8/14/2019 Cro Protein-DNA Interactions

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 9 , p p . 8 1 8 0 - 8 1 8 4 , S e p t e m b e r 1 9 9 2B i o c h e m i s t r y

T h e r m o d y n a m i c s o f C r o p r o t e i n - D N A i n t e r a c t i o n s( e n t h a l p y / e n t r o p y / h e a t c a p a c i t y c h a n g / c a l o r m t r y / D N A s e q u e n c e r e c o n )

Y O S H I N O R I T A K E D A * , P H I L I P D . R o s s t , AND COURTNEY P . MUDDt* L a b o r a t o r y o f M o l e c u l a r B i o l o g y , N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e - F r e d e r i c k C a n c e r R e s e a r c h F a c i l i t y , P r o g r a m R e s o u r c e s I n c . , F r e d e r i c k , MD 2 1 7 0 1 ; t L a b o r a t o r yo f M o l e c u l a r B i o l o g y , N a t i o n a l I n s t i t u t e o f D i a b e t e s a n d D i g e s t i v e a n d K i d n e y D i s e a s e s ; a n d t B i o m e d i c a l E n g i n e e r i n g a n d I n s t n r m e n t a t i o n P r o g r a m , N a t i o n a lC e n t e r f o r R e s e a r c h R e s o u r c e s , N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h , B e t h e s d a , MD 2 0 8 9 2C o m m u n i c a t e d b y W i l l i a m A . H a g i n s , May 5 , 1 9 9 2 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w F e b r u a r y 1 5 , 1 9 9 1 )ABSTRA CT U s i n g a h i g h l y s e n s i t i v e p u l s e d - f l o w m i c r o c a l -o r i m e t e r , w e h a v e m e a s u r e d t h e c h a n g e s I n e n t h a l p y a n dd e t e r m i n e d t h e t h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s AH, A S , A G ,a n d A C p f o r C r o p r o t e i n - D N A a s o a t i o n r e a c t i o n s . T h e r e a c -t i o n s s t u d i e d i n c l u d e sequeno i f i c DNA a s i a t i o n a n ds e q u e n c e - s p e c i f i c DNA a s c i a t i o n s i n v o l v i n g s i n g l e - a n d m u l t i -p l e - b a s e a l t e r a t i o n s a n d / o r s i n g l e - a m i n o a c i d a l t i m u -t a n t s . ( i ) T h ea i o f C r o p r o t e i n w i t h n o n s p e c i f i c DNAa t 1 5 0 C i s c h a r a c t e r i z e d b y AH = + 4 . 4 k c a l - n o t ' ( 1 c a l =4 . 1 8 J ) , A S O = 4 9 c a l ' m o l - l K ' 1 , AGO = - 9 . 7 k c a l o m d - l , a n dA C p 0 ; t h e atin w i t h s p e c i f i c h i g h - a f f n i t y o p e r a t o rO R3 DNA i s c h a r a c t e r i z e d b y AH = + 0 . 8 k c a l i m o l - 1 , A S O =5 9 c a l m o l - l ' K ' 1 , AGO = - 1 6 . 1 k c a l m o l - 1 , a n d A C , = - 3 6 0c a l m o l l K - ' , r e s p e c t i v e l y , . B o t h n o n s p e c i f i c a n d s p e c i f i c C r o -DNA a s o i a t i o n s a r e e n t r o p y - d r i v e n . ( i i ) P l o t s o f AH v s . A C pa n d AS v s . A C p f o r t h e 2 0 sin r e a c t i o n s s t u d i e d f a g i n t ot w o c o r r e l a t i o n g r o u p s w i t h l i n e a r s l o p e s o f + 9 . 4 K a n d - 2 0 . 5K a n d o f - 0 . 0 3 a n d - 0 . 1 4 , r e s p e c t i v e l y . T h e s e r nl i n e sh a v e common i n t e r c e p t s , a t t h e AH a n d A S O v a l u e s o f n o n s p e -c i f i c a s s o c a t i o n ( w h e r e A C p = 0 ) . T h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e r ea r e , a t l e a s t , t w o d i s t i n c t c o n f o r m a t i o n a l s u b c l a s s e s i n s p e c i f i cC r o - D N A c o m p l e x e s , s t b i z e d b y d i f f e r e n t c o m b i n a t i o n s o fe n t h a l p i c a n d e n t r o p i c c o n t r i b u t i o n s . T h e AGO a n d A C , v a l u e sf o r m a n a p p r o x i m a t e l y s i n g l e l i n e a r c o r r e l a t i o n g r o u p a s ac o n s e q u e n c e o f c o m p e n s a t o r y c o n t r i b u t i o n s f r o m AH a n d AS"t o AGO a n d t o A C p . C r o p r o t e i n - D N A asiatis s h a r e s o m es i m i l a r t h e r m o d y n a m i c p r o p e r t i e s w i t h p r o t e i n f o l d i n g , b u tt h e i r o v e r a l l e n e r g e t i c s a r e q u i t e d i f f e r e n t . A l t h o u g h t h e n o n -s p e c i f i c c o m p l e x i s s t a b l i p r e d o m i n a n t i y b y e l e c t r o s t a t i cf o r c e s , i t a p p e a r s t h a t H b o n d s , v a n d e r W a a l s c o n t a c t s ,h y d r o p h o b i c e f f e c t s , a n d c h a r g e i n t e r a c t i o n s a l l c o n t r i b u t e t o t h es t a b i l i t y ( A G O a n d A C p ) o f t h e s p e c i f i c c o m p l e x . ( M i ) T h ev a r i a t i o n s i n t h e v a l u e s o f t h e t h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s a r e i ng e n e r a l a c c o r d w i t h o u r k n o w l e d g e o f t h e s t r u c t L r e o f t h eCro-DNA c o m p l e x .C r o p r o t e i n r e p r e s e n t s a p r o t o t y p e o f D N A - b i n d i n g p r o t e i n sw i t h a h e l i x - t u r n - h e l i x s t r u c t u r e a s a s p e c i f i c DNA-r e c o g n i t i o n m o t i f ( 1 - 4 ) . R e c e n t d e t e r m i n a t i o n o f t h e t h r e e -d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f a C r o p r o t e i n - D N A c o m p l e x ( 5 )s h o w s t h a t t h e p e r t i n e n t h e l i x - t u r n - h e l i x . s t r u c t u r e i s , i n f a c t ,u s e d f o r DNA b i n d i n g , a s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d f o r o t h e rD N A - b i n d i n g p r o t e i n s , s u c h a s 4 3 4 r e p r e s s o r ( 6 ) , 4 3 4 C r o ( 7 ) ,A r e p r e s s o r ( 8 ) , t r p r e p r e s s o r ( 9 ) , a n d C AP p r o t e i n ( 1 0 ) .A n a l y s e s o f t h e s e s t r u c t u r e s ( 1 - 1 2 ) s u g g e s t t h a t t h e i m p o r t a n tf e a t u r e s i n D N A - s e q u e n c e r e c o g n i t i o n a r e a s n u g f i t b e t w e e np r o t e i n a n d DNA s t r u c t u r e s , r e s u l t i n g H b o nd s a nd v a n d e rW a a l s c o n t a c t s b e t w e e n a m i n o a c i d s a n d e d g e s o f DNAb a s e s , a n d p h o s p h a t e i n t e r a c t i o n s . To u n d e r s t a n d how p r o -t e i n r e c o g n i z e s s p e c i f i c DNA s e q u e n c e s , h o w e v e r , we m u s tu n d e r s t a n d t h e e n e r g e t i c s o f DNA b i n d i n g a l o n g w i t h t h e

s t r u c t u r e b e c a u s e t h e s p e c i f i c i t y o f DNA a s s o c i a t i o n i su l t i m a t e l y d e t e r m i n e d b y t h e f r e e e n e r g y .T a k e d a e t a l . ( 1 3 ) h a v e r e p o r t e d t h e e f f e c t s o f s y s t e m a t i cb a s e s u b s t i t u t i o n s u p o n t h e f r e e e n e r g y o f Cro-DNA a s s o -c i a t i o n s . E x a m i n a t i o n o f t h e s e d a t a i n r e l a t i o n t o t h e s t r u c -t u r e o f t h e Cro-DNA c o m p l e x r e v e a l e d t h a t t h e l o c a t i o n s o ft h e c h a n g e s i n t h e f r e e e n e r g y o f b i n d i n g c o i n c i d e d w i t h t h el o c a t i o n s o f t h e s p e c i f i c a m i n o a c i d - n u c l e i c a c i d b a s e c o n -t a c t s . T h i s r e s u l t s u g g e s t e d t h a t t h e s e q u e n c e r e c o g n i t i o n b yC r o r e p r e s s o r i s m e d i a t e d p r i m a r i l y b y t h e s e d i r e c t a m i n oa c i d - b a s e c o n t a c t s - e . g . , s p e c i f i c H b o n d s a n d v a n d e rW a a l s c o n t a c t s . H o w e v e r , w h e n b a s e s u b s t i t u t i o n w a sc l e a r l y b r e a k i n g a H b o n d o r v a n d e r W a a l s c o n t a c t b e t w e e np r o t e i n a n d DNA, t h e a m o u n t o f o b s e r v e d f r e e e n e r g y c h a n g ea t t r i b u t a b l e t o t h a t p e r t u r b a t i o n w a s u n c l e a r b e c a u s e s i g n i f -i c a n t c o n t r i b u t i o n s t o A G 0 m i g h t come f r o m o t h e r s o u r c e s -e . g . , c h a n g e s i n p h o s p h a t e i n t e r a c t i o n s a n d l o c a l o r g l o b a lh y d r o p h o b i c e f f e c t s .T h u s , t o g a i n i n s i g h t i n t o t h e o r i g i n s o f AG' i n Cro-DNAa s s o c i a t i o n a n d u n d e r s t a n d t h e f o r c e s s t a b i l i z i n g t h e c o m -p l e x , w e h a v e m e a s u r e d AH v a l u e s a n d d e t e r m i n e d t h et h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s , A G ' , AH, A S 0 , a n d A C p , f o r t h ea s s o c i a t i o n s o f C r o p r o t e i n w i t h n o n s p e c i f i c DNA, a s s o c i a -t i o n s w i t h s p e c i f i c o p e r a t o r DNA, a n d t h e a s s o c i a t i o n si n v o l v i n g a v a r i e t y o f d e f i n e d s i n g l e - b a s e a n d / o r s i n g l e -a m i n o a c i d a l t e r a t i o n m u t a n t s . T h e s e s t u d i e s s u g g e s t , a l -t h o u g h i t i s n o t o b v i o u s f r o m A G ' , a t l e a s t t w o t h e r m o d y -n a m i c a l l y d i s t i n c t t y p e s o f s p e c i f i c Cro-DNA a s s o c i a t i o n s :o n e p r o c e e d i n g w i t h a more f a v o r a b l e A H , a n d t h e o t h e rp r o c e e d i n g w i t h a l e s s f a v o r a b l e AH t h a n t h a t a c c o m p a n y i n gn o n s p e c i f i c - D N A a s s o c i a t i o n . We d i s c u s s t h e s i g n i f i c a n c e o ft h e s e f i n d i n g s i n t e r m s o f p r o t e i n - D N A r e c o g n i t i o n .

MATERIALS AND M E T H O D SDNAs a n d P r o t e i n s . A l l DNAs u s e d w e r e 2 1 - b a s e - p a i r ( b p )s y n t h e t i c DNAs ( 1 3 ) . C r o p r o t e i n b i n d s t o 1 7 - b p DNA,l o c a t e d i n t h e m i d d l e o f t h e f o l l o w i n g s e q u e n c e s : O R 3 ,T T T AT C C C T T GC GGT GAT AAA; O R 1 , T T TAC C T C T G-GCGGTGATAAA; # 4 , TAAAACACCTCACGAGTTAAT;# 5 , TAAAT CAC T C C C GGG TATAT T; # 1 0 , T GGAAC -C C A C C G A G T G A A A G T ; a n d # 1 1 , T C C G T C A C C G C -

CAGTTAATCT. O p e r a t o r DNAs OR3 a n d OR 1 h a v e t h eh i g h e s t - a n d t h e t h i r d - h i g h e s t - a f f i n i t y f o r C r o , r e s p e c t i v e l y .DNAs #4 a n d # 5 a r e n o n o p e r a t o r DNA w i t h i n t e r m e d i a t ea f f i n i t y . DNAs # 1 0 a n d # 1 1 a r e n o n s p e c i f i c DNA. S i n g l e -b a s e s u b s t i t u t i o n m u t a n t DNAs a r e a l l d e r i v a t i v e s o f OR3 a n da r e l i s t e d i n T a b l e 1 b e l o w . T h e s e DNAs w e r e 7 0 - 1 0 0 % 6a c t i v e i n DNA b i n d i n g ( t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e w i l l b ep u b l i s h e d e l s e w h e r e ) . P u r i f i e d C r o p r o t e i n was 1 0 0 % a c t i v e .M e a s u r e m e n t o f E nt h a l p y C h a ng e . T h e p u l s e d - f l o w m i c r o -c a l o r i m e t e r d e s c r i b e d b y Mudd a n d B e r g e r ( 1 4 ) was u s e dw i t h b e t t e r t h a n 1 - p J r e s o l u t i o n . I n e a c h e x p e r i m e n t , 8 0 p I o fC r o p r o t e i n ( 7 x 1 0 - 1 0 m o l ) i n 0 . 1 M K C l p l u s 0 . 0 1 M K P O 4b u f f e r a t pH 7 was m i x e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f t h e s a m es o l u t i o n c o n t a i n i n g a 3 0 % o m o l a r e x c e s s o f DNA. T w e n t ys u c h r u n s w e r e a v e r a g e d , a n d t h e t h e r m a l - m i x i n g a r t i f a c t was8 1 8 0

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

8/14/2019 Cro Protein-DNA Interactions

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 9 ( 1 9 9 2 ) 8 1 8 1T a b l e 1 . T h e r m o d y n a m i c parameters o f Cro-DNA a s s o c i a t i o nr e a c t i o n s a t 1 5 ' C

P r o t e i n DNA - A G ' 5 * A H 1 5 t A S 1 s t - A C p , 1 5 C r o g I n 2 7( w i l d t y p e )

E x p . 1 # 1 1 9 . 7 4 4 0 0 4 9 1 0E x p . 2 # 1 0 9 . 8 4 3 0 0 4 9 1 0E x p . 3 # 5 1 3 . 0 2 8 0 0 5 5 1 5 0E x p . 4 #4 1 3 . 5 3 0 0 0 5 7 2 1 0E x p . 5 O R 1 1 5 . 4 1 2 0 0 5 8 3 3 0E x p . 6 O R 3 1 6 . 1 8 0 0 5 9 3 6 0E x p . 7 O R 3.2AU 1 6 . 0 1 2 0 0 6 0 3 5 0E x p . 8 O R 3 . 2TA 1 2 . 3 7 9 0 0 7 0 1 5 0E x p . 9 O R 3 .2UA 1 0 . 3 5 7 0 0 5 5 4 0E x p . 1 0 OR3.2GC 1 0 . 5 4 2 0 0 5 1 1 2 0E x p . 1 1 OR3.2CG 1 0 . 2 4 3 0 0 5 1 1 0E x p . 1 2 O R 3 . 4 G C 1 3 . 1 3 1 0 0 5 6 2 6 0E x p . 1 3 O R 3 . 4 A T 1 2 . 2 5 8 0 0 6 3 1 2 0E x p . 1 4 OR3.SAU 1 4 . 5 2 1 0 0 5 8 2 6 0C r o v a l 2 7E x p . 1 5 OR3 1 1 . 7 5 7 0 0 6 0 1 3 0E x p . 1 6 O R 3 . 2A U 1 1 . 6 4 7 0 0 5 7 6 0E x p . 1 7 O R 3 .2TA 1 4 . 0 8 9 0 0 7 9 1 9 0E x p . 1 8 O R 3 . 2U A 1 2 . 2 7 3 0 0 6 8 9 0E x p . 1 9 O R 3 . 2 G C 1 0 . 3 5 0 0 0 5 3 5 0E x p . 2 0 O R 3 . 2 C G 1 0 . 3 4 9 0 0 5 3 0S o l v e n t w a s 0 . 1 M K C I / 0 . 0 1 M KPO4 b u f f e r , pH 7 . A H 1 5 a n dA C p , 1 5 w e r e d e t e r m i n e d from r e p e a t e d measurements o f AH ( 3 0 0c a l - 1 - m o l - 1 ) a t tw o t o f o u r temperatures b e t w e e n 4 0 a n d 2 0 0 C . A G ' 1 sw a s c a l c u l a t e d by Eq. 1 from AGo ( 0 . 1 k c a l m o l - 1 ) d e t e r m i n e d byt h e f i t e r - b i n d i n g a s s a y ( 1 3 ) , which d e f i n e s t h e s t a nd a r d - s t a t e con-d i t i o n s ( s u p e r s c r i p t ) . AA S l w a s o b t a i n e d f o r m A G l 5 a n d A H 1 5 . T h eo p e r a t o rOR3 s e q u e n c e i s pseudo p a l i n d r o m i c , t o w h i c h t h e C r od i m e r b i n d s b y f i t t i n g t h e 2 - f o l d sym metry e l e m e n t o f t h e p r o t e i n( r e f s . 1 - 5 , 1 3 ) . T o s t u d y e f f e c t s o f e s s e n t i a l l y i d e n t i c a l i n t e r a c t i o n so c c u r r i n g a t t w o 2 - f o l d r e la t ed p o s i ti o n s s i m u l t a ne o u s l y , a l l b a s e -s u b s t i t u t i o n m u t a n t s c a r r y tw o a l t e r a t i o n s a t 2 - f o l d r e l a t e d p o s i t i o n s ,e x c e p tO R 3.5AU. Because t h e 1 7 - b p operator sequence i s l o c a t e d i nt h e m i d d l e o f t h e 2 1 - b p DNA u s e d , b a s e - p a i r p o s i t i o n s are numberedf r o m t h e t h i r d b a s e . T h u s , mutantO R 3 . 2 T A , O R 3 . 4 A T , a n dO R 3 . 5 A U , r e s p e c t i v e l y , h a v e t h e sequences TTTTTCCCTTGCG-

GT GAAAAA, TTTATACCTTGCGGTTATAAA, a n d T T T A T C -C C T T GC GGUGATAAA ( b a s e a l t e r a t i o n s f r o mOR3 a re u n d e r -l i n e d ) . N o m e n c l a t u r e and b a s e a l t er a t i o ns f o r t h e o t h e r DNAs f o l l o wt h e s a m erule.* U n i t s f o r A G ' ar e k c a l m o l - 1 .t U n i t s f o r AH a r e c a l m o l - 1 .* U n i t s f o r AS a r e c a l m o l - l K - 1 . U n i t s f o r A C p a r e c a l m o l - l K - 1 .s u b t r a c t e d . T he e n t h a l p i e s o f d i l u t i o n o f b o t h Cro a n d DNAw e r e z e r o w i t h i n e x p e r i m e n t a l erro r. T h e m o l a r e n t h a l p yc h a n g e , AH, o f t h e Cro-DNA a s s o c i a t i o n was c a l c u l a t e d ont h e b a s i s o f a d d e d p r o t e i n a nd h ad an e s t i m a t e d u n c e r t a i n t yo f 300 c a l m o l - 1 .

R E S U L T SC a l o r i m e t r i c D e t e r m i n a t i o n o f E n t h a l p y and Heat C a p a c i t yC h a n g e s . F i g . 1 shows measured A H v a l u e s as a f u n c t i o n o ft e m p e r a t u r e f o r t h e a s s o c i a t i o n o f C ro p r o t e i n w i t h nonspe-c i f i c DNA # 1 1 , s p e c i fi c h i g h - af f i ni t y operator DNAOR3,a n d s p e c i f i c n o n o p e r a t o r DNA # 5 w i t h an i n t e r m e d i a t ea f f i n i t y . A n o t h e r s e t o f DNAs o f s i m i l a r r e s p e c t i v e a f f i n i t i e s( 1 3 ) g a v e n e a r l y i d e n t i c a l v a l u e s o f AH from 4 0 C t o37C-i . e . , # 1 0 = # 1 1 , # 4 = # 5 , and OR1 OR3 ( d a t a not s h o w n ,b u t a l l t h e r m o d y n a m i c parameters a t15C f o r t h e s e DNAsa r e r e p o r t e d i n Table 1 ) . S e v e r a l l i n e s o f e v i d e n c e suggestt h a t t h e c u r v a t u r e a n d i n c r e a s i n g l y e x o t h e r m i cAHa l u e so b s e r v e d w i t h a l l t h e DNAs a b o v e 2 5 0 C ( F i g . 1 ) a r i s e p r i -m a r i l y f r o m t h e r e na t u r a ti o n o f p a r t i a l l y u n f o l d e d C r o pro-t e i n . ( i ) W i l d - t y p e Cro p r o t e i n s t a r t s m e l t i n g a t - 2 5 0 C , a n d i t s

+ 1 L

0

0E-10

- 20~ 1- 3 0

l t v 1 0 2 0T ( O C ) 3 0F I G . 1 . AH v a l u e s o f Cro-DNA association reactionsf u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e . S o l v e n t was 0 .1 MKCl/0.01MPO4b u f f e r , pH 7 . n, N o n s p e c i f i c DNA # 1 1 ; A, specific nonoperator# 5 ;o, s p e c i f i c operator DNAOR3.

d e n a t u r a t i o n i s c o m p l e t e l y reversible (Fig. 2). TheCro-0R3DNA c o m p l e x m e l t s above 7 0 T C (Fig. 2) . Thus, if partiallyd e n a t u r e d C r o i s mixed with DNA, i t would probably rena-t u r e e x o t h e r m i c a l l y t o form a heat-stableCro-DNAcomplex.( i i ) T h e a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n mutant of Cro protein,C r o v a 2 7 , h a s 1 0 T C g r e a t e r thermo-stability than wild-typeC r o p r o t e i n . T h e i n c r e a s i n g l y exothe rm icAHhangesinthea s s o c i a t i o n s o f C r o , . 1 2 7 with DNAsare accordingly shiftedtoo 1 0 T C higher temperatures (data notshown).Becausei m p o s s i b l e t o account quantitatively for contributionstotheo b s e r v e d AH f r o m p a r t i a l unfolding, we useAHandACpd e t e r m i n a t i o n s o n l y i n t h e r e g i o n below 2 0 T C tomeasurethei n t r i n s i c a s s o c i a t i o n r e a c t i o n b e t ween Croprotein andDNA.C o m p a r i s o n o f A G ' , AH, a nd TAS' for Nonspecific andS p e c i f i c A s s o c i a t i o n . AlthoughACp varies with temperature,b e l o w 2 0 T C t h e temperature-dependent variation inACpve ry s m a l l ( F i g . 1 ) , and t h e t her m odyna m ic parameters att e m p e r a t u r e T s 2 0 T C ) can b e expressed by

AHT=A H O +ACp(T- )A S T =AS + A C p l n ( T / 0 )A G ; =AGO + A C p [ ( T 6) T l n ( T / 0 ) ] ,

00(0

I)

0nnnxw

0 . 20.0- . 2 --.4--.6-

*0 20 0 60T ( C O )

80 100

F I G . 2 . T h e r m a l d e n a t u r a t i o n o f C r o p r o t e i n a n d t h e C r o - 0 R 3DNA c o m p l e x m o n i t o r e d b y d i f f e r e n t i a l s c a n n i n g c a l o r i m e t r y . T o pand m i d d l e cur ves r e p r e s e n t f i r s t a n d f o u r t h h e a t i n g , r e s p e c t i v e l y , o fC r o p r o t e i n ( 2 . 2 m g / m i i n 0 . 1 M K C I / 0 . 0 1 M KPO4 b u f f e r , pH 7 ) .Bottomcurverepresents Cro-0R3DNAcomplex at 10-foldlowerc o n c e n t r a t i o n . D a t a w e r e o b t a i n e d w i t h a M i c r o c a l ( A m h e r s t , MA)MC-2 c a l o r i m e t e r a t a scan rate of 60 K/hr.

# 1 1

# 5

O R 3

B i o c h e m i s t r y : T a k e d a e t a l .

8/14/2019 Cro Protein-DNA Interactions

3/5

P r o c . N a d l . A c a d . S c i . USA 8 9 ( 1 9 9 2 )w h e r e 0 d e n o t es a r e f e r e n c e t e m p e r a t u r e . T h e s t a n d a r d f r e ee n e r g y c h a n g e , A G ' , i s c a l c u l a t e d f r o m t h e e q u i l i b r i u ma s s o c i a t i o n c o n s t a n t K a b y AG0 = - R T I n K a .W i t h t h e AH a n d A C p v a l u e s o f F i g . 1 a n d t h e K a v a l u e s o f1 . 4 x 1 0 7 M - 1 a n d 1 . 0 x 1 0 1 2 M - 1 d e t e r m i n e d p r e v i o u s l y b yf i l t e r - b i n d i n g a s s a y a t 0 0 C f o r a s s o c i a t i o n o f C r o w i t h # 1 1 a n dO R3 DNA ( 1 3 ) , r e s p e c t i v e l y , v a l u e s o f t h e r m o d y n a m i c p a -r a m e t e r s a t 5 0 i n t e r v a l s w e r e c a l c u l a t e d . T h e s e v a l u e s w e r eu s e d t o i l l u s t r a t e t h e t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t c h a n g e s i n A G ,AH , a n d T A 5 0 f o r t h e n o n s p e c i f i c a n d s p e c i f i c DNA a s s o -c i a t i o n ( F i g . 3 ) . F o r b i nd i ng o f C r o t o n o n s p e c i f i c DNA # 1 1b e t w e e n 4 0 C a n d 2 0 0 C , AH +4 k c a l m o l - 1 a n d A C p 00c a l - m o l - l K - 1 . I n c o n t r a s t , AH f o r t h e s p e c i f i c C r o - 0 R 3DNA a s s o c i a t i o n d e c r e a s e s w i t h i n c r e a s e d t e m p e r a t u r e w i t hA C p = - 3 6 0 c a l - m o l ' l K - 1 . AG0 i s n e a r l y t e m p e r a t u r e -i n v a r i a n t i n b o t h c a s e s . B o t h t h e n o n s p e c i f i c a n d s p e c i f i cDNA a s s o c i a t i o n s a r e e n t r o p y - d r i v e n . ,E f f e c t s o f S i n g l e B a s e a n d / o r S i n g l e A m i n o A c i d A l t e r a t i o nM u t a n t s o n t h e T h e r m o d y n a m i c P a r a m e t e r s o f S p e c i f i c A s s o -c i a t i o n s . A l t h o u g h t h e s e r e s u l t s p r o v i d e a g e n e r a l p i c t u r e o ft h e o v e r a l l t h e r m o d y n a m i c b e h a v i o r o f Cro-DNA a s s o c i a -t i o n s , t h e DNAs u s e d c o n t a i n t o o m a n y b a s e a l t e r a t i o n s f o rd e t a i l e d a n a l y s i s . To g a i n i n s i g h t i n t o t h e e n e r g e t i c s o fs p e c i f i c Cro-DNA a s s o c i a t i o n , we s t u d i e d t h e e f f e c t s o fv a r i o u s s i n g l e - b a s e a n d / o r s i n g l e - a m i n o a c i d a l t e r a t i o n m u -t a n t s o n A G 0 , AH , T A S 0 , a n d A C p . M u t a n t DNAs a r e a l ld e r i v a t i v e s o f O R3 ( T a b l e 1 ) . A m u t a n t p r o t e i n , C r o * , U 7 , i s ap r o d u c t o f a s p e c i f i c i t y m u t a n t t h a t c h a n g e s b a s e - r e c o g n i t i o ns p e c i f i c i t y ( Y . T . , u n p u b l i s h e d w o r k ) . T h e s e DNA a n d p r o -t e i n m u t a n t s d i s r u p t a f e w H b o n d s o r a v a n d e r W a a l s c o n t a c ta t s p e c i f i c l o c a t i o n s i n t h e b i n d i n g r e g i o n w i t h i n t h e c o m p l e x ,t h e re b y r e d u c i ng b i n d i n g a f f i n i t y ( s e e F i g . 4 ) . V a l u e s o f t h et h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s a t 1 5 0 C a r e r e p o r t e d i n T a b l e 1 .E x a m i n a t i o n o f T a b l e 1 r e v e a l s t h a t A H , A S ' , a n d A G 0 a l lc o r r e l a t e w i t h A C p ( F i g . 5 ) . P l o t s o f AH a n d A S 0 v s . A C p( F i g . 5 a a n d b ) s h o w t h a t t h e 2 0 Cro-DNA a s s o c i a t i o n ss t u d i e d f a l l i n t o t w o c o r r e l a t i o n g r o u p s : t h e a s s o c i a t i o n s o fw i l d - t y p e C r o w i t h O R 3 , O R 3 . 2 A U , O R 1 , O R 3 . 5 A U ,O R 3 . 4 G C , # 4 , # 5 , 0 R 3 . 2 G C , a n d O R 3 . 2 C G m a k e u p o n eg r o u p ( g r o u p I ) , w h e r e a s t h e a s s o c i a t i o n s o f C r o v l 2 7 w i t h a l lt h e DNAs t e s t e d ( O R 3 , O R 3 . 2 A U , 0 R 3 . 2 T A , O R 3 . 2 U A ,O R 3 . 2 G C , a n d O R 3 . 2 C G ) a n d t h e a s s o c i a t i o n s o f w i l d - t y p eC r o w i t h O R 3 . 2 T A , O R 3 . 2 U A , a n d O R 3 . 4 A T m a k e u pa n o t h e r g r o u p ( g r o u p I I ) . T h e l i n e a r c o r r e l a t i o n s b e t w e e n AHa n d A C p ( F i g . 5 a ) o r b e t w e e n A S 0 a n d A C p ( F i g . S b ) f o r t h et w o g r o u p s a r e g i v e n b y :

+20

0

J9

Uzw U

+ 1 0 l T AS

AH

1 0 o _ AG

- 200 1 0 2 0 0

T ( O C )1 0 2 0

5 ' 3 '- 9 G A C * 9N i 06 N4

- 8 C - I- I - G + 8*

- 7 G-A-C7N . 2 f y H 2 A r g 3 8

- 6 G I I A - C + 6*- 5 T Q Aj 4 - A . 5

C H 2 L y s 3 2- 4 G r cNH3C L y s 3 2

- 3 A AI- I - - 6 T + 3H O S e r 2 8 c A s n 3 1

- 2 T {3 I A I A + 2O NH G i n 2 7

- I A l a l a T ' IN i N6 0 4 ,T h r 1 7 - C H 3

F I G . 4 . I l l u s t r a t i o n o f t h e s e q u e n c e - s p e c i f i c H b o n d s ( ) a n d v a nd e r W a a l s c o n t a c t s ( I I I ) b e t w e e n a m i n o a c i d s i d e c h a i n s o f C r o a n df u n c t i o n a l g r o u p s e x p o s e d w i t h i n t h e DNA m a j o r g r o o v e o f t h ec o n s e n s u s h a l f - o p e r a t o r o f OR3 ( r e f s . 2 , 3 , 5 , 1 3 ) . I , H - b o n da c c e p t o r ; h , H - b o n d d o n o r ; o , t h y m i ne m e t h y l g r o u p . O n l y o n e - h a l fs i t e i s p r e s e n t e d b e c a u s e t h e o t h e r h a l f - s i t e i n t e r a c t s s i m i l a r l y .AH1= 4 6 0 0 + 9 . 4 K X A C pA H I I = 4 3 0 0 - 2 0 . 5 K X A C P [ 2 ]ASo= 4 9 . 4 - 0 . 0 3 x A C EASO = 4 9 . 0 - 0 . 1 4 x A C P ,

w h e r e AH i s e x p r e s s e d i n c a l l m o l - , a n d A 5 0 a n d A C p a r ee x p r e s s e d b y c a l m o l - l - K - 1 , r e s p e c t i v e l y . T h e l i n e s i n t e r c e p tc l o s e t o t h e v a l u e s c h a r a c t e r i s t i c o f t h e C r o - n o n s p e c i f i cDNA a s s o c i a t i o n ; AH = + 4 . 4 k c a l - m o l - 1 a n d ASo = 4 9c a l m o l - l K - l , w h e r e A C p 0 . A l l AG' a n d A C p v a l u e s f o r ma m o r e o r l e s s s i n g l e c o r r e l a t i o n g r o u p w i t h a s l o p e o f 1 7 . 1 K( F i g . 5 c ) ; t h i s r e l a t i o n s h i p i s a s f o l l o w s :- 2 0

F I G . 3 . C o m p a r i s o n o f c a l c u l a t e d A G ' , A H , a n d TA S 0 b e t w e e na s s o c i a t i o n s o f C r o w i t h n o n s p e c i f i c DNA # 1 1 ( L e f t ) a n d w i t hs p e c i f i c o p e r a t o r DNA O R3 ( R i g h t ) . T h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s ar ec a l c u l a t e d f r o m AG' a n d m e a s u r e d AH b y E q . 1 .

A G 0 = - 9 7 0 0 + 1 7 . 1 K x A C p , [ 3 ]w h e r e A G 0 i s e x p r e s s e d b y c a l - m o l i 1 . T h i s r e l a t i o n s h i p e x i s t sb e c a u s e t h e s l o p e s o f c o r r e l a t i o n i n t h e A G 0 -A C p p l o t s ar every c l o s e , 1 7 . 6 K a n d 1 9 . 7 K f o r groups I a n d II , respec-t i v e l y , d u e t o c o m p e n s a t o r y c o n t r i b u t i o n s f r o m AH a n d A S 5t o A G 0 a n d t o A C p .P a i r w i s e c o m p a r i s o n s show t h a t t h e v a r i a t i o n s i n t h ev a l u e s o f t h e t h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s ar e i n g e n e r a la c c o r d w i t h ou r k n o w l e d g e o f t h e s t r u c t u r e o f t h e Cro-DNAc o m p l e x ( T a b l e 1 a n d F i g . 4 ) . F o r i n s t a n c e , ( i ) The r e m o v a lof the methyl groupof -2T(2 AT O R 3 ) -*2 AU) has veryl i t t l e e f f e c t on a l l t h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s ( T a b l e 1 , ex -p e r i m e n t s 6 a n d 7 ; e x p e r i m e n t s 1 5 a n d 1 6 ) , b e i n g c o n s i s t e n tw i t h t h e s t r u c t u r a l s t u d i e s ( 2 , 5 ) , w h i c h s u g g e s t t h a t t h i sm e t h y l group i s n o t i n v o l v e d i n any c o n t a c t .( i i ) S u b s t i t u t i o n o f 2 TA f o r 2 A T ( O R 3 ) ( T a b l e 1 , e x p e r -i m e n t s 6 a n d 8 ) r e s u l t s i n t h e c h a n g e s : AAH = + 7 . 1k c a l m o l ' , - T A A S = - 3 . 3 k c a l m o l - 1 , AAG' = + 3 . 8k c a l m o l - 1 , a n d A A C p = + 2 1 0 c al m o l - l - K - 1 . S u b s t i t u t i o n o f

~ ~ ~ ~AS

-o 0AH

AG _

8 1 8 2 B i o c h e m i s t r y : T a k e d a e t a l .

8/14/2019 Cro Protein-DNA Interactions

4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 9 ( 1 9 9 2 ) 8 1 8 31 0 1

8 F0Ec o0J v% f o I

6

4

2

. - M0

0v0

EC DI

0

0I

- 1 0

- 12

1 4 p

1 6 1- 4 0 0 -3 0 0 -200 - 1 0 0 0

ACp ( c a l / m o l d e g )F I G . 5 . C o r r e l a t i o n s b e t w e e n AHand A C p ( a ) , b e t w e e n A S 0 a n dA C p ( b ) , a n d b e t w e e n AG' a n d A C p ( c ) seen f o r Cro-DNA a s s o c i -a t i o n r e a c t i o n s . D a t a ar e f r o m T a b l e 1 . C l o s e d s y m b o l s d e n o t ea s s o c i a t i o n s w i t h w i l d - t y p e C r o , a n d open s y m b o l s d e n o t e a s s o c i a -t i o n s w i t h m u t a n t C r o , . j 2 7 .

2 UA f o r 2 A T ( O R 3 ) ( e x p e r i m e n t s 6 a n d 9 ) r e s u l t s i n AAH=+ 4 . 9 k c a l m o l i 1 , -TAAS0 = + 1 . 1 k c a l m o l - 1 , A A l G ' =+ 5 . 8 k c a l ' m o l - 1 , a n d A A C p = + 3 2 0 c a l - m o l h l K - 1 . A l l o ft h e s e c h a n g e s i n t h e t h e r m o d y n a m i c v a l u e s are c o n s i s t e n tw i t h t h e p i c t u r e t h a t t h e 2 T A s u b s t i t u t i o n , w h i l e r e m o v i n g Hb o n d s b e t w e e n G l n - 2 7 a n d + 2 a d e n i n e , c r e a t e s v an d e r W a a l sc o n t a c t s b e t w e e n t h e +2 t h y m i n e m e t h y l group a n d A s n - 3 1a n d / o r G l n - 2 7 . R e m o v a l o f t h i s m e t h y l group d e c r e a s e s t h es t a b i l i t y b y 2 k c a l m o l - 1 . A s s o c i a t i o n s o f C r o w i t h OR3.2GCa n d OR3.2CG ar e weak ( e x p e r i m e n t s 1 0 a n d 1 1 ) b e c a u s e , l i k et h e Cro-0R3.2UA a s s o c i a t i o n , t h e y l a c k t h e H b o n d s a n dv a n d e r W a a l s c o n t a c t s .( i i i ) T h e s p e c i f i c i t y m u t a n t p r o t e i n , C r o v W 2 7 , c a n n o t f o r m Hb o n d s t o t h e + 2 a d e n i n e a n d b i n d s p o o r l y t o O R 3 . T her e d u c t i o n o fAA = 4 . 4 k c a l m o l - ' ( e x p e r i m e n t s 6 a n d 1 5 )i s d u e p r i m a r i l y t o t h e more p o s i t i v e e n t h a l p y c h a n g e AAH

= + 5 . 0 k c a l m o h l 1 ( T A A S o 0 ) . B i n d i n g o f C r o , . m 7 t o DNAi s i m p r o v e d w h e n t h y m i n e i s p l a c e d a t t h e + 2 p o s i t i o nb e c a u s e t h i s c h a n g e c r e a t e s a v a n d e r W a a l s c o n t a c t . T h i sa s s o c i a t i o n p r o c e e d s w i t h a n e v e n more u n f a v o r a b l e e n -t h a l p y c h a n g e , A A H = + 3 . 2 k c a l m o l 1 , w h i c h i s o v e r c o m eb y a l a r g e e n t r o p y c h a n g e -TAAS' = - 5 . 7 k c a l - m o l - 1 ,r e s u l t i n g i n AAG0 = - 2 . 3 k c a l ' m o l - 1 a n d A A C p = - 6 0c a l m o h l K - 1 ( e x p e r i m e n t s 1 5 a n d 1 7 ) . T h e r e m o v a l o f t h i sm e t h y l g r o u p ( e x p e r i m e n t s 1 7 a n d 1 8 ) r e v e r s e s t h e s e e f f e c t s ,w e a k e n i n g t h e i n t e r a c t i o n b y AAG0 = + 1 . 8 k c a l m o l 1 w i t hAAH = - 1 . 6 k c a l m o l - 1 a n d -TAAS5 = + 3 . 3 k c a l m o l 1 .( i v ) S u b s t i t u t i o n o f 4 G C f o r 4 C G ( O R 3 ) ( e x p e r i m e n t s 6 a n d1 2 ) b r e a k s H b o n d s b e t w e e n -4 G a n d L y s - 3 2 , r e s u l t i n g i nAAH= + 2 . 3 k c a l - m o l - 1 , - T A A S = + 0 . 9 k c a l - m o l - 1 , AAG'= + 3 . 0 k c a l m o l - 1 , a n d A A C p = + 1 0 0 c a l m o l - l h K - 1 . T h e 4A T s u b s t i t u t i o n , w h i l e b r e a k i n g H b o n d s , p r o b a b l y c r e a t e s av a n d e r W a a l s c o n t a c t b e t w e e n t h e t h y m i n e m e t h y l a n d t h eh y d r o p h o b i c p a r t o f L y s - 3 2 , r e s u l t i n g i n t h e c h a n g e s o f A A H= + 5 . 0 k c a l m o l h , -TAA S = - 1 . 1 k c a l m o l 1 , a n d AAG'= + 3 . 9 k c a l - m o l - 1 .( v ) R e m o v a l o f t h e s i n g l e -5 t h y m i n e m e t h y l g r o u p ( e x -p e r i m e n t s 6 a n d 1 4 ) e l i m i n a t e s a van d e r W a a l s c o n t a c t ,w h i c h r e s u l t s i n AAGO = + 1 . 6 k c a l - m o l - 1 , AAH = + 1 . 3k c a l m o l 1 , a n d T A A S ' 0 .

DISCUSSIONT h e r e s u l t s o f F i g . 3 L e f t s h o w t h a t t h e n o n s p e c i f i c Cro-DNAa s s o c i a t i o n i s e n t r o p y - d r i v e n . T h i s r e s u l t c o n f i r m s p r e v i o u sc o n c l u s i o n s ( 1 5 - 2 2 ) , d r a w n f r o m measurements o f t h e v a n ' tH o f f A H , t h a t many p r o t e i n - D N A a s s o c i a t i o n s a r e e n t r o p y -d r i v e n . I n p r o t e i n - D N A a s s o c i a t i o n l o n g - r a n g e e l e c t r o s t a t i cf o r c e s b r i n g p r o t e i n a n d DNA i n t o p r o x i m i t y , a n d c h a r g e dg r o u p s o f t h e p r o t e i n d i s p l a c e c a t i o n s a n d w a t e r m o l e c u l e sf r o m DNA. T h i s p r o c e s s i s a c c o m p a n i e d b y a l a r g e p o s i t i v ee n t r o p y c h a n g e ( 1 5 - 1 7 , 2 1 , 2 2 ) . A n a l y s i s o f t h e i o n i c - s t r e n g t hd e p e n d e n c e o f n o n s p e c i f i c Cro-DNA a s s o c i a t i o n ( 2 3 ) b y a ne l e c t r o s t a t i c m o d e l ( 2 1 , 2 2 ) s u g g e s t s t h e r e l e a s e o f a b o u t n i n eu n i v a l e n t c a t i o n s , a n d c h e m i c a l p r o t e c t i o n s t u d i e s ( 2 4 ) i n d i -c a t e 1 0 l y s i n e r e s i d u e s i n t e r a c t i n g w i t h D N A , 8 o f t h e m w i t ht h e p h o s p h a t e b a c k b o n e . B e c a u s e o f m a r k e d i o n i c s t r e n g t hd e p e n d e n c y , i t h a s b e e n p o s t u l a t e d t h a t n o n s p e c i f i c DNAa s s o c i a t i o n i s p r i m a r i l y e l e c t r o s t a t i c i n n a t u r e ( 1 5 - 1 7 , 2 1 - 2 7 ) .T h i s v i e w i s s u p p o r t e d b e c a u s e w e h a v e f o u n d t h a t t h e r a t i oA S 0 / A G ' = 0 . 0 0 5 f o r n o n s p e c i f i c Cro-DNA a s s o c i a t i o n a t1 5 0 C i s v e r y c l o s e t o t h e v a l u e o f ( d I n D / d T ) = 0 . 0 0 4 6 ( w h e r eD i s t h e d i e l e c t r i c c o n s t a n t o f w a t e r ) p r e d i c t e d f o r A S 0 / A G 'b y t h e s i m p l e e l e c t r o s t a t i c t h e o r i e s o f i o n h y d r a t i o n ( B o r n )a n d B j e r r u m ' s t h e o r y o f i o n a s s o c i a t i o n ( 2 8 ) . T h e o b s e r v e dA C p = 0 f o r t h e n o n s p e c i f i c a s s o c i a t i o n i n d i c a t e s v e r y l i t t l ep e r t u r b a t i o n o f t h e e n t h a l p i c s t a t e s o f t h e s y s t e m ( 2 9 ) a n d i sc o n s o n a n t w i t h a v e r y " l o o s e " c o m p l e x h e l d t o g e t h e r b yl o n g - r a n g e e l e c t r o s t a t i c f o r c e s .T h e s p e c i f i c Cro-DNA c o m p l e x i s f o r m e d w i t h t h e f u r t h e rd i s p l a c e m e n t o f w a t e r m o l e c u l e s f r o m t h e p r o t e i n - D N Ai n t e r f a c e a n d t h e f o r m a t i o n o f t h e s p e c i f i c a m i n o a c i d - n u c l e i ca c i d b a s e c o n t a c t s . T h i s p r o c e s s i s a c c o m p a n i e d b y f u r t h e rp o s i t i v e c h a n g e s i n e n t r o p y a n d n e g a t i v e v a l u e s o f A C p ( F i g .3 R i g h t ) . T h e n e g a t i v e A C p i n d i c a t e s a n a r r o w i n g o f t h ee n t h a l p i c s t a t e s o f t h e s y s t e m ( 2 9 ) . I n common w i t h manyl i g a n d b i n d i n g a n d a s s o c i a t i o n p r o c e s s e s o f p r o t e i n s ( 2 9 - 3 2 ) ,a p a r t o f t h e o b s e r v e d n e g a t i v e A C p w o u l d b e c o n t r i b u t e d b yt h e " t i g h t e n i n g " o f t h e s t r u c t u r e a s a r e s u l t o f c o n s t r a i n t s i nt h e m o t i o n o f DNA a n d p r o t e i n i n t h e s p e c i f i c c o m p l e x .C h a n g e s i n A C p a r e c h a r a c t e r i s t i c o f h y d r o p h o b i c e f f e c t s( 2 9 - 3 7 ) . We a s k e d w h e t h e r t h e n e g a t i v e A C p v a l u e s seen f o rt h e s p e c i f i c Cro-DNA a s s o c i a t i o n s o r i g i n a t e m a i n l y f r o mh y d r o p h o b i c e f f e c t s . B e f o r e e x a m i n i n g t h i s h y p o t h e s i s , wer e c a l l a f e w k e y o b s e r v a t i o n s c o n c e r n i n g A C p a n d h y d r o -p h o b i c e f f e c t s . F o r d i s s o l u t i o n o f a v a r i e t y o f h y d r o p h o b i c

- a

A

c # 1 12UA # 1 CV 2 7 - 2 G C 00 2G2G C V 2 7 - 2 C GV27 V27-2AU

2 T A *02-2UA4AT* # 44 G C # 5

0V 2 7 - 2 T A/ 5 A UO R 10

0 R 3 A

B i o c h e m i s t r y : T a k e d a e t A

8/14/2019 Cro Protein-DNA Interactions

5/5

P r o c . N a i l . A c a d . S c i . USA 8 9 ( 1 9 9 2 )c o m p o u n d s i n w a t e r , S t u r t e v a n t ( 3 0 ) o b s e r v e d t h a t A C pv a l u e s ar e a c c o m p a n i e d b y commensurate A S ' v a l u e s , a n dt h e r a t i o A S / A C p h a s a c o n s t a n t v a l u e o f - 0 . 2 6 a t 2 5 0 C .M o r e r e c e n t l y , M u r p h y e t a l . ( 3 5 ) s h o w e d t h a t t h e r a t i oA S 0 / A C p f o r d e na t u r a t i o n o f p r o t e i n s h a s a s i m i l a r c o n s t a n tv a l u e . T h e n, S p o l a r e t a l . ( 3 6 ) s h o w e d t h a t t h e r a t i o b e t w e e nA C p a n d t h e c h a n g e i n w a t e r - a c c e s s i b l e n o n p o l a r s u r f a c e area( A A n p ) i s i d e n t i c a l f o r t h e t r a n s f e r o f n o n p o l a r s o l u t e s f r o mw a t e r t o t h e pure l i q u i d p h a s e a n d f o r t h e f o l d i n g o f s m a l lg l o b u l a r p r o t e i n s . O u r c u r r e n t r e s u l t s ( F i g . S b ) s h o w t h a t t h et h e r m o d y n a m i c b e h a v i o r o f Cro-DNA a s s o c i a t i o n s i s some-w h a t s i m i l a r t o t h e s e w e l l - s t u d i e d cases i n t h a t t h e r a t i oAS/AC p i s c o n s t a n t b u t q u i t e d i f f e r e n t i n t h a t t h e r e ar e tw ov a l u e s o f t h i s r a t i o i n Cro-DNA a s s o c i a t i o n s a n d t h a t t h ev a l u e s ar e much s m a l l e r a n d m o r e p o s i t i v e - i . e . , - 0 . 0 3 a n d- 0 . 1 4 a t 1 5 0 C ( e s t i m a t e s a t 2 5 0 C ar e + 0 . 0 2 a n d - 0 . 0 8 ,r e s p e c t i v e l y ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t C r o p r o t e i n - DN Aa s s o c i a t i o n s s h a r e some s i m i l a r t h e r m o d y n a m i c p r o p e r t i e sw i t h p r o t e i n f o l d i n g , b u t t h e i r o v e r a l l e n e r g e t i c s ar e q u i t ed i f f e r e n t . T h i s c o n c l u s i o n i s f u r t h e r s u p p o r t e d b y t h e f a c tt h a t , w h e r e a s A G 0 c o r r e l a t e s t o A C p w i t h a c o e f f i c i e n t o f 8 0K i n p r o t e i n f o l d i n g ( 3 6 ) , AG' c o r r e l a t e s t o A C p w i t h ac o e f f i c i e n t o f 1 7 K i n t h e s p e c i f i c Cro-DNA a s s o c i a t i o n ( s e ea b o v e a nd F i g . S c ) . A l i k e l y reason f o r t h e s e d i f f e r e n c e s i st h a t t h e p r o t e i n - D N A i n t e r f a c e i s m o r e p o l a r a n d m o r eh y d r a t e d t h a n t h e i n t e r i o r o f a f o l d e d p r o t e i n . By a n a l o g yw i t h h y d r o c a r b o n t r a n s f e r a n d p r o t e i n f o l d i n g , Ha e t a l . ( 2 0 )r e c e n t l y p r o p o s e d t h a t p r o t e i n - D N A a s s o c i a t i o n s ar e s t a b i -l i z e d b y t h e l a r g e h y d r o p h o b i c f r e e energy. T h e r m o d y n a m i cd a t a on Cro-DNA a s s o c i a t i o n s d o n o t s u p p o r t t h i s p r o p o s a l .A s d e s c r i b e d a b o v e , o nl y l i m i t e d s i m i l a r i t y e x i s t s b e t w e e np r o t e i n - D N A a s s o c i a t i o n a n d p r o t e i n f o l d i n g , a n d t h e i r over-a l l e n e r g e t i c s ar e q u i t e d i f f e r e n t . I n Cro-DNA a s s o c i a t i o nA C p i s t i g h t l y c o u p l e d w i t h AG ' o f s p e c i f i c b i n d i n g ( s e e F i g .S c ) , a n d H b o n d s , v a n d e r W a a l s c o n t a c t s , a n d h y d r o p h o b i ce f f e c t s appear t o a l l c o n t r i b u t e d i r e c t l y t o A C p , s u c h t h a tb r e a k a g e o f any o f t h e s e i n t e r a c t i o n s m a r k e d l y a f f e c t s b o t hA C p a n d A G 0 ( s e e R e s u l t s a n d T a b l e 1 ) .T h e A H - A C p a n d A S - A C p p l o t s r e v e a l e d tw o t y p e s o ft h e r m o d y n a m i c b e h a v i o r f o r t h e s p e c i f i c Cro-DNA a s s o c i -a t i o n s t h a t we re n o t e v i d e n t f r o m t h e v a l u e s o f A G 0 a n d A C p( F i g . 5 ) . One group o f a s s o c i a t i o n , w h i c h i n c l u d e s m o s tw i l d - t y p e C r o a s s o c i a t i o n s , i s c h a r a c t e r i z e d b y m o r e f a v o r -a b l e AH a n d A S 0 t h a n f o r n o n s p e c i f i c DNA a s s o c i a t i o n . Thes e c o n d group o f a s s o c i a t i o n , w h i c h i n c l u d e s t h r e e w i l d - t y p eC r o a s s o c i a t i o n s a n d a l l C r o w J 2 7 a s s o c i a t i o n s e x a m i n e d , i sc h a r a c t e r i z e d b y l e s s f a v o r a b l e AH t h a n i n t h e n o n s p e c i f i ca s s o c i a t i o n t h a t i s o f f s e t b y a p o s i t i v e A S . T h u s group I a n dgroup I I a s s o c i a t i o n s ar e s t a b i l i z e d b y d i f f e r e n t e n t h a l p i c a n de n t r o p i c c o n t r i b u t i o n s , a n d our r e s u l t s i n d i c a t e t h a t s p e c i f i cc o m p l e x e s w i t h g i v e n a f f i n i t y c an b e c r e a t e d b y two d i f f e r e n tc o m b i n a t i o n s o f Hand S c o n t r i b u t i o n s . We s u g g e s t t h a t t h e s et h e r m o d y n a m i c a l l y d i s t i n c t b i n d i n g m o d e s r e f l e c t tw o d i s -t i n c t c o n f o r m a t i o n a l s u b c l a s s e s i n t h e s t r u c t u r e s o f s p e c i f i cCro-DNA c o m p l e x e s . I t i s n o t e d t h a t a s i n g l e - b a s e - p a i r or as i n g l e - a m i n o a c i d c h a n g e c a n s w i t c h t h e t h e r m o d y n a m i cb e h a v i o r f r o m on e group t o t h e o t h e r . T a k e d a e t a l . ( 1 3 )r e p o r t e d t h a t t h e A G 0 v a l u e s are m o s t l y a d d i t i v e f o r s p e c i f i cCro-DNA a s s o c i a t i o n . A d d i t i v i t y o f AG d e p e n d s on u n i f o r -m i t y o f c o n f o r m a t i o n . I n r e t r o s p e c t , t h e e x p e r i m e n t s t h a t l e dt o t h i s c o n cl u s i o n i n cl u d e d o n l y m u t a n t s t h a t give r i s e t ogroup I a s s o c i a t i o n s a n d none t h a t g i v e r i s e t o group I Ia s s o c i a t i o n s . I t w i l l b e i n t e r e s t i n g t o t e s t w h e t h e r AG v a l u e sar e a d d i t i v e or n o t when t h e m u t a t i o n s t h a t give r i s e t o groupI a n d I I a s s o c i a t i o n s ar e c o m b i n e d . C o m p a r i s o n o f t h et h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e s o f group I a n d II a s s o c i a t i o n sw i l l a l s o be ver y i n t e r e s t i n g .

We a r e d e e p l y i n d e b t e d t o D r . R o b e r t L . B e r g e r f o r u s e o f t h ec a l o r i m e t e r ( n o w a v a i l a b l e f r o m C o m m o n w e a l t h T e c h n o l o g y , A l e x -a n d r i a , V A ) . We t h a n k M i s s N a n c y S e a t o n f o r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .T h i s r e s e a r c h h a s b e e n s u p p o r t e d , a t l e a s t i n p a r t , b y t h e N a t i o n a lC a n c e r I n s t i t u t e , D e p a r t m e n t o f H e a l t h a n d Human S e r v i c e s , u n d e rC o n t r a c t N O 1 - C O - 7 4 1 0 2 w i t h P r o g r a m R e s o u r c e s , I n c .1 . A n d e r s o n , W. F . , O h l e n d o r f , D . H . , T a k e d a , Y . & M a t t h e w s ,B . W. ( 1 9 8 1 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 9 0 , 7 5 4 - 7 5 8 .2 . O h l e n d o r f , D . H . , A n d e r s o n , W. F . , F i s h e r , R . G . , T a k e d a , Y .& M a t t h e w s , B . W. ( 1 9 8 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 9 8 , 7 1 8 - 7 2 3 .3 . T a k e d a , Y . , O h l e n d o r f , D . H . , A n d e r s o n , W. F . & M a t t h e w s ,B . W. ( 1 9 8 3 ) S c i e n c e 2 2 1 , 1 0 2 0 - 1 0 2 6 .4 . B r e n n a n , R . G . & M a t t h e w s , B . W. ( 1 9 8 9 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 4 ,1 9 0 3 - 1 9 0 6 .5 . B r e n n a n , R . G . , R o d e r i c k , S . L . , T a k e d a , Y . & M a t t h e w s ,B . W. ( 1 9 9 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 7 , 8 1 6 5 - 8 1 6 9 .6 . A g g a r w a l , A . K . , R o d g e r s , D . , D r o t t a r , M . , P t a s h n e , M . &H a r r i s o n , S . C . ( 1 9 8 8 ) S c i e n c e 2 4 2 , 8 9 9 - 9 0 7 .7 . M o n d r a g o n , A . & H a r r i s o n , S . C . ( 1 9 9 1 ) J . M o l . B i o l . 2 1 9 ,3 2 1 - 3 3 4 .8 . J o r d a n , S . R . & P a b o , C . 0 . ( 1 9 8 8 ) S c i e n c e 2 4 2 , 8 9 3 - 8 9 9 .9 . O t w i n o w s k i , R . W . , S c h e v i t z , R . W . , Z h a n g , R . - G . , J o a c h -n k , A . , M a r m o r s t e i n , R . Q . , L u i s i , B . F . & S i g l e r , P . B .( 1 9 8 8 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 3 5 , 3 2 1 - 3 2 9 .1 0 . S t e i t z , T . A . ( 1 9 9 0 ) Q . R e v . B i o p h y s . 2 3 , 2 0 5 - 2 8 0 .1 1 . P a b o , C . 0 . & S a u e r , R . T . ( 1 9 8 4 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 3 ,2 9 3 - 3 2 1 .

1 2 . H a r r i s o n , S . C . & A g g a r w a l , A . K . ( 1 9 9 0 ) A n n u . R e v . B i o -c h e m . 5 9 , 9 3 3 - 9 6 9 .1 3 . T a k e d a , Y . , S a r a i , A . & R i v e r a , V . M. ( 1 9 8 9 ) P r o c . N a t l . A c a d .S c i . USA 8 6 , 4 3 9 - 4 4 3 .1 4 . M u d d , C . P . & B e r g e r , R . L . ( 1 9 8 8 ) J . B i o c h e m . B i o p h y s .M e t h o d s 1 7 , 1 7 1 - 1 9 2 .1 5 . R i g g s , A . D . , B o u r g e o i s , S . & C o h n , M . ( 1 9 7 0 ) J . M o l . B i o l . 5 3 ,4 0 1 - 4 1 7 .1 6 . R e v z i n , A . & v o n H i p p e l , P . H . ( 1 9 7 7 ) B i o c h e m i s t r y 1 6 , 4 7 6 9 -4 7 7 6 .1 7 . d e H a s e t h , P . L . , L o h m a n , T . M . & R e c o r d , M . T . , J r . ( 1 9 7 7 )B i o c h e m i s t r y 1 6 , 4 7 8 3 - 4 7 9 0 .1 8 . W h i t s o n , P . A . , O l s o n , J . S . & M a t t h e w s , K . S . ( 1 9 8 6 ) B i o -c h e m i s t r y 2 5 , 3 8 5 2 - 3 8 5 8 .1 9 . V e r s h o n , A . K . , L i a o , S . - M . , M c C l u r e , W. R . & S a u e r , R . T .( 1 9 8 7 ) J . M o l . B i o l . 1 9 5 , 3 1 1 - 3 2 2 .2 0 . H a , J . - H . , S p o l a r , R . S . & R e c o r d , M . T . , J r . ( 1 9 8 9 ) J . M o l .B i o l . 2 0 9 , 8 0 1 - 8 1 6 .2 1 . M a n n i n g , G . S . ( 1 9 7 8 ) Q . R e v . B i o p h y s . 1 1 , 1 7 9 - 2 4 6 .2 2 . R e c o r d , M . T . , J r . , A n d e r s o n , C . F . & L o h m a n , T. M. ( 1 9 7 8 )Q . R e v . B i o p h y s . 1 1 , 1 0 3 - 1 7 8 .2 3 . B o s c h e l l i , F . ( 1 9 8 2 ) J . M o l . B i o l . 1 6 2 , 2 6 7 - 2 8 7 .2 4 . T a k e d a , Y . , K i m , J . G . , C a d a y , C . G . , S t e e r s , E . , J r . , O h l e n -d o r f , D . H . , A n d e r s o n , W. F . & M a t t h e w s , B . W. ( 1 9 8 6 ) J .B i o l . C h e m . 2 6 1 , 8 6 0 8 - 8 6 1 6 .2 5 . L i n , S . Y . & R i g g s , A . D . ( 1 9 7 5 ) C e l l 4 , 1 0 7 - 1 1 1 .2 6 . v o n H i p p e l , P . H . ( 1 9 7 9 ) i n B i o l o g i c a l R e g u l a t i o n a n d D e v e l -o p m e n t , e d . G o l d b e r g e r , R . F . ( P l e n u m , New Y o r k ) , p p . 2 7 9 -3 4 7 .2 7 . M a t t h e w s , J . B . & O h l e n d o r f , D . H . ( 1 9 8 5 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 0 ,5 8 6 0 - 5 8 6 2 .2 8 . K i n g , E . J . ( 1 9 6 5 ) A c i d - B a s e E q u i l i b r i a ( M a c m i l l a n , NewY o r k ) , p p . 1 3 7 - 2 1 7 .2 9 . E f t i n k , M . & B i l t o n e n , R . L . ( 1 9 8 0 ) i n B i o l o g i c a l M i c r o c a l o -r i m e t r y , e d . B e e z e r , A . E . ( A c a d e m i c , L o n d o n ) , p p . 3 4 3 - 4 1 2 .3 0 . S t u r t e v a n t , J . M . ( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 4 ,2 2 3 6 - 2 2 4 0 .3 1 . R o s s , P . D . & S u b r a m a n i a n , S . ( 1 9 8 1 ) B i o c h e m i s t r y 2 0 , 3 0 9 6 -3 1 0 2 .3 2 . H i n z , H . - J . ( 1 9 8 3 ) A n n u . R e v . B i o p h y s . B i o e n g . 1 2 , 2 8 5 - 3 1 7 .3 3 . E d s a l l , J . T . ( 1 9 3 5 ) J . Am . C h e m . S o c . 5 7 , 1 5 0 6 - 1 5 0 7 .3 4 . K a u z m a n n , W. ( 1 9 5 9 ) A d v . P r o t e i n C h e m . 1 4 , 1 - 6 3 .3 5 . M u r p h y , K . P . , P r i v a l o v , P . L . & G i l l , S . J . ( 1 9 9 0 ) S c i e n c e 2 4 7 ,5 5 9 - 5 6 1 .3 6 . S p o l a r , R . S . , H a , J . - H . & R e c o r d , M . T . , J r . ( 1 9 8 9 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 8 6 , 8 3 8 2 - 8 3 8 5 .3 7 . P r i v a l o v , P . L . & G i l l , S . J . ( 1 9 8 8 ) A d v . P r o t e i n C h e m . 3 9 ,1 9 1 - 2 3 4 .

8 1 8 4 B i o c h e m i s t r y : T a k e d a e t a l .