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microestacas producidas de lagerminación in vitro. El medio decultivo empleado fue el de las sales yvitaminas M&S (1962), con 3% desacarosa. La adición de reguladores enel medio indujo la formación de callo yvariación somaclonal. Se inocularonsegmentos de hoja en un medio decultivo que contenía el 50% de las salesde M & S (1962), complementado conlas vitaminas de Morel (1958), 2mg/Lde AIB, y 1% de sacarosa, se colocaronen la oscuridad y se obtuvieron callosfriables efectivos para elestablecimiento de suspensiones.

Introducción

Jatropha curcas es una especie de lafamilia Euphorbiaceae, nativa de Américatropical. Se conoce comúnmente comotempate o tampate, coquillo o coquito.(Burger y Huft, 1995).

Palabras clave

Tempate, cultivo de tejidos, callogénesis.

Resumen

J. curcas es una especie de importanciamedicinal. Las hojas, la corteza y lasemilla han sido utilizadas popularmentepara aliviar inflamaciones, para elcombate de hongos y como agentesantimicrobianos. Se emplea en laindustria de fabricación de tintas ycolorantes por sus propiedades comoastringente y como fuente de aceite. Estavariedad de usos se debe a la presencia dediversos compuestos como enzimasproteolíticas, presursores de hormonasesteroidales, alcaloides, taninos yflavonoides.

El trabajo de investigación consistió enestablecer el protocolo de cultivo invitro de embriones de Jatropha curcas yla propagación masiva in vitro de las

Cultivo in vitro de tempate (Jatropha curcas)

Jenny Muñoz Valverde 1Karla Valerín Berrocal 2

Silvana Alvarenga Venutolo 3Elizabeth Alán Fonseca 4

Muñoz, J.; Valerín, K.; Alvarenga, S.; Alan, E. Cultivo in vitro de tempate (Jatropha curcas). Tecnología en Marcha. Vol. 16 N˚ 4.

1 Escuela de Biología. Universidad de Costa Rica. jmunoz@biologia.ucr.ac.cr.

2 DP y L Semilla Delta Land. kvalerin@costarricense.cr.

3 Escuela de Biología. Instituto Tecnológico de CostaRica. salvarenga@itcr.ac.cr.

4 Escuela de Biología. Instituto Tecnológico de Costa Rica. ealan@itcr.ac.cr.

Jatropha curcas es unaespecie de la familiaEuphorbiaceae, nativade América tropical.Se conocecomúnmente comotempate o tampate,coquillo o coquito.(Burger y Huft, 1995).

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setiembre. Es muy resistente a la sequía.(Jones y Miller, 1996). Se puedepropagar en forma natural por semillas opor estacas. (House et al., 1995). Sedistribuye en Centroamérica a lo largodel Pacífico seco (Burger y Huft, 1995).En Costa Rica se encuentra enGuanacaste y en el Pacífico Central, enlas provincias de Alajuela y Puntarenas(INBIO, 2001).

En el Cuadro 1 se detallan loscompuestos producidos en diferentespartes de la planta, sus usos medicinales ymecanismos de acción. J. curcas hadespertado interés debido a la altaproducción de aceite a partir de la semillaque se considera como sustituto potencialdel petróleo, que puede usarse comocombustible para motores diesel (Jones yMiller, 1996).También puede utilizarsecomo aceite comestible después de sudetoxificación y en la elaboracion develas, jabones y cosméticos (Mittelbach

Es un arbusto que crece entre 1,5 y 5metros de altura. Presenta una saviaviscosa, lechosa o rojiza. Con tallosfrondosos, glabros o levementepubescentes, con estípulas, hojasdeciduas, alternas o en gruposterminales. Produce inflorescencias decolor amarillento o blanco. Las floresson acampanadas y unisexuales, perolas flores femeninas y masculinas estánjuntas, los frutos son cápsulaselipsoides, algo carnosos. Presentansemillas oblongas de color negruzco conranuras longitudinales diminutas, ricasen aceite. El sistema radical es pivotante(Jones y Miller, 1996).

Crece en el bosque caduco en regionesmuy secas y se cultiva desde los 5 a los1.000 m de elevación, para laproducción óptima requiere entre 900 y1.200 milímetros de precipitación anual.Tolera temperaturas de entre 18 y 28,5°C. Florece y fructifica de mayo hasta

Cuadro 1Compuestos activos de interés, localización en la planta de J. curcas y uso.

Compuesto Localización en la planta Uso

Alcaloides Corteza Medicinales. Actúan sobre el sistema nervioso y constituyen materias primas para medicamentos.

Beta-sitoesterol, Hojas Poliesteroles antiinflamatorios, regulan los ciclos menstruales, tienenEstigmaesterol y efectos anticonceptivos e inhiben cánceres femeninos.campesterol Curcaína Látex Enzima proteolítica que destruye proteínas, tiene propiedades

antimicrobianas contra Candida albicans y Staphyloccus aureus. Fenoles simples Hojas Medicinales e industriales. Poseen actividad antifúngica y desinfectante. Flavonoides Hojas Compuestos fenólicos antioxidantes, con propiedades antialergénicas,

antiinflamantorias, antimicrobianas, antivirales y anticancerígenas, su consumo elevado reduce el riesgo de cáncer pulmonar.

Jatropina Hojas Alcaloide que tiene actividad antiinflamatoria y diurética Saponinas Hojas Medicinales e industriales. Precursores de hormonas esteroidales y

corticosteroides. Por su actividad tensoactiva son útiles como emulgentes y hemolizantes.

Taninos Hojas y corteza Propiedades astringentes, antisépticas y cicatrizantes. Útiles en la fabricación de tintas y otros colorantes para curtir pieles.

Vitexina Hojas Flavonoide,se considera como anti ulceroso

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utilizando alcohol de 95º. Las semillasse colocaron en un plato Petri estérilhasta que la llama se consumió. Seeliminó la testa con pinzas y un bisturíque se introdujo lejos del embrión, paraevitar dañarlo (Figs. 1 y 2). Una vezeliminada la cubierta seminal, seprocedió a la extracción del embriónpartiendo el endospermo a la mitad conun corte longitudinal y sin tocar elembrión. Se extrajo el embrión concuidado de no eliminar las hojas

et al., 1997). Por el efecto tóxico de lasemilla puede usarse como insecticida,raticida y contra babosas.

La industria farmacéutica emplea lashojas como fuente de Beta-sitoesterol,estigamesterol y campesterol, para lafabricación de medicamentosanticonceptivos, antiinflamatorios einhibidores de cáncer femenino.

Esta planta puede ser tóxica. La corteza,fruta, hoja, raíz y madera contienen HCN(Duque, 1983). La ingestión de cincosemillas altera la respiración y lacirculación sanguínea; más de 20 semillaspueden provocar un estado de coma,inclusive la muerte; se conoce por sucapacidad abortiva (House et al., 1995).

La micropropagación de esta especie esimportante para la obtención de unmayor número de individuos sanos enmenor tiempo, el establecimiento desuspensiones celulares y el análisis desustancias activas. Con este trabajo sepretende establecer el protocolo delcultivo in vitro para la propagaciónmasiva a partir del cultivo de embrionessexuales.

Metodología

El proyecto se llevó a cabo en loslaboratorios del Centro de Investigaciónen Biotecnología (CIB) de la Escuela deBiología en el Instituto Tecnológico deCosta Rica.

Las semillas de J. curcas se colectaron enTempate de Santa Cruz, Guanacaste.Estas se conservaron en refrigeración(5º C) para posteriormente ser utilizadasen el cultivo in vitro.

La desinfección se efectuó lavando lassemillas con agua y jabón líquidoutilizando un cepillo. Posteriormente sesumergieron en alcohol de 70º durante10 minutos. Se llevaron a la cámara deflujo laminar y se flamearon cada unapor separado con ayuda de pinzas largas,

Figura 1Semillas de Jatropha curcas

Figura 2Semillas de J. curcas (izquierda) y corte

longitudinal de semillas (derecha)

El proyecto se llevó a cabo en loslaboratorios delCentro deInvestigación enBiotecnología (CIB)de la Escuela deBiología en el InstitutoTecnológico de CostaRica.

Después de dossemanas de cultivo, el 10% del material se contaminó conbacteria endógena.Los embriones que no sufrieroncontaminación,germinaron y sedesarrollaron.

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Las microestacas se sembraron en unmedio de cultivo con las sales y vitaminasde Murashige & Skoog (1962), 2g/L dePhyta-Gel y un 3% de sacarosa. A estemedio de cultivo se agregaron giberelinasy citocininas, en las concentracionesseñaladas en el Cuadro 3. Se inocularon30 microestacas por tratamiento.

Inducción a la callogénesis

Se siguió el protocolo establecido porAlvarenga, Alan y Peraza, 2002, en lainducción de callo de Uncariatomentosa (uña de gato). Se inocularonsegmentos de hoja en el medio quecontenía los macroelementos M&S(1962) al 50%, vitaminas de Morel,2mg/L de Ácido Indol Butírico (AIB),10g/L de sacarosa y 2g de Phytagel. Losexplantes se sometieron a luz directa,luz difusa y oscuridad. Después de laobtención de los callos a partir de losdiferentes tratamientos, se realizó unanálisis citológico para describir el tipode células presentes.

Resultados y discusión

Cultivo de embriones

Después de dos semanas de cultivo, el10% del material se contaminó conbacteria endógena. Los embriones queno sufrieron contaminación, germinarony se desarrollaron. El mayor porcentajede embriones en desarrollo se obtuvo enel medio de cultivo con las sales de M &S (1962) complementado con 1mg/L deBA (tratamiento 2).

En los individuos inoculados en eltratamiento 2, se pudo observar uncrecimiento de aproximadamente 2 cmde largo en el tallo, al cabo de unasemana. Además presentaban raícesbastante gruesas con una longitudsimilar a la del tallo. A las dos semanasde la germinación las raíces formaron uncallo en el extremo distal y en la base delexplante. Una vez que se formó el callo,

embrionarias, las que seguidamente secortaron a la mitad.

Los embriones se inocularon en unmedio suplementado con las sales yvitaminas de Murashige & Skoog(1962), 2g/L de Phyta-Gel y un 3% desacarosa. A este medio de cultivo seagregaron diferentes concentraciones degiberelinas y citocininas, como seseñala en el Cuadro 2. Se introdujeron30 embriones por tratamiento

Las vitroplantas obtenidas mediante elcultivo de embriones se utilizaron en losensayos de multiplicación. De cadaindividuo se obtuvieron de 1 a 3microestacas. Se seccionaron enmicroestacas de aproximadamente 1,5cm de largo con dos yemas y una hojascada una.

Cuadro 2Tratamientos utilizados en el cultivo de embriones de Jatropha

curcas

Reguladores Tratamiento Testigodel 1 2 3

crecimiento

AG3 1 mg/L ——- 0,5mg/L ——- BA ——- 1mg/L 0,1mg/L ——-

Cuadro 3Tratamientos utilizados en la micropropagación de Jatropha curcas.

Reguladores del Tratamiento Testigocrecimiento I II

AG3 0,5 mg/L 0,5mg/L ——- BA 2 mg/L 1,5 mg/L ——-

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celular (Villee, 1996), lo queprobablemente provocó un aceleradocrecimiento de las plántulas y una mayorlongitud de los entrenudos, encomparación con los individuos que seinocularon en medio M&S (1962)simple. Por otra parte, en los medios decultivo que contenían reguladores decrecimiento, se produjo la formación deun callo en la base de la plántula.

Multiplicación in vitro

El medio de cultivo más efectivo para lamultiplicación in vitro fue el M & S(1962), sin reguladores de crecimiento.A las pocos días de la inoculación seobservó la regeneración de lasvitroplantas. La formación de raíz seobtuvo al cabo de 30 días demultiplicado el material.

Se determinó que el regulador delcrecimiento Benciladenina (BA), fomentala formación de callo en Jatropha curcas.Según Solomon et al., (1998) en el cultivode tejidos de tabaco el empleo de unadosis de auxina alta (2mg/L) y decitocinina baja (0,2 mg/L) favorece laformación de callo. En este caso, laposible presencia de auxinas endógenasen los tejidos de Jatropha curcas al entraren contacto con la BA añadida al mediode cultivo, posiblemente incidió en laformación y crecimiento de callo.

La formación de callo en algunosexplantes produjo cambios en la forma ycolor de las hojas y un aceleradodesarrollo de yemas (Figura 4); muchasveces la formación de callos a partir detejidos somáticos y la diferenciaciónposterior de plantas a partir de estos,puede ocasionar variabilidad genética.Esta se produce debido a que los tejidosde la planta, al cultivarse in vitro,manifiestan como producto del mosaicocromosómico que poseen, una altafrecuencia de variación, que da comoresultado plántulas con característicasdiferentes a las de la planta de donde setomó el material de propagación (Arias et

su crecimiento fue muy pobre (Fig.3.A). Por el contrario, los individuosinoculados en el medio M &S (1962),sin reguladores, no formaron callo ypresentaron un crecimiento normal, conraíces más delgadas y largas (Fig. 3 B).

Cuanto más tiempo se mantuvieron lassemillas en almacenamiento, aumentó elporcentaje de contaminación de losembriones y se redujo el número deindividuos con crecimiento normal.

Al comparar las plantas que crecieron enel medio de cultivo al que se adicionó1mg/L de AG3, se pudo apreciar mayorelongación del tallo, sin embargo, lasvitroplantas presentaban un bajo númerode nudos (2 yemas por individuoaproximadamente). En el medio decrecimiento sin reguladores, este fuemás lento pero con mayor número denudos (de 2 a 3 nudos aproximadamente4 a 7 yemas por individuo). Debidoprobablemente a la acción del AG3, seha informado que las giberelinaspropician la elongación del tallo porinducción de la división y elongación

Figura 3A) Embrión inoculado en el medio de cultivo complementado con 1mg/L

de BA. Se observa la formación de un callo en la base de la raíz. B) Embrióncon desarrollo normal en medio M & S (1962)

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al., 1987). El aumento en el número debrotes en el caso de los individuos queformaron callo, podría atribuirse a que lascitocininas se han citado comopromotores del crecimiento de yemaslaterales, limitando la dominancia apical(Solomon et al., 1998).

Inducción de la callogénesis

El inicio del desarrollo del callo seobservó a los 5 días de establecido elcultivo. Se obtuvieron callos condiferentes características morfológicas(Fig. 5) y microscópicas (Cuadro 4), apartir de hojas de plantas cultivadas invitro de Jatropha curcas.

Según García et al. (1987), un análisismicroscópico de secciones de hojas decafé, sometidas a la acción de sustanciasde crecimiento, reveló que el callo seorigina a partir del mesófilo esponjoso yla proliferación de este tejido ocasionaposteriormente la desorganización delparénquima empalizada y luego ocurreuna ruptura de la epidermis. Es por elloque cuando se hizo este tipo de análisis encallos obtenidos de hojas de Jatrophacurcas se pudo observar partes de tejidodel mesófilo como, por ejemplo, lascélulas tubulares.

Figura 4Ensayo de multiplicación. A) Formación de callo en la base

de la microestaca inoculada en medio con BA. B) Microestaca inoculada en medio M&S simple (no presenta callo)

Figura 5Callogénesis en hoja expuesta a luz directa,en medio M & S (1962) con 2 mg/L de AIB.

Cuadro 4Análisis macroscópico y microscópico de los callos obtenidos a partir de secciones de hoja de Jatropha curcas

Observación Desarrollo en oscuridad Desarrollo en luz difusa Desarrollo en luz

Macroscópicas Callos friables: se podían Callos friables y callos Callos compactos: muyseparar fácilmente, de color compactos de color verde duros y difíciles de separar,blanco. claro. de color verde oscuro.

Microscópicas a Presencia de células Presencia de células tubulares Presencia de células tubularesun aumento de 40 X tubulares con menor con mayor cantidad de con mayor proliferación de

cantidad de cloroplastos. cloroplastos. cloroplastos. Células meristemáticas Células meristemáticas Células meristemáticaspequeñas, con menor pequeñas, con mayor pequeñas, con mayorcantidad de cloroplastos. cantidad de cloroplastos cantidad de cloroplastos.

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Agradecimiento

Este proyecto fue apoyado y financiadopor el Fondo de Proyectos Estudiantilesde la Vicerrectoría de Investigación yExtensión del Instituto Tecnológico deCosta Rica.

BibliografíaAlvarenga, S., Alan, E., Peraza, J. 2002.

Estudio de la Biología, la propagación y elcultivo in vitro de Uncaria tomentosa (uñade gato). Informe Final. Escuela de Biología.Instituto Tecnológico de Costa Rica.Cartago, Costa Rica. 89p.

Arias, O y Villalobos, I. 1987. Inducción ymultiplicación de callos in vitro en trescultivares comerciales de caña de azúcar(Saccharum ssp). Agronomía Costarricense11 (1): 39-44.

Burger, W and Huft, M. 1995. “Floracostarricensis: Family # 113:Euphorbiaceae”. Fieldiana: Botany . FieldMuseum of Natural History: USA. 165p.

Duque, J. 1983. “Jatropha curcas L.”<ht tp : / /www.t ropi lab.com/ja t ropha-cur.html> (7/10/2000).

House, P.; Lagos, S.; Mejia, T.; Ochoa, L.;Torres, C y Rivas, M. 1995. PlantasMedicinales Comunes de Honduras.Universidad Nacional Autónoma deHonduras. Litografia López S. De R.L.Tegucigalpa Honduras. p: 234 – 235.

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Mittelbach, M.; Trabi, M. 1997. “Biofuels andIndustrial Products from Jatropha curcas”. <http://www.biodiesel.at/references.html >(7-12-2000)

Murashige, T. And Skoog, F. 1962. “A revisedmedium for rapid growth and bioassays withtobacco tissue cultures”. Physiol. Plant. 15:473-497.

Solomon, E y Villee, C. 1998. Biología. 3ed.Interamericana McGraw Hill. México D.F.1305p.

Villee, C. 1996. Biología. 8ed. McGraw Hill.México, D. F., Mexico. 994p.

Para la inducción de callo se usan mediosde cultivos con auxinas como el ÁcidoIndol Butírico (AIB). Se ha reportado quesi se desea inducir a callo en un medio queno contenga auxinas, la producción decallo es casi nula o muy baja, pero si seincrementa la concentración de auxinas sepodría incrementar la producción de callo(García et al., 1987).

Según el cuadro 4, el mejor tratamientopara establecer un ensayo de suspensionescelulares en esta especie, fue el quepropició el desarrollo de callo en laoscuridad, debido a que se obtienen callosfriables, lo que permite una buenaseparación de las células (Cuadro 4).

Conclusiones

- El medio de cultivo M&S (1962), sinreguladores de crecimiento y con 3%de sacarosa, fue el óptimo para elcultivo de embriones in vitro de J.curcas.

- Aunque la literatura reporta que elAG3 promueve la enlongación en lostallos, en este ensayo con J. curcas sefavoreció la formación de callo.

- Los resultados obtenidos coincidencon lo que indica Solomon et al.,(1998) acerca de que la Benciladenina(BA) utilizada en el medio de cultivoinduce a callogénesis y fomenta laformación y el crecimiento de broteslaterales.

- Los tejidos de Jatropha curcas son muysensibles a la formación de callo, lapresencia de concentraciones bajasde reguladores en el medio de cultivoo tejidos dañados indujeron acallogénesis. Este proceso morfológicorequiere de mayor seguimiento.

- El cultivo de segmentos de hoja en unmedio que contiene el 50% de las salesde M & S(1962), complementado conlas vitaminas de Morel (1958), 2mg/Lde AIB, y 1% de sacarosa e incubadoen condiciones de oscuridad produjoel desarrollo de callos friables.