CUESTIONARIO PRÁCTICA 3 1. Representa las rectas patrones para Bradford y Lowry .Calcula las

concentraciones de proteína de la muestra problema para ambos métodos , según los datos obtenidos en los experimentos realizados.

En la gráfica anterior puede verse en absicsas las concentraciones y en ordenadas las absorbancias. Se representa la recta patrón generada con los datos de las concentraciones y las absorbancias medidas. También se representa el valor de absorbancia igual a 0,994 calculada como la media aritmética de las tres mediciones realizadas con la muestra y la recta interpolada a partir del patrón que pasa por dicho punto. A partir de su ecuación empleando la absorbancia se calcula la concentración, obteniendo un valor de 0,6424 mg/ml

Se repite el mismo procedimiento de cálculo que en la cuantificación de Lowry con los datos de absorbancia obtenidos en este caso. Los resultados obtenidos son: la absorbancia de la muestra es de 0,418 y la concentración de 0,5162 mg/ml

2. Las réplicas de la muestra problema dan el mismo valor ? Por qué ?

No, dan diferente valor y con diferente variabilidad en el rango de medidas. En la cuantificación de Lowry la variación de las medidas observadas es de un 11,74 % .En cambio en la cuantificación de Bradford la variación es de 6,7 % .

Esta diferencia se debe a la mayor dificultad del procedimiento de Lowry que da lugar a errores en su ejecución, mientras que la variación observada en Braford es atribuible a la variabilidad estadística causada por errores de medición ,instrumentación ,etc …

3. Calcula el coeficiente de extinción molar (M-1.Cm-1) de la BSA y la concentración de la muestra problema, según los datos obtenidos mediante la lectura de la absorbancia a 280nm.

Según la ecuación de Lambert-Beer:A = .c. L, dondeꜪ

A: absorbancia : coeficiente de extinción, MꜪ -1 cm-1

L: longitud del medio (cubeta), cm

Calculamos del patrón BSA a partir de la concentración y la medición de la Ꜫabsorbancia: c= 0,25 mg/ml, A=0,0560,25 mg/l x 103ml/1l x 1g/103mg x 1 mol BSA/66.463 g = 3,76149x10-6M

= A/c.L = 0.056/3,76149x10Ꜫ -6 = 14.887 M-1 cm-1

Y a continuación calculamos la concentración de la muestra problema:c = A/ .L = 0,023/14.887 = 1,54x10Ꜫ -6 M 1,54x10-6 M x 66.463 = 0,1024 mg/ml

Los valores obtenidos presentan errores significativos:- El coeficiente de extinción de BSA es muy inferior al que se encuentra en la

literatura, que es de 43824 M-1 cm-1

- El error en la determinación de del patrón BSA se propaga al càlculo de la Ꜫconcentración obteniéndose un valor entre 5 y 6 veces inferior a los valores obtenidos con los otros métodos. Pero si se empleara el valor correcto de

, la concentración aún sería menor. Por tanto se deduce que el valor de lasꜪ absorbancias medidas presenta un error sistemático significativo.

4. Podríamos usar el valor E de la BSA para calcular la concentración de otra muestra de proteína desconocida?

No ya que el coeficiente de extinción molar es característico de cada proteína en condiciones definidas de longitud de onda, solvente y temperatura. También depende de las características del instrumento utilizado. Por esta razón, normalmente no se utilizan valores predeterminados del coeficiente de extinción para análisis cuantitativo. En su lugar, se utiliza una solución patrón con concentraciones conocidas de analito.

5. Describe el principio químico en el que se basan los métodos Bradford y Lowry. Porque usamos la longitud de onda de 750 nm para Lowry y 595 nm para Bradford?

El método Bradford se basa en el cambio de colorante en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas . Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina ) y aromáticos (mediante enlaces electrostáticos y de Wan der Waals), según el contenido de estas dos componentes la intensidad de absorción variará. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio del pico de absorción del colorante desde 465nm a 595nm . Por eso se emplea la longitud de onda a 595nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína ( por eso , en el blanco encontramos una coloración marrón)

En el método Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteína en el que el color azul fuerte lo crean 2 reacciones:

1) reducción de los iones Cu++ bajo condiciones alcalinas forma un complejo con enlaces péptidos de las proteínas y se reduce a Cu+ ( reacción Biuret )

2) Reducción del agente Folin-Ciocalteu por el complejo Cobre-Peptido que subsecuentemente provoca un cambio de color en la solución hacia azul con una absorción detectable en un espectrofotómetro en el rango de 650 a 750 nm . Por eso se emplea la longitud de onda de 750nm

6. Por qué usamos cubetas de metacrilato para medir absorbancias a 595 y 750nm ,y cubetas de cuarzo para medir la absorbancia a 280nm ?

Las cubetas de cuarzo se emplean para medir la absorbancia a 280nm porque por debajo de 320nm el cristal y los plásticos (metacrilato) absorben mayor parte de la luz y se interferiría en el resultado . En cambio , las de metacrilato son adecuadas para longitudes de onda entre 380 y 780nm.

7. Compara los resultados obtenidos para los tres métodos de cuantificación y discute sobre las posibles interferencias.

Una vez realizadas las 3 cuantificaciones se obtienen los siguientes resultados :

Bradford : 0,5161588 mg /ml de concentración problema Lowry: 0,642427 mg/ ml de concentración problema

Lambert –Beer : 0,102 mg/ml de concentración problema ( error en absorbancia ).

Discusión de resultados :Los métodos de Bradford y Lowry se han realizado siguiendo el procedimiento sin cometer errores importantes . Las réplicas de la muestra problema han sido parecidas sin observarse una dispersión importante de valores para una misma muestra. Sin embargo la propia dificultad procedimental, especialmente en el caso de Lowry, nos ha inducido a cometer pequeños errores que acumulados dan lugar a la diferencia de los valores.

Respecto el cálculo de la concentración de Lambert Beer se observa un resultado anómalo debido a las posibles interferencias en la metódica ,una mala ejecución del protocolo, fallos en la instrumentación o falta en la homogenización de los reactivos .. que han provocado que la absorbancia de las muestras fuera erróneo.

8. Haz una lista de ventajas y desventajas de los tres métodos :

Método de Bradford : Ventajas :

o Es muy sensible , puede detectar 1-20 µg de proteína o Es muy rápidoo Hay pocos materiales que interfierano No tiene incubacioneso Capacidad de identificar bastantes aminoácidos o Permite utilizar cubeta metacrilato.

Inconvenientes : o Los detergentes interfieren , incluso trazas de los productos de

limpieza pueden invalidar los resultados .o Depende fuertemente de la composición de los aminoácidos.o Tiñe las cubetas empleadas.

Método Lowry : Ventajas :

o Es bastante sensible y es capaz de detectar hasta 1 ug de proteína .

o Permite utilizar cubeta metacrilato. Inconvenientes :

o Requiere bastante tiempoo Algunas proteínas no responden al método.o Lo puede perturbar bastantes materiales, por ejemplo, sulfato

de amonio , glicina y mercaptanos.o El tiempo de incubación es critico

o Sensible a muchas interferenciaso Es más adecuado para comparar diversas soluciones de una

misma proteína que para realizar mediciones absolutas.Ecuación de Lambert Beer :

Inconvenientes : o La ley L-B solo es válida para soluciones diluidas porque para

concentraciones altas varia con la concentración debido aꜪ fenómenos de dispersión de la luz, cambios de medio, agregación de moléculas , etc.

o Requiere la utilización de cubetas de cuarzoo Se ve influenciada por interferencias de los materiales que

absorben UV Ventajas :

o Es un método rápidoo No se pierde la muestra utilizada

9. Discute el efecto del tween 20 , el SDS y del B- mercaptoetanol sobre los métodos de Bradford y de Lowry. Coinciden estos resultados con el listado de ventajas y desventajas de ambos métodos?

A continuación se da una tabla con las absorbancias obtenidas al añadir estos productos restando el valor de la absorbancia del blanco.

PRODUCTO BRADFORD LOWRYB-mercaptoetanol 0,037 0,105

Tween20 Interferencia elevada -0.073SDS 0,142 0,004

Blanco 0 0

El B-mercaptoetanol debido a su acción reductora rompe los puentes de disulfuro entre las proteínas y esto da lugar a una interferencia que es más significativa en el caso de Lowry que en Bradford.

Se puede comprobar que tal como indica la bibliografía los detergentes invalidan el empleo del método de Bradford ya que producen una interferencia elevada, principalmente el Tween 20. En el caso del SDS se nota menos debido a que el producto está bastante más diluido, aunque de todas formas se obtiene una absorbancia claramente superior al blanco. Por el contrario el método de Lowry es bastante robusto frente a la presencia de detergentes i las absorbancias son bastante similares a las del blanco. Estos resultados también son coherentes con la bibliografía.

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10. En el caso de que se necesitara cuantificar la concentración total de una mezcla de proteínas, qué método sería el más adecuado? por qué ?

En general el método más adecuado depende de la composición de la mezcla y sus propiedades, por ejemplo el espectro de absorción de la luz para identificar la longitud de onda más adecuada. En general el método de Lowry presenta una mayor sensibilidad pero es válido para un rango menor de proteínas que el método de Bradford. También es fundamental conocer los componentes de la mezcla para identificar posibles interferencias. Sin embargo, en caso de no disponer de ninguna información, el más adecuado sería el de Bradford por su mayor generalidad y porque el de Lowry es más adecuado para comparar diversas soluciones de una misma proteína que para realizar mediciones absolutas.