UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO

ABAD DEL CUSCO FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

TROPICALESCC PP: INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

BIOQUIMICA DE ALIMENTOSCARACTERIZACION DEL COLORANTE AMARILLO 5

(TARTRAZINA ) EN EL NECTAR DE PIÑANOMBRE:FERNANDO BEJAR DURAND

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN O HPLC

La HPLC es un procedimiento analítico para la separación, identificación y cuantificación de sustancias mediante la cromatografía de líquidos. Los comienzos de la HPLC, High Pressure Liquid Chromatography (cromatografía líquida de alta presión) se remontan a la década de los años 60. Gracias a la mejora de los materiales para las columnas y de los aparatos, se puede hablar desde finales de los 70 de High Performance Liquid Chromatography (cromatografía líquida de alta eficacia)• Aplicaciones en Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) : Como aplicaciones de la cromatografía de reparto en productos de alimentación : edulcorantes artificiales, antioxidadntes, aflatoxinas, aditivos, colorantes, aminoácidos, proteinas, carbohidratos, lípidos.Las aplicaciones de la cromatografía iónica está el análisis de drogas y sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas para vitaminas, azúcares, y preparaciones farmacéuticas.Respecto a las aplicaciones referidas a productos alimenticios en cromatografía por exclusión de tamaños: separación de ácidos grasos, determinación de glucosa fructosa y sacarosa en zumos enlatados.

Cromatografía iónica:La cromatografía iónica se usa para separar y determinar especies iónicas. La fase móvil es un líquido acuoso y salino que contiene un disolvente orgánico como metanol o acetonitrilo y un compuesto iónico que aporta un contraion de carga opuesta al analito. La elución de los pares iónicos se consigue mediante una disolución acuosa de metanol u otro disolvente orgánico soluble en agua. La fase estacionaria es una resina de intercambio iónico. Se trata de un material polimérico (Ej: poliestireno), que contiene muchos grupos funcionales por molécula y prácticamente insoluble en agua.

COMPONENTES BÁSICOS EN UN EQUIPO DE HPLC:

SISTEMA SUMINISTRO DE LA FASE MÓVIL:Se trata de un reservorio o varios reservorios para los disolventes. Sirve para desgasificar y eliminar partículas en suspensión de los disolventes que interfieren formando burbujas en los sistemas de detección.SISTEMA DE BOMBEO DE LA FASE MÓVIL:Se usan bombas para impulsar a la fase móvil y deben cumplir los siguientes requisitos:•Deben vencer altas presiones.•Proporcionar caudales estables entre 0,1 y 10mL/min.•Deben estar libres de pulsaciones y tener volúmenes muertos pequeños.•Deben estar construidas de materiales resistentes a la presión y a las agresiones químicas.•Fácil manejo y mantenimiento.Se utilizan tres tipos de bombas :•Bombas recíprocas•Bombas de desplazamiento•Bombas neumáticas.

INYECTORES:

Son los encargados de introducir la muestra en la cabeza de la columna de forma reproducible y adecuada.Hay dos tipos de inyectores•Septum: Inyecta la muestra mediante una jeringa. Se usa poco y no permite mucha presión.•Bucle de muestreo: Este dispositivo normalmente se encuentra integrado en el equipo cromatográfico y existen bucles intercambiables que permiten la elección de tamaños de muestra.

PRECOLUMNAS

Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes. La composición del relleno debe ser semejante al de la columna. Aunque el tamaño de partícula es mayor para minimizar la caída de presión. En muchas ocasiones se usan para aumentar la vida de la columna.

COLUMNA:

Normalmente son de acero inoxidable, vidrio, sílice fundida, o teflónde diámetro interno uniforme aunque en ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes.La mayoría de las columnas de cromatografía de líquidos tienen una longitud entre 10 y 30 cm. Generalmente son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas. El diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10m.Los empaquetados más comunes son de partículas de sílice pero también se usa la alúmina, polímeros porosos y resinas de intercambio iónico.La columna más utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de diámetro interno, empaquetada con partículas de 5 m. Estas columnas tienen de 40.000 a 60.000 platos/metro.Desde hace poco, se han empezado a fabricar columnas de alta resolución más rápidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener diámetros internos que oscilan entre 1 y 4,6 mm y se rellenan con partículas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7,5 cm. Pueden tener hasta 100.000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mínimo consumo de disolvente característica muy importante ya que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografía de líquidos son muy caros.

DETECTORES:A diferencia de la cromatografía de gases, en HPLC no existen detectores tan universalmente aplicables, ni tan fiables tampoco. En lo que si coinciden cromatografía de gases y HPLC, son las cualidades enumeradas en los detectores de cromatografía de gases.En HPLC existen dos tipos básicos de detectores:•Los basados en una propiedad de la disolución: Que corresponden a una propiedad de la fase móvil, como el índice de refracción, la constante dieléctrica, la densidad...•Los basados en una propiedad del soluto: Es decir, responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, intensidad de difusión, que no son propias de la fase móvil.

 Detectores más comúnmente usados en HPLC.Paso a hacer una breve descripción de algunos de ellos:•Detectores de Absorbancia: Miden la absorbancia de los efluyentes de una columna cromatográfica. Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se usan detectores fotoeléctricos contrastados. En cualquier caso, el cromatograma consiste en una representación en función del tiempo del logaritmo del cociente de las dos señales transducidas. También se utilizan instrumentos de un solo haz, en cuyo caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el cálculo de la absorbancia.•Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia es detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitación. Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente

•Detectores de Índice de refracción: Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales análogos a los detectores de llama en cromatografía de gases. Se añade que son fiables, no dependen del caudal, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayoría de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elución con gradiente.•Detector de dispersión de luz: El efluyente de la columna pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla gracias a un flujo de nitrógeno o aire. Estas finas gotitas pasan por un tubo de conducción a una determinada temperatura de forma que se evapora la fase móvil y se originan partículas de analito. Estas partículas pasan a través de un láser y por un fotodiodo de silicio se detecta la radiación dispersada perpendicularmente al flujo. Su principal ventaja es que resulta ser más sensible que el detector de índice de refracción.•Detectores Electroquímicos: Actualmente hay varios tipos de detectores electroquímicos, que se basan en cuatro métodos: amperometría, voltamperometría, coulombimetría, conductimetría.•Detectores por espectrometría de masas: Consiste en el acoplamiento de la cromatografía de líquidos con la espectrometría de masas. De forma general se pueden obtener tanto cromatogramas a tiempo real como reconstruidos por ordenador hasta los espectros de los picos eluidos.

MATERIALES Y MÉTODOS

El análisis de las muestras se realiza con una columna llena con un copolímero reticulado de estireno y divinilbenceno que se ha modificado con grupos de sulfato de sodio. Este material aprovecha el mecanismo de exclusión de ionos. Esto significa que los analitos se separan en función de diferentes interacciones iónicas. Debido a los grupos sulfonatos en la superficie del material, los poros presentan una carga negativa. Esto provoca que las moléculas con carga negativa no puedan penetrar en los poros del material y acelera su elución. Esta exclusión se basa en el equilibrio de iones en membranas de Gibbs-Donnan. Los analitos que puedan penetrar en los poros se separan en la superficie de la fase estacionaria mediante diferencias estéricas así como interacciones hidrófobas y polares con los grupos funcionales.Los tiempos de retención de los diferentes azúcares se determinaron mediante el registro de la señal del índice de refracción (RI). La señal RI se indica en una cifra adimensional en nRIU (nano Refractive Index Unit) y constituye la diferencia entre el índice de refracción de la muestra en la célula de la muestra y la fase móvil en la célula de referencia.Como fase móvil se utilizó agua ultrapura para efectuar la desgasificación necesaria para la HPLC, el agua ultrapura se filtró al vacío.

PROCEDIMIENTOEn la HPLC, el fluido debe ser especialmente puro, tanto física como químicamente, no debe contener sustancias o partículas en suspensión ni sustancias disueltas que puedan liberarse de la columna con retardo y emitir con ello una señal. La calidad del disolvente es a menudo determinante por lo que respecta a la fiabilidad de un análisis HPLC. La presencia de trazas de impurezas en la elución del gradiente puede provocar la aparición de “picos fantasma”. Estas trazas de sustancias se van acumulando en la columna lo largo del análisis y se liberan en el siguiente cambio de elución. El agua empleada como fluido debe estar libre de gérmenes. Para ello pueden añadirse sustancias (p. ej. sales de cobre, acida de sodio) que previenen la aparición de gérmenes o algas en el fluido. En este sentido es necesario tener en cuenta las recomendaciones del fabricante de la columna, ya que el uso de aditivos incorrectos puede provocar daños irreversibles en la columna.

En la HPLC se bombea la mezcla a separar con ayuda de un disolvente (medio de elución) o de una mezcla de disolventes (eluyente / fase móvil) y mediante un inyector y una bomba al cilindro de separación, que suele ser un tubo de acero inoxidable lleno con la llamada fase estacionaria. La fase estacionaria consta normalmente de partículas porosas de gel de sílice o de polímeros en cuya superficie están fijados ligandos químicos. Estos ligandos son responsables de las interacciones selectivas de los analitos en la fase estacionaria, que son necesarios para obtener una separación cromatográfica efectiva. Como mecanismos de separación, y dependiendo de la muestra y la fase estacionaria se pueden tomar en consideración p. ej. la absorción por las fuerzas de Van der Waals, el intercambio de iones, la exclusión de iones y demás. En la separación, las sustancias de muestra se retienen en el material de la columna durante períodos de tiempo diferentes y, por ello, abandonan la columna transcurridos tiempos diferentes. El detector registra seguidamente cada uno de los componentes de la muestra y se evalúan en un ordenador. El resultado es un cromatograma.El número de picos equivale a la cantidad de componentes de la muestra separados, la superficie representa su cantidad proporcional.

Separación de azúcares inyectados individualmente y de una mezcla de azúcares a través de una columna