contribution à l'étude de l'activité amidasique de la trypsine

116 BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

BBA 65419

C O N T R I B U T I O N ~ L ' ]~TUDE DE L 'ACTIVITt~ A M I D A S I Q U E DE LA

T R Y P S I N E

JEAN CHEVALLIER ET JEANNINE YON

Laboratoire de Biologie Physico-Chimique, Facult~ des Sciences de Paris, Orsay (Seine et Oise) (France)

(Regu le 5 novembre, 1965)

S U M M A R Y

The amidase activity of trypsin (EC 3.4.4.4) The kinetics of the t rypsin-catalyzed hydrolysis of two specific amide sub-

strates is discussed on the assumption of an acylenzyme intermediate. The limiting process is the acylation step. The acylation rate constant exhibits a bell-shaped pH profile. The p K values have been determined and compared with previous results from our laboratory. The activation by substrate previously observed during de- acylation is not detected in the acylation step. The enzymatic and non-enzymatic (hydroxyl ion-catalysed) rate constants have been compared according to the "five factors" proposed by BENDER.

INTRODUCTION

L'6tude des propri6t6s fonctionnelles de la trypsine (EC 3.4.4.4) sur des substrats de synth6se a fair l 'objet de nombreux t ravaux 1-5. Par des 6tudes analogues plus syst6matiques effectufes sur la chymotrypsine (EC 3.4.4.5) avec des esters sp6ci- fiques et les amides correspondantes BENDER et collaborateurs63 ont apport6 des pr6cisions importantes sur le m6canisme d 'act ion de cet enzyme. Un ensemble de r6sultats a 6t6 obtenu dans notre laboratoire ~ pour l 'hydrolyse trypsique de quelques esters simples et spdcifiques de formule g6n6rale R N H C H R ' C O O R " en parti- culier BAEE, BAME, TAME et TLME. L'analyse des donn6es cin6tiques a 6% effectu6e en tenant compte de l 'hypoth6se g6n6ralement admise, quoique encore contestde par quelques auteurs dans le cas des substrats sp6cifiques s de la formation d 'un acyl enzyme interm6diaire. On a pu montrer que la r6action limitante est la d6sacylation. D 'aut re par t la cin6tique d 'hydrolyse des esters n 'est pas interpr6table

Abrdviations: B A, N-benzoyl-L-arginine; BAA, amide du BA; BAEE, ester 6thylique du BA; BAME, ester m~thylique du BA; TA, N-p-tolu6nesulfonyl-L-arginine; TAA, amide du TA ; TAME, ester m6thylique du TA; TLME, ester mdthylique de la N-p-tolu6nesulfonyl-L-lysine; AcPheME, ester mdthylique clu N-acdtylph6nylalanine.

Biochim. Biophys. Acta, 122 (1966) 116-126

TRYPSINE:L'INHIBITION PAR LES D]~RIVI~S SP]~CIFIQUES 117

selon les lois classiques, car on observe une activation par le substrat qui a 6t6 inter- pr6t6e comme un effet allost6rique 9.

Dans les conditions oh il n ' y a pas encore activation par le substrat la cin6tique de ces r6actions peut ~tre repr6sent~e par le schema complexe:

k~' k( S + E . ~ E S ES' + P1 E P 2 ~ E + P2

k ( ks" Ka ,]~ ,]~ Ka" Ka" .]~ Ka"" ,It

k 1 k 3 k~ k 7 S + E H ~ - E H S ~-EHS" + P t ~ E H P 2 ~ E H + P2

k2 k4 k6 ks

k(' k(' S + E H 2 ~-- EH~S EH~S' + Px EHaP 2 ~_ EH~ + P2

k2" ks"

S reprdsente le substrat dont l '~tat d'ionisation ne varie pas darts toute la zone de pH off la r~action est 6tudi6e; E, EH, et EH,, sont les diff~rents 6tats d'ionisation de l 'enzyme; ES, EHS, et EH2S ceux du premier complexe interm6diaire; ES', EHS' et EH2S' ceux de l 'acylenzyme; EP2, EHP.. et EH2Po " ceux du complexe enzyme- produit, P1 et P~ ~tant respectivement le premier et le second produit de la r6action. Si le substrat est une amide de formule g~n6rale R N H C H R ' C O N H 2 ou R N H C H R ' - CONHR", le premier produit est NH a ou NH2R".

Par un trai tement cin~tique d6sormais classique, d6velopp6 par KRUPKA ET LAIDLER 1° et ALBERTY ET BLOOMFIELD 11 qui comporte plusieurs simplifications et admet que les seules formes ioniques r6actives sont EHS et EHS', on aboutit h une dquation des vitesses de la forme:

v is] v K m + IS]

dans laquelle [SI est la concentration du substrat, Ve t Km sont des param~tres cin6ti- ques apparents ayant la valeur complexe respective:

kaks ET V =

Kaa [I~+] / (I Ka" [H+] t k3 ( 1 + + + E ;j + i

dans laquelle ET est la concentration de l 'enzyme total et

Ka [H+] / k3] ks [k2( I + ~ ] ] +---Kb-b ] + Kra =

Si l '~tape d'acylation est l imitante (k a < ks) ces expressions se simplifient. En d6finissant la constante catalytique heat = V/ET on a:

Ko' [H+]/ (1) keat : ka] I ÷ - ~ ÷ KO" ]

K~ [H+] 1+

Km= Ks (2) Ka' [H +]

I + [ ~ + Ko-- ~ -


118 J. CHEVALLIER, J. YON

Si l'6tape de d6sacylation est limitante (k s < ka), on a:

keat = ks/ ~ + [H+~ + Kd' / (S)

( tG, [H+]I t% I + ~ + ~ ] + Kb ]

Km - - K s (4) ( EH+j 1

G i + [ ~ q + K~"/

Dans ce travail, les param6tres cin6tiques des rdactions d'hydrolyse trypsique de deux amides ont 6t6 ddtermin6s & divers pH et analys6s. La comparaison des rdsultats avee les donn6es obtenues pour l'hydrolyse des esters eorrespondants permet d'apporter quelques prdcisions sur ]e mdcanisme d'action de la trypsine.

MAT]~RIEL ET MI~THODES

La trypsine (Worthington) est dialys6e exhaustivement contre HC1 o.oI M pour 61iminer le MgSO 4 pr6sent darts la pr4paration eommerciale; elle est ensuite centrifug6e ~ 20 ooo tours/rain pendant 2o rain h froid. Son activit6 sp6cifique est d6termin6e par la m6thode potentiom6trique ~ pH constant en utilisant le BAEE comme substrat. Elle est ramen6e ~ celle d'une solution 6talon dont l'activit6 a 6t6 prise arbitrairement 6gale ~ l'unit6. La concentration des solutions de trypsine varie pour les diverses exp6rienees de 8o #M ~ 17o ttM.

Le BAA et le TAA sont des produits "Mann Research Laboratories". Le TAA pr6sente suivant les lots de I4 - I6 % de TAME. Le produit commercial peut ~tre utilis6 ainsi, puisque le TAME est hydrolys6 environ ioo fois plus rapidement que le TAA. On travaille done dans ce cas en pr6sence d'une concentration connue de TA produit de la r6action et inbibiteur comp6titif de la trypsine. Les constantes d'inhibition du TA vis ~ vis de l'enzyme ont 6% mesur6es 12 et sont donn6es dans le Tableau I. On peut done 4valuer la constante de Michaelis apparente de la r6action enzymatique, Kin, en faisant une correction d'aprhs la relation:

Km~ = Km(r + Ki I

Kmi 6tant la constante de Michaelis exp6rimentale en pr6sence d'inhibitem. On peut aussi transformer le TAME du m61ange en son amide le TAA en le

traitant par l 'ammoniaque en solution m6thanolique. La m6thode est d6crite pour la pr6paration du TAA (%f. I). On recristallise l'amide dans un m61ange alcool m6thylique-ether m~thylique. Les r6sultats obtenus avec le produit purifi6 et cor- rig6s tt l'aide de la relation pr6c6dente, et ceux que l'on obtient avec le produit purifi6 sont identiques.

Aux pH alcalins le TAA (comme d'ailleurs le TAME) se trouve sous forme ionis6e. On a l'6quilibre:

~ H H H CH ~ ~X')SO~-N-C-CONH2 ~ C H 3 - ~ - S O 2 - N - C - C O N H ~

3 N , ~ R - - R

NH /

avec R = -(CH.a)3-NH C

NH 3

Biochim. Biophys. Acta, 122 (I96C) 116-126

TRYPSINE: L'ACTIVITI~ AMIDASIQUE 119

v ~ =~~=B.~,, 1.5

1 o o

5

Fig. I. D 6 t e r m i n a t i o n des pa r am~t r e s c in~t iques co r r e spondan t k l ' hydro lyse du B A A par la t ryps ine 5. diff~rents p H ( t empera tu re 35 ° ± o.o5 °, force ionique = o.2). Les concen t ra t ions de B A A va r i en t en t r e 4 m M et 17. 5 mM. Les pen tes des droi tes on t ~t~ d~termin~es par la m~thode des mo indres carr~s. R e p r e s e n t a t i o n d ' E ad i e (v = f(v[[S])).

Le p K de cet te iouisa t ion d6termin6 pa r t i t rage k 35 ° en NaC1 o.2 M pa r N a O H o.I M est de 9.8. La forme ionis6e du subs t ra t signal6e pa r BENMOUYAL ET TROW- BRIDGE 13 dans le cas du T A M E n 'es t plus hydro lysab le pa r la t ryps ine 1~. I1 est done n6cessaire de faire une correct ion sur la concent ra t ion du subs t ra t aux p H alcalins.

Dans t o u s l e s cas, les concent ra t ions de subs t ra t sont mesur6es spec t rophoto- m6t r iquement . Les coefficients d ' ex t inc t ion sont pour le BAA e~ ~ 4300 ~ 257 m# et pour le T A A eM - - 12 ooo h 229 m# (ceci pour les valeurs de p H infdrieures ~ 9.5). Les exp6riences sont effectu6es en solut ion t a m p o n o.02 M, en NaC1 o.2 M (afro de ma in t en i r la force ionique constante) et ~ 35 °. Le p H du in61ange r6act ionnel est vdrifid au d6but et ~ la fin de chaque exp6rience. Les mesures cin6tiques commencent en gdn6ral 20 sec apr~s l ' add i t i on d ' enzyme, t emps n6cessaire h l '6quil ibre de tem- p6ra ture et ~ l ' hydro lyse du T A M E (clans le cas off l 'on t rava i l l e avec le T A A non purifi~). Les pr61~vements sont effectu6s ~ in terval les r~guliers (15 ou 20 sec su ivant

1 .5

o

o o

%

Fig, 2. Ddter rn ina t ion des p a r a m ~ t r e s c in6t iques c o r r e s p o n d a n t k l ' hydro lyse du T A A pa r la t ryps ine . M6mes condi t ions que pour la Fig. i . Les concen t r a t ions de s u b s t r a t va r i en t en t r e 5 m M et 22 raM.


I 2 0 J. CHEVALLIER, J. YON

TABLEAU I

VALEURS DES CONSTANTES D'INHIBITION ~2" l A DIFF£RENTS pH POUR L'HY'DROLYSE TRYPSIQUE D U

A c P h e M E ~ZN pRI~SENCE DF T A ~'~ DIFFI~RENTS p H

D'aprbs rdf. 12. Tempdrature 25°; NaC1 o.i M; AcPheME 2 mM; TA 9 mM.

pH 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5

K, × lO 3 1.26 1.6 x.82 2. 7 3.45 6.7 lO. 3 lO.2 7.3

les exp6riences) pendant 5 6 rain, ce qui est suffisant pour avoir une bonne d6termi- nation des vitesses initiales. La m~thode ~ la ninhydrine a dt6 utilisde pour les dosages15; elle donne une pr6cision d'environ 3% (rdf. 16).

RI~SULTATS EXPI~RIMENTAUX ET DISCUSSION

Etude des param~tres cindtiques correspondant d l'hydrolyse du B A A et du T AA Ddtermination de Km en fonction du pH. Les valeurs des param+tres cin~tiques

eorrespondant ~ l'hydrolyse trypsique du BAA et du TAA ont 6t6 ddtermindes diff6rents pH (Figs. I et 2), pour des concentrations de substrat variant entre 20 mM et 7 mM pour le BAA et 20 mM et 5 mM pour le TAA. Les valeurs obtenues sont port6es dans les Tableaux II et III . On remarque que les valeurs de K m pour l 'hydrolyse du BAA ne varient pratiquement pas en fonction du pH. Les variations observ6es sont de l'ordre de grandeur des erreurs expdrimentales. La valeur moyenne de eette eonstante (3.3 raM) est en accord avec les donn6es de la litt6rature3,17J 8.

Par eontre, pour l'hydrolyse du TAA, les valeurs de K m augmentent ldg+rement avec le pH (de 3 mM ~ IO mM lorsqu'on passe de pH 6 ~ pH 9). Ces variations sont signifieatives. Pour les deux amides, les valeurs de Km ont 6t~ caleul6es par la m6thode des moindres carr6s et la reprdsentation d'Eadie (Figs. i et 2) qui est utilis6e est la plus pr6eise pour cette ddtermination eomme l'ont montr~ DOUB ET RIGGS 19.

La Fig. 3 repr6sente les variations de p/x" m e n fonction du pH pour les deux substrats 6tudi6s.

pK,,, 3

2.5

1=~A 2=TAA

o. o N

o

6 } ; 6 6 p.

Fig. 3- Variations de pKm en fonction du pH pour l 'hydrolyse du BAA et du TAA.

Biochim. Biophys. Acta, 122 (1966) I I 6 - I 2 6

TRYPSINE: L'ACTIVITI~ AMIDASIQUE 12I

TABLEAU II

VALEURS DES PARAM]~rRES CIN]~TIQUES CORRESPONDANT ~k L 'HYDROLYSE DU BAA PAR LA TRYPSINE

Mesures cffectudes par la m6thode ~ la ninhydrine. Temp6rature 35.o ° 4- o.I °. Tampon phosphate o.o2 M ou Tris-kIC1 o.o2 M ou carbonate o.o2 M; NaCI o.2 M; BAA, 5 mM. Les valeurs de Km sont obtenues ~t I5% pr~s.

Phosphate Tris Carbonate

pH 6.05 6 .85 7 .65 7 .92 8.35 9 .36 9 .62 zo.o5 ~o.31 ~o.52

/¢m 3.5 3.3 3.6 3.3 3.1 3.5 3 .0 2.8 3.6 3.4 (M X IO 3)

kcat 0.3* 0.66 0 .82 0.87 1 .35 0.80 0.60 0 .54 0.30* 0.27* (sec-~)

* Ces valeurs sont moins prdcises que celles d6termin6es au pH optimum, les vitesses d'hydrolyse 6rant tr~s faibles.

On doit r emarquer en outre que dans les condit ions de pH optimales de la

rdaction la valeur de Km obtenue pour les deux amides est p ra t iquemen t dgale ~ la constante d ' inhib i t ion K~ ddterminde lors de l 'hydrolyse t ryps ique d 'esters en prd-

sence des m~mes amides ou des ddrivds acides correspondants 12, comme le mont re le

Tableau IV, Ce rdsultat nous permet de confirmer que l 'dtape d 'acyla t ion est l imi- tan te dans l 'hydrolyse t ryps ique des amides spdcifiques, alors que la ddsacylation

est l imi tante dans l 'hydrolyse des esters spdcifiques, comme Font montrd ZERN~R ET

BENDER s dans le cas de la chymotrypsine . Km est donnd par Eqn. 2; elle reprdsente la constante de ddcomposit ion du premier complexe intermddiaire.

Ddtermination de kcat en fonction du pH. Les valeurs de kcat ddtermindes aux divers p H pour l 'hydrolyse des deux amides sont donn6es dans les Tableaux I I et I I I .

Pour l 'hydrolyse du BAA par la t rypsine, on t rouve keat 6gal ~ 0.82 sec -1 ~ 35 ° et pH 7.65. HARMON ET NIEMANN 3 donnent une valeur de 0.46 sec -1 dans les mfimes

condit ions de pH et ~ 3 o°, ce qui correspondrai t ~ 0.56 sec -1 en a d m e t t a n t une valeur de 14 900 cal (rdf. 20) pour l 'enthalpie d ' ac t iva t ion de la rdaction. Mais on peut toutefois s 'd tonner de la valeur obtenue par les auteurs ~ 25 ° (o.18 see-l), ce

qui correspondrai t / t u n e dnergie d ' ac t iva t ion bien supdrieure. Puisque l '6tape

d ' acy la t ion est l imi tante , kcat est donn6e par Eqn. I et repr~sente pour l 'hydro lyse

TABLEAU III

VALEURS DES PARAM]~TRES ClNI~TIQUES CORRESPONDANT ~ L'HYDROLYS]~ DU TAA PAR LA TRYPSINE

Mesures effectu6es par la mdthode k la ninhydrine. Tempdrature 35.o ° 4- o. i °. Tampon phosphate 0.o2 M ou Tris-HC1 o.o2 M ou carbonate o.o2 M; NaC1 o.2 M; TAA 5 rnM.

Phosphate Tris Carbonate

pH 6.o5 6.8 7.3o 8.25 8.65 9

Kra (M x ~o~)

keat ( see -1)

3 .0 4.7 5.6 7.8 7.7 IO.I

o.24. o.8o i . i 1.8 1.6 1. 4

* M6me remarque que pour les valeurs donn6es dans le Tableau I I t t pH 6.05.


122 j . CHEVALLIER, J. YON

T A B L E A U IV

C O M P A R A I S O N D E S V A L E U R S D E LA C O N S T A N T E D E M I C H A E L I S O B T E N U E P O U R L ' H Y D R O L Y S E D E S

A M I D E S E T D E S C O N S T A N T E S D ' I N H I B I T I O N D E L A T R Y P S I N E P A R L E S A M I D E S E T L E S D ~ R I V ~ S

C O R R E S P O N D A N T S D A N S L E S C O N D I T I O N S D E p H O P T I M U M

D6te rmina t i on des Kin: Les mesures sont effectu6es par la m~thode ~ la n inhydr ine e x a c t e m e n t dans les m~mes condi t ions que celles des T a b l e a u x I[ e t I l l . Les concen t ra t ions de TAA et de BAA sont comprises r e s pe c t i ve m e n t ent re 20 mM et 5 mM pour le TAA et 20 mM et 7 mM par le BAA, D6 te rmina t i on des K, (d 'aprbs r6f. 12): Temp6ra tu re 25°; p H 8 sans t a m p o n en mil ieu NaCl 0.2 M.

Substrats ou K~ Km inhibiteurs (mM) (raM)

TAA 7.8 TAA 7 TA IO BAA 3.3 BAA 5 BA 5

des deux amides la constante d'acylation de la r6action. Nous avons donc la possi- bilitd de comparer au pH optimum les vitesses d'acylation et de d6sacylation (Tableau VI).

Ddtermination des pK d'ionisation de l'enzyme Les profils de r6action d'hydrolyse des amides en fonction du pH ont 6t6

analys6s par la mfithode de DIXON 21, afin de d~terminer les pK d'ionisation des groupes de l'enzyme impliqu~s dans les variations d'activit6 (Figs. 3 et 4). La Fig. 4 repr~sentant les variations de log keat ell fonction du pH montre un optimum d'activitd qui, pour les deux amides, se situe entre 8.3 et 8.5. Elle permet aussi de d6finir deux pK d'ionisation de part et d'autre de l'optimum, qui correspondent /~ pKd et pKa' (Eqn. z), c'est ~ dire aux pK d'ionisation de deux groupes de l'enzyme dans le corn-

p

l ,\ i t ! f £ A N ~ ~

[ ' "

-.X

- -2 . !

- - 0 , 5

Fig. 4. Var ia t ions de log heat en fonct ion du p H pour l ' hydro lyse t r yps ique du BAA et du TAA. D~te rmina t ion des p K d ' ion isa t ion de l ' enzyme par la m6thode de DIXON 2t.


T R Y P S I N E : L'ACTIVIT1~ A M I D A S I Q U E 123

T A B L E A U V

VALEUR DES p K D'IONISATION APPARENTS DES GROUPES DE L'ENZYME INTERVENANT DANS L'&CTI- VITI~ ~ 35 °

Substrats pK~ pK~

T A M E " 7.3 IO.I T A A 7.2 t o B A E E 6 .25""* 12"" B A A 6.9 i o . i

* D ' a p r ~ s r6f . 5. T e m p 6 r a t u r e 35° ; T A M E 0.2 m M . ** D ' a p r ~ s r~f. 14. T e m p 6 r a t u r e 25° ; T A M E d e 5 m M 5. o . i m M ; B A E E d e I m M 5. 0 .2 m M .

*"* D ' a p r ~ s rdf . 26. T e m p 6 r a t u r e 35° ; N a C I o . i M ; B A E E i m M .

plexe interm6diaire. Les valeurs obtenues sont indiqu6es dans le Tableau V en comparaison avec celles qui ont 6t6 d6termin6es pour l 'hydrolyse des esters correspondants.

Les valeurs de p K d reflfitant l'ionisation de l'imidazole du centre actif de l 'enzyme diff6rent l~g~rement suivant la nature du substrat, puisqu'on observe une variation de o.3 unitfis pH lorsqu'on passe des d6riv6s benzoyles aux d6riv6s tosyles. Mais ces variations sont plus marqu6es au niveau de l 'acylenzyme, (environ I unit6 pH) comme l 'indiquent les valeurs obtenues avec les esters correspondants pour l 'hydrolyse desquels la d~sacylation est limitante, et par cons6quent les pK obtenus repr6sentent pKb" (Eqn. 3).

Ces r6sultats peuvent s 'interpr~ter si l 'on admet que chacune des 6tapes 61e- mentaires de la r6action s 'accompagne de modifications r6versibles de la conformation de la prot6ine au niveau du site r6actionnel, modifications variables selon la nature du substrat qui l 'induit 22. Pour les d6riv6s benzoyles, les variations de pKb sugg&rent que ces modifications sont plus importantes dans l 'acylenzyme que dans le (ou les )complexe(s) enzyme-substrat non-covalent(s). Au contraire, pour les d6riv6s tosyles c'est dans l'(ou les) 6tape(s) qui pr6cfident l 'acylation que s'inscrivent principalement les changements conformationnels de l 'enzyme.

Les variations de pKa montrent l'existence d 'un groupement de pK io d6celable au cours de l 'acylation, groupement qui n 'avai t pas fit6 d6cel6 au cours de la d6sacyla- tion 14. L'hypoth~se d'un groupement tyrosine intervenant sous sa forme proton6e comme facteur de conformation a 6t6 avanc6e 14. Toutefois dans l 'hydrolyse des d6riv6s benzoyles (BAA et BAEE), ce groupement apparait ~ pH IO dans l '6tape d'acylation et A pH 12 dans l '6tape de d6sacylation. On pourrait penser ~ l ' interven- tion d 'un troisi~me groupement dont le pK serait d@lacd dans le cas de certains substrats. Un tel groupement pourrait intervenir directement dans la catalyse pour coopdrer au transfert d 'un proton avec les deux imidazoles dans le sch6ma r6ac- tionnel propos~ actuellement pour rendre compte des mficanismes d'action de la trypsine et de la chymotrypsine 23. L'existence et la nature de ce groupe (il pourrait s'agir d'u~a r6sidu arginine 24) restent encore hypoth~tiques.

Etude de l'activation par le substrat Les cin6tiques d'hydrolyse trypsique d'esters sp6cifiques pr6sentent une

activation par le substrat, qui a d6j~ 6t6 dfcrite et analysfe ant6rieurement. L ' f tude

Biochim. Biophys. Acla, 122 (1966) I I 6 - I 2 6

124 J. CHEVALLIER, J. YON

cindtique a dt6 effectude avec les amides correspondantes pour des concentrations de substrat variant aussi largement que dans le cas des esters. L'examen des courbes obtenues par la repr6sentation d'Eadie montre que pour les deux amides la cindtique obdit ~ la loi simple de Michaelis. Aucune activation par le substrat ne peut ~tre observ6e dans ces r6actions off l'6tape d'acylation est limitante .

On peut interpr6ter ee rdsultat en admettant que la cin6tique des r6actions catalys6es par la trypsine ob6it au deuxibme sch6ma propos6 par BI~CHET ET YON 9. Dans cette 6ventualit6 il faudrait admettre que la deuxibme moldcule de substrat intervenant comme effecteur allost6rique ne pourrait se fixer sur le deuxi~me site de l'enzyme que lorsque l 'acylenzyme est form6; l 'activation n'interviendrait donc que dans l'dtape de d6sacylation: elle ne serait ddcelable que darts l'hydrolyse des esters et non dans celle des amides.

Cette hypoth~se, bien que s6duisante, n~cessite encore d'etre 6tay~e. En effet, les valeurs de Km obtenues pour l'hydrolyse des esters sont des valeurs apparentes (Eqn. 4) et relativement petites aux faibles concentrations de substrat. Elles varient darts un rapport de IOO lorsqu'il y a activation par le substrat. Pour l'hydrolyse des amides, on obtient les Km vrais par l'analyse cin6tique et leur valeur varie entre 3 mM et Io mM selon le substrat ; par cons6quent pour observer une activation par le substrat dans ces conditions, une investigation avec les concentrations de substrat de l'ordre de Ioo Km serait nfcessaire. Or elle s'av~re impossible par suite des limites de solubilit6 des substrats. Une activation par le substrat au eours de l'~tape d'acylation ne peut donc ~tre ddfinitivement exclue.

Comparaison entre l'hydrolyse enzymatique et l'hydrolyse non-enzvmatique des amides spdcifiques

Les valeurs des constantes cin6tiques correspondant ~t l 'hydrolyse enzymatique (constante d'acylation et de d6sacylation) du BAA et du TAA sont indiqu6es dans le Tableau VI ainsi que la constante de vitesse de ces r6actions catalysdes par les ions OH-. L'efficacit6 du processus enzymatique est environ 2" lO 3 lois plus grande. On peut tenter comme l'ont fait BENDER, KEDZY ET GUNTER '25 de rendre compte de cette diffdrence au moyen de cinq facteurs intervenant dans la catalyse enzymatique.

BENDER et collaborateurs calculent ainsi la constante de vitesse d'acylation d'un substrat de la chymotrypsine et trouvent une concordance 6tonnante avec la

T A B L E A U VI

VALI~UR DES CONSTANTES DE VITESSt~ CORRESPONDANT A L'HYDROLYSE TRYPSIQU~ ET A L'HYDRO- LYSE ALCALINE DU B A A ET DU T A A

Temp6ra ture 35°; p H 8.5; NaC1 0.2 M; t a m p o n Tris-HC1 o.o2 M.

Substrats k s k 5 ks/k s ko l t - k s / ko~- (see -1) (sec-~) (M-~. see-l)

BAA 1. 3 25 19 7.1"1o -4 2 "lOs TAA 1.8 113 63 (7.1 " lO-4) * 2.5" l O s

* Cette valeur n ' a pu 6tre d~termin~e exp6rimentMement. Elle a 6t6 suppos6e 6gale celle que l 'on obt ient exp6r imentalement pour l 'hydrolyse alcaline du BAA. En effet les deux esters correspondants B A E E et TAME ont mSme constante de vitesse d 'hydrolyse alcaline 14.


TRYPSINE: L'ACTIVITI~ AMIDASIQUE 125

valeur exp6rimentale, en prenant un facteur de sp6cificit6 6gal k i . lO 3. DaBs le cas de la trypsine on aurait une bonne correspondance entre la valeur calcul6e et la valeur exp6rimentale de la constante de vitesse d'acylation en prenant un facteur de sp6cificit6 de l 'ordre de I . lO 4. Ce r6sultat conduirait ~ admettre que la trypsine est un enzyme "plus sp6cifique" que la chymotrypsine.

L'6tude de l 'hydrolyse des amides sp6cifiques par la trypsine apporte des in- formations compl6mentaires sur le mdcanisme d'action de l 'enzyme k celles que l 'on avait obtenues dabs l '6tude de l 'hydrolyse des esters correspondants. L'hydrolyse trypsique des amides est limit6e par la vitesse d'acylation alors que la d6sacylation est limitante daBs l 'hydrolyse des esters. Les pK d'ionisations des groupes de l'enzyme intervenant daBs l 'acylation ont 6t6 d6termin6s, la nature et le r61e de ces groupes dabs l 'activit6 de l 'enzyme sont discut6s. La trypsine pr6sente dabs son mdcanisme d'action de grandes analogies avec la chymotrypsine ; elle semble toutefois plus spdcifique. D'autre part, elle pr6sente la particularit6 de montrer que l ' importante activation par le substrat, 6vidente dans l '6tape de d6sacylation, n 'apparal t pas dans l '6tape d'acylation.

REMERCIEMENT

Ce travail a 6t6 effectu6 grace ~ une subvention du Centre National de la Re- cherche Scientifique (RCP No. 23),

RI~SUMI~

Les cin6tiques d'hydrolyse trypsique de deux amides sp6cifiques ont 6t6 6tudi6es en admet tant l 'hypoth6se de la formation d 'un acylenzyme interm6diaire.

Le processus l imitant est l '6tape d'acylation. Les valeurs de p K d'ionisation ont 6t6 d6termin6es et compar6es avec celles

que l 'on a obtenues pour l 'hydrolyse trypsique des esters correspondants. L'aetiva- tion par le substrat observ6e dans les r6actions pour lesquelles l '6tape de d6sacyla- tion est limitante n 'est pas d6celable au cours de l '6tape d'acylation.

Les constantes de vitesse des r6actions enzymatiques et non-enzymatiques (hydrolyse alcaline) ont 6t6 compar6es et discut6es h la lumi6re des "cinq facteurs" propos6s par BENDER.

B I B L I O G R A P H I E

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contribution à l'étude de l'activité amidasique de la trypsine

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