Contribution à l'étude de l'activité amidasique de la trypsine

Download Contribution à l'étude de l'activité amidasique de la trypsine

Post on 02-Sep-2016

213 views

Category:

Documents

1 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

<ul><li><p>116 BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA </p><p>BBA 65419 </p><p>CONTRIBUTION ~ L']~TUDE DE L'ACTIVITt~ AMIDASIQUE DE LA </p><p>TRYPS INE </p><p>JEAN CHEVALLIER ET JEANNINE YON Laboratoire de Biologie Physico-Chimique, Facult~ des Sciences de Paris, Orsay (Seine et Oise) (France) </p><p>(Regu le 5 novembre, 1965) </p><p>SUMMARY </p><p>The amidase activity of trypsin (EC 3.4.4.4) The kinetics of the trypsin-catalyzed hydrolysis of two specific amide sub- </p><p>strates is discussed on the assumption of an acylenzyme intermediate. The limiting process is the acylation step. The acylation rate constant exhibits a bell-shaped pH profile. The pK values have been determined and compared with previous results from our laboratory. The activation by substrate previously observed during de- acylation is not detected in the acylation step. The enzymatic and non-enzymatic (hydroxyl ion-catalysed) rate constants have been compared according to the "five factors" proposed by BENDER. </p><p>INTRODUCTION </p><p>L'6tude des propri6t6s fonctionnelles de la trypsine (EC 3.4.4.4) sur des sub- strats de synth6se a fair l 'objet de nombreux travaux 1-5. Par des 6tudes analogues plus syst6matiques effectufes sur la chymotrypsine (EC 3.4.4.5) avec des esters sp6ci- fiques et les amides correspondantes BENDER et collaborateurs63 ont apport6 des pr6cisions importantes sur le m6canisme d'action de cet enzyme. Un ensemble de r6sultats a 6t6 obtenu dans notre laboratoire ~ pour l 'hydrolyse trypsique de quel- ques esters simples et spdcifiques de formule g6n6rale RNHCHR'COOR" en parti- culier BAEE, BAME, TAME et TLME. L'analyse des donn6es cin6tiques a 6% effectu6e en tenant compte de l'hypoth6se g6n6ralement admise, quoique encore contestde par quelques auteurs dans le cas des substrats sp6cifiques s de la formation d'un acyl enzyme interm6diaire. On a pu montrer que la r6action limitante est la d6sacylation. D'autre part la cin6tique d'hydrolyse des esters n'est pas interpr6table </p><p>Abrdviations: B A, N-benzoyl-L-arginine; BAA, amide du BA; BAEE, ester 6thylique du BA; BAME, ester m~thylique du BA; TA, N-p-tolu6nesulfonyl-L-arginine; TAA, amide du TA ; TAME, ester m6thylique du TA; TLME, ester mdthylique de la N-p-tolu6nesulfonyl-L-lysine; AcPheME, ester mdthylique clu N-acdtylph6nylalanine. </p><p>Biochim. Biophys. Acta, 122 (1966) 116-126 </p></li><li><p>TRYPSINE:L'INHIBITION PAR LES D]~RIVI~S SP]~CIFIQUES 117 </p><p>selon les lois classiques, car on observe une activation par le substrat qui a 6t6 inter- pr6t6e comme un effet allost6rique 9. </p><p>Dans les conditions oh il n 'y a pas encore activation par le substrat la cin6tique de ces r6actions peut ~tre repr6sent~e par le schema complexe: </p><p>k~' k( S + E .~ES ES' + P1 EP 2 ~ E + P2 </p><p>k( ks" Ka ,]~ ,]~ Ka" Ka" .]~ Ka"" ,It </p><p>k 1 k 3 k~ k 7 S + EH ~-EHS ~-EHS" + P t~EHP2 ~ EH + P2 </p><p>k2 k4 k6 ks </p><p>k(' k(' S + EH 2 ~-- EH~S EH~S' + Px EHaP 2 ~_ EH~ + P2 </p><p>k2" ks" </p><p>S reprdsente le substrat dont l'~tat d'ionisation ne varie pas darts toute la zone de pH off la r~action est 6tudi6e; E, EH, et EH,, sont les diff~rents 6tats d'ionisation de l'enzyme; ES, EHS, et EH2S ceux du premier complexe interm6diaire; ES', EHS' et EH2S' ceux de l'acylenzyme; EP2, EHP.. et EH2Po " ceux du complexe enzyme- produit, P1 et P~ ~tant respectivement le premier et le second produit de la r6action. Si le substrat est une amide de formule g~n6rale RNHCHR'CONH 2 ou RNHCHR' - CONHR", le premier produit est NH a ou NH2R". </p><p>Par un traitement cin~tique d6sormais classique, d6velopp6 par KRUPKA ET LAIDLER 1 et ALBERTY ET BLOOMFIELD 11 qui comporte plusieurs simplifications et admet que les seules formes ioniques r6actives sont EHS et EHS', on aboutit h une dquation des vitesses de la forme: </p><p>v is] v Km+ IS] </p><p>dans laquelle [SI est la concentration du substrat, Vet Km sont des param~tres cin6ti- ques apparents ayant la valeur complexe respective: </p><p>kaks ET V= </p><p>Kaa [I~+] / (I Ka" [H+] t k3 (1+ + + E ;j + i </p><p>dans laquelle ET est la concentration de l'enzyme total et </p><p>Ka [H+] / k3] ks [k2( I + ~] ] +---Kb-b ] + Kra = </p><p>Si l'~tape d'acylation est limitante (k a &lt; ks) ces expressions se simplifient. En d6finissant la constante catalytique heat = V/ET on a: </p><p>Ko' [H+]/ (1) keat : ka] I -~ KO" ] </p><p>K~ [H+] 1+ Km= Ks (2) </p><p>Ka' [H +] I +[~+ Ko-- ~- </p><p>Biochim. Biophys. Acta, 112 (1966) 116-126 </p></li><li><p>118 J. CHEVALLIER, J. YON </p><p>Si l'6tape de d6sacylation est limitante (k s &lt; ka), on a: </p><p>keat = ks/ ~ + [H+~ + Kd' / (S) </p><p>( tG, [H+]I t% I+~+~] + Kb ] </p><p>Km - - Ks (4) ( EH+j 1 G i+[~q+ K~"/ </p><p>Dans ce travail, les param6tres cin6tiques des rdactions d'hydrolyse trypsique de deux amides ont 6t6 ddtermin6s &amp; divers pH et analys6s. La comparaison des rdsultats avee les donn6es obtenues pour l'hydrolyse des esters eorrespondants per- met d'apporter quelques prdcisions sur ]e mdcanisme d'action de la trypsine. </p><p>MAT]~RIEL ET MI~THODES </p><p>La trypsine (Worthington) est dialys6e exhaustivement contre HC1 o.oI M pour 61iminer le MgSO 4 pr6sent darts la pr4paration eommerciale; elle est ensuite centrifug6e ~ 20 ooo tours/rain pendant 2o rain h froid. Son activit6 sp6cifique est d6termin6e par la m6thode potentiom6trique ~ pH constant en utilisant le BAEE comme substrat. Elle est ramen6e ~ celle d'une solution 6talon dont l'activit6 a 6t6 prise arbitrairement 6gale ~ l'unit6. La concentration des solutions de trypsine varie pour les diverses exp6rienees de 8o #M ~ 17o ttM. </p><p>Le BAA et le TAA sont des produits "Mann Research Laboratories". Le TAA pr6sente suivant les lots de I4- I6 % de TAME. Le produit commercial peut ~tre utilis6 ainsi, puisque le TAME est hydrolys6 environ ioo fois plus rapidement que le TAA. On travaille done dans ce cas en pr6sence d'une concentration connue de TA produit de la r6action et inbibiteur comp6titif de la trypsine. Les constantes d'inhibition du TA vis ~ vis de l'enzyme ont 6% mesur6es 12 et sont donn6es dans le Tableau I. On peut done 4valuer la constante de Michaelis apparente de la r6action enzymatique, Kin, en faisant une correction d'aprhs la relation: </p><p>Km~ = Km(r + Ki I </p><p>Kmi 6tant la constante de Michaelis exp6rimentale en pr6sence d'inhibitem. On peut aussi transformer le TAME du m61ange en son amide le TAA en le </p><p>traitant par l'ammoniaque en solution m6thanolique. La m6thode est d6crite pour la pr6paration du TAA (%f. I). On recristallise l'amide dans un m61ange alcool m6thylique-ether m~thylique. Les r6sultats obtenus avec le produit purifi6 et cor- rig6s tt l'aide de la relation pr6c6dente, et ceux que l'on obtient avec le produit purifi6 sont identiques. </p><p>Aux pH alcalins le TAA (comme d'ailleurs le TAME) se trouve sous forme ionis6e. On a l'6quilibre: </p><p>~ H H H CH ~ ~X')SO~-N-C-CONH2 ~ CH3-~-SO2-N-C-CONH~ </p><p>3 N ,~ R - - R NH </p><p>/ avec R = -(CH.a)3-NH C </p><p>NH 3 </p><p>Biochim. Biophys. Acta, 122 (I96C) 116-126 </p></li><li><p>TRYPSINE: L'ACTIVITI~ AMIDASIQUE 119 </p><p>v ~ =~~=B.~,, 1.5 </p><p>1 o o </p><p>5 </p><p>Fig. I. D6terminat ion des param~tres cin~tiques correspondant k l 'hydrolyse du BAA par la t rypsine 5. diff~rents pH (temperature 35 o.o5 , force ionique = o.2). Les concentrat ions de BAA var ient entre 4 mM et 17. 5 mM. Les pentes des droites ont ~t~ d~termin~es par la m~thode des moindres carr~s. Representat ion d 'Eadie (v = f(v[[S])). </p><p>Le pK de cette iouisation d6termin6 par t i trage k 35 en NaC1 o.2 M par NaOH o.I M est de 9.8. La forme ionis6e du substrat signal6e par BENMOUYAL ET TROW- BRIDGE 13 dans le cas du TAME n'est plus hydrolysable par la trypsine 1~. I1 est done n6cessaire de faire une correction sur la concentration du substrat aux pH alcalins. </p><p>Dans tous les cas, les concentrations de substrat sont mesur6es spectrophoto- m6triquement. Les coefficients d'ext inct ion sont pour le BAA e~ ~ 4300 ~ 257 m# et pour le TAA eM -- 12 ooo h 229 m# (ceci pour les valeurs de pH infdrieures ~ 9.5). Les exp6riences sont effectu6es en solution tampon o.02 M, en NaC1 o.2 M (afro de maintenir la force ionique constante) et ~ 35 . Le pH du in61ange r6actionnel est vdrifid au d6but et ~ la fin de chaque exp6rience. Les mesures cin6tiques commencent en gdn6ral 20 sec apr~s l 'addit ion d'enzyme, temps n6cessaire h l '6quil ibre de tem- p6rature et ~ l 'hydrolyse du TAME (clans le cas off l 'on travai l le avec le TAA non purifi~). Les pr61~vements sont effectu6s ~ interval les r~guliers (15 ou 20 sec suivant </p><p>1.5 </p><p>o </p><p>o o </p><p>% </p><p>Fig, 2. Ddterrnination des param~tres cin6tiques correspondant k l 'hydrolyse du TAA par la trypsine. M6mes condit ions que pour la Fig. i. Les concentrat ions de subst rat var ient entre 5 mM et 22 raM. </p><p>Biochim. Biophys. Acta, 122 (1966) 116-126 </p></li><li><p>I 20 J. CHEVALLIER, J. YON </p><p>TABLEAU I </p><p>VALEURS DES CONSTANTES D'INHIBITION ~2" l A DIFFRENTS pH POUR L'HY'DROLYSE TRYPSIQUE DU AcPheME ~ZN pRI~SENCE DF TA ~'~ DIFFI~RENTS pH </p><p>D'aprbs rdf. 12. Tempdrature 25; NaC1 o.i M; AcPheME 2 mM; TA 9 mM. </p><p>pH 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 </p><p>K, lO 3 1.26 1.6 x.82 2. 7 3.45 6.7 lO. 3 lO.2 7.3 </p><p>les exp6riences) pendant 5 6 rain, ce qui est suffisant pour avoir une bonne d6termi- nation des vitesses initiales. La m~thode ~ la ninhydrine a dt6 utilisde pour les dosages15; elle donne une pr6cision d'environ 3% (rdf. 16). </p><p>RI~SULTATS EXPI~RIMENTAUX ET DISCUSSION </p><p>Etude des param~tres cindtiques correspondant d l'hydrolyse du BAA et du TAA Ddtermination de Km en fonction du pH. Les valeurs des param+tres cin~tiques </p><p>eorrespondant ~ l'hydrolyse trypsique du BAA et du TAA ont 6t6 ddtermindes diff6rents pH (Figs. I et 2), pour des concentrations de substrat variant entre 20 mM et 7 mM pour le BAA et 20 mM et 5 mM pour le TAA. Les valeurs obtenues sont port6es dans les Tableaux II et II I . On remarque que les valeurs de K m pour l'hydro- lyse du BAA ne varient pratiquement pas en fonction du pH. Les variations observ6es sont de l'ordre de grandeur des erreurs expdrimentales. La valeur moyenne de eette eonstante (3.3 raM) est en accord avec les donn6es de la litt6rature3,17J 8. </p><p>Par eontre, pour l'hydrolyse du TAA, les valeurs de K m augmentent ldg+re- ment avec le pH (de 3 mM ~ IO mM lorsqu'on passe de pH 6 ~ pH 9). Ces variations sont signifieatives. Pour les deux amides, les valeurs de Km ont 6t~ caleul6es par la m6thode des moindres carr6s et la reprdsentation d'Eadie (Figs. i et 2) qui est utilis6e est la plus pr6eise pour cette ddtermination eomme l'ont montr~ DOUB ET RIGGS 19. </p><p>La Fig. 3 repr6sente les variations de p/x" men fonction du pH pour les deux substrats 6tudi6s. </p><p>pK,,, 3 </p><p>2.5 </p><p>1=~A 2=TAA </p><p>o. o N </p><p>o </p><p>6 } ; 6 6 p. </p><p>Fig. 3- Variations de pKm en fonction du pH pour l 'hydrolyse du BAA et du TAA. </p><p>Biochim. Biophys. Acta, 122 (1966) I I6 - I26 </p></li><li><p>TRYPSINE: L'ACTIVITI~ AMIDASIQUE 12I </p><p>TABLEAU II </p><p>VALEURS DES PARAM]~rRES CIN]~TIQUES CORRESPONDANT ~k L'HYDROLYSE DU BAA PAR LA TRYPSINE </p><p>Mesures cffectudes par la m6thode ~ la ninhydrine. Temp6rature 35.o 4- o.I . Tampon phosphate o.o2 M ou Tris-kIC1 o.o2 M ou carbonate o.o2 M; NaCI o.2 M; BAA, 5 mM. Les valeurs de Km sont obtenues ~t I5% pr~s. </p><p>Phosphate Tris Carbonate </p><p>pH 6.05 6.85 7.65 7.92 8.35 9.36 9.62 zo.o5 ~o.31 ~o.52 </p><p>/m 3.5 3.3 3.6 3.3 3.1 3.5 3 .0 2.8 3.6 3.4 (M X IO 3) </p><p>kcat 0.3* 0.66 0.82 0.87 1.35 0.80 0.60 0.54 0.30* 0.27* (sec-~) </p><p>* Ces valeurs sont moins prdcises que celles d6termin6es au pH optimum, les vitesses d'hydrolyse 6rant tr~s faibles. </p><p>On doit remarquer en outre que dans les conditions de pH optimales de la rdaction la valeur de Km obtenue pour les deux amides est prat iquement dgale ~ la constante d' inhibit ion K~ ddterminde lors de l 'hydrolyse trypsique d'esters en prd- sence des m~mes amides ou des ddrivds acides correspondants 12, comme le montre le Tableau IV, Ce rdsultat nous permet de confirmer que l'dtape d'acylation est l imi- tante dans l 'hydrolyse trypsique des amides spdcifiques, alors que la ddsacylation est l imitante dans l 'hydrolyse des esters spdcifiques, comme Font montrd ZERN~R ET BENDER s dans le cas de la chymotrypsine. Km est donnd par Eqn. 2; elle reprdsente la constante de ddcomposition du premier complexe intermddiaire. </p><p>Ddtermination de kcat en fonction du pH. Les valeurs de kcat ddtermindes aux divers pH pour l 'hydrolyse des deux amides sont donn6es dans les Tableaux I I et I I I . Pour l 'hydrolyse du BAA par la trypsine, on trouve keat 6gal ~ 0.82 sec -1 ~ 35 et </p><p>pH 7.65. HARMON ET NIEMANN 3 donnent une valeur de 0.46 sec -1 dans les mfimes conditions de pH et ~ 3 o, ce qui correspondrait ~ 0.56 sec -1 en admettant une valeur de 14 900 cal (rdf. 20) pour l 'enthalpie d'act ivat ion de la rdaction. Mais on peut toutefois s'dtonner de la valeur obtenue par les auteurs ~ 25 (o.18 see-l), ce qui correspondrait / tune dnergie d'act ivat ion bien supdrieure. Puisque l'6tape d'acylat ion est l imitante, kcat est donn6e par Eqn. I et repr~sente pour l 'hydrolyse </p><p>TABLEAU III </p><p>VALEURS DES PARAM]~TRES ClNI~TIQUES CORRESPONDANT ~ L'HYDROLYS]~ DU TAA PAR LA TRYPSINE </p><p>Mesures effectu6es par la mdthode k la ninhydrine. Tempdrature 35.o 4- o. i . Tampon phosphate 0.o2 M ou Tris-HC1 o.o2 M ou carbonate o.o2 M; NaC1 o.2 M; TAA 5 rnM. </p><p>Phosphate Tris Carbonate </p><p>pH 6.o5 6.8 7.3o 8.25 8.65 9 </p><p>Kra (M x ~o~) </p><p>keat (see -1) </p><p>3 .0 4.7 5.6 7.8 7.7 IO.I </p><p>o.24. o.8o i. i 1.8 1.6 1. 4 </p><p>* M6me remarque que pour les valeurs donn6es dans le Tableau I Itt pH 6.05. </p><p>Biochim. Biophys. Acta, 122 (1966) 116-126 </p></li><li><p>122 j . CHEVALLIER, J. YON </p><p>TABLEAU IV </p><p>COMPARAISON DES VALEURS DE LA CONSTANTE DE MICHAEL IS OBTENUE POUR L 'HYDROLYSE DES </p><p>AMIDES ET DES CONSTANTES D ' INHIB IT ION DE LA TRYPS INE PAR LES AMIDES ET LES D~RIV~S </p><p>CORRESPONDANTS DANS LES CONDIT IONS DE pH OPTIMUM </p><p>D6terminat ion des Kin: Les mesures sont effectu6es par la m~thode ~ la n inhydr ine exactement dans les m~mes condit ions que celles des Tableaux I[ et I l l . Les concentrat ions de TAA et de BAA sont comprises respect ivement entre 20 mM et 5 mM pour le TAA et 20 mM et 7 mM par le BAA, D6terminat ion des K, (d'aprbs r6f. 12): Temp6rature 25; pH 8 sans tampon en mil ieu NaCl 0.2 M. </p><p>Substrats ou K~ Km inhibiteurs (mM) (raM) </p><p>TAA 7.8 TAA 7 TA IO BAA 3.3 BAA 5 BA 5 </p><p>des deux amides la constante d'acylation de la r6action. Nous avons donc la possi- bilitd de comparer au pH optimum les vitesses d'acylation et de d6sacylation (Tableau VI). </p><p>Ddtermination des pK d'ionisation de l'enzyme Les profils de r6action d'hydrolyse des amides en fonction du pH ont 6t6 </p><p>analys6s par la mfithode de DIXON 21, afin de d~terminer les pK d'ionisation des grou- pes de l'enzyme impliqu~s dans les variations d'activit6 (Figs. 3 et 4). La Fig. 4 repr~sentant les variations de log keat ell fonction du pH montre un optimum d'activitd qui, pour les deux amides, se situe entre 8.3 et 8.5. Elle permet aussi de d6finir deux pK d'ionisation de part et d'autre de l'optimum, qui correspondent /~ pKd et pKa' (Eqn. z), c'est ~ dire aux pK d'ionisation de deux groupes de l'enzyme dans le corn- </p><p>p </p><p>l ,\ i t ! f AN ~ ~ [ ' " </p><p>-.X </p><p>--2.! </p><p>- -0 ,5 </p><p>Fig. 4. Variat ions de log heat en fonction du pH pour l 'hydrolyse tryps ique du BAA et du TAA. D~terminat ion des pK d' ionisat ion de l 'enzyme par la m6thode de DIXON 2t. </p><p>Bioc...</p></li></ul>