Cultivos celulares

• Propagación de células fuera del organismo de origen

• Pueden ser de origen vegetal o animal, y dentro de éstas, pueden provenir de distintos tejidos de vertebrados o invertebrados

• Los cultivos celulares producen clones, por lo que todas las células de un cultivo poseen el mismo genotipo, excepto que se produzcan mutaciones durante el proceso

¿Para qué cultivar células in vitro ?

• Investigación– Comprender la fisiología celular– Toxicología, virología, etc.

• Ingeniería de tejidos– Piel, hígado– Hueso y cartílago

• Producción de biológicos– Anticuerpos monoclonales– Hormonas (FSH)– Enzimas– Vacunas virales (polio, aftosa, parvo, moquillo, etc.)

Ventajas

• Un solo tipo bien definido de células en cada cultivo• Fácil de manipular, condiciones controladas• Establecimiento de líneas internacionales de fácil

acceso• Alternativa al uso de animales

– Sistema para estudiar principios fisiológicos– Chequeo posterior en un número reducido de animales

• Pueden obtenerse grandes cantidades de células• Permite trabajar en pequeña, media y gran escala• Las células pueden mantenerse congeladas por largos

períodos de tiempo con mínima pérdida de viabilidad

Un poco de historia

• 1880-1910: Primeros ensayos de sobrevida de células fuera de organismos enteros (Roux, Haberlandt, etc.)

• 1912: Burrows y Carrel establecen las primeras líneas celulares. Desarrollan técnicas asépticas de trabajo y material específico

Componentes de un cultivo

CELULAS

Tipos de cultivo

• Cultivo primario: células, tejidos u órganos tomados directamente de un animal.

• Cultivo de órganos, explantes: mantenimiento de órganos o parte de órganos in vitro.

• Cultivo de tejidos: mantenimiento de tejidos in vitro.• Cultivo de células: mantenimiento de células dispersas.• Líneas celulares: células mantenidas por subcultivos

sucesivos comenzando por un cultivo primario.• Cultivos continuos: células que han logrado sobrevivir

a muchos subcultivos. Expectativa de vida “infinita”.

Líneas celulares continuas: algunos ejemplos

• BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado• CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico• MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel)• CHO: Epitelio de ovario de hamster chino• VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano• HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano• MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto• HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana• FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino• Etc., etc., etc.

Colecciones internacionales más importantes

Sigla Nombre u organismo

Ciudad, país

Nº de cultivos

ATCC American Type Culture Collection

Minassas, USA

800

DSMZ Human and Animal Cell Cultures

Braunschweig, Alemania

500

ECACC European Collection of Cell Cultures

Salisbury, Wiltshire, UK

1000

GEIMM Istituto Giannina Gaslini

Genova, Italia

2300Fuente: www.biotech.ist.unige.it/cldb/indexes.html

En la Argentina

• ABAC: Asociación Banco Argentino de Células– Desde 1987 mantiene y/o administra varias

decenas de líneas celulares en distintos centros de investigación.

– Provee células congeladas o en cultivo a cambio de un arancel razonable ( $ 90 por cada botella con una monocapa celular de 75 cm2 de cultivo ).

– Brinda servicios relacionados con los cultivos celulares: detección de micoplasmas, mantenimiento de células en depósito de nitrógeno líquido, dispone de manuales de la ATCC traducidos que ofrece a la venta, etc.

– www.abac.org.ar

SOPORTE

Componentes de un cultivo

CELULAS

Soporte

• Líquido: Células en suspensión

Soporte

• Sólido: Células adheridas a vidrio o distintos tipos de materiales sintéticos.

POLICUBETAS

Soporte

Titulación de virus en policubetas con coloración final

FRASCOS ESTÁTICOS

BOTELLAS RODANTES (ROLLERS)

Soporte

• Superficies cubiertas con sustancias que favorecen el crecimiento celular

CÉLULAS FBHE CRECIDAS DURANTE 5 DÍAS SOBRE SOPORTE PLÁSTICO

DESNUDO

CÉLULAS FBHE CRECIDAS DURANTE 5 DÍAS SOBRE SOPORTE PLÁSTICO CON

COBERTURA DE COLÁGENO I

MICROCARRIERS

FASE GASEOSASOPORTE

Componentes de un cultivo

CELULAS

Fase gaseosa

• La concentración de oxígeno necesaria depende de los requisitos de las células

• La concentración de dióxido de carbono depende de la capacidad buffer del medio de cultivo

• Usualmente el equilibrio dióxido de carbono (en la fase gaseosa) - bicarbonato (en la fase líquida) actúa como buffer del cultivo

MEDIO DE CULTIVO

FASE GASEOSASOPORTE

Componentes de un cultivo

CELULAS

Medios de cultivo celulares

CUALIDADES:

• Específico para la célula a cultivar• Nutritivo• pH adecuado• Capacidad buffer• Isotónico• Estéril

Medios de cultivo celulares

COMPONENTES:

• Agua• Sales• Glucosa• Ácidos grasos• Vitaminas• Suero• Péptidos

Micro y oligoelementos Aminoácidos esenciales Factores de crecimiento Otro regulador de pH Indicador de pH Antiespumante ¿Antibióticos?

Organización de un subcultivo

• El objetivo de un subcultivo (pasaje) es mantener las células en condiciones de replicación normal.

• En el subcultivo se renueva el medio de cultivo y se lleva la relación células/medio/superficie de soporte, a la inicial.

• Las células adheridas a soportes sólidos deben ser primero despegadas de este soporte y separadas enzimáticamente (tripsina). Luego se resuspenden, se tiñen con colorante vital (Azul Tripan) y se cuentan en cámara de Neubauer.

• Si se parte de un cultivo de células en suspensión directamente se procede a contar las células.

Organización de un subcultivo

• Una vez conocida la concentración de células en el material de origen, se definen las condiciones del subcultivo deseado y se realiza el pasaje.– Ejemplo

• Material de origen: 2x106 cél/ml• Destino: tres botellas de 175 cm2 con una

concentración inicial de 35000 cél/cm2

• Necesidad: 3 x 175 x 35000 = 1.8x107 células• 1.8x107 células / 2x106 cél/ml = 9 ml ( 3 ml / botella )

Factores críticos

• Suero:– Ventajas: Gran aporte de nutrientes básicos,

proteínas, factores de crecimiento, hormonas, promotores de adhesión, inhibidores enzimáticos, etc.

– Desventajas: Composición indefinida, variabilidad entre lotes, interferente en procesos de purificación de proteínas, interferente en procesos de multiplicación viral, vehículo de entrada de contaminaciones, etc.

Factores críticos

• Temperatura de cultivo: depende del origen de las células. Mamíferos: 37ºC, peces e insectos: 18-22ºC, aves: 38.5ºC, etc.

• Contaminaciones: gran complicación en los laboratorios de cultivos celulares, principalmente a escala industrial. Pueden ser por levaduras, hongos miceliares, virus, bacterias, micoplasmas, otras células, etc.

Equipamiento

• Además del equipamiento usual de cualquier laboratorio, se requiere:– Microscopio invertido

– Cámara de conteo de células

– Flujo laminar de características adecuadas al trabajo a desarrollar

– Sistema de filtración esterilizante de soluciones, líquidos y medios de cultivo

– Material de soporte estéril

– Espacio frío de 4, -20, -75 y –196ºC

– Estufas de cultivo con o sin atmósfera de CO2