Sara Zapata García

Manuela Zapata López

Carolina Cartagena Durango

CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

PALABRAS CLAVES

Bacterias aerobias, microorganismos, medios de cultivo, métodos de inoculación.

RESUMEN

Las bacterias están presentes en los diferentes ecosistemas, pero para su

crecimiento requieren de condiciones óptimas las cuales les permitan vivir. En esta

práctica se llevó a cabo el cultivo y el aislamiento de diferentes bacterias, para

ello se empleó distintos medios de cultivo cada uno de ellos con propiedades

desiguales, por otra parte para llevar a fin dicha siembra se realizaron diferentes

métodos de cultivo.

Todo esto se realizó con la finalidad de identificar las particularidades de

crecimiento de algunos microorganismos dependiendo del medio de cultivo, los

medios de cultivo se dividen dependiendo del propósito, en este caso era para

observar que bacterias pueden crecer en los diferentes agares.

Se contempló el desarrollo de E. Coli el agar nutritivo sembrado con el método

francés. En el agar eosina azul de metileno el cual es un agar selectivo crecieron

S. Aureus y E. Coli pero no germinó la bacteria B. Cereus. Por otra parte en el

agar manitol sal solo se observó la proliferación de S. Cilius pero no se

desarrollaron B. Cereus ni E. Coli. En comparación con los otros medios de

cultivo en el agar sangre crecieron las tres bacterias S. Aureus, B. Cereus y E.

Coli.

MARCO TEORICO

Para aislar e identificar una especie bacteriana del medio y de otra especie que

pueda confundirse morfológicamente es necesario usar medios de cultivos, ya que

nos permiten diferenciar las características del crecimiento de las bacterias y

establecer su identidad según el medio de cultivo que se use.1

Los microorganismos se encuentran en muchos ambientes naturales como el

agua, el suelo, aire, el hombre y otros seres vivos, alimentos, entre otros.

Haciendo parte de los diferentes ecosistemas. Por esto se deben usar los medios

de cultivo adecuados que se asemejen al ambiente si queremos posibilitar el

crecimiento de la bacteria.1

Un medio de cultivo está diseñado para posibilitar el desarrollo y nutrición de las

bacterias por esto cuenta con una cantidad de sustancias como: carbono, agua,

azufre, fosforo, nitrógeno, potasio, sodio, magnesio, entre otros. También su

crecimiento depende de muchos factores entre ellos: un pH preferiblemente

neutro, humedad, oxigeno, temperatura, presión osmótica, todo esto en

condiciones adecuadas.2

Los medios de cultivo se clasifican dependiendo de las características que se

necesiten para su óptimo desarrollo los cuales según su consistencia pueden ser:

Líquidos: no contienen agar y favorecen el crecimiento bacteriano ya que las

bacterias poseen una gran libertad de movimiento y al difundirse por todo el

medio encuentran su componente nutritivo y requerimiento de oxigeno más

óptimo con gran facilidad, por ejemplo: las aerobias estrictas crecen en los

primeros 10-15mm de la superficie del medio, las microaerofilas ligeramente

por la superficie del medio, las anaerobias estrictas en los 10-20mm del fondo

y las facultativas por todo el medio.

Solidos: su concentración de agar es de 1.5% a 2%, en estos las bacterias

crecen con mayor dificultad, ya que los nutrientes pueden agotarse fácilmente,

se utilizan para ver colonias, aislar microorganismos, características de

crecimiento, color, tamaño, taxonomía, entre otros.

semi-solido: su concentración de agar es de 0.5% y se utiliza para estudiar el

movimiento y algunas propiedades bioquímicas.2

También según su aplicación se usa:

Simples: son apropiados para la mayoría de microorganismos ya que poseen

requisitos nutricionales mínimos para desarrollarse.

Enriquecidos: permiten el crecimiento de bacterias difíciles de cultivar, puesto

que se añade ciertos componentes muy ricos en nutrientes.

Selectivos: estos medios contienen componentes que inhiben el crecimiento

de algunas bacterias cuyo crecimiento no interesa, permitiendo así aislar una

determinada especie.

Diferenciales: en este se les adiciona sustancias para el crecimiento de

determinadas bacterias y al actuar sobre dichas sustancias adquieren un color

que las diferencia de otras colonias.

Enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen la multiplicación de

bacterias cuando la muestra obtenida es pobre.2

De acuerdo con su aplicación los componentes usuales de los medios de cultivo

son:

Extracto de carne: constituye una fuente de carbono, nitrógeno, sales

orgánicas y otros nutrientes.

Peptonas: son proteínas degradadas, ricas en nitrógeno y carbono.

Cloruro de sodio: importante para proporcionar un adecuado equilibrio

osmótico.

Tampones estabilizadores del pH: necesarios para contrarrestar las

variaciones del pH debido a los productos del metabolismo bacteriano.2

Nutrientes para medios de enriquecimiento:

Extracto de levadura: rico en vitaminas del complejo B, proteínas y ácidos

nucleicos.

Extracto de glóbulos rojos: suministra los factores X (hemina) y V (difosfo-

piridin-adenin-nucleotido o coenzima I) imprescindibles para el crecimiento

bacteriano de algunos microorganismo.

Infusión de hígado o corazón y cerebro: son infusiones ricas en

aminoácidos azufrados que reducen el potencial de óxido reducción.2

Agentes reductores:

Se adicionan tioglicolato sódico, cisteína, ácido ascórbico a los medios de cultivo

para promover la anaerobiosis.2

Agentes selectivos:

Colorantes: el cristal violeta, azul de metileno, el verde brillante y otras

sustancias usadas por su efecto toxico sobre las Gram positivas.

Cloruro sódico a altas concentraciones.

Bilis o Sales biliares

Antibióticos

Cicloheximida o actidiona: se añade para impedir el crecimiento de hongos

ambientales en los medios de cultivo.2

Azucares:

Se puede adicionar para fines nutritivos o para investigar la actividad metabólica.2

Indicadores de pH:

Es esencial para detectar variaciones en la acidez o alcalinidad del medio

causadas por el metabolismo bacteriano.

Los medios de cultivo usados en el laboratorio fueron:

Agar nutritivo: está compuesto de extracto de carne, peptona, ClNa, agar y

agua destilada. Se usa como medio de cultivo general para la mayor parte de

los microorganismos y como base para la preparación de medios selectivos y

enriquecidos.2

Agar sangre: compuesto por extracto de carne, peptona, ClNa, sangre, agra y

agua destilada. Lleva como base el agar nutritivo y se le adiciona sangre

desfibrinada en una porción del 5-10%, principalmente sangre de conejo,

carnero y caballo ya que ofrecen buenas reacciones hemolíticas. No se usa

sangre humana procedente de banco puesto que contiene citrato que puede

inhibir el crecimiento de algunos microorganismos y glucosa que falsea las

reacciones de hemolisis, aparte de anticuerpos y agentes antimicrobianos.

Aquí crecen la mayoría de bacterias patógenas y algunas levaduras. Este

medio es adecuado para el cultivo y aislamiento de microorganismos

exigentes, también para estudiar la actividad hemolica.2

La hemolisis puede ser de 3 tipos: α hemolisis: clarificación parcial de la

sangre en una colonia, que produce un cambio de color gris verdoso o

pardusco en el medio; β hemolisis: zona de clarificación completa de la sangre

alrededor de las colonias debido una lisis completa de eritrocitos que produce

una eliminación de la sangre del medio debajo de las colonias y a su alrededor;

γ hemolisis: sin lisis o cambio de color en los eritrocitos.3

Agar MacConkey: está compuesto por peptona, lactosa, ClNa, sales biliares,

cristal violeta, rojo neutro, agar y agua destilada. Los medios usados para el

aislamiento selectivo de enterobacterias se caracterizan por contener lactosa y

un indicador de cambio de pH que detecta la actividad fermentadora sobre este

azúcar. Además estos medios de cultivos llevan sustancias inhibidoras de

Gram positivos. Las sales biliares y el cristal violeta actúan como inhibidores.

El indicador vira a rojo ladrillo en medio acido. Las bacterias que fermentan la

lactosa producen colonias de color rojo que pueden estar rodeadas de una

zona opaca debida a la precipitación de sales biliares; las no fermentadoras

dan colonias incoloras más o menos transparentes.2

Agar EMB (Eosina azul de metileno): compuesto por peptona, fosfato

dipotásico, lactosa, eosina azul de metileno, agar y agua destilada. Su uso es

prácticamente el mismo del agar MacConkey. El azul de metileno actúa como

indicador e inhibidor al mismo tiempo. Las colonias fermentadoras de lactosa

presentan un tono violeta más o menos intenso. Por ejemplo Escherichia Coli

origina colonias muy oscuras, frecuentemente con brillo verde metálico que

facilita su detección en aguas contaminadas con materias fecales.2

Agar AMS (Manitol sal): es un medio de cultivo altamente selectivo, pues

tiene una alta concentración de cloruro de sodio que impide el crecimiento de

la mayoría de las bacterias, sin embargo tolera los estafilococos. Además el

cultivo contiene manitol como único carbohidrato y rojo fenol como indicador

del pH, cuyo ámbito de viraje esta entre pH 8,4 (rojo) y pH 6,8 (amarillo).

Cuando hay producción de ácido a causa de la fermentación de manitol, las

colonias aparecen rodeadas de un halo amarillo; el medio permanecerá sin

cambio de color o acentuara a rojo medio si las bacterias no fermentan el

manitol.4

Caldo nutritivo: es un medio líquido compuesto por una infusión de carne,

ClNa, peptona, extracto de levadura y también fosfato disódico. Es usado como

base para otros caldos que puedan contener más nutrientes.5

METODOLOGÍA

Para este laboratorio se utilizaron cepas de Gram positivas y cepas de Gram

negativas, se implementaron medios de cultivo como lo fue el agar nutritivo que es

en medio simple, el caldo nutritivo, el agar EMB que es un medio selectivo,

también el agar AS que es un medio enriquecido, el agar AMS que es un medio

diferencial y otros materiales como mecheros, asas y agujas de inoculación, cinta

de enmascarar.

Se realizó el procedimiento en 3 tipos de cultivo, en cultivo en placa de agar, en

cultivo en agar inclinado y cultivo en caldo nutritivo.

En el cultivo en placa de agar se utilizan varios métodos de siembra por estrías en

superficie entre las cuales tenemos el francés y el clásico de los cuales teníamos

como objetivo conseguir colonias separadas para lograr un mejor análisis

En el método francés flameamos el asa y tomamos la muestra de E. coli y la

pusimos en la caja de petri con el inoculo extendiendo el cultivo haciendo líneas

paralelas, después flameamos de nuevo el asa e hicimos otras líneas paralelas de

forma vertical y después volvimos a flamear e hicimos las líneas de forma

horizontal hasta que cubrir toda al caja.

En el método clásico utilizamos barias cepas por lo cual marcamos en la cinta de

enmascarar los nombres de dichas bacterias, en el cual también se utilizó un asa

flameado pero a diferencia del anterior este se esparcía por la caja de petri en

forma de zig-zag hasta cubrirla.

En el cultivo de agar inclinado lo primero que hicimos fue rotular los tubos y

ponerles los datos necesarios para la observación que se hizo al día siguiente.

Luego de flamear el asa se tomó una muestra del cultivo teniendo cuidado en el

remover el tapón y mantenerlo en la zona estéril ya luego se tomó el tubo en el

que se iba a inocular el cual se flameo la boca para introducir la porción de cultivo

haciendo una estría en la superficie en línea recta. Ya para terminar se flamearon

las asas. Esquema 1

Esquema 1 Esquema 2

En el cultivo en caldo nutritivo realizamos los mismos pasos del anterior pero en

este caso la muestra de cultivo la sumergimos y la agitamos con el asa ene l

medio líquido Esquema 2.

RESULTADOS Y DISCUSION

1. CULTIVO EN CAJA PETRI DE

AGAR NUTRITIVO

METODO: Francés

BACTERIA: Sherichia coli

CONSITENCIA: Solido

El agar nutritivo es un medio de cultivo

simple utilizado para propósitos

generales como para el aislamiento y

recuento de microorganismos con

escasos requerimientos nutricionales.6

Se aconseja como medio de cultivo

general para la mayor parte de los

microorganismos y como base para la

preparación de otros medios

enriquecidos y selectivos.7

El método utilizado fue el francés. En la imagen 1 se pueden observar algunas

colonias separadas.

El crecimiento de la Scherichia coli, se puede decir fue porque este cultivo no es

selectivo por tanto la mayoría de las bacterias crecen en él.

La bacteria cultivada presento las siguientes características:

Forma Puntiforme

Color Blanco

Transparentoso

Borde Entero

Elevación Convexa

2. CULTIVO EN AGAR-SANGRE

Método: Clásico

Bacterias: Scherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.

Imagen 2

En el agar sangre crecen la mayoría de bacterias

y levaduras, ya que es un medio enriquecido de

nutrientes que se usa principalmente para

microorganismos exigentes.8

Como se observa en la imagen 2 las bacterias

Staphylococcus aurerus, Bacillus cereus y

Scherichia coli, sembradas en este cultivo

formaron colonias.

Staphylococcus aurerus

Se observaron colonias grandes con las siguientes características:

Es una colonia Beta hemolítica, porque se

puede observar un halo transparente

alrededor de la colonia.

Tanto la S. aureus y B. cereus son colonias

B-hemoliticas, pues poseen enzimas

Forma Circular

Color Blanco

Transparentoso

Borde Entero

Elevación Convexa

Forma Ameboide

Color Amarillo opaco

Borde Ondulado

Elevación Convexa

llamadas hemolisinas que hacen lisis de los globulos rojos.8

Scherichia coli

La colonia de Scherichia coli presentó las siguientes características:

Forma Puntiforme

Color Gris apagado

Borde Entero

Elevación Convexa

Es una colonia gamma hemolítica porque la E. coli no es capaz de realizar

hemolisis.9

3. CULTIVO EN AGAR EMB (EOSINA AZUL DE METILENO)

Método: Clásico

Bacterias: Scherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.

Imagen 3

Scherichia coli

Esta bacteria en agar EMB presenta un brillo

verde con negro producido por miembros que

fermentan ávidamente lactosa.

La colonia de Scherichia coli presentó las

siguientes características:

Forma Circular

Color Gris apagado

Borde Entero

Elevación Convexa

Forma Puntiforme

Color Verde brillante

Borde Entero

Elevación Convexa

Las bacterias Staphylococcus aureus y Bacillus cereus no muestran crecimiento,

porque son bacterias Gram positivas, y en este medio de cultivo solo crecen

bacterias Gram negativas.9

4. CULTIVO EN AGAR MANITOL SAL

Método: Clásico

Bacterias: Scherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.

Imagen 4

Ninguna bacteria mostro crecimiento. (Imagen

4)

La S. aureus es una bacteria capaz de crecer

en este medio pues los estafilococos crecen en

altas concentraciones de sal y la S. aureus

posee coagulasa que fermenta el manitol y se

visualiza como colonias amarillas rodeadas de

una zona del mismo color. Pero en este cultivo

no crecio, se concluye que fue por falta de

tiempo ya que La American Public Health

Association (A.P.H.A) recomienda la incubación

durante 3 días a 32 °C, en aerobiosis.10

Forma Circular

Color Verde brillante

Borde Entero

Elevación Convexa

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