cultivo de una microalga, mediante la tecnica de la masificación

Cultivo de fitoplancton, zooplancton y macroalgas

“AÑO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE INGENIERIA PESQUERA

TEMA : CULTIVO DE UNA MICROALGA, MEDIANTE LA TECNICA DE LA MASIFICACIÓN

CURSO : CULTIVO DE FITOPLANCTON, ZOOPLANCTON Y

MACROALGAS

PROFESOR : ING. EDGAR REGULO VEGA ALCAZAR M. Sc.

INTEGRANTES:

ALDANA AMAYA, GIAN MARCOS ALVARADO NUÑEZ ARNOLD CORDOVA CRUZ, HERNAN SILVA TALLEDO, JOSE HERNAN SUAREZ RAMIREZ SEGUNDO CHRISTIAN

[Escriba texto] Página 1


ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………. 3

II. OBJETIVOS…...……………………………………………………… 4

III. MATERIALES Y EQUIPOS………………………………………… 5

IV. FUNDAMENTO TEÓRICO………………………………………… 7

4.1. CARACTERISTICAS DE LA MICROALGA EN CULTIVO (nannochloropsis)……………………………………………………… 7

4.2. ACONDICIONAMIENTOS FISICOS……………………….. 8

4.3. ACONDICIONAMIENTOS QUIMICOS …………………….. 10

4.4. TÉCNICAS DE CONTAJE CELULAR…........................... 13

V. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS…………………………… 14

5.1. LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DE TODOS LOS EQUIPOS Y MATERIALES……………………………………………………………….. 14

5.2. PRIMERA MASIFICACIÓN…………………………………………….… 17

5.3. RESULTADOS DE LA CUANTIFICACION……………….. 24

5.4.- SEGUNDA MASIFICACIÓN: ………………………………………... 31

5.5. RESULTADOS DE LA CUANTIFICACION……………….. 37

VI.- REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DEL

CULTIVO……………………………………………………………………. 43

VII.-DISCUSIONES……………………………………………… 45

VIII.- CONCLUSIONES…………………………………………… 46

IX.- BIBLIOGRAFIA………………………………………………… 47



I.-INTRODUCCIÓN

El cultivo de microalgas se realiza mediante la “técnica de la masificación”, que necesariamente debe ser desarrollada en la práctica, para reafirmar los conocimientos teóricos y finalmente capacitar al estudiante de Acuicultura para obtener microalgas como cultivo de apoyo para alimentar a los diferentes cultivos principales.Las microalgas en los sistemas acuáticos cumplen un papel importante debido a que son el primer eslabón en la cadena trófica ya que ellas son foto autótrofas, es decir, generan su propio alimento utilizando la luz, el CO2 y una serie de nutrientes que les brinda el medio donde se desarrollan.Su cultivo es muy importante en una acuicultura comercial ya que representan un adecuado alimento para los cultivos principales, por lo que deben manejarse las condiciones adecuadas semi-controladas o controladas totalmente, para lograr en ellas una biomasa considerable como alimento.Entre estas condiciones para el cultivo adecuado deben manejarse requerimientos físicos (Agitación, luz, Temperatura) y químicos (Manejo de la contaminación, nutrientes o sales minerales, gases, Ph, salinidad) los cuales si se manejan eficientemente van a generar una exitosa y considerable biomasa.Además de todo lo anteriormente mencionado se deben realizar controles de desarrollo del cultivo (generales y sistemáticas) para determinar crecimiento, incremento de biomasa o posibles competidores o predadores.Por lo que en el presente informe detallamos el procedimiento para un cultivo adecuado de microalgas (nannochloropsis), teniendo en cuenta las características físicas y químicas, así como los controles mencionados.



II.- OBJETIVOS

Utilizar el medio de cultivo de GUILLARD modificado. Establecer y acondicionar un sistema de cultivo para

microalgas. Desarrollar la técnica de la masificación, hasta llegar a un

volumen de 3 litros. Cuantificar el cultivo mediante la técnica de conteo directo,

utilizando la cámara de “Neubaver”

III.- MATERIALES Y EQUIPOS



3.1.- Materiales para la masificación:

Dos botellas de 1.5 litros.

Dos botellas de 3.0 litros.

2 mts de manguera transparente ( ).

2 llaves para acuario ( ).

2 T para acuario ( ).

2 uniones para acuario ( ).

2 pali globos. ( ).

2 pliegos de papel de molde.

Un rollo de papel higiénico.

Un paño para limpieza (toalla).

Un paquete de algodón.

Una cinta de embalaje.

Un marcador indeleble.

3.2.- Materiales y reactivos para la desinfección y conteo de microalgas:

Hipoclorito de sodio.

Tiosulfato de sodio.

Agua destilada

Formol al 5%.

3.3.- Materiales y equipos de laboratorio utilizados:

Microscopio.

Cámara de neubaver.

Pipetas volumétricas.

Vasos de precipitados (500 y 250 ml).

Probeta (500 ml).

Laminillas cubre y porta objetos.

Placas Petri.

Pizeta




MICROSCOPIO BOTELLAS

PIZETA LLAVES T

TOALLA PLUMON

INDELEBLE

PAPEL HIGIENICO PAPEL MOLDE

CINTA ALGODON


IV.- FUNDAMENTO TEORICO

4.1 CARACTERISTICAS DE LA MICROALGA EN CULTIVO.

Nannochloropsis sp.

Nannochloropsis es una pequeña alga verde usada ampliamente en la industria de la

acuicultura para cultivar zooplancton, tal como la alimentación de rotíferos y para hacer la

técnica de las aguas verdes. También es usada para alimentar corales y otros

consumidores filtradores.

Nannochloropsis es un género de alga que comprende aproximadamente 6 especies. Las

especies mayormente se han conocido en el medio marino, pero también se producen en

agua dulce y salobre. Todas la especies son pequeñas esferas, no móviles que no expresan

ninguna característica morfológica distintiva, y no puede ser indicada mediante luz o

microscopia electrónica.

Las algas del genero Nannochloropsis ellos tienen un diámetro de alrededor de 2 a 3 micrómetros.

.

Cultivo de nannochloropsis Página 7


CLASIFICACIÓN CIENTIFICA

Dominio Eucariontes

Reino Chromalveolata

Filo Heterokontophyta

Clase Eustigmatophyceae

Familia Eustigmataceae

Genero Nannochloropsis

4.2.-ACONDICIONAMIENTOS FISICOS:

Nuestro cultivo masificado deberá contar con 3 factores físicos fundamentales que son:

agitación, luz blanca y temperatura del medio ambiente.

Estos acondicionamientos tienen influencia de forma directa sobre los cultivos debido a que

si faltarán algunos de estos factores nuestro cultivo se verá seriamente afectado y

posteriormente fracasará.

LA AGITACIÓN.- Este acondicionamiento evita la sedimentación de las microalgas

y es necesario agitar constantemente; esto es posible hacerlo por medios mecánicos

es decir utilizando un aireador, logrando así que en el cultivo haya una mejor

distribución de los nutrientes disueltos en el agua, además permite un

abastecimiento continuo de anhídrido carbónico (CO2 ) el cual es un componente del

aire, como efecto del bombeo y además la agitación permite que todas las

microalgas aprovechen la mayor captación de la luz para la fotosíntesis. Por esta

razón es considerada como el primero factor físico y más importante.



LA LUZ.- Es un factor físico de gran influencia, la cual puede ser tomada de dos

fuente, una natural que es la luz solar, esta es utilizada si los cultivos son exteriores

y extensivos, y la otra fuente es artificial que por lo general es utilizada para

cultivos intensivos e interiores es decir los que se controlan dentro de un

laboratorio.

Esta luz artificial debe de ser LUZ BLANCA O FRIA, no la luz amarilla o la que produce

calor.

En cambio la luz blanca es producida por la reacción de la energía eléctrica con el gas

neón, contenida en los fluorescentes; mientras que la luz amarilla es producida por

incandescencia ósea por calor en el vació, lo que genera mucha energía calorífica, que

calienta los cultivos de microalgas y los mata.

Las condiciones que debe reunir La luz artificial es que tener la calidad espectral

adecuada, que están comprendidas entre los 380 y 720 nano micras (nm), nunca por debajo

de los 380 ni mayor a los 720 nano micras, debido a que cuando se encuentran fuera de

estos rangos son muy perjudiciales para nuestros cultivos debido a que producen inhibición

de la fotosíntesis.

La otra condición es que debe tener una adecuada intensidad, que está en relación a la

distancia que existe entre la fuente de luz y el cultivo de microalgas, esta debe estar entre

0,20 a 1.0 m dependiendo del volumen del cultivo. La intensidad de la luz se mide por

LUX, y el rango adecuado de LUX para los cultivos está entre 2000 a 5000 lux,

dependiendo siempre del volumen y la densidad del cultivo.

LA TEMPERATURA.- Es un factor de igual importancia que los anteriores

mencionados debido a que la fisiología de las microalgas depende de la

temperatura del medio en la que se desarrollan en este caso el agua de mar.



La temperatura del medio de cultivo determina la principal actividad fisiológica, que es la

fotosíntesis y su intensidad. Razón por la que la producción de biomasa de las microalgas,

depende de la temperatura del agua o medio.

4.3.- ACONDICIONAMIENTOS QUÍMICOS:

Nuestro cultivo de Nannochloropsis sp también deberá contar con los 5 factores químicos

más importantes los cuales son: manejo de la contaminación, nutrientes, pH, gases y

salinidad. Los cuales tienen influencia sobre los cultivos debido a que si algunos de estos

factores no estuviera en los márgenes correctos nuestro cultivo estará retardado en

crecimiento o aumento de densidad y se vería seriamente afectado y posteriormente

fracasará.

MANEJO DE LA CONTAMINACIÓN: Este factor es el primero y principal

requerimiento o acondicionamiento químico, debido a que determina la

producción de biomasa (microalgas) en el tiempo y en las condiciones proyectadas.

Manejar la contaminación va a significar principalmente evitar que el ecosistema o

medio de cultivo no sea invadido por otros organismos competidores u organismos

predadores es decir evitar que en nuestro cultivo existan “organismos no

invitados”. Entre los competidores están otras microalgas y/o bacterias que se

alimentan de los nutrientes desplazando a la microalga cultivada; de los

predadores serán todos aquellos organismos que se alimentan de las microalgas

Las dos principales técnicas para manejar la contaminación son:

La Esterilización.- Consiste en la eliminación de TODOS los microorganismos como

bacterias y otras microalgas y sus formas resistentes, para evitar que compitan con la

microalga en cultivo y así obtener un ecosistema estéril, donde sólo viva la microalga en

cultivo. Se logra luego de haber utilizado el calor directo o húmedo y procedimientos

químicos en combinación con procesos químicos, cuando se filtra el agua hasta llegar a las

2 micras, y luego aplicar radiación ultravioleta.



La desinfección.- Es la eliminación de la mayoría de los microorganismos como bacterias

otras microalgas y sus formas resistentes, para evitar que compitan con la microalga en

cultivo y así obtener un ecosistema monoespecífico , donde prevalezca la microalga en

cultivo por su densidad sobre los demás acompañantes, así la microalga tendrá un

ecosistema acuático más indicado para su crecimiento. Se logra aplicando lavados con

detergentes, alcohol, lejía, formol, yodo.

NUTRIENTES O SALES MINERALES: Es un factor importante pues los nutrientes

son el conjunto de sustancias que son agregadas al medio de cultivo en este caso

agua de mar esterilizada o desinfectada, que deberá necesariamente contener

toda la composición de sales minerales que requiera cada especie de microalga, en

general se requiere:

-Nitrato de sodio 75 mg/L

-Fosfato de sodio 5 mg/L

-Trazas de minerales

- Vitaminas

GASES: tercer factor a tener en cuenta en los cultivos de microalgas, los

principales son el Anhídrido carbónico (CO2) y el oxígeno disuelto en el agua (O2), el

CO2 es el gas insumo y deficitario en el cultivo de microalgas, debido a que

participa en la fotosíntesis.

El CO2, ingresa mediante la agitación con el aire filtrado al cultivo de microalgas, logrando

densidades elevadas ejemplo 4.5 x 106, para mayores densidades es necesita añadir al

cultivo CO2 en su forma purificada en un 1% del volumen del aire que ingresa con la



agitación, caso contrario el cultivo no se desarrolla y por falta de CO2 el pH se eleva hasta

9, creando un medio ambiente no adecuado para las microalgas.

PH DEL AGUA.- Es el cuarto factor químico a tener en cuenta debido a que este

representa la cantidad de hidrogeniones activos que están presentes en el agua y

determinan si el cultivo de microalgas se va a desarrollar adecuadamente, para lo

cual debe estar en el rango de 6,5 a 9,5, siendo el óptimo entre 7 y 8, valores fuera

de este rango (6,5 a 9,5) causan problemas de erosión y deterioro en la pared

celular de las microalgas.

El pH del agua está relacionado directamente con la cantidad de CO2 disuelto en el agua.

Por esta razón el pH promedio recomendado para el medio de cultivo de microalgas en

agua dulce será de 7,5 y en agua de mar 8,4 los que con la edad de las células y el

desarrollo del cultivo se incrementará hasta 9,0 , pH que detendrá el desarrollo del cultivo,

dado que se ha consumido todo el CO2 administrado por la agitación al cultivo, debiendo

obligatoriamente agregar el 1% de CO2 al sistema de agitación, para proveer CO2 para que

el desarrollo del cultivo reinicie su incremento, y se baje el pH a 7,5 o 8,4 según el tipo de

agua.

SALINIDAD DEL AGUA.- Es el quinto factor químico a tener en cuenta debido a

que este comprende todas las sales disueltas en el agua, que las microalgas

necesitan para su desarrollo normal, como por ejemplo el cloruro de sodio, el

nitrato de sodio y el fosfato de sodio.

Las microalgas cultivadas pueden ser de origen marino o de agua dulce, en ambos casos

será necesario verificar con un salinómetro óptico que la salinidad del medio de cultivo

sea igual o muy similar al nuevo medio de cultivo a utilizar, durante el proceso de la

masificación.



4.4.- TECNICAS DE CONTAJE CELULAR:

A continuación se hace una descripción breve de los métodos que se utilizan para

determinar el número de células presentes en una muestra.

UTILIZANDO UN MICROSCOPIO Y UNA CÁMARA DE NEUBAVER.

Primero tomamos una muestra la cual tiene que ser homogénea y representativa, esto ser

realiza no destapando la botella si no apretando la botella y por la misma manguera de

aireación verter en un vasito la muestra, luego mediante una pipeta se toma una

submuestra de 2 ml del cultivo y se les aplica 2 ml de formol al 5%, luego

homogenizamos, después con otra pipeta se extrae la muestra homogénea y se desliza en

la cámara. Luego se cubre con la lámina cubreobjetos, se procede a contar el número de

células presentes en cada cámara mediante el microscopio.

Una vez que se tiene el promedio de células de las cámaras, el cálculo total de células por

mililitro se lleva a cabo de la siguiente manera:

a.- Primero calcule el factor de dilución

m = Muestra problema (ml)

f = solución de formol al 5% (ml)

b.- Se tiene que multiplicar por 10 000, debido a que el volumen de una cuadricula es de

0.1 micro litro y para llevarlo a mililitro se tiene q multiplicar por 10 000

c.- Se requiere el número promedio de células de la muestra problema.

N.P. = Número promedio de células por ml



Con todos los incisos anteriores se realiza el cálculo de número de células de la muestra

problema por ml y la fórmula queda así:

No. de Células/ ml = (F.D.) (10 000) (N.P.

V.- PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS

5.1. LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DE TODOS LOS EQUIPOS Y

MATERIALES

Para manejar el problema de la limpieza y desinfección, hemos tenido que lavar los

materiales que vamos a utilizar en la masificación y también el lugar de trabajo del grupo

(mesa). Aquí se realizó lo siguiente:

El Primero lavado se hizo con detergente.

El Segundo lavado se hizo con hipoclorito de sodio.

El tercer lavado se hizo con tiosulfato.

El cuarto lavado se hizo con agua destilada.

El procedimiento fue el siguiente:

EL PRIMER LAVADO:

Lo hicimos utilizando detergente con la finalidad de eliminar las partículas más grandes y

persistentes como la suciedad y algunas impurezas de mayor tamaño, pues inicialmente

lavamos cuidadosamente el área de la mesa de trabajo, utilizando abundante agua y una

cierta cantidad detergente, restregando con el paño de limpieza para poder sacar la mayor

suciedad posible; luego el área lavada con agua, detergente y enjuagada con agua potable

la secamos totalmente con el papel higiénico.



Así mismo, se procedió el lavado con detergente y agua a los materiales tanto de vidrio

como los materiales de plástico que se utilizaran durante el proceso de masificación.

EL SEGUNDO LAVADO:

Luego se procedió a realizar el segundo lavado utilizando hipoclorito de sodio (lejía), con

el fin de eliminar todo tipo de microorganismos presentes e impurezas de menor tamaño

adheridas al material, pero solo se realizó en materiales que luego utilizaríamos en la

masificación; ya que el cloro tiene una valencia muy activa y por lo tanto corrosiva. Que al

estar en contacto con cualquier organismo vivo este lo corroerá (es decir les destruirá su

pared celular lo que les impedirá seguir reproduciéndose y en consecuencia morirán)

Determinamos la cantidad de esta solución para luego diluirla y realizar el desinfectado

utilizando la siguiente cantidad 5.88ml a una concentración de 500 ppm para 500 ml de

agua de mar.



TERCER LAVADO:

Luego pasamos al tercer lavado que lo hicimos con Tiosulfato el cual se agregó 0.5 ml

por cada 500 ml de agua destilada en un vaso de precipitado, este lavado se hace con el fin

de neutralizar y eliminar los residuos de HCl que han quedado presentes tanto en los

materiales como en la zona de trabajo, es importante neutralizar con tiosulfato debido a

que si no lo hacemos los residuos de cloro al momento de verterle nuestro inoculo corroerá

la pared celular de nuestras micro algas causándoles la muerte.

CUARTO LAVADO:

Por último realizamos el cuarto lavado con agua destilada para retirar los residuos de

Tiosulfato concluyendo finalmente que los materiales están desinfectados completamente.



Para evitar que nuestros materiales se vuelvan a contaminar cubrimos con papel molde

todos los materiales desinfectados: botellas rotuladas, el pali globo, la manguera, las

conexiones de plástico (Uniones, llaves T). Una ver cubierto todos los materiales los

recubrimos con un pliego de papel para obtener un solo paquete u bolsa, lo cerramos con

cinta y volvemos a rotular (marcar con los datos del grupo) está vez el paquete.

Al final todo el paquete de materiales desinfectados se les entregará al docente para

guardarlos, además se le hará la devolución de todos los materiales utilizados en esta

práctica completamente limpios.

5.2.- PRIMERA ETAPA DE MASIFICACIÓN:

5.2.1.- PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO A MASIFICAR.

5.2.1.1.- TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR:

Se inicia con el proceso de recolección en el (mar), para luego ser llevada al CEAPA

entregada a los encargados de esa zona y luego ellos hagan lo siguiente:

a.- FILTRACIÓN:

Los encargados del CEAPA tuvieron que aplicar el filtrado a nuestra agua con el fin de esta

no presente sólidos, tal que todos los elementos sólidos no deseados se vayan quedando

en el papel filtro y así lograr el adecuado manejo de la contaminación. Una vez filtrada un

alumno del grupo tiene que ir a recoger la botella previa desinfección.

b.- TRATAMIENTO TERMICO:

Una vez filtrada el agua de mar llevamos a calor húmedo la cual se eleva a una

determinada temperatura hasta que sea calentada, obteniendo la eliminación de:

esporas, bacterias y todo tipo de microorganismos que pongan en riesgo nuestro cultivo.



Nota: El tiempo de aplicación del calor húmedo debe ser breve ya que si esta hierve se

formaran precipitados de color blanquecino (básicamente son sales), lo cual perjudicaría

el desarrollo óptimo de nuestro cultivo.

5.2.1.2.- PREPARACIÓN Y ENRIQUECIMIENTO DEL MEDIO DE CULTIVO

El proceso de filtración y esterilización lo llevamos a cabo dos días un día antes de la

masificación respectivamente. Nutrientes (nitrato de sodio, fosfato de sodio trazas de

minerales y vitaminas) cada una con su respectivo volumen que a continuación

detallamos:

NITRATO DE SODIO:

Se trata de una sustancia incolora, ligeramente higroscópica y altamente oxidante; debido

a su contenido de nitrógeno se utiliza como fertilizante.

1 mg 1000 ml

X mg 1000 ml

X=1 mg=1 ml



Para los nitratos de sodio en la fiola estaba especificado que dicha solución debería

vestirse 1 mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero como esta (nitrato de sodio)

está en forma de solución entonces decimos que: 1 mg = 1ml, para que pueda ser tomado

como medida volumétrica en la pipeta; es por ello que nuestra muestra le hemos

agregado 1 ml de fosfato de sodio para empezar a enriquecer nuestra agua de mar.

FOSFATO DE SODIO:

Se emplean como aditivos alimentarios principalmente estabilizantes, en algunas

ocasiones empleado como regulador de la acidez, y también como agente en algunos

minerales.

1 mg 1000 ml

X mg 1000 ml

X=1 mg=1 ml

Para los fosfatos de sodio en la fiola estaba especificado que dicha solución debería

vestirse 1 mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero como esta (Fosfato de sodio)

está en forma de solución entonces decimos que: 1 mg = 1ml, para que pueda ser tomado



como medida volumétrica en la pipeta; es por ello que nuestra muestra le hemos

agregado 1 ml de fosfato de sodio para empezar a enriquecer nuestra agua de mar.

TRAZAS DE MINERALES:

1 mg 1000 ml

X mg 1000 ml

X=1 mg= 1 ml

Para las trazas en la fiola estaba especificado que dicha solución debería vestirse en 1.1

mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero como esta (trazas) está en forma de

solución entonces decimos que: 1mg = 1 ml, para que pueda ser tomado como medida

volumétrica en la pipeta; es por ello que nuestra muestra le hemos agregado 1 mg de

trazas para concluir el enriquecer de nuestra agua de mar.

La razón por la cual se agregan más volúmenes de fosfatos, nitratos y vitaminas es debido

a que estos en el agua de mar que hemos tratado están en condiciones deficitarias; los

minerales o trazas le hemos reducido su volumen a 1 ml es debido a que en el agua de

mar existen más carbonatos y bicarbonatos lo cual este volumen vertido es solo para

complementar algunas trazas faltantes ya que toda agua donde se va a realizar un cultivo

debe contar con minerales en concentraciones relativamente bajas para que este

progrese.



Todo esto que hemos realizado es con la finalidad de darle todas las facilidades a la

especie a cultivar para que tenga el crecimiento o reproducción adecuada.

VITAMINAS:

La actividad de las vitaminas se pone en manifiesto químico como precursores en las

formas metabólicas correspondientes por esta razón como el aporte natural es escaso de

vitaminas da lugar a síntomas de deficiencia.

0.5 mg 1000 mlX mg 1000 ml

X=0.5 mg=0.5 ml

Para las vitaminas en la fiola estaba especificado que dicha solución debería vestirse 0.55

mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero como esta (Vitaminas) está en forma

de solución entonces decimos que: 1 mg = 1ml, para que pueda ser tomado como

medida volumétrica en la pipeta; es por ello que nuestra muestra le hemos agregado 0.5

ml de vitaminas para empezar a enriquecer nuestra agua de mar.

5.2.2.- INCORPORACIÓN DEL INÓCULO:

Inicialmente estaba presente como cepa del cual se extraería la muestra para el cultivo

(inoculo), y que posteriormente albergaría a todos los cultivos de las microalgas a cultivar.

El inoculo incorporado al medio de cultivo preparado fue de 500 ml



A.- TOMA DE MUESTRA PARA SU PRIMERA CUANTIFICACIÓN.

Luego de tener nuestro sistema de cultivo en completo funcionamiento procedemos a

desconectar el sistema de aireación de la línea madre, luego extraemos una pequeña

muestra la cual debe ser homogénea y representativa.

De esta muestra sacaremos una submuestra la cual tendrá un volumen de 2 ml, que lo

vertimos en la placa Petri. La pipeta a utilizar para esta medida debe estar totalmente

esterilizada para evitar contaminar la muestra y alterar los resultados.

De inmediato pipeteamos un volumen de 2 ml de formol al 5%, el cual le agregaremos a la

placa Petri que contiene los 2 ml de la muestra, teniendo estos dos volúmenes nos

servirán para el factor de dilución. El motivo por el cual agregamos formol es de

inmovilizar (matar) a las microalgas para poder realizar el conteo; hecho esto

homogenizaremos con el propósito de tener una muestra fiable a nuestro propósito

(cuantificación).

Luego de haber realizado esto haremos uso de parte de pali globo, el cual nos servirá para

llevar parte de la muestra homogenizada a la cámara de Neubaver, el pali globo y la

cámara deben estar limpia y bien desinfectado, para obtener resultados fiables, Una vez



realizado esto cubrimos la muestra puesta en la cámara de Neubaver con una laminilla

cubre objeto.

Para llevarla al microscopio y realizar el conteo correspondiente; para localizar las

cuadriculas primero hicimos uso del lente de color rojo, el cual tiene un aumento de 4

aumentos (X 4), este sirvió para ubicar la cuadriculas en dimensiones relativamente

pequeñas.

Una vez ubicada procedemos a utilizar el lente de color amarillo el cual tiene un aumento

de 10 aumentos (X 10) , el cual nos sirvió para ubicar una cuadricula de las cuatro en

dimensiones relativamente más grandes que a la anterior, luego hicimos uso del

micrómetro para darle nitidez a la imagen a la muestra que visualizamos en el

microscopio.



Hecho todo esto procedimos a realizar el conteo correspondiente de cada una de las

cuadriculas

5.3.- CUANTIFICACIÓN: RESULTADOS.

PRIMER CONTEO DE MICROALGAS (SIEMBRA): (lunes 11/11/13)

76 62 60 68

50 57 40 7253 58 77 5369 48 50 55

Promedio:X = Σ (76+62+60+68………….) = 59.36 14

Total de microalgas



T = X . 2 . 10 000T = 59.36 x 2 x 10 000T = 1.1 x 106 células/mililitro

SEGUNDA CONTEO : (miércoles 13/11/13)

132

124

141

123

132

110 93 10

5130

122

120

121 87 89 94 93

132

116

148

116 96 71 73 95

109

101

160

127 97 10

5114 92

Promedio:A = Σ (132+124+………+127)= 125.79



14 B = Σ (132+110+………+92)= 95.93

14X= 125.78 + 95.93= 110.86

2Total de microalgas


TERCER CONTEO: (viernes15/11/13)

116

111

113

142

170

140

118

140

145

119

111

120

130

103

125

119

147 97 12

7128

133

117

128

126

103

120

143

130

108

127

124

127



Promedio:A =Σ(116+111+……..+130)=123.43 14B = Σ (130+140+………+108) = 125.86

14X= 123.43 + 125.86= 124,65

Total de microalgas

T = X . 2 . 10 000T = 124,65 x 2 x 10 000T = 2.4 x 106 células/mililitros

CUARTO CONTEO: (martes 19/11/13)

152

183

180

126

185

165

158

160

167

134

166

179

164

166

179

206



Promedio:X = Σ(152+183+……..+206) =167celulas 14

Total de microalgas

T = X . 2 . 10 000T = 167 x 2 x 10 000T = 3.3 x 106 células/mililitros

5.3.3. ACONDICIONAMIENTO DEL SISTEMA DE AGITACIÓN

La agitación es el acondicionamiento físico más importante que debe tener un

cultivo de microalgas ya que va a evitar la sedimentación de la densidad de

microalgas, generar el movimiento del medio de cultivo y así proporcionar la buena

distribución de los nutrientes disueltos en el agua, también funciona como

abastecedor de anhídrido carbónico (CO2) del aire por efecto del bombeo a través

del burbujeo y brinda una mejor captación de la energía de la luz. Todo esto va a

ser posible que se produzca una rápida reproducción de las microalgas y por

consiguiente aumento en biomasa.

El abastecimiento de aire para nuestro cultivo es proporcionado por una bomba de

aire la cual toma aire del medio ambiente para luego comprimirlo y distribuirlo por

toda la red. Es importante que la bomba cuente con un filtro para poder controlar

la contaminación del cultivo. La distribución del aire se realiza a través de una

tubería principal de PBC la cual va a tener pequeñas boquillas por donde se

conecta una manguera transparente de 2 metros y , para regular la

cantidad de aire que entre al cultivo es necesario colocar en la conexión una llave

pequeña de plástico. En la parte final de la manguera se coloca un pali globo (



) el cual va a pasar por la tapa de la botella previamente perforada

colocándose hasta la parte más profunda de la botella para así generar una mayor

agitación del cultivo y obtener una mayor biomasa.

5.3.4. CONTROLES DE DESARROLLO DEL CULTIVO DE MICROALGAS:

A.- REGISTRO DE DESARROLLO GENERALES (Diarias):

- DETERMINACIÓN DE COLOR Y TONALIDAD:

El color que iba tomando nuestro cultivo a lo largo de los días fue uno de los indicadores que nos permitió determinar que nuestro cultivo estaba progresando, es decir que las microalgas (nannochloropsis sp) se estaban reproduciendo, consumiendo los nutrientes aportados al agua de mar y que los acondicionamientos físicos y químicos que se habían hecho estaban dentro de los rangos aceptables para el cultivo de dicha microalga.Fue así que a diario se tomaba nota del color, este iba en aumento es decir aumentaba el tono del color, iniciándose nuestro cultivo en un verde claro de ahí en adelante se fue notando que el color iba en aumento hasta llegar a un verde oscuro.



B.- REGISTRO DE DESARROLLO SISTEMATICO (diarias)

FECHA HORA TEMPERATURA lunes 11/11/13

08.30 am. 23 °C11.30 24 °C

martes 12/11/13

08.00 am. 23 °C11.30 am. 25 °C

miércoles 13/11/13

08.30 am. 23 °C12.30 pm. 25 °C

jueves 14/11/13

08.30 am. 23 °C12.00 m. 25 °C



viernes 15/11/13

08.30 am. 23 °C12.00 m 25 °C

lunes 18/11/13

08.30 am. 25 °C10.55 am. 26 °C

5.4.- SEGUNDA MASIFICACIÓN:

5.3.1. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO A MASIFICAR

5.3.1.1. TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR:

Inicia con el uso del agua de mar anteriormente recolectada en el mar, en el

CEAPA se volverá a hacer la entrega a los correspondientes encargados de esa

zona y luego empiecen con el siguiente proceso:

a.- FILTRACIÓN:



Los encargados del CEAPA tuvieron que aplicar nuevamente el filtrado con el fin de que

no haya sólidos, tal que todos los elementos sólidos no deseados se vayan quedando en el

papel filtro de 50 a 1 y así poder manejar adecuadamente la contaminación dándole

calidad al agua de mar. Una vez filtrada un alumno del grupo tiene que ir a recoger la

botella previa desinfección con agua de mar filtrada para luego sea calentada (técnica del

calor húmedo).

b.- TRATAMIENTO TÉRMICO:

Una vez filtrada el agua de mar será llevada a calor húmedo la cual se eleva a una

determinada temperatura hasta que sea calentada, obteniendo la eliminación de:

esporas, bacterias y todo tipo de microorganismos que pongan en riesgo nuestro cultivo.

Hay que tener en cuenta que el tiempo de aplicación del calor húmedo debe ser breve ya

que si esta hierve se formaran precipitados de color blanquecino (básicamente son sales),

lo cual perjudicaría el desarrollo óptimo de nuestro cultivo.

5.3.1.2.- PREPARACIÓN Y ENRIQUECIMIENTO DEL MEDIO DE CULTIVO:

Para poder agregar los nutrientes (nitrato de sodio, vitaminas, fosfato de sodio y trazas)

cada una con su respectivo volumen como ya se ha detallado anteriormente, debemos

hacer cálculos para cada uno en relación con la cantidad de agua de mar que se necesita

para llegar a los tres litros obteniéndolos de la diferencia entre los tres litros que se

necesitan y el inoculo. En nuestra muestra obtuvimos 1350 de inoculo y la diferencia:

1750 necesitamos de agua de mar. Cada nutriente esta especificada en su respectiva fiola

que dicha soluciones deben verterse 1 mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero

como están en forma de soluciones entonces decimos que 1 mg = 1ml.



NITRATO DE SODIO:

Cálculos para determinar la cantidad de nitrato de sodio a utilizar en la segunda

masificación:

1 mg 1000 ml

X mg 1750ml

X=1.75mg = 1.75 ml de Nitrato de sodio

FOSFATO DE SODIO:

Como ya se sabe estos se emplean como aditivos alimentarios principalmente

estabilizantes, en algunas ocasiones empleado como regulador de la acidez, y también

como agente quelante en algunos minerales.

1 mg 1000 ml

X 1750 ml

X=1.75 mg =1.75 ml de Fosfato de sodio.



TRAZAS:

1 mg 1000 ml

X mg 1750 ml

X=1.75mg =1.75 ml de trazas.

Para las trazas en la fiola estaba especificado que dicha solución debería vestirse en 0.5

mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero como esta (trazas) está en forma de

solución entonces decimos que: 1mg = 1 ml, para que pueda ser tomado como medida

volumétrica en la pipeta; es por ello que nuestra muestra le hemos agregado 0.95 ml de

trazas para concluir el enriquecer de nuestra agua de mar.

La razón por la cual se agregan más volúmenes de fosfatos, nitratos y vitaminas ya ha sido

explicada en la primera preparación del medio de cultivo para la masificación de la

microalga.

VITAMINAS:

Cálculos para determinar la cantidad de vitaminas que van a ser utilizadas para nuestro

cultivo

0.5 mg 1000 ml

X mg 1750 ml

X=0.875mg =0.875 ml de vitaminas.



5.3.2. INCORPORACIÓN DEL INÓCULO:

En este caso debemos agregar el volumen total de nuestro cultivo realizado como inoculo

que es más de 1100ml de microalga.

A.-Toma de muestra para su primera cuantificación

Una vez que se ha condicionado el sistema de cultivo para la microalga y está en completo

funcionamiento procedemos a tomar una muestra para realizar la primera cuantificación,



para lo cual tenemos que desconectar el sistema de aireación de la línea madre, y luego

extraemos nuestra muestra (4ml).

Sacaremos una sub-muestra la cual tendrá un volumen de 2 ml, y lo verteremos en la

placa Petri, cabe recordar que la pipeta a utilizar para esta medida debe estar totalmente

esterilizada para evitar contaminar la muestra y alterar los resultados.

De inmediato pipetearemos un volumen de 2 ml de formol (5%), el cual le agregaremos a

la placa Petri que contiene los 2 ml de nuestra muestra (determinamos el factor de

disolución); hecho esto homogenizaremos con el propósito de tener una muestra fiable a

nuestro propósito (cuantificación).

Luego de haber realizado esto usamos el pali globo para llevar parte de la muestra

homogenizada a la cámara de Neubaver, el pali globo y la cámara deben estar limpia y

bien desinfectado, para obtener resultados fiables. Una vez realizado esto cubrimos la

muestra puesta en la cámara de Neubaver con una laminilla cubre objeto.



Luego se lleva al microscopio para el conteo correspondiente; localizamos las

cuadriculas con el aumento (X4). Una vez ubicadas las cuadriculas utilizamos el lente

de (X10), para localizar la primera cuadricula y empezamos a realizar el conteo

correspondiente.

5.5.- CUANTIFICACION: RESULTADOS:

PRIMER CONTEO: (MARTES 19/11/13)

36 50 72 55



75 79 60 7074 84 81 8575 68 58 62

X = Σ(36+50+…………..+62) =68.79celulas 14

Total de microalgas

T = X . 2 . 10 000T = 68.79 x 2 x 10 000T = 1.3 x 106 células/mililitros

SEGUNDO CONTEO: (JUEVES 21/11/13)

60 68 78 90

99 108

191

104

124 85 10

6123

10 89 93 10



1 2

X = Σ(60+68+78+……….+112) =97.86células 14

Total de microalgas


TERCER CONTEO: (SÁBADO 23/11/13)

135

103

117

123

130

113

130

125

126

139

113

127



151

111

119

143

X = Σ(135+103+………..+143) = 125.07células 14

Total de microalgas

T = X . 2 . 10 000T = 125.07 x 2 x 10 000T = 2.5x 106 células/mililitro

VOLUMEN FINAL: 2840 MILILITROS

5.3.4. ACONDICIONAMIENTO DEL SISTEMA DE AGITACIÓN

La agitación es el acondicionamiento físico más importante que debe tener un

cultivo de microalgas ya que va a evitar la sedimentación de la densidad de

microalgas, generar el movimiento del medio de cultivo y así proporcionar la buena

distribución de los nutrientes disueltos en el agua, también funciona como



abastecedor de anhídrido carbónico (CO2) del aire por efecto del bombeo a través

del burbujeo y brinda una mejor captación de la energía de la luz. Todo esto va a

ser posible que se produzca una rápida reproducción de las microalgas y por

consiguiente aumento en biomasa.

El abastecimiento de aire para nuestro cultivo es proporcionado por una bomba de

aire la cual toma aire del medio ambiente para luego comprimirlo y distribuirlo por

toda la red. Es importante que la bomba cuente con un filtro para poder controlar

la contaminación del cultivo. La distribución del aire se realiza a través de una

tubería principal de PBC la cual va a tener pequeñas boquillas por donde se

conecta una manguera transparente de 2 metros y , para regular la

cantidad de aire que entre al cultivo es necesario colocar en la conexión una llave

pequeña de plástico. En la parte final de la manguera se coloca un pali globo (

) el cual va a pasar por la tapa de la botella previamente perforada

colocándose hasta la parte más profunda de la botella para así generar una mayor

agitación del cultivo y obtener una mayor biomasa.

5.3.5. CONTROLES DE DESARROLLO DEL CULTIVO DE MICROALGAS:

A.- REGISTRO DE DESARROLLO GENERALES (Diarias):

- DETERMINACIÓN DE COLOR Y TONALIDAD:



El color que iba tomando nuestro cultivo a lo largo de los días fue uno de los indicadores que nos permitió determinar que nuestro cultivo estaba progresando, es decir que las microalgas (nannochloropsis sp) se estaban reproduciendo, consumiendo los nutrientes aportados al agua de mar y que los acondicionamientos físicos y químicos que se habían hecho estaban dentro de los rangos aceptables para el cultivo de dicha microalga.Fue así que a diario se tomaba nota del color, este iba en aumento es decir aumentaba el tono del color, iniciándose nuestro cultivo en un verde claro de ahí en adelante se fue notando que el color iba en aumento hasta llegar a un verde caña oscuro.

B.- REGISTRO DE DESARROLLO SISTEMATICO (diarias)

FECHA HORA TEMPERATURA lunes 08.30 am. 25 °C



18/11/13 10.55 am. 26 °C martes 19/11/13

08.30 am. 24 °C11.35 am. 24 °C

miércoles 20/11/13

08.30 am. 23 °C10.30 pm. 24 °C

jueves 21/11/13

08.30 am. 25 °C11.35 am. 25 °C

viernes 22/11/13

08.25 am. 25 °C11.30 m 25 °C

sábado 23/11/13

08.50 am. 24 °C10.55 am. 25 °C

VI.- REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DEL

CULTIVO.

Al final de todo el proceso de cultivo se obtuvo una gráfica que es una curva que muestra el

resultado de 2 masificaciones del cultivo de la Nannochloropsis sp.



MASIFICACIÓN TIPO FECHA CELULAS / mL

A 1500 ml 1° cuantificación (Siembra) 11/11/13 1.1 x 106

A 1500 ml 2ª cuantificación 13/11/13 2.2 x 106

A 1500 m 3ª cuantificación 15/11/13 2.4 x 106


A 3000 ml 1° cuantificación (Siembra) 19/11/13 1.3 x 106


A 3000 ml 3ª cuantificación 23/11/13 2.5x 106

CURVA DE CRECIMIENTO



VII.- DISCUSIONES

Se comprobó que la agitación es un factor determinante en el cultivo de microalgas porque nos va a permitir que todas las especies se encuentren en constante movimiento, es decir para que no s sedimenten.



Las determinaciones generales y sistemáticas es una actividad que se debe realizar diariamente, para tener una mejor referencia es necesario realizar estas determinaciones dos veces x día. Esto nos permitirá verificar si hay aumento o disminución de la población.

La luz es un factor muy importante para que las microalgas puedan realizar la fotosíntesis, por lo tanto debe mantener una cierta distancia que le permita a la microalga desarrollarse. Debe de ser de color blanca o fría.

Todos los materiales deben ser lavados, desinfectados para que así nuestro cultivo se desarrolle de la mejor manera.

Se debe de entregar con anticipación el agua de mar no contaminada a los encargados del CEAPA, para que ellos sean los responsables de esterilizarla y así nosotros poder cultivar sin ningún problema cualquier tipo de microalga.

VIII.- CONCLUSIONES

Se concluyó que la técnica de la masificación de microalgas es de gran importancia, que tiene por objetivo principal obtener la densidad y volumen determinado de la microalga



(Nannocholoropsis sp.)en un determinado tiempo, y que va a servir de alimento para los cultivos de apoyo y cultivos principales.

Se establecieron condiciones adecuadas para el cultivo de microalgas.

Se aprendió a manejar la cámara de NeuBauer que sirve para realizar el conteo de microalgas como una determinación sistemática.

IX.- BIBLIOGRAFIA:

http://en.wikipedia.org/wiki/Nannochloropsis

http://www.acuinuga.com/00_plugins/docs.php?id=572.


http://en.wikipedia.org/wiki/Nannochloropsis


http://mznbiotech.com/nannochloropsis-sp

http://gaceta.cicese.mx/print.php?topico=secciones&ejemplar=152&sid=&id=2273

http://centrodeartigos.com/articulos-de-todos-los-temas/article_39981.html


http://gaceta.cicese.mx/print.php?topico=secciones&ejemplar=152&sid=&id=2273

http://mznbiotech.com/nannochloropsis-sp

cultivo de una microalga, mediante la tecnica de la masificación

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