabolismul carbohidratilor 7. NU ESTE INCA CLAR CARE DINTRE ACESTE FUNCTII SUNT CELE MAI IMPORTANTE A FI REPRODUSE INTR-

UN DISPOZITIV CU ROL DE FICAT Transplantul de ficat constituie o metoda de tratament in bolile hepatice. Problemele fundamentale pe care le ridica transplantul

de ficat le constituie: - alegerea severa a donatorilor;- inexistenta unei variante terapeutice care sa stopeze amplificarea deficientei hepatice.

Directii de cercetare:- preluarea temporara a functiei ficatului: bioreactorii extracorporali si dispozitivele de hemoperfuzie; - transplantul de sisteme hepatocitare ca alternativa permanenta.

Celulele care fac parte din masa ficatului sunt numite hepatocite si sunt aranjate in straturi unicelulare Fiecare celula are nucleu si aparatul Golgi, multe mitocondrii si lipozomi si sunt abundente in granule de glicogen si picaturi de

grasime Unde celulele sunt in contact cu vase de sange, microvilii apar a face schimbul de substante Aranjarea stratului de celule implica atat vasele de sange cat si alte vase denumite caniculii bilei. Ramificatiile acestora,

impreuna cu nervii, vasele limfatice si capsula fibroase Glisson formeaza un aranjament denumit tractul portal. Vasele de sange se divid in venule, care se divid in sinusoide de tip capilar. Aceasta combinatie de venule si hepatocite se

considera a forma partea functionala a ficatului. Sinusoidele separa straturile de hepatocite si permit schimbul de material intre sange si celule. Ele se reunesc apoi inspre vena hepatica.

SISTEME DE ASISTARE A FICATULUI Bioreactoare cu fibre cu lumen

• HepatAssist (Circuit Biomedical), celule porcine pe purtatori tip fibra • Live Rx (Algenix Inc), celule porcine pe gel colagenic cu fibre cu lumen in interior• ELAD (VitaGen), hepatocite umane cultivate pe fibre cu lumen din polisulfone • Excorp Medical BAL, hepatocite porcine suspendate in colagen, inafara unor fibre prin care curge sangele

Alte configuratii: • sferoizi • sisteme de tip sandwiches pe baza de colagen • sferoizi microincapsulati • culturi suprapuse

HEPATASSIST

Stadiu: testare clinica - faza III, in SUA si EUUtilizeaza hepatocite de porcine intr-un circuit de detoxificare si sinteza de componente Hepatocitele sunt criogenate si apoi reincalzite dupa o perioada de timp.Procedeul elimina celulele antigenice si pastreaza doar celulele functionale.Etape - Sangele este preluat de la pacient cu ajutorul unui cateter cu dublu lumen inserat in vena femurala superficiala - Separatorul de plasma - separa plasma din sange, previne afectarea eritrocitelor si leucocitelor, permitant intoarcerea acestora in

circulatia pacientului - Pompa asigura miscarea lenta a plasmei prin intreg sistemul, toxinele fiind eliminate in hemoperfuzor. O coloana cu membrana

celulozica asigura aceasta functie.

Incalzitorul + oxigenatorul - au rolul de a pastra hepatocitele intr-o stare de functionare adecvata Bioreactorul - consta din module de fibre cu lumen care contin hepatocite. Fibrele sunt din acetat de celuloza, sunt poroase, cu o

suprafata interna de 6000cm2.In aceste module exista 5bilioane hepatocite porcine care permit plasmei sa circule cu un debit de 400mL/minut.Se produce un transfer liber intre plasma si hepatocite, sistemul actionand in acelasi mod ca un ficat normal.Sisteme hepatocitare pentru transplant Aceste sisteme ofera posibilitatea de a crea multe functii echivalente ficatului, fie depozitand hepatocite prin conservare

crioscopica fie utilizarea celulelor analoage pentru terapia genetica.

1.Modelul de injectare hepatocitar Hepatocitele necesita, pentru crestere si diferentiere, o matrice extracelulara si de aceea se poate pleca de la tesutul stromal ca

matrice extracelulara. Hepatocitele izolate au fost injectate direct in splina sau ficat. Studiile efectuate au aratat o corectie importanta, insa temporara a defectelor metabolice ale ficatului.

Caracteristici:- tehnica clasica;- localizare corecta;- durata de injumatatire scurta;- timp redus de raspuns tisular;- utilizeaza molecule mari;- posibila toxicitate;- conjugare cu proteine purtatoare inerte.

2.Transplantul hepatocitelor pe matrici polimerice Deoarece aplicarea practica a implanturilor de hepatocite care sa prolifereze si sa preia functiile ficatului nu a fost inca

posibila, constructia unui schelet hepatocitar utilizand polimeri are drept scop transplantul unui mare numar de hepatocite care sa permita supravietuirea unei parti din acestea.

Interfata polimer – hepatocite poate fi manevrata prin intermediul proteinelor (laminina, fibronectina) precum si factori de crestere pentru a imprima aderenta, viabilitatea, functia si cresterea celulelor.

A – Dispozitiv rezervor B – Matrice polimerica solida C – Microsfere polimerice D – Hidrogeluri

(i) inglobare; (ii) degradabile (iii) umflare TERAPIA CU CELULE STEM

5. HEMODIALIZA UTILIZÂND RINICHIUL ARTIFICIAL CU FIBRE CU LUMENPrincipalele caracteristici sunt:- toxinele sunt îndepărtate prin difuzia solutului prin porii membranei, în special prin menţinerea unui gradient de concentraţie între sânge şi dializat;- dializatul înlocuieşte continuu produsele toxice prin păstrarea unui gradient de concentraţie şi prin viteza de difuzie;- dializatul conţine substanţe ionice ale sângelui, în concentraţie mare, ionii în exces difuzând spre concentraţiile reduse, până la stabilirea unui echilibru;- proteinele şi celulele din sânge nu pot traversa membrana; - viteza de curăţare de substanţe cu dimensiuni mici este ridicată;- fluidul în exces se îndepărtează prin ultrafiltrare- gradientul de presiune hidrostatică de-a lungul membranei forţează fluidul din sânge către dializat, care are gradient de concentraţie în solut mai mare; -hemofiltrarea utilizează membrane cu pori mari care favorozează îndepărtarea moleculelor cu dimensiuni medii prin convecţie- gradientul de presiune forţează apa să treacă înafara sângelui, iar apa trage după sine şi moleculele cu dimensiuni medii. O curăţare rapidă are loc prin hemodiafiltrare, procedeu care combină hemodializa şi hemofiltrarea, utilizând membrane cu pori mari şi mici pentru îndepărtarea avansată a moleculelor mici prin hemodializă şi pentru o bună curăţare de molecule medii prin hemofiltrare

Com ponentele maşinii de dializă- circuitul extracorporeal

Tuburile pentru sânge-sunt din PVC flexibil şi prelucrabil prin adaos de plastifianţi;-tuburile sunt prelucrate astfel încât să aibă o suprafaţă internă netedă şi tratate cu silicon pentru a minimiza coagularea sângelui(importantă în special în segmentul pompei);-reprezintă linia arterială care conduce sângele dela arteră la dializor, linia venoasă care întoarce sângele la pacient. Monitorizarea presiunii arteriale-este necesară pentru a indica deconectarea sau obstrucţionarea tubulaturii, controlând îndepărtarea fluidului din sânge prin gradient de presiune;-traducătorul de alimentare amplifică şi converteşte semnalul în unul electric;-alarmele înregistrează trecerea presiunii înafara limitelor şi dacă pompa de sânge este închisă Pompa de sânge-are rolul de a forţa sângele să curgă de-a lungul tubului;-pompa se adaptează la diferite dimensiuni ale tuburilor corespunză-toare diferitelor dimensiuni ale pacienţilor;-hemoliza minimă are loc la viteze reduse ale sângelui. Pompa de heparină-uzual se utilizează pompă tip seringă, dar pot fi utilizate şi pompe rotative;-heparina se introduce deasupra pompei de sânge, utilizarea unui punct de alimentare sub pompa de sânge putând conduce la complicaţii (embolii), ca urmare a faptului că în zona respectivă presiunea este subatmosferică. Opţional-pompă de solutDializorul-unul cu fibre cu lumenMonitorizarea presiunii venoase-aceeaşi metodă ca şi în cazul monitorizării presiunii arterialeDetectorul de aer- monitorizează scurgerile de aer Componentele maşinii de dializă Incălzitor de apă şi monitor temperatură-este un schimbător de căldură sau element de încălzire cu imersie;-elementele de încălzire sunt din oţel inox pasivat, nu pe baza de Cu sau Al pentru a evita pătrunderea acestora în organism şi a preveni intoxicaţiile;-de preferinţă, doar apa se încălzeşte înainte de a fi amestecate cu concentratul aflat la temperatura camerie, pentru a reduce riscul de coroziune a elementelor de încălzire; -temperatura apei este de cca. 36oC-42oC;-senzorii d etemperatură detectă fluctuaţiile în fluid şi ajustează elementul de încălzire;-mecanismul de biofeedback măsoară temperatura pacientului(sau temperatura specificată);-dacă dializatul are temperatură mult mai mare se deschide o valvă de bypass pentru a preveni intrarea fluidului în dializor;-se poate utiliza apă caldă dezinfectată( temperatura de 85oC) Deaerarea dializatuluiIn apa de preparare poate exista aer. Pentru îndepărtare, apa este încălzită la temperatura fiziologică, se crează diferenţă de presiune si elimină aerul.Deaerarea poate fi realizată şi prin încălzire la 85oC, urmată de răcire la temperatura fiziologică, cu schimbătoare de căldură.Celula de conductivitate-are rolul de a măsura conductivitatea, pentru a asigura un raport corect apă-concentrat;-conductivitatea dializatului se modifică cu concentraţiile ionilor;-dializatul parcurge celula care conţine un electrod;-dacă conductivitatea diferă se recurge la bypass.

Monitorizarea scurgerilor de sângeAceasta este necesară deoarece indică dacă au apărut fisuri la nivelul membranei. Pentru aceasta se utilizează un dispozitiv foto-optic, care face apel la lumina vizibilă şi spectrul în lumină albastră- măsoară modificarea transmisiei optice a dializatului(dată de deviaţiile induse de hemoglobina conţinută în celulele roşii).In momentul apariţiei unor scurgeri, pompa de sânge se închide. Camera optică previne falsele alarme date de bulele de aer. FlowmetrulTransportul de-a lungul membranei este influenţat de viteza de curgere a dializatului. Două flowmetre calibrate se localizează, unul înainte şi unul după dializor. Viteza de curgere nu este totuşi critică pentru siguranţa pacientului.Monitorizarea presiunii transmembranareAre loc pentru a asigura volumul corect de fluid îndepărtat şi pentru a preveni excesul de presiune în compartimentul dializatului, faţă de presiunea din compartimentul cu sânge.

INGINERIA TISULARA A OSULUI SI CARTILAJULUIAspecte clinice

Grefele osoase sunt necesare pentru repararea tesuturilor lezate ca urmare a:– traume – afectiuni – defecte congenitale

Restabilirea functiei osoase – protejare organe vitale – medierea activitatilor dependente de musculoschelet

Structura osului Osul este un ţesut de legătură, format din o matrice extracelulară mineralizată şi celule specializate: osteoblaste, osteocite şi

osteoclaste. Principalul component organic al matricei este colagenul de tip I, ce este in procent de 90% şi restul de 10% este repezentat de o

serie de proteine nestructurale de dimensiuni mici, printre care se găseşte osteocalcina, osteonectina, unele fosfolipide, siloproteine, factori de creştere şi proteine serice.

Faza anorganică este alcătuită din cristale minuscule dintr-un mineral cu caracter alcalin, hidroxiapatita. Aceste cristale se încrucişează cu fibrele de colagen pentru a forma un material ce întruneşte caracteristicile adecvate de rigiditate, flexibilitate şi rezistenţă.

Reglarea activitatii celulelor osoase1.Hormonii: Hormonul paratiroidian (PTH): ↑ formarea şi activitatea OC; ↑ proliferarea şi activitatea OB → ↑ turnover PTH intermitent: ↑ formarea ţesutului osos „in vivo” PTH în doze mari: ↑ resorbţie osoasă → pierderea ţesutului osos. Vitamina D: ↑ formarea şi activitatea OC; ↓ proliferarea OB; ↑ diferenţierea OB Necesară pentru mineralizarea matricei osoase: deficienţa → rahitism. Calcitonina: ↓ formarea şi activitatea OC. Glucocorticoizii: Necesari pentru dezvoltarea şi funcţionarea normală a osului În exces → pierdere de ţesut osos/ osteoporoză. Hormoni de creştere: Nesesar pentru creşterea normală a scheletului. Hormonii sexuali (estogeni şi androgeni): ↓ formarea şi activitatea OC; ↑ activitatea OB (posibil) Deficitul → ↑ osteoporoza (↑= creştere; ↓= descreştere; OB= osteoblaste; OC= osteociteSemnificatie clinica

Tesutul osos ocupa locul 2 intre cele mai transplantate tesuturi: – 643,000 proceduri anuale (USA)– cost ~ $600 milioane/an (USA)

Natura transplantului – 45% autologe – 45% alogenice – 10% sintetice

50% dintre grefe esueaza Grefe osoase autologe

Transplantul de tesut de la acelasi pacient - “Stimulare Vindecare” Imbunatatiri clinice:

– celule, factori de crestere in tesutul grefat Pot fi remodelate:

– nou os format– grefa transpalntata resorbita

Limitari:– disponibilitatea de tesut donor (forma si marime)– doua interventii chirurgicale (dureros pentru pacient, cost ridicat)

Grefe alogenice si sintetice “Inlocuirea functiei tesutului” Avantaje

– varietate de forma si marime – interventie chirurgicala unica

Dezavantaje – integrare slaba – rupturi mecanice in material

Strategia in ingineria tisulara a osului si cartilajului Producrea de materiale cu caracteristici similare grefelor osoase autologe Producerea de materiale cu compozitie similara grefelor osoase autologe

– celule si factori de crestere in matrice colagenice mineralizata

Suportul Definit de forma tesutului care trebuie vindecat Macroporos cu suprafata extinsa pentru a favoriza adeziunea celulara si dezvoltarea de tesut Caracteristici esentiale

stimuleze functiile celulare: factori bioactivi pe suprafata materialului, medicament/factori de crestere in material compliante/degradare

Suportul - os

Dintre diferitele solutii care s-au propus ca materiale de substitutie a osului sau care sa ajute regenerarea acestuia se pot cita ceramicile de hidroxiapatita, amestecate sau nu cu colagen.

Materialele cu colagen - foarte bune biocompatibilitati deşi sunt putin osteoconductoare, cele mai utilizate materiale colagenice fiind atelocolagenul sau fibra de colagen

Un biomaterial implantabil s-a realizat prin formarea treptată de cristale de hidroxiapatită într-o matrice tip burete de colagen liofilizat.

Rezultate In timp ce buretele de colagen netratat s-a degradat rapid (într-o zi), implantul încărcat cu

minerale a fost capabil să-şi menţină integritatea timp de 2 săptămâni. In cultura de celule s-a pus în evidenţă o degradare medie a implantului printr-o descreştere a conţinutului de calciu.

Morfologia colagenul liofilizat şi forma sa mineralizată (conţinând fosfat de calciu) arata ca structura poroasă a colagenului liofilizat original a fost menţinută când s-a realizat depunerea cristalelor de fosfat de calciu de formă aciculară. Aceasta are o semnificatie deosebita atunci când se aşteaptă ca matricea de colagen să fie utilizata pentru creşterea şi proliferarea celulară, difuzia celulelor fiind dependenta de marimea porilor suportului.

Buretele colagenic are, în stadiul uscat, pori cu dimensiunea de 100 mm, care-si vor mari volumul în stare umflată, în mediul de cultură. Menţinerea porozităţii în cadrul mineralizării indică faptul că matricea este stabilizată fără a se apela la reticulări cu compusi micromoleculari şi oferă un “model” pentru aderenţa celulară.

Pãstrarea morfologiei celulare, rotunde originale, asociatã cu interactiunea moderatã celulã-substrat indicã în general faptul ca celula îsi manifestã functia sa diferentialã.

Mentinerea morfologiei celulare si cresterea numãrului de celule pentru un interval de studiu de doua sãptãmâni recomanda acest biomaterial compozit pentru realizarea unor produse care sa functioneze ca suport pentru culturi de osteocite si condrocite, constituindu-se ca un pas important in realizarea unor substituienti de tesuturi complexe. Colagen- hidroxiapatita- acid citric

Pentru cresterea capacitatii de formare a hidroxiapatitei pe membrane colagenice s-a propus utilizarea acidului citric ca agent de complexare, cunoscut fiind faptul ca mai bine de 70% din cantitatea de citrat existenta in organism este localizata la nivelul sistemului osos.

Acidul citric se leaga de membrana colagenica la functiile -OH, -C=O, -NH2, prin legaturi de hidrogen, prin intermediul functiilor hidroxilice. Sarcinile negative ale acidului citric pot chelatiniza simultan cu ioni de Ca 2+ din solutie formând complex Ca-citrat. Se formeaza agregate prin adsorbtia ulterioara a fosfatilor si ionilor de calciu, rezultând structuri tridimensionale care se pot constitui ca nuclee pentru cristalele de hidroxiapatita.

Alte materiale: - colagen + hidroxiapatita + acid hialuronic;- microsfere de colagen cu hidroxiapatita- chitosan + hidroxiapatitaSuportul - cartilaj

Cartilaj articular

Femur

Tibia

Cartilaj articular

Os subcondral

Os spongios

Condrocit

Matrice extracelulară

Cartilajul articularŢesut performant

Componenta celularăComponenta extracelulară

Matricea extracelulalră

Condrocite

Sinteza, secreţia, organizarea şi

menţinerea componentelor

organice a matricei extracelulare

Faza solidăComponenete oraganice

Faza lichidăFluid interstiţial

Colagen tip IIUltrastuctura fibrilarăDistribuţie neomogenă

Rezistenţă şi rigiditate la tracţiune

ProteoglicaniMolecule de polizaharide

Agrecani

Rezistenţă la compresiuneMenţine o structură ordonată a

fibrelor de colagen

Componenta structurală Componenta lichidă

ApăComponenta lichidă

Permite circularea nutrienţilor şi a particulelor de

uzură

Alte proteine

Structura bifazică

PROPRIETĂŢI BIOMECANICEVâscoelasticitate

Suprafaţă de compresiune portantăConferă o aria de contact mare pentru:

-distribuiriea tensiunile -reducerea presiunilor de la nivelul contactului

Oferă o bună rezistenţă de suprafaţă - un coeficient de frecare mic

Cartilajul prezinta o capacitate redusa de autorefacere datorita naturii sale nevascularizate. Din aceasta cauza, in prezent se practica reconstructia sa plastica sau chirurgia ortopedica ca tratamente pentru pacientii cu defecte datorate artritelor, anomaliilor congenitale sau traumelor diferite. Terapiile includ:-transplantul;

-implantul de dispozitive protetice artificiale. Amândoua tehnici prezinta insa dezavantaje:

- transplantul presupune gasirea de tesuturi donatoare;- apar dificultati legate de marimea grefei si fixarea acesteia; - protezele pot produce toxicitate datorita adeziunii la interfata cu ruptura.

Sistemul modelCondrocitele izolate se insamanteaza pe suporturi de polimer biodegradabil si se realizeaza culturi in vitro, in capsule

petri, recipient cu elice sau bioreactor, inainte de implantarea in vivo pentru a forma un neocartilaj sau pentru a repara cartilajul articular.Se folosesc ca suporturi biodegradabile:

- colagen;- acid hialuronic;- poli(acid glicolic)

care asigura o structura 3D pentru atasarea celulelor si stabileste marimea si forma tesutului proiectat. In conditiile specifice ale culturii in vitro, condrocitele prolifereaza in interiorul suportului si secreta matricea extracelulara cartilaginoasa formata din glicozoaminoglicani si colagen. Degradarea suportului in paralel cu regenerarea tesutului conduce la o biocompatibilitate in timp.

Suportul poate fi proiectat astfel incât sa corespunda criteriilor specifice ingineriei tisulare. Astfel, ideal ar fi ca materialul:a)sa fie reproductibil intr-o structura poroasa 3D permitând o distributie spatiala uniforma si diminuarea constrângerilor difuzionale din timpul culturii in vitro;b)stimularea proliferarii celulare si secretia matricii extracelulare fara aparitia efectelor secundare sau toxice;c)biodegradarea intr-un ritm controlabil. Alte potentiale avantaje:-utilizarea atât a condrocitelor autografe cât si alografe;-imunoprotectia oferita de sechestrarea antigenelor suprafetelor celulelor de catre matricea extracelulara generata in timpul culturii in vitro;-abilitatea de control a culturii in vitro;-posibilitatea cresterii ‘in vitro’ a cartilajului in mod continuuu si astfel complet integrat cu tesutul gazda in care se implanteaza.Sistem celula polimer- Bioreactor Celule precursoare- Suport polimeric: ex. Material fibros sau burete poros Bioreactor: Ex. Vas rotativAplicatii

INGINERIA TISULARA A CARTILAJULUIRetea de colagen (Scanning Electron Micrograph)Celule Formeze un tesut de tip os sau cartilaj Asamblu Crestere 3 D Formare Matrice Diferentiere Vascularizare

Cerinte esentiale:– Stimulare proliferare fara pierde a pluripotentei

– Diferentiere directa in liniile celulare dorite. Agenti farmaceutici Caracteristici:

– Diferiti agenti necesari in diferite stadii de dezvoltare a celulei spre tesut osos – Suporturi proiectate astfel incat sa elibereze diferiti factori la anumite intervale de timp bine precizate

Hormoni, factori de crestere:– Stimulaeaza proliferarea celulara – Diferentiere directa a celulelor multipotente in tesut specific

Exemple:– dexamethasone – factor de crestere de tip insulina-I (IGF-I) – proteina morfogenetica a osului-2 (BMP-2)

INGINERIA TISULARA A VASELOR DE SÂNGE Problematica vaselor de sânge presupune o complexitate deosebita datorita necesitatii de realizare a celor trei staturi din care este

constituit tesutul vascular:-intima, in constitutia careia se gasesc celule endoteliale;-media, care contine celule musculare; -adventicea, pe baza de fibroblaste. Biomateriale utilizate pentru realizarea protezelor vasculare Poliuretanii Cea mai simpla reprezentare a PU este liniara fiind de forma:unde R2 reprezinta un lant hidrocarbonatat iar R este o hidrocarbura care contine gruparea OH. În cazul reactiilor de obtinere a PU pot fi utilizati si diizocianatii deoarece ei vor reactiona cu orice compus care contine un hidrogen activ. Proteze vasculare nebiodegradabile

În ultimii ani au fost dezvoltate mai multe proteze vasculare din PU modificati în scopul prevenirii biodegradarii, reducerii caracterului trombogenic si pentru a le îmbunatati proprietatile legate de ingineria tisulara. Acestea includ Chronoflex®, Chronoflex® modificat, Thoratec® (grefa de acces vascular), PU acoperit cu L-lactid, PU policarbonat, Thoratec-ePTFE, Corvita®, Pulsetec®. Proteza MyoLink ramforsata (a); modificarile diametrului intern al unei grefe MyoLink pe parcursul uni ciclu cardiac Poli(etilentereftalatul) si poli(tetrafluoretilena)

Cele mai utilizate materiale în chirurgia cardiovasculara moderna sunt poli(etilentereftalatul) (denumirea comerciala Dacron) si poli(tetrafluoretilena) (denumirea comerciala Teflon). Complicatiile cele mai severe legate de utilizarea acestui tip de biomateriale sunt formarea trombilor si infectiile bacteriene.Principiul de realizare a autogrefelor de vase de sânge Suport colagenic

Celulele endoteliate se dezvolta mult mai usor pe materiale colagenice sau compozite cu laminina decât pe alte tipuri de produse, asa cum se poate observa din datele prezentate in tabelul 3. S-au efectuat de asemenea studii de imobilizare a colagenului pe materiale sintetice, în scopul îmbunatatirii adeziunii celulelor endoteliale si cresterii hemocompatibilitatii materialelor sintetizate. Literatura de specialitate considera ca cea mai performanta metoda de hemocompatibilizare este acoperirea corpurilor straine cu celule endoteliale, generând astfel suprafete hibride

Fixarea celulelor endoteliale pe implant prin intermediul colagenului

INGINERIA TISULARA IN SISTEMUL NERVOS Eforturile ingineriei tisulare in sistemul nervos au ca obiective:o inlocuirea functiei unui component neuroactiv lipsa;o salvarea sau regenerarea unui tesut neural vatamat;o stimularea elementelor de cuplare neurale.Furnizarea de molecule neuroactive sistemului nervos Exista câteva modalitati de proiectare a unor sisteme care pot furniza acesti factori. Pentru aceasta trebuie luate in considerare:

stabilitatea factorilor;dozajul necesar;solubilitatea;tesutul tinta;posibilele efecte secundare.

Principalele modalitati utilizate sunt:Pompele – prezinta inconveniente legate de faptul ca trebuie reâncarcate la fiecare 4 saptamâni si sunt susceptibile la formarea de “depozite” de substante neuroactive, la infectii si apar probleme la difuzie.Sisteme polimere cu eliberare lenta a moleculelorAcestea sunt matrici polimerice ce include moleculele necesare si pe care le elibereaza lent prin difuzie o anumita perioada de timp.Exemple de sisteme polimere utilizate:

- poli(etilen vinil acetat);- elastomeri siliconici;- poliesteri;- microsfere din poli(lactic-glicolic acid) sau poli(DL-lactida)-glicolida

Dezavantajul acestor sisteme il reprezinta faptul ca permite incarcarea cu o cantitate limita de molecule neuroactive precum si faptul ca ritmul de cedare este ajustat de catre polimer.Transplantul de celule Acest mod de eliberare a moleculelor neuroactive se poate realiza in urmatoarele maniere:1)transplantul celulelor primare autologe Aceasta tehnica presupune procurarea celulelor primare de la gazda, proliferarea lor daca este necesara generarea unei cantitati de tesut, modificarea prin inginerie genetica(daca este cazul) si apoi transplantate inapoi la ”donor”, intr-o zona apropiata.Dezavantajul principal il constituie faptul ca nu intotdeauna este posibil sa se procure tesut autolog.2)Transplantul de tesut fetal Unul dintre avantajele unui astfel de sistem il reprezinta abilitatea acestuia de a supravietui si de a se integra in creierul adultului gazda. Transplantul de tesut neural fetal alogen poate fi util in tratarea bolii Parkinson. 3)Transplantul de tesut xenogenic (exogen) incapsulat - realizarea unor capsule cu pori suficient de mari pentru ca nutrientii sa ajunga la tesutul transplantat si sa permita eliberarea factorilor neuroactivi, dar cu o marime suficient de mica pentru a impiedica patrunderea in tesutul transplantat a moleculelor si celulelor Implicarea inginerie tisulare in optimizarea tehnicii de incapsulare presupune:a)tipul si configuratia membranei de incapsulare. Un factor important ce determina marimea dispozitivului il reprezinta difuzia oxigenului spre celulele incapsulate, astfel incât distanta dintre sursa de oxigen si miezul intern al tesutului transplantat sa fie minima. Marimea si configuratia dispozitivului influenteaza si cinetica de eliberare a moleculelor neuroactive, „timpul de raspuns” fiind mai mic in capsulele mari cu peretii membranei mai grosi.Avantajul principal al acestor sisteme il constituie faptul ca nu au nevoie de un solvent organic in formarea capsulelor si pot fi mai putin citotoxice, insa rezistenta mecanica si stabilitatea lor in mediul ionic fiziologic este discutabila.b)Alegerea celulelor si tesuturilor pentru incapsulare . Se utilizeaza trei tipuri de celule: postmitotice, liniare si care se divid lent.b)Matricile pentru incapsulare pot fi clasificate in urmatoarele tipuri:-polielectroliti reticulati, solutie de colagen sau granule poroase;-derivati ai matricii extracelulare, cum ar fi Matrigel;-hidrogeluri biosintetice.

Matricea are ca functii:-prevenirea formarii unor mari agregate celulare care conduc la dezvoltarea necrozelor centrale ca o consecinta a insuficientei oxigenului si a accesului de nutrienti;-permit ancorarea celulelor;-pot induce diferentierea celulelor.

Reconstructia tisulara. Regenerarea nervului In studiul mecanismului de baza al regenerarii nervilor periferici s-au utilizat canale sintetice de ghidare a nervilor

pentru intensificarea procesului de regenerare. Canalele de ghidare pot simplifica „repararea” capetelor(terminatiilor) si pot fi utile in intreruperile lungi ale nervilor.

Exemplu de canale de ghidare a nervilor Canalele de ghidare au rolul:-reduc tensiunea pe linia suturii;-protejeaza regenerarea nervului de infiltratii;-directioneaza axonii spre tintele periferice(distale). Optimizarea si intensificarea regenerarii nervului se pot realiza prin: proprietatile canalului, matricea care umple canalul, celulele insamântate in lumenul canalului si „sudarea” axonilor indusa polimeric.Canalele de ghidare a nervilor pot fi:1)peretele canalului: -polimeri inerti: elastomer siliconic, PVC, polietilena.-polimeri permeabili: copolimer de acrilonitril si clorura de vinil, colagen, PTFEe;-polimeri resorbabili: acid poliglicolic, acid poli-L-lactic, colagen;-polimeri incarcati electric: poliviniliden fluorura(piezoelectric), PTFE;-polimeri cu eliberare a factorilor trofici: copolimer etilena-acetat de vinil.2)Matricea lumenului poate fi:-fibrina;-suport colagen-glicozoaminoglicani.3)Celule insamântate pentru suportul trofic:-celule Schwann.Utilizarea eficienta a proprietatilor canalului de ghidare ia in considerare:1)Suprafata canalului- microgeometria Morfologia nervilor periferici care se regenereaza este modelata de catre microgeometria suprafetei canalelor polimerice de ghidare. Canalele cu peretii interiori netezi dau nastere la matrici de fibrina longitudinale, organizate, rezultând lanturi nervoase mobile cu numerosi axoni mielinizati. Canalele cu suprafata interna rugoasa dau nastere unei matrici de fibrina neorganizata cu fascicule nervoase difuze intr-un tesut conjunctiv slab ce umple intregul lumen. 2) Proprietatile electrice. Regenerarea in vivo urmeaza sectiunea leziunii in sistemul nervos periferic si poate fi sporita prin curenti galvanotrofici produsi in canalele siliconice prevazute cu mansoane de electrozi.3) Eliberarea factorilor bioactivi din peretele canalului Canalele polimere de ghidare pot fi incarcate cu diferiti factori care sporesc regenerarea nervilor. Factorul de crestere al fibroblastelor, eliberat dintr-un canal de ghidare pe baza de copolimer etilena- acetat de vinil faciliteaza regenerarea nervilor periferici de-a lungul nervului afectat.4)Peretele canalului resorbabil Odata cu terminarea regenerarii, canalul dispare fara interventie chirurgicala. Astfel de comportament au cele obtinute din acid poliglicolic si, respectiv, din poli-L-lactic acid. Aceste canale trebuie insa sa-si mentina proprietatile mecanice timp de 4-12 saptamâni, iar produsele lor de degradare sa nu interfere cu procesul de regenerare a nervului.

INGINERIA TISULARA A PIELII Pielea artificiala = autogrefa de piele = substituient de piele umana se obtine printr-o tehnologie care implica recoltarea prin biopsie a fibroblastelor si keratinocitelor de la un tesut de origine sanatos si generarea proliferarii celulare in prezenta unui suport de ancorare si a mediilor de cultura adecvate. Se disting trei aspecte importante ale procesului de formare a noului tesut:- necesitatea biodegradarii totale a suportului;

- formarea unei noi matrici extracelulare, care inlocuieste suportul;- stabilizarea matricii nou formate - dobândirea de catre aceasta a caracteristicilor fizico-chimice, mecanice si biologice adecvate functiei sale.

Etapele de realizare ale pielii artificiale Calitatea de auxiliar poate fi detinuta de substante de natura diversa, acestea având adesea si o importanta functionala. Se disting astfel:·proteine:fibroina, fibrinogen, albumina, elastina;·polizaharide animale( GAG): condroitinsulfati, acid hialuronic, heparina;·polizaharide vegetale: celuloze modificate, dextran, chitosan, xantan;·polimeri sintetici: copolimeri cu acid acrilic, copolimeri cu grupe sulfonate sau sulfatate, produsi de policondensare.Colagenul solubil este semnalat a fi utilizat pentru ingineria tisulara in forma reticulata, dehidrotermic sau prin intermediul carbodiimidelor, in prezenta sau nu de mucopolizaharide.Cercetarile efectuate in directia realizarii pielii artificiale cu componenta colagenica au permis dezvoltarea unor produse comerciale , dintre care se amintesc:-GRAFTSKIN- retea de colagen cu fibroblaste acoperita cu celule epidermice, promovat de Organogenesis Inc. Canton, USA;-DERMAGRAPH T.C.- produs din tesut uman, Michigan, U.S.A;-TERUDERMIS- compozit tip sandwich format dintr-un stat colagenic fibros rezultat prin liofilizare peste care se gaseste depus un film siliconic, provenit de la Teruneo Corporation, S.U.A;-BIOBRANE®- structura tesuta de nylon impregnata cu colagen porcin, peste care se gaseste depusa o membrana siliconica semipermeabila, produsa de Dow B.Hiekaw Inc.;-APLIGRAFT®- sistem bistartificat compus din gel de colagen bovin si fibroblaste peste care se depune un strat de colagen keratinizat, etc.Performantele produsului BIOBRANE Materialul este flexibil, cu capacitate ridicata de permeatie a vaporilor de apa ceea ce diminueaza acumularile de fluid, in timp ce transparenta avansata a stratului superior permite evaluarea continua a tesutului in refacere. Prezenta colagenului confera produsului capacitate de limitare a contractiei ranii.