Cuando existe una deficiencia de alguno de los componentes del sistema inmune, apareciendo las enfermedades que llamamos inmunodeficiencias primarias. › Inmunodefiencias específicas .En ellas, el defecto se

circunscribe en general a un solo aspecto de la respuesta, por lo que se pueden catalogar en (si se afecta la parte específica de la respuesta inmunitaria, es decir los linfocitos B o T).

› Inmunodeficiencias inespecíficas: Si afectan a la porción inespecífica de la respuesta (células fagocíticas y complemento).

Con mayor frecuencia, la respuesta inmunitaria se afecta secundariamente a la aparición de otra patología (cáncer, enfermedades metabólicas, malnutrición etc.) o a la administración de drogas (drogas inmunosupresoras), hablamos entonces de inmunodeficiencias secundarias.

Son enfermedades en general poco frecuentes, que en su mayoría aparecen en la infancia y tienen un componente genético importante, habiéndose definido en muchas de ellas el modo de herencia y la localización cromosómica de la alteración

En ellas se afecta la parte específica de la respuesta inmunitaria (aquella capaz de reconocer al antígeno): los linfocitos T o B, o los anticuerpos.› Inmunodeficiencias

predominantemente de anticuerpos. › Inmunodeficiencias combinadas › Inmunodeficiencias asociadas a otros

defectos 

INMUNODEFICIENCIAS PREDOMINANTEMENTE DE

ANTICUERPOS.

Si se afecta solo la producción de anticuerpos hablamos de una inmunodeficiencia humoral, que puede afectar únicamente a la producción de anticuerpos de la clase IgA (deficit selectivo de IgA), a la producción de IgA e IgG (Sindrome de Hiper IgM) o a todas las clases de inmunoglobulinas (agammaglobulinemia ligada al sexo e inmunodeficiencia variable común).

Son las más frecuentes dentro de las inmunodeficiencias específicas (especialmente el deficit aislado de IgA), y también las menos graves y las que mejor responden al tratamiento

INMUNODEFICIENCIAS COMBINADAS 

En ellas se afectan los linfocitos B y T. Se presentan prácticamente desde el nacimiento con infecciones graves que ponen en peligro la vida, falta de desarrollo, linfopenia e hipogammaglobulinemia. Pueden confundirse con el SIDA trasmitido por la madre, debiéndose investigar por PCR la presencia de genoma viral.

SCID ligada al cromosoma X: debida a una mutación en la cadena gamma del receptor de la IL-2. Casi siempre se presenta con cifras normales de linfocitos B circulantes.

Deficit de adenosina deaminasa (ADA): debida a mutaciones o delecciones en el gen que codifica para este enzima. 

Deficit de purina-nucleosido fosforilasa (PNP). También debida a defectos en el gen que codifica para el enzima PNP. En ambos defectos enzimáticos la acumulación de metabolitos tóxicos afecta a los linfocitos impidiendo su proliferación; pero mientras que en el defecto de ADA se afectan tanto los linfocitos T como B, en el defecto de PNP se afectan preferentemente los linfocitos T.

Deficit de HLA clase II: Al faltar estas moléculas el reconocimiento del antígeno por los linfocitos T CD4+ no se puede realizar. El número total de linfocitos es normal pero las células T CD4+ están disminuidas, así como la producción de anticuerpos y las inmunoglobulinas del suero..

Disgenesia reticular: Producida por la falta de diferenciación de las células progenitoras de la médula osea hacia células linfoides y mieloides, por lo que además de linfopenia se observa neutropenia y trombocitopenia. La muerte suele ocurrir en este caso pocos dias despues del nacimiento.

INMUNODEFICIENCIAS ASOCIADAS A OTROS DEFECTOS 

En algunas enfermedades la inmunodeficiencia no es más que uno de los componentes del proceso:

1. Sindrome de Wiskott-Aldrich: Caracterizado clínicamente por inmunodeficiencia, eczema y trombocitopenia. Aparecen alteraciones en el citoesqueleto de los linfocitos T y de las plaquetas. Se conoce el gen defectuoso presente en el brazo corto del cromosoma X, que ha sido clonado y codifica para una proteina de 501 aminoacidos (WASP), pero la función de esta proteina aún se desconoce.

2. Ataxia-telangiectasia: Es un trastorno autosómico recesivo caracterizado por ataxia cerebelosa progresiva, dilataciones vasculares (telangiectasias) y una extrema sensibilidad a las radiaciones ionizantes que junto con una incidencia muy elevada de cáncer parecen depender de un defecto en los mecanismos de reparación del DNA.

3. Anomalía de Di George: Caracterizado por la aparición de múltiples anomalías en el desarrollo de la tercera y cuarta bolsas faringeas (aplasia del timo y las paratiroides y anomalías cardiovasculares severas).

Estas pueden ser por defecto del sistema del complemento o de células fagociticas principalmente,

Se han descrito defectos en prácticamente todos los componentes del sistema del complemento, aunque son poco frecuentes.

Todos tienen una herencia autosómica recesiva, y los heterozigotos pueden ser reconocidos por tener la mitad de los niveles normales del componente afectado. Tanto en el caso de los defectos de los primeros componentes de la vía clásica (C1q, C1r, C4 y C2), como en los defectos de los últimos (C5, C6, C7, C8 y C9) no se observa un aumento en el número de infecciones o el incremento es escaso, lo que indica que la vía clásica no es indispensable, y que la parte terminal de la cascada tampoco es esencial, existiendo una protección aceptable con la activación del C3 por cualquiera de las dos vías.

Además de las neutropenias, que pueden tener diversas causas, existen diversos defectos de las células fagocíticas (en general muy poco frecuentes) que pueden afectar a los fagocitos polimorfonucleares o mononucleares.

En la enfermedad granulomatosa crónica existe un defecto de la capacidad para producir la muerte intracelular de los microorganismos fagocitados al no producirse intermediarios reactivos del oxigeno.

En la enfermedad de Chediak-Higashi los lisosomas son deficientes en elastasa y catepsina G.

La respuesta inmunitaria puede afectarse secundariamente por numerosos factores. La afectación es en general difusa, aunque suele predominar el defecto de la respuesta celular, y de intensidad muy variable dependiendo del proceso primario.

En el tercer mundo la malnutrición es la causa más frecuente de inmunodeficiencia. En países desarrollados lo son las enfermedades metabólicas, los tumores, las enfermedades infecciosas y diversos tratamientos (drogas citotóxicas y corticosteroides fundamentalmente).

Entre los tumores, aunque en todos los casos de cáncer se acaba produciendo una inmunodeficiencia secundaria, aquellos que afectan a las células del propio sistema inmunitario (leucemias y linfomas) son los que ocasionan un trastorno más grave de la respuesta.

Numerosas infecciones, desde la lepra lepromatosa al paludismo producen un trastorno de la respuesta inmunitaria, pero son sin duda las infecciones por virus las que lo afectan más frecuentemente y con mayor intensidad. Aunque el prototipo ha sido siempre el sarampión, en la actualidad la infección por el HIV es la que supone un riesgo más importante, dada su frecuencia y su capacidad para producir una inmunodeficiencia (SIDA) que acaba con la vida del enfermo.

Se denomina inmune a aquél que habiendo padecido una infección, mantiene luego una defensa permanente contra los gérmenes que la provocaron.Esta inmunidad puede ser natural o adquirida y a su vez, activa o pasiva.Activa natural: producida por infecciones.

Activa artificial: producida por vacunas.

Pasiva natural: producida por pasaje transplacentario.

Pasiva artificial: producida por gammaglobulinas.

Inmunocompetente › Que es capaz de producir una respuesta

inmunitaria normal. Inmunodeficiente

› Tener un sistema inmunitario debilitado a causa de ciertas enfermedades o tratamientos.

Inmunodepresión › Debilitamiento del sistema inmunitario del

cuerpo y de su capacidad de combatir infecciones o enfermedades. La inmunodepresión se puede producir a propósito mediante medicamentos, como en la preparación para un trasplante de médula ósea o de otro órgano para prevenir el rechazo al tejido del donante. También puede ser el resultado de ciertas enfermedades como el SIDA o el linfoma, o de medicamentos contra el cáncer.

Aparece en el individuo tras la superación de una enfermedad, y se basa en la existencia de células de memoria. En primer lugar el patógeno estimula la producción de anticuerpos y de dichas células, quedando así inmunizado, en algunos casos de por vida. En posteriores infecciones, la respuesta inmune secundaria es mucho más intensa y más rápida, evitando así el desarrollo de la enfermedad. Ej: inmunidad tras pasar el sarampión y la varicela.

El feto queda inmunizado durante el embarazo al recibir a través de la placenta inmunoglobulinas, y durante la lactancia de los mamíferos, las crías reciben inmunoglobulinas A y G (IgA. IgG) contenidas en el calostro (primera leche). Es una protección TEMPORAL, entre seis meses y un año, ya que al cabo de este plazo los anticuerpos recibidos desaparecen y empieza a actuar el SI de la cría o bebé.

Esta técnica consiste en inyectar a un individuo infectado, un suero (plasma sin fibrinógeno) con Ac (gammaglobulinas) fabricados por otro organismo, por lo que se denomina pasiva). Por tanto, es una medida CURATIVA DE URGENCIA, y utiliza cuando el individuo necesita de forma inmediata los Ac. La vacunación tarda semana o meses en formar los Ac.

Sin embargo su efecto es TEMPORAL, a corto plazo, ya que el receptor no forma células con memoria, e incluso puede formar Ac contra ellos y los destruye. 

Hoy día hay gammaglobulinas contra el tétanos, rubeola, hepatitis A y B, botulismo, escarlatina y venenos de animales. Los primeros sueros eran de caballo, cabra, conejo,... y se extraían de animales infectados. El problema aparece por además de los Ac se inyectaban otras proteínas, que el donante las rechaza y provoca una respuesta no deseada. Por ello, el Ac se purifica y sólo se inyecta el Ac.

El individuo queda inmunizado al suministrarle en una inyección un preparado llamado VACUNA, que contiene antígenos. Estos provoca una respuesta inmune primaria, formando Ac (ACTIVO) y células con memoria. Esas últimas son las se activarán si se producen posteriores infecciones de dicho patógeno. Se basa por tanto en la especificidad antígeno-anticuerpo y en la memoria del Sistema inmune

Es una protección DURADERA, con efectos A LARGO PLAZO, por lo tanto es un método PREVENTIVO o PROFILÁCTICO, y hay que administrarla antes de que se produzca la infección. Ej: vacuna antigripal, que se administra sobre Noviembre. No tienen utilidad si el individuo ha desarrollado la infección

En algunas casos, la inmunización es permanente, (la duración de las células de memoria es muy larga), en otros hay que dar vacunas de refuerzo (en estos casos, las células de memoria desaparecen ) y hay que volver a inducir su formación.

Los antígenos que contienen las vacunas son diversos (cuatro tipos) › Patógenos muertos, como en la vacuna de la tos ferina, la fiebre

tifoidea y cólera (origen bacteriano) o antipolio Salk, o de la rabia (víricas). Estos patógenos conservan su capacidad inmunogénica (. Son las vacunas inactivadas. Precisan dosis de recurso o refuerzo.

› Patógenos atenuados, como en la de la polio, paperas, rubéola, viruela y sarampión, todas producidas por virus o de la tuberculosis (bacteriana). Su virulencia ha sido reducida. Son las vacunas atenuadas. Son muy inmunogénicas)

› Antígenos purificados, como toxinas modificadas del patógeno, y toxoides. Un toxoide es una forma inactiva de una toxina bacteriana pero con capacidad de provocar la síntesis de Ac, como la antitetánica y antidiftérica.

› Antígenos puros (normalmente proteínas), fabricados normalmente por I.G. (sintéticos). De esta manera se consigue evitar que aparezca la propia enfermedad (con las primera vacunas esto ocurría ocasionalmente), que haya inflamaciones u otras consecuencias. Ej: vacuna de la hepatitis B.

Las VACUNAS MÚLTIPLES contienen varios antígenos distintos al mismo tiempo, de esta manera se reduce el número de inyecciones que se pone a la población y preparados, ahorrando dinero.

Método originado en los laboratorios de George Stark en Stanford. El nombre de "western blot" fue dado a la técnica por W. Neal Burnette (Bioquímico Analítico, 112:195-203, 1981) en base a "Southern blot", técnica para la detención de ADN desarrolada con anterioridad por Edwin Southern. La detención de ARN es denominada Northern blotting.

La transferencia de proteínas o 'blotting' supone la inmovilización de las proteínas sobre membranas sintéticas, seguido de la detección empleando sistemas especialmente diseñados para la tinción de 'blots'. El método más potente es el denominado 'Western blot' en el que las proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel a una membrana.

El western blot es un método en biología molecular/bioquímica/inmunogenética para la detección de proteínas en una muestra de un tejido homogeneizado o extracto. Implementa gel electroforesis para separar proteínas desnaturalizadas de la masa. Las proteínas son transferidas desde el gel hacia la membrana (originalmente de nitrocelulosa), donde son examinadas utilizando anticuerpos específicos para la proteína. Como resultado, los investigadores pueden examinar la cantidad de proteínas en una muestra y comparar los niveles de presencia entre varios grupos.

Todo procedimiento de 'blotting' consta de 5 etapas : › Inmobilización de proteínas sobre la membrana ya sea

mediante transferencia (electroforética, aspiración, presión, ...) o mediante aplicación directa.

› Saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados para evitar la unión no específica de anticuerpos, que son proteínas.

› Incubación del 'blot' con anticuerpo primarios contra la/s proteína/s de interés.

› Incubación del 'blot' con anticuerpos secundarios, o reactivos que actúan de ligando del anticuerpo primario unidos a enzimas u otros marcadores.

› Las bandas de proteínas marcadas con enzimas se hacen visibles por incubación con los sustratos apropiados para formar productos coloreados insolubles en el lugar donde se encuentran las bandas de proteína.

El fundamento de la principal prueba confirmatoria de la actualidad, o Western blot (WB), es una discriminación de los antígenos del VIH frente a los que se dirigen los anticuerpos presentes en la muestra.Básicamente se basa en la separación de las proteínas (antígenos) obtenidas del VIH-1 procedentes del lisado del cultivo del virus y purificadas por centrifugación. La proteína viral así obtenida se coloca en un gel de poliacrilamida en forma de láminas delgadas y luego se efectúa una electroforesis con la que las proteínas de menor peso molecular (p17, p24) emigran más lejos en el gel mientras que las de mayor peso molecular se mantienen cerca de su lugar de depósito. Después se transfieren a una tira de nitrocelulosa y se cortan en tiras de unos 5 mm de ancho. Estas son las tiras que se exponen al suero humano diluido, después de una incubación se lavan y se vuelven a incubar con una IgG antihumana marcada con una enzima que con la exposición a un revelador enzimático producirá una banda coloreada en las zonas correspondientes a los anticuerpos específicos que contenga la muestra.

La técnica ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente.

Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal : es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.

Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas,...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las

siguientes :› Conjugación del anticuerpo o del antígeno

con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.

› Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.

› Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.

› Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.

La Reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1985 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causante de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (94 ºC en algunos momentos) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras con corrección de errores (Pfu, Vent).

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador

Para realizar la técnica se necesitan:› Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar

nuevo ADN. › Dos cebadores (o primers), oligonucleótidos que son, cada uno,

complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia (no más de 4 kb. Delimitan la zona de ADN a amplificar.

› Iones de magnesio (Mg 2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. Éste es un cofactor de la polimerasa.

› Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.

› ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas (la más común es la Taq polimerasa). También llamado DNA problema

› ADN molde, que es la muestra que se va a amplificar. › Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria

en cada paso del ciclo.

Ciclo de amplificación La PCR básica consta de un primer paso de calentamiento hasta 94-95ºC durante 5-10 minutos, en el cuál se activa la ADN polimerasa, en caso de necesitarlo. Posteriormente tiene tres pasos que se repiten muchas veces dependiendo de lo que se vaya a realizar:

1. DesnaturalizaciónEn primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la denaturación depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.

2. Unión del cebadorA continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para esto es necesario que la temperatura descienda (generalmente, a 55 ºC, aunque se puede variar según sea el caso entre 45ºC y 65ºC). Estos cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

3. Extensión de la cadenaPor último actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. Se aumenta la temperatura hasta 72 ºC (para la Taq Polimerasa), temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su máximo de actividad, aumentando geométricamente la cantidad de fragmentos de ADN en la muestra.

Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensión de la cadena a la temperatura óptima de la ADN polimerasa, normalmente 72ºC, para finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su conservación.

Las técnicas de inmunofluorescencia directa permiten la detección de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM) y fracción 3 del complemento, sobre tejido congelado. Sus aplicaciones más comunes son el estudio de enfermedades ampollosas o inmunitarias sobre biopsia cutánea y la clasificación de glomerulopatías en biopsia renal. Los resultados deben interpretarse siempre en conjunto con los hallazgos de microscopía óptica y la información clínica.

Para la clasificación de enfermedades ampollosas, debe efectuarse la biopsia en la piel eritematosa perilesional. Puede ser, además, de utilidad el estudio de la fractura osmótica de la unión dermoepidérmica, que consiste en provocar un clivaje hiperosmolar subepidérmico a nivel de la lámina lúcida y detectar posteriormente “in situ” la localización de las inmunoglobulinas en el techo o en el suelo del clivaje. En los casos de lupus eritematoso, debe obtenerse biopsia de la lesión y para el “lupus band test”, debe biopsiarse piel sana de áreas no fotoexpuestas.

Las muestras de biopsia renal, sólo serán valorables si contienen glomérulos.

En general, todas las muestras para inmunofluorescencia deben remitirse al laboratorio lo antes posible, en fresco, humedecidas con suero o PBS para evitar su desecación. Antes y durante el transporte, pueden mantenerse en nevera (2-8º), pero nunca en congelador.