código genético y sintesis proteica

8/16/2019 Código Genético y Sintesis Proteica

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Código genético y síntesis proteica


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La hipótesis del adaptador de Crick a mediados delos 50s (izquierda) y la observación de Hoagland yZamecnik sobre la activación de los aa con ATP y unnuevo RNA soluble fueron otros pasos decisivos.

Luego vendría la resolución del código genético

Hitos en los inicios de los estudios de síntesis proteica

Temprano en los 50s, Paul Zamecnik encuentra quecorto tiempo después de un pulso de aa radioactivos encélulas animales, la marca se encuentra asociada a lomicrosomas.


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Polinucleótido fosforilasa (PNPasa) participa en procesamiento y degradación de mRNA

RNAn + XDP RNAn+1 + Pi

En 1961, Nirenberg vió que poliU incorporaba poli-phe, poliC incorporaba poli-pro, poliA poli-lis, etc. Luego,con polinucleótido fosforilasa se hicieron polinucleótidos

de composición relativa de bases conocida, midiéndoseincorporación de aa marcados en 20 tubos paralelos

Severo Ochoa (izq) y ArthurKornberg (der), Premio Nobel deMedicina 1959 por los descubri-mientos de la PNPasa y DNA polimerasa, respectivamente


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En 1964, Nirenberg y Leder vieron que ribosomas aislados de E. coli unen aa-tRNAsespecíficos si los primeros tienen unido un mRNA que posee secuencias complementara los anticodones de los tRNAs. Después se vio que bastaban trinucleotidos unidos a ribosomas para unir los aa-tRNAs.

Esta herramienta fue decisiva, ya que se identificaron unos 50 tRNAs uniéndose a tripletes específ¡Pero también se vio que algunos tripletes no unían tRNA, mientras que otros unían a más de un


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Combinando todos estos datos con los de las tablas anteriores se resolvió el

código, incluyendo los codones de término, puesto que se sintetizaban péptidos más chicos. Por ej, una misma secuencia (GUAA)n da términos endistintos sitios (en rojo) de acuerdo a su marco de lectura. Concepto de marco abierto de lectura u open reading frame (ORF).


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RV con Marshall Nirenberg2008

Khorana y Nirenberg en la ceremoniadel Premio Nóbel en 1968

Khorana Nirenberg


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Código genético(Nótese que los codones se leen en sentido 5’ 3’ del mRNA)


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2) No hay sobreposición en la lectura

La no sobreposición se comprobó por el efecto de inserciones y deleciones

Características del código : 1) Contiene señales de iniciación y término.


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3) Hay más de un codón por aa: el código es desgenerado


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4) El código es universal (salvo excepciones)


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El caso especial de selenocisteína y pirrolisina, dos aminoácidosque ocasionalmente se incorporan a proteínas

Selenocisteina (sec o U): en proca yeuca. Mayor potencial de reducciónquecis , por lo tanto se encuentra enmuchas proteínas que se requieremantener reducidas. Un tipo especialde tRNAser que reconoce el codon detérmino UGA en un cierto contexto desecuencia es cargado conser por la aa-tRNA sintetasa canónica paraser .Luego, otra enzima convierte laser unida al tRNA ensec .

Pirrolisina: en bacterias metanógenas.

Tiene su tRNA específico y aa-tRNAsintetasa específicas. El tRNAreconoce el codón UAG, pero seconoce un solo caso: el del transcritodel gen de la enzima monometilaminametiltransferasa


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Conceptos adicionales relacionados al uso del código

a) Regla del balanceo (wooble)

El hecho que el número de tRNAs para un aa fuese inferior al númerode codones llevó a Crick a

postularla. Solo el apareamiento delas dos primeras bases es fuerte.

Se requiere un mínimo de 32 tRNAs para los 61 codones.

El wooble permite que el tRNA sesuelte más fácilmente del mRNA-ribosoma durante la síntesis proteica.


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b) Sobreposición de genes. Por ejemplo, en el fago X174


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La sobreposición de genes es muy frecuente y la hay de varios tipos


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deamination

deamination

c) RNA “editing”: existen diferentes tipos


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Típicas deaminaciones en la edición del RNA


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Mecanismo deinserción de Us

RNAs guías se aparean en determinados lugares al mRNA quedando algunas As de susecuencia sin aparear. Las Us son insertadas mediante la acción de tres actividadesenzimáticas presentes en el editosoma (TUTase = terminal uridyl transferase). Cuandola edición implicadeleción de Us, en lugar de la TUTase opera una3’U exonucleasaque actúa sobre Us del mRNA que no están apareadas al RNA guía.


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Ejemplo de inserción de Us

La figura muestra el cambio en el marco de lectura que produce la inserción de 4 Usen el transcrito del gen de la subunidad II de la citocromo oxidasa en la mitocondriadelTrypanosoma brucei .


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En este caso, una citocina deaminasa presente solo en intestino transforma C en U

Ejemplo clásico en mamíferos: edición del gen de laapolipoproteína B-100, un componente de los LDL

La edición tiene que ver con el diferentedestino metabólico de los lípidos en elhígado y en el intestino


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Actores de la síntesis proteica

I) Los ribosomas

En una bacteria hay 13.000 ribosomas (Nilsson et al, Biotechnol. Bioengin. 54, 461-467, 1997), mientras que

solo el RE de una célula eucariótica tiene 13 millones de ribosomas (Weibel, J. Cell Biol. 42, 68-91, 1969)


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Los rRNA tienen muchaestructura secundaria


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El árbol de la vida de Woese, construído con rRNA 16s

Carl Woese† 30 dic 2012


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En procariotes, los rRNAs junto a algunos tRNAs son procesados a partir de un precursor.

En E. coli hay 7 copias de este precursor, las que difieren en la identidad de lostRNAs que contienen. Los sitios 1, 2 y 3 son cortados por RNAsa III, RNAsa P(una ribozima) y RNAsa E, respectivamente.


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Eneucariotes, los rRNAs son procesados a partir de un precursorde 45s ya asociado a un complejo preribosomal en el nucléolo.

El 5s se transcribe aparte.

Los snoRNPs (small nucleolarribonucleoproteins) son complejosque evocan el splicesoma y dirigen

las modificaciones químicas de las bases.


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Ejemplo de la acción de dos snoRNAs


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Estructura del ribosoma bacteriano con una resolución de 3.5 ÅScience 310, 827-833, 2005

RNA 23s

RNA 23s y 5s en la subunidad 50sSe muestra también la proteína L1


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1/3 de las proteínas tiene contrapartes bacterianas1/3 tiene contraparte en Archea

1/3 son únicas de eucariotes

Eukaryotic 40S ribosome.(A and B) A superposition of eukaryotic 18S RNA (blue)and bacterial 16S RNA (yellow). (C and D) Corresponding views of eukaryotic 40S.Proteins with bacterial homologs shown in cyan, those with archaeal homologs in gold,

and those unique to eukaryotes in red. Proteins eIF1 and RACK1 are magenta (C and D).


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Los genes de las proteínasribosomales en E. coli están enoperones con subunidades de laRNA pol y los factores de

elongación Tu y Ts. Nótese que hay una regulación de latraducción (no de la transcripción),la que opera por unión de algunas proteínas a algunos genes de sus

respectivos operones.


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Actores de la síntesis proteica II) los tRNAs: 73 y 93 residuos en procay euca, respectivamente

Tienen bases modificadas


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Procesamiento de los tRNAs en proca y eucariotes incluye acción de RNAsasmodificación de bases y adición del CCA en el 3’

(en euca)

í d éb l d l


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Estructura típica de trébol de los tRNAsEn rosado, las bases comunes a todos los tRNAs.

Los eucarióticos tienen los brazos D y extra más largos

5,6-dihidrouridina

pseudouridina

2’-O-metilguanilato

ribotimidina

Este brazo interactúa conel rRNA de la subunidadribosomal mayor


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Estructura de los tRNAs


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Repaso: ejemplos de activación de reacciones por ATP mediante adenilació

1.- Biosíntesis de ácidos grasosR-COO- + ATP R-COO-AMP + PPi

3.- Biosíntesis de proteínas

aa + ATP aa-AMP + PPi

aa-AMP + tRNA aa-tRNA + AMP

2. DNA ligasa: adenilacióndel 5’P


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Otra vez: la activación de los aminoácidos

Las aa-tRNA sintetasas son específicas para el aa, aunque haya más

de un tRNA para algunos de ellos.


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El producto final es un aa-tRNAcon el aa formando un éster de altocontenido energético al 3’OH de laribosa de la adenina del CCA, elque puede formarse directamenteen 3’ (enzimas clase II) o primeroen 2’ y luego transesterificarse(enzimas clase I)


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Sitios de reconocimiento de las aa-tRNA sintetasas

Las aa-tRNA sintetasastienen puntos específicosde interacción con sucorrespondiente tRNA(además de hacerlo con elaa y el anticodon)

Las bases azulesson comunes (porlo que no pueden

dar especificidad), pero las verdes ynaranjas se hancomprobado paravarias enzimas.


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Las aa-tRNA sintetasas tienen un sistema de corrección por si se equivocan(recuerda la actividad editora de las DNA polimerasas)

El aa-AMP se forma primero y queda unido al sitio activo. En lo que se ha llamado el“segundocódigo genético”, casi todas estas enzimas tienen una oportunidad para asegurar su especificidad:tienen un segundo sitio activo hidrolítico para el aa-AMP en el cual no encajan los correspondientes aa sin activar o un aa-AMP distinto, el que es hidrolizado a aa + AMP. Más aún, aunqulo llegara a cargar mal, la enzima todavía puede hidrolizar el aa-tRNA a aa + tRNA.


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Iniciación en procariotes: formilación de la metionina N-terminal

N10formil-FH4 + met-tRNAfmet fmet-tRNAfmet + FH4

La met es cargada el tRNAfmet por la

misma aminoacil tRNA sintetasa quecargamet en tRNAmet.Esta modificación da la especificidad para la unión al AUG iniciador.

Cloroplastos y mitocondrias usan

tambiénfmet . No así los eucariotes,aunque en este caso el tRNA delAUG inicial es distinto al de lasmet interiores.


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En procariotes, el codón del tRNAfmet es guiado a la posición correcta en la subunidad 30sdel ribosoma por la secuencia Shine-Dalgarno, de modo que el fmet-tRNAfmet se une solo

al sitio P de dicha subunidad.


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IF-1: previene unión prematura de losaa-tRNAs al sitio A

IF-2: ayuda a unión de fmet-tRNAfmetal sitio P de la subunidad 30s.Complejo con GTP.

IF-3: impide unión prematura desubunidad 50s

Único aa-tRNA que entra al sitio P. Nótese sitio E en subunidad 50s)

Iniciación


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Elongación:3 etapas

a) Unión del aa-tRNA al sitio Adel complejo de iniciación70s formando un complejocon EF-Tu y GTP. EF-Ts

permite reciclar EF-Tu.El breve tiempo que tomareciclar el Tu-GTP da laocasión de que salga del sitioA un aa-tRNA cuando no hay

buen apareamiento codon-anticodon

E i lá i d Di i (1961) d i l id


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Experimento clásico de Dintzis (1961) para determinar el sentidode crecimiento de la cadena polipeptídica

Usó leu marcada en un sistema de síntesis de globina en reticulocitos(eritrocitos inmaduros) y aisló moléculas de globina recién terminadas.


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b) Formación del enlace peptídico.El NH2 del aa en el sitio A actúacomo nucleófilo, quedando eldipéptido unido a su tRNA.La

formación del enlace peptídico escatalizada por el rRNA 23s, actividadque históricamente se ha conocidocon el nombre de peptidiltransferasa, ya que normalmente enel sitio P hay un peptidil-tRNA

(transpeptidación).El ribosoma no chequea la identidaddel aa unido al tRNA: Lipman yBenzer tomaron cis-tRNAcis y loconvirtieron químicamente a ala-tRNAcis, resultando que ala seincorporó a las proteínas en sitioscorrespondientes a cis. Se confirmaque la fidelidad del proceso descansaen las aa-tRNA sintetasas y en la buena lectura de los codones


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c) Translocación. El ribosoma semueve un codonhacia el 3’ delmRNA, lo que deja al peptidil-tRNA en el sitio P del ribosoma,

reacción que es catalizada por latraslocasa (G en la figura),hidrolizándose GTP.

El tRNA deacilado queda ubicadoen el sitio E y sale del ribosoma.


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Releasing factors

Se unen al codón de término y contribuyena la hidrólisis del polipéptido desde el tRNAy a la disolución de todo el complejo

RF-1: reconoce UAA y UAG

RF-2: reconoce UAA y UGA

RF-3: hidroliza ATP

RRF: ribosome recycling factor

La hidrólisis de un GTP mediada por latraslocasa ayuda a la disociación delribosoma

Terminación


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Conceptos adicionales sobre síntesis proteica.

1. Se gastan al menos 4 ATPs por cada enlace peptídico formado: 2 en la activación dlos aa, 1 por IF2 o por Tu (GTP), 1 la traslocasa. El RF3 gasta un quinto ATP al

último.2. Concepto de polisomas.

3. Acoplamiento de la transcripción y de la traducción en bacterias.

4. Plegamiento de las proteínas.

5. Modificaciones postraduccionales.

6. Stringent response.

7. Antibióticos.

8. Degradación de proteínas.

9. Iniciación de la SP en eucariotes.


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2. Polisomas

3 Acoplamiento transcripción traducciónen bacterias


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3. Acoplamiento transcripción-traducciónen bacterias

Ocurre porque no hay transporte del mRNA del núcleo al citoplasma. El ribosomay la RNA pol no están a escala, ya que el primero es 10 veces mayor.

4 Plegamiento de proteínas: el rol de las chaperonas


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4. Plegamiento de proteínas: el rol de las chaperonas(DnaK y DnaJ bacterianas son homólogas a las Hsp70 y Hsp40 eucarióticas, respectiv

Las chaperonas tipo Hsp70 se unen a regiones ricas en aa hidrofóbicos en péptidos aún no plegados o denaturadoseucariotes también unen proteínas que deben ser translocadas a través de membranas antes de su plegamiento. Enno se conoce homólogo de GrpE.

Más que para promover plegamiento, las chaperonas impiden agregaciones incorrectas. Las chaperoninas , en cam(por ej el sistema GroEL/GroES) son absolutamente requeridas por ciertas proteínas (15%) para su adecuado plegamiento.


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5. Modificaciones post-traduccionales

- remoción del formilo en proca- acetilación de la met terminal en euca (no siempre)- pérdida de péptidos señales en proca y euca- N-glicosilaciones (asn) en el RE y O-glicosilaciones (ser, treo) en

Golgi y citoplasma- fosforilaciones en ser, treo y tir- metilaciones en lis y glu- adición de grupos isoprenos vía cis, lo que ayuda a ciertas proteínasa anclarse en la membrana

- adición de grupos prostéticos (hem, biotina, FAD)- procesamiento proteolítico (insulina, proteasas)- formación de grupos disulfuro, etc.

Ejemplo: dirección de proteínas hacia el RE para su secreción en eucariotes


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Ejemplo: dirección de proteínas hacia el RE para su secreción en eucariotes

signalrecognition particle

Ribosomas unidos al retículoendoplásmico en una célula del

páncreas

El péptido señal es removidodurante el transporte o despuésque la proteína llega a su destinofinal

Dirección de proteínas hacia el RE para su secreción en eucariotes


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p pSecuencias de algunos péptidos señales: residuos hidrofóbicos precedidos por uno o más residuos básicos

El profe con Gunther Blobel

Gunther Blobelrecibiendo el

premio Nobelde Medicina

1999


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Las proteínas bacterianas también tienen péptidos señales según el sitio de destino.La figura no incluye proteínas que se secretan al medio extracelular, pero el tipo de

péptido señal es el mismo


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6. Stringent response(la “respuesta severa”)

Cuando por falta de aa untRNA se carga en el sitio A

solo, se activa el stringentfactor, el que cataliza laformación de pppGpp, el quese hidroliza a ppGpp, uninhibidor de la RNA pol

7. Antibióticos


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Erythromycin Fusidic acid

Actúan en las distintas etapas de la síntesis proteica

Mecanismo de acción de algunos antibióticos


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Inhibitor Action

Chloramphenicol Inhibits peptidyl transferase on the prokaryotic largesubunit

Cycloheximide Inhibits peptidyl transferase on the eucaryotic largesubunit

Erythromycin Inhibits translocation by the prokaryotic large subunit

Fusidic acid Inhibits elongation in prokaryotes by preventing EF-G•GDP dissociation from the large subunit

Puromycin An aminoacyl-tRNA analog that causes prematute chaintermination in prokaryotes and eukaryotes

Spreptomycin Causes mRNA misreading and inhibits chain initiation in prokaryotes

Tetracycline Inhibits the biding of aminoacyl-tRNAs to the prokaryotic small subunit

Diphtheria toxin Catalytically inactivates eEF-2 by ADP-ribosylation

Ricin/Abrin Poisonous plant proteins that catalytically inactivate the

eukaryotic large subunit


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La puromicina se asemeja unaa-tRNA y forma un enlace

covalente con el polipéptidoluego de unirse al sitio A, loque provoca terminación prematura.

8. Degradación de las proteínas


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8. Degradación de las proteínas

En E. coli actúa una proteasa especializadallamadaLon, que es dependiente de ATP.

En euca operan dos vías: una en lisosomas acargo de proteasas llamadascatepsinas yotra vía citoplasmática universal en la que participa la proteínaubiquitina (76 aa).

Esta última se une a la proteína blancomediante un enlace isopeptídico entre sugli del C-term y a unalis de la última en un proceso en que participan 3 enzimas. Luego,a esta ubiquitina se le van agregando otras por este mismo mecanismo, a través devarias lis en la propia ubiquitina,formándose una poliubiquitina-proteina.

Finalmente, la proteína poliubiquitinada esdegradada por el proteasoma, un complejoATP-dependiente de PM 2.5 x 106, que

constituye el 1% de la proteína celular

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Ubiquitin_cartoon-2-.png


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Estructura de la ubiquitina,destacando dos de sus sietelis

Diagramas de diubiquitina, con enlaces a través de la lis 48 y 63

El proteosoma eucariótico

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Ubiquitin_cartoon-2-.png


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El proteosoma eucarióticoun core catalítico y dos partículas regulatorias

El core tiene 4 anillos, cada uno con 7 subunidades. De las celestes , tres son catalíticas(azules). A la vez, los dos anillos de subunidades están flanqueados por dos anillos de

subunidades . Las partículas regulatorias que flanquean al core tienen c/u 18 subunidades.


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9. Algunos conceptos sobre lainiciación en eucariotes

( principales diferencias con procariotes)

eIF4F: eIF4E + eIF4G + eIF4A

(no se muestran unidoslos extremos del mRNA)

Al comienzo los extremos del mRNA son aproximados


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El complejo eIF4F (eIF4E + eIF4G + eIF4A que no se muestra) une el cap y PAB (polyA bindi protein) manteniendo los extremos unidos. El escaneo para buscar el AUG inicial lo inicia eIF4B desde el cap, ayudado por la helicasa eIF4A del eIF4F, que elimina las estructurasecundarias del RNA. Regulación de la traducción puede ocurrir a través de proteínas que se una las UTR y que tienen también afinidad por el complejo de iniciación. También puede habregulación por fosforilación de los eIFs, lo que los hace menos activos.

Se postula que durante la elongación y el consiguiente movimiento del ribosoma, se mantiene

código genético y sintesis proteica

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