ΑΝΑΕΡΟΒΙΟΙ ΜΙΚΡ/ΣΜΟΙΑΝΑΕΡΟΒΙΟΙ ΜΙΚΡ/ΣΜΟΙCLOSTRIDIUM CLOSTRIDIUM

sp.sp.Βασιλική Χ. Πιτυρίγκα

Επικ. Καθ. Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή

Email: vpitiriga@med.uoa.gr

ΑΝΑΕΡΟΒΙΑ ΜΙΚΡΟΒΙΑ ΕIΝΑΙ…

Τα μικρόβια που αναπτύσσονται σε:

Ατμόσφαιρα πτωχή σε Ο2 ή χωρίς οξυγόνο

Σε χαμηλό οξειδοαναγωγικό δυναμικό

ΑΝΑΕΡΟΒΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ

ΑΡΧΗ: ΑερόβιαΑερόβια βακτήριαβακτήρια -- ΟΞΕΙΔΩΣΗ→

Τελικός δέκτης e το Ο2. Γλυκόζη→ co2 και H2O-

ΑναερόβιαΑναερόβια βακτήριαβακτήρια -- ΖΥΜΩΣΗ→ Τελικός δέκτης e οι ανόργανες ουσίες (θειϊκά, ανθρακικά, νιτρικά άλατα). Γλυκόζη → πυροσταφυλικό οξύ

ATP 32

ATP 2

ΑΠΟΥΣΙΑ ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ Δισμουτάση του υπεροξειδικού ανιόντος: O2 +

O2 + 2H+ H2O2 + O2 Καταλάση : 2H2O2

2H2O + O2

Υπεροξειδάση του Κυτοχρώματος C→ διάσπαση Η2Ο2+οξείδωση οργανικών ουσιών

ΒακτηριακοΒακτηριακος θανατος ς θανατος

ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΣΕ ΥΓΡΟ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ

1: Υποχρεωτικώς αερόβια αναπτύσσονται στην κορυφή του σωληναρίου. (Pseudomonas aeruginosa). 2: Υποχρεωτικώς αναερόβια (Clostridium tetani). O2 <0.05%3: Δυνητικά αναερόβια κυρίως στην κορυφή (Ο2) αλλά και χωρίς οξυγόνο (Escherichia coli, Staphylococcus aureus).4: Μικροαερόφιλα στην κορυφή αλλά όχι επιφανειακά (Ο2 σε συγκεκριμένη ποσότητα). <21% O2; typically 2-10% O25: Αεροανεκτικά (Aerotolerant) αναερόβια δεν χρησιμοποιούν Ο2 αλλά δεν επηρεάζονται από αυτό.

ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ

Gram (+) βακτήρια σπορογόνα (Clostridium sp)

Gram (+) βακτήρια μη σπορογόνα (Actimomyces sp, Propionibacterium sp, Lactobacillus sp,)

Gram (+) κόκκοι (Peptostreptococcus sp, Peptococcus sp.) Gram (-) κόκκοι (Veilonella sp.) Μη σπορογόνα Gram (-) βακτήρια (Bacteroides sp., Fusobacterium sp., Porphyromonas )

ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΑ Οικογένεια Clostridiaceae

203 είδη 5 υποείδη

Gram (+) Βακτηρίδια μεγάλα, ευθέα, ή και

με ελαφρά κάμψη-σχήμα ατρακτοειδές

Βλαστικές μορφές-σπόροι Ισχυρές εξωτοξίνες και ένζυμα Δυνητικά παθογόνα-εξαιρετικά

παθογόνα-αβλαβή σαπροφυτικά

Κλωστηρ =άτρακτος αδράχτι

ΕΝΔΟΣΠΟΡΙΑ

Ωοειδείς-σφαιρικοίΚεντρικοί , τελικοί ή υποτελικοίΠροκαλούν ή όχι διόγκωση κυττάρου

Υποτελικοί Clostridium botulinum

Κεντρικοί C. perfringens, C. botulinum

Σφαιρικοί τελικοί Clostridium tetani

ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΑ

Αυστηρά αναερόβια, (C. novyii type A, C. hemolyticus)Ορισμένα: μικροαερόφιλα (C. tertium,

C. histolyticum), Αεροανεκτικά

Κινητά μέσω βλεφαρίδων (εκτός C. perfringens C. ramosum C. innocuum)

Gram(+) Gram (-) (C. ramosum

C. Innocuum) Αποχρωματισμός παλιών

καλλιεργημάτων (C. tetani C.difficile C. septicum)

Gram ποικίλα (variable)Καταλάση (-)Οξειδάση (-)

ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ

Εκτεταμένη διασπορά στη φύση: Έδαφος (κοπριά) Πεπτικό σωλήνα άνθρωπου και

ζώων ως φυσιολογική χλωρίδα Σε αυξημένα φορτία σε κόπρανα

νεογνών Νερά υπονόμων Γλυκό νερό ιζήματα θαλάσσιων

νερών Τρόφιμα

ΤΟΞΙΝΕΣ

ΙΣΧΥΡΕΣ εξωτοξίνες και ένζυμα: Λεκιθινάση Κολλαγενάση Υαλουρονιδάση Δεσοξυριβονουκλεάση Νευραμινιδάση Αιμολυσίνες

Αντιγονικές –παραγωγή αντισωμάτων –ταυτοποίηση ταξινόμηση κλωστηριδίων

ΚΛΙΝΙΚΑ ΣΗΜΑΝΤΙΚΑ ΕΙΔΗ

Ομάδα υπεύθυνη για αεριογόνο γάγγραινα Κλωστηρίδιο το διαθλαστικό ή Clostridium

perfringens Κλωστηρίδιο το σηπτικό ή Clostridium septicum Κλωστηρίδιο το ιστολυτικό C. histolyticum Κλωστηρίδιο το οιδηματογόνο ή Clostridium

oedematiens Κλωστηρίδιο της αλλαντιάσης ή Clostridium

botulinum Κλωστηρίδιο του τετάνου ή Clostridium tetani Κλωστηρίδιο το δύσκολο ή Clostridium difficile

ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΒΑΣΕΙ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ

ΖΥΜΩΤΙΚΟΣ Σακχαρολυτικά –ζύμωση

σακχάρων Προϊόντα μεταβολισμού : οξέα, CO2 H2- Απουσία δυσοσμίας

Πρωτεολυτικά –αποικοδόμηση πρωτεϊνών – προϊόντα μεταβολισμού: πτητικά λιπαρά

οξέα, αμίνες, υδρόθειο Ρευστοποιουν πηγμα ορου αιματος ή

πηγμα γαλακτος Δυσοσμία

Ωστόσο ορισμένα είδη:

• Πρωτεολυτικά+ ζυμωτικά (C. sporogens, C. perfringens)• Αζυμωτικά –μη πρωτεολυτικά

ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΑΠΟ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΑ

Ενδογενείς: Πηγή: χλωρίδα του ασθενούς

Εξωγενείς: Πηγή: περιβάλλον

Μεικτές (ενδοεξωγενεις) C. difficile

Συνθήκες ανάπτυξης λοιμώξεων από CLOSTRIDIA

Διαταραχή ισορροπίας εντερικής φυσιολογικής χλωρίδας αερόβιων- αναερόβιων

Σε περιοχές του σώματος με: Ιστική καταστροφή (νέκρωση) (τραύμα) ή Ελαττωμένη αιματική ροή

Επικρατεί Υποξία και Ελαττωμένο οξειδοαναγωγικό δυναμικό

Ευνοϊκές συνθήκες για

ανάπτυξη αναεροβίων

ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ Χειρουργικές επεμβάσεις παρακάμψεις, συρίγγια,

τραύματα, κατακλίσεις)

Συστηματικές ή τοπικές νόσοι (σκληρόδερμα, λέμφωμα, Σ. διαβήτης)

Τροφικές ελλείψεις (ασιτία, υπολευκωματιναιμία, αλκοολισμός)

Φάρμακα (αντιβιοτικά)

ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ

Αεριογόνος γάγγραινα Σηπτικές λοιμώξεις Τροφικές δηλητηριάσεις

C. perfringens + C. botulinum

Αλλαντίαση: C. botulinum Τέτανος: C. tetani Ψευδομεμβρανώδης κολίτιδα –

διάρροια εξ αντιβιοτικών

C. Perfringens (80%)

C. novyi C. septicum C. fallax C. tertium C. histolyticum C. bifermentans C. sporogenes

ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΣΕ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ Πενικιλλίνη Ερυθρομυκίνη Τετρακυκλινη Βανκομυκίνη Κινολόνες Καρβαπενέμες Μετρονιδαζόλη Κλινδαμυκίνη Χλωραμφαινικόλη

Penicillin + clindamycin > single therapy with metronidazole, clindamycin, rifampin or penicillin.

Penicillin + metronidazole <

Stevens DL et al. Antimicrob Agents Chemother 1987;31:312-6

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ CLOSTRIDIA

ΔΥΣΧΕΡΗΣ Απαιτείται: Καταλληλότητα του δείγματος:

Ορθή συλλογή, μεταφορά Ειδικός εργαστηριακός εξοπλισμός-Συνθήκες

απουσίας Ο2 Εμπειρία στην επεξεργασία των δειγμάτων Θρεπτικές απαιτήσεις μικρ/σμών -Αργή

ανάπτυξη Άμεση επεξεργασία δειγμάτων (εντός 2 ωρών)-

Αν όχι, διατήρηση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος

ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ

ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ: Ιστορικό ασθενούς Προσεκτική παρατήρηση βλάβης Λήψη ιδανικού δείγματος Σωστή μεταφορά δειγμάτων στο εργαστήριο Λήψη αιμοκαλλιεργειών

ΛΗΨΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Αποστήματα: καθαρισμός της επιφάνειας του τραύματος με

70% αιθυλική αλκοόλη, ιωδιούχο διάλυμα Αφού στεγνώσει ξανά με 70% αιθυλική αλκοόλη. Διάνοιξη τραυματος με νυστερι Λήψη υλικού με σύριγγα

ΑΡΙΣΤΟ ΥΛΙΚΟΑΡΙΣΤΟ ΥΛΙΚΟ: : ΒΙΟΨΙΕΣ + ΒΙΟΨΙΕΣ +

ΥΓΡΟ ΣΕ ΥΓΡΟ ΣΕ ΣΥΡΙΓΓΑΣΥΡΙΓΓΑ

ΠΥΟΝ, ΑΠΟΣΤΗΜΑ – ΒΑΘΥ ΤΡΑΥΜΑ

ΛΗΨΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ-ΑΝΤΙΣΗΨΙΑ

ΝΑ ΑΠΟΦΕΥΓΕΤΑΙ Η ΛΗΨΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΜΕ ΣΤΥΛΕΟ: Όχι αντιπροσωπευτικό δείγμα Επιμόλυνση από επιφάνεια του τραύματος Ωστόσο επειδή είναι ο συνήθης τρόπος... Στυλεός: βαμβάκι με κοκκία άνθρακα/ίνες

αλγινικού ασβεστίου Υλικό μεταφοράς με χαμηλό οξειδοαναγωγικό

δυναμικό. (Cary-Blair, e.g. BBL™ Port-a-cul™ or Anaerobic Systems ATM

ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΙΣΤΟΥ ΓΙΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ-ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ

Α. Κλινικές πληροφορίεςΒ. Μακροσκοπική-μικροσκοπική εξέταση κλινικού

δείγματος Δ. Καλλιέργεια απομόνωση μικ/σμου από:

σηπτικές φλεγμονές, κόπρανα

Ε. Ταυτοποίηση (προκαταρκτική-τελική)

Α. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ

Λοίμωξη κοντά σε επιφάνεια βλεννογόνου

Δυσοσμία εξιδρώματος ή εκκρίματος Νέκρωση ιστών και δημιουργία

αποστημάτων Αέριο στους ιστούς ή τα εκκρίματα Γάγγραινα Λοίμωξη μετά από χρήση αντιβιοτικών

δραστικών έναντι των αεροβίων (πχ αμινογλυκοσιδών)

B.ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ

Μαύρα, πυώδη ή αιματηρά εξιδρώματα Δυσοσμία Πιθανόν φθορισμός (έκθεση σε λάμπα φθορισμού) Παραγωγή αερίου

Γ. ΑΜΕΣΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ

Νωπό: Μικροσκόπηση σε Phase contrast και σε σκοτεινό πεδίο: Παρατήρηση των σπόρων Εκτίμηση κινητικότητας

ΑΜΕΣΗ ΧΡΩΣΗ GRAM: ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ

Gram (+) βακτηριδία μεγάλα με τετραγωνισμένα άκρα, σπορογονα ή μη

Απουσία λευκοκυττάρων Παρουσία μυϊκών ινών Συνύπαρξη πολλών ειδών μικροβίων

ΕΙΚΟΝΑ ΜΥΟΝΕΚΡΩΤΚΗΣ

ΑΕΡΟΓΟΝΟΥ ΓΑΓΓΡΑΙΝΑΣ

Gram stain Αμφίβολη: αποχρωματισμός σε παλιά

καλλιεργήματα Δ.Δ. Clostridium species ≠

Bacteroides

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ

C. perfringens: Gram (+) βακτηρίδια μεγάλα με τετραγωνισμένα άκρα χωρίς σπόρους

C. septicum: Μακρύ λεπτό πολύμορφο νηματοειδές με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους

C. novyi: Mεσαίου μεγέθους με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους

C. difficile: Μακρύ λεπτό, με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους

Clostridium tetani

ΧΡΩΣΕΙΣ ΕΝΔΟΣΠΟΡΙΩΝ

Schaeffer–Fulton stain (malachite green +0.5% safranin)

Moeller stain (Carbol fuchsin + Methylene blue)

Δ. ΚΑΛΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ - ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ

Παρουσία αιμίνης (5 μg/ml) και βιταμίνης Κ (1μg/ml)

Στερεά- ζωμοί Ιδανικά υλικά τα λιγότερο εκτεθειμένα σε Ο2→

φρέσκα, προανηγμένα

* Φρέσκα ή προανηγμένα: υγρά → βρασμός, στερεά → διατήρηση σε αναερόβιες συνθήκες

Columbia αγαρ CDC anaerobe blood

agar ΒΑ: Brucella agar +

5 % αίμα+ Κ1 + αιμίνη

Schaedler blood agar Απαραίτητο το τεστ

αεροβιωσης –αναπτύσσονται και αερόβια

Ζωμός από εκχύλισμα καρδιάς και εγκεφάλου (brain heart infusion) εμπλουτισμενος με κυστείνη

Columbia ζωμός TB: Θειογλυκολικός ζωμός με

ή χωρίς δείκτη+ Κ1 + αιμίνη+ τρίμματα μαρμάρου

Ζωμός με κρέας κιμά Chopped meat

carbohydrate Chopped meat -glycose

ΚΟΙΝΑ*ΚΟΙΝΑ* ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΤΙΚΑΕΜΠΛΟΥΤΙΣΤΙΚΑ

* Αίμα : προβάτου, ίππου, κουνελιού

ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ-ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΤΙΚΑ

EYA (Egg yolk agar)-κροκός αυγού + λακτόζη PEA (Phenylethyl alcohol Agar): Αιματούχο

άγαρ προβάτου Εξουδετερώνει τον ερπυσμό

CCFA (Cycloserine-cefoxitin fructose agar) Clostridium difficile agar Tryptose Sulphite Cycloserine (TSC) Shahadi Ferguson Perfringens (SFP) agar

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ

Συνδυασμός θρεπτικών υλικών Υγρών – στερεών Κοινών - εκλεκτικών

ΕΠΩΑΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ

Jars →48h (όχι νωρίτερα) Θάλαμοι αναερόβιων

συνθηκών →ανά 24h Φάκελοι επώασης ανά 24h

ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΥΠΑΡΞΗΣ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΣΤΗΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ-ΖΩΜΟΙΑ) Θρεπτικός ζωμός Cooked Meat • Θόλωση μετά από 48h →μικροβιακή ανάπτυξη • Πρωτεόλυση - μαύρη ή γκρίζα βλεννώδης περιοχή στον πυθμένα -ελάττωση της ποσότητας του κρέατος -οσμή σάπιου κρέατος -μάζες κρυστάλλων τυροσίνης που μεγαλώνουν όσο μένουν στην

καλλιέργεια→ χιονισμένη επιφάνεια π.χ. C. histolyticum -αέριο • Σακχαρόλυση - αέριο

- αλλαγή χρώματος (ροζέ) λόγω αναγωγής της αιματίνης • Λιπόλυση - βουτυρώδης αφρός στην επιφάνεια του ζωμού

ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΥΠΑΡΞΗΣ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ- ΣΤΕΡΕΑ ΘΡ. ΥΛΙΚΑ

Άσχημη μυρωδιά με το άνοιγμα της jar

Παρατήρηση στα στερεά υλικά Στα κοινά: ανάπτυξη

πολλών ειδών Στα εκλεκτικά υλικά:

Ανάπτυξη αναερόβιων

Μέγεθος Όψη Επιπλέον χαρακτηριστικά• Χρωστική, • Φθορισμός• Αιμόλυση, • Οσμή

Ε. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ

Α) ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ

Β) ΤΕΛΙΚΗ

ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ: Clostridium sp (από καθαρό καλλιέργημα)

Χρώση Gram Περιγραφή της

αποικίας-οσμή Έλεγχος κινητικότητας Έλεγχος αεροβίωσης Δίσκοι ειδικής

περιεκτικότητας (Vancomycin 5 μg, Kanamycin 1000 μg, Colistin 10 μg)

Αναγωγή νιτρικών Λιπάση –Λεκιθινάση Παραγωγή ινδόλης Καταλάση Φθορισμός Παραγωγή ουρεάσης Δοκιμασία παραγωγής

σπόρων (alcohol shock)

Ανάστροφη CAMP Nagler test

ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ

ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ

Μεγάλες ριζοειδείς (Clostridium sp)

Μεγάλες αποικίες με διπλή ζώνη αιμόλυσης (C. perfringens, C. novyi )

Ερπύζουσες αποικίες (C. septicum, C. tetani, C. sordellii, C. sporogenes)

Χαρακτηριστική οσμή (στάβλου αλόγων, C. difficile)

ΧΡΩΣΗ GRAM από καλλιέργημα: Clostridium tetani

BOX CARS

ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΜΕ ΔΙΣΚΟΥΣ ΕΙΔΙΚΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ (SPECIAL POTENCY DISKS)

Βlood Αgar. Colistin (10 μg), kanamycin (1 mg), vancomycin (5 μg) στο

πρώτο τεταρτημόριο Αναερόβια επώαση x 48h /

35o C Ανάγνωση : ≤10mm R,

≥10mm S Gram (+) anaerobes:

Vanc: S-Col: R

ΔΙΑΦ. ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΔΙΑΦ. ΔΙΑΓΝΩΣΗ G G (+) / G(-) (+) / G(-)

ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ (ΑΜΦΙΒΟΛΗ(ΑΜΦΙΒΟΛΗ ΧΡΩΣΗ ΧΡΩΣΗ

GRAMGRAM))

ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ

EYA (Egg yolk agar)

Λεκιθινάση → λευκή, αδιαφανής κάτω και γύρω από την αποικία Λιπάση → ιριδίζουσα επιφάνεια Πρωτεόλυση → διαυγής άλως γύρω από την αποικία

ΛΕΚΙΘΙΝΑΣΗ (+) C. perfringens

ΤΕΛΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ

Πλήρες βιοχημικό προφίλ - Συστήματα βιοχημικής ταυτοποίησης

Παρουσία ενζύμων- Ενζυμικά συστήματα ταυτοποίησης αναεροβίων

Προσδιορισμό λιπαρών οξέων κυτταρικού τοιχώματος- Fatty Acids Methyl Ester (FAME) Analysis

Προσδιορισμό λιπαρών οξέων/τελικών προϊόντων μεταβολισμού- Αέρια υγρά χρωματογραφία

Προσδιορισμό τοξινών

ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ Βιοχημικές διαδικασίες

(σάκχαρα, ινδόλη, ουρία, ζελατίνη)

ΑΡΙ20Α(BioMerieux, Inc.)

Minitek (BD Biosciencens)

Προβλήματα Αναερόβια επώαση του

strip (24 – 48h) Αντίδραση ινδόλης

ψευδώς θετική Απαιτούνται επιπλέον

δοκιμασίες (πχ. καταλάση)

Ορισμένα σακχαρολυτικά αλλοιώνουν τους δείκτες → δυσκολία στην ανάγνωση

ΕΝΖΥΜΑΤΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ

Δράση των προσχηματισμένων βακτηριακών ενζύμων

Anaerobe ANI card (BioMerieux, Inc.)

Rapid ID 32A (BioMerieux, Inc.)

Rapid Anaerobe ID (Dade MicroScan, Inc.)

Crystal Anaerobe ID kit (BD Biosciences)

RapID – ANA (Remel, Inc.)

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ

∆εν απαιτούν μικροβιακή ανάπτυξη Επώαση αερόβια Ταυτοποίηση σε 4h Καλή ταυτοποίηση απαιτητικών / α-σακχαρολυτικών Πολλά στελέχη ταυτοποιούνται χωρίς επιπλέον βιοχημικές

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΞΙΝΩΝ

Τοξίνη Α C. difficile (ELISA, ανοσοχρωματική) Τοξίνες Α και Β C. difficile (ELISA,

ανοσοχρωματική) Τοξίνη Β C. difficile (κυτταροκαλλιέργεια) Τοξίνες Α, Β, ∆ιαδική (PCR) Τοξίνες C. botulinum (PCR) Αδρανοποίηση τοξινών σε πειραματόζωα μετά από

έγχυση αντιτοξινων

ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣCommercial identification Systems Pulsed- Field Gel Electrophoresis (PFGE), Fluorescent Amplified Fragment Length

Polymorphism (AFLP), 16S rDNA gene sequencing, PCR- restriction fragment length Polymorphism

(PCR-RFLP), Microarray analysis, Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeat

Analysis (MVLA), whole-genome sequencing (WGS) Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation -

Time of Flight (MALDI-TOF)

CLOSTRIDIUM CLOSTRIDIUM PERFRINGENSPERFRINGENS

Clostridium perfringens Κλωστηρίδιο το διαθλαστικό

Μεγάλο (2.4μm πλατος-19.0μm μηκος), ορθογώνια άκρα

Gram (+) Ακίνητο Αεροανεκτικό (aerotolerant) Έλυτρο:

Ναι στο σημείο της λοίμωξης Όχι στα θρεπτικά υλικά

Στις ιστικές φλεγμονές δεν παράγει σπόρους Σπόροι ωοειδείς, κεντρικοί ή

υποτελικοί δεν προκαλούν διόγκωση

Clostridium perfringens

Το Clostridium που απομονώνεται πιο συχνά

Η 3η συχνότερη αιτία τροφικής δηλητηρίασης UK και USA

Generation time: 6,3 ‘ σε thioglycollate broth (20 -50°C-optimum 45°C)

ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙ

5 αντιγονικοί τύποι A-E με βάση την ικανότητα ειδικών αντι-ορών να

εξουδετερώνουν τις θανατηφόρες τοξίνες Τύπος Α: αεριογόνο γάγγραινα Τύποι B, D, και E: εντερίτιδα και

εντεροτοξιναιμία στα βοοειδή και στα πρόβατα

Τύπος C: νεκρωτική εντεροκολίτιδα στον άνθρωπο

73

Clostridia perfringens -toxin Α-toxin Φωσφολιπάση Λεκιθινάση: Διασπά τη λεκιθίνη του αυγού

(lecithinase C) Υδρολυσίνη: Διασπά τις κυτταρικές μεμβράνες

RBC, WBC και μυϊκών ινών

74

Clostridia perfringens

β-toxin - Α2 υποτύπος

Εντεροτοξίνες

θ-toxin Αιμολυσίνη

Ένζυμα Κολλαγενάση Δεσοξυριβονουκλεάση Υαλουρονιδάση Πρωτεάσες

ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ

Τροφική δηλητηρίαση

Αεριογόνος γάγγραινα

Νεκρωτική εντεροκολίτιδα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ

Μικροσκοπική εξέταση κλινικού δείγματος με χρώση Gram

Καλλιέργεια, απομόνωση-ταυτοποίηση Κόπρανα Σηπτικές φλεγμονές

Ανίχνευση τοξίνηςΣωστή ΛΗΨΗ

και ΜΕΤΑΦΟΡΑ

κλινικού δείγματος!!!

ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ

Κοινά Cooked meat broth Thiglyclolate broth

Εκλεκτικά Tryptose Sulphite (TS) agar Tryptose Sulphite

Cycloserine (TSC) TSC-egg yolk agar Shahadi Ferguson Perfringens

(SFP) agar anaerobic jar 24 h at 35°C

Μαύρες αποικίες

ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΑΠΟΙΚΙΩΝ

Αποικίες 2 – 4 mm, Ημιδιαφανείς, κυκλικές

ομαλές μερικές με γραμμώσεις

β- αιμόλυση Ορισμένα είδη →

βλεννώδεις αποικίες

ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ

Motility-nitrate agar (buffered) 24 h at 35°C

ΑΚΙΝΗΤΟ

Ανάστροφη δοκιμασία CAMP (Reverse CAMP test)

Sheep blood agar 37o C for 24-48 hours in anaerobic conditionsAlpha- toxin produced by C. perfringens interacts with CAMP factor and produce synergistic hemolysis

NAGLERS ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ

Η παραγωγή λεκιθινάσης αναστέλλεται παρουσία αντιορου της α-τοξινης

Egg yolk agar Μισή επιφάνεια : 2-3

σταγόνες αντιτοξίνης 37ο C x 48h

Α-τοξίνη του Cl. perfringens

ΔΙΠΛΗ ΖΩΝΗ ΑΙΜΟΛΥΣΗΣ (Target hemolysis)

Αιματούχο προβάτου, κονίκλου, βοός,

Στενή ζώνη της πλήρους αιμόλυσης : θ-τοξίνη

Ευρεία ατελής ζώνη της αιμόλυσης: α-τοξίνη

>24 h επώαση μειώνεται το φαινόμενο

Lactose-gelatin media 24 hours x 37ºC. Έλεγχος παραγωγής αερίου Ζύμωση λακτόζης-Χρώμα από κόκκινο σε

κίτρινο κίτρινο Ψύξη 1 h - 5°C – έλεγχος για

ρευστοποίηση Αν ρευστοποίηση (+): επιπλέον 24 h at

35°C και επανελεγχος.

Clostridium perfringens Non-motile bacteria black colonies in Tryptose Sulfite

Cicloserine Agar liquefy gelatine in 48 hours

89

Cooked meat broth Παραγωγή

αερίου Δεν πέπτει το

κρέας –σακχαρολυτικό

90

Litmus milk Ζυμώνει τη λακτόζη →

παραγωγή οξέος και αερίου → Παραγωγή πήγματος γάλακτος

CLOSTRIDIUM DIFFICILE

Αυστηρά αναερόβιο βακτήριο Περίτριχο, κινητό Gram (+) Σπορογόνο

Ωοειδής υποπολικοί σπόροι

Εξωτοξίνες• Τοξίνη Α: Εντεροτοξίνη• Τοξίνη Β: Κυτταροτοξίνη• Δυαδική τοξίνη (binary toxin):

• 20% των στελεχών

CLOSTRIDIUM DIFFICILE

Το κύριο αίτιο λοιμώδους διάρροιας σε νοσηλευόμενους παγκοσμίως. 

ΕΝΔΟΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΟΣ ΑΠΟΙΚΙΣΜΟΣΕΞΩΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΟΣ

Περιβάλλον – Τρόφιμα

SOS 5-70% βρέφη <=1 έτους-φυσ. χλωρίδα

ΚΥΡΙΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΓΙΑ CDAD

Παρατεταμένη νοσηλεία

Ηλικία >65 Σοβαρή υποκείμενη

νόσος Καταστολή έκκρισης

γαστρικού οξέος

XΡΗΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝXΡΗΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ

• IgG προστατευτική αντιτοξίνη A

ΣΥΧΝΕΣ ΟΙ ΥΠΟΤΡΟΠΕΣ ΣΥΧΝΕΣ ΟΙ ΥΠΟΤΡΟΠΕΣ

ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

PCR-LAMP

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ γλουταμινικής δευδρογενάσης immunoassay

ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ

ΔΙΑΓΝΩΣΗ

ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ ΕΛΕΓΧΟΥ

Ο έλεγχος περιορίζεται σε ασθενείς:– Ασθενείς >1έτος– Ιστορικό λήψης αντιμικροβιακών– Διαρροϊκό σύνδρομο– >=3 διαρροϊκές κενώσεις /24 h

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

Αύξηση ευαισθησίας Προεμπλουτισμός σε υγρά θρεπτικά υλικά Προεργασία: shock αιθανόλης –θέρμανση

(καταστροφή των βλαστικών μορφών) Αναερόβια προ-επώαση Επεξεργασία με ταυροχολικό Να –

(εκβλάστηση σπόρων)

CCFA agar (cycloserine cefoxitine fructose agar)

Gold standard

ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ

Κοινά CDC anaerobe blood agar

Εκλεκτικά- διαφοροποιητικά Egg Yolk Phenylethyl alcohol blood agar

(PEA): αναστέλλει τον ερπυσμό γενικα των κλωστηριδιων

BBL™ Clostridium difficile Selective Agar

Cycloserine –Cefoxitin Fructose Agar. Κίτρινες αποικίες με κίτρινο φθορισμό

Cycloserine –Cefoxitin Fructose Agar Αποικίες μεγάλες κιτρινωπές

χαμηλές κυκλικές ριζοειδείς προσεκβολές

Οσμή κρεσόλης Sensitivity 2000

bacteria/g of stool

ΤΟΞΙΝΟΓΟΝΟΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΟΞΙΝΟΓΟΝΟΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ Έλεγχος παραγωγής τοξίνης

Επιβεβαιωτικά τεστ EIA–PCR –τεστ κυτταροτοξικότητας

Πλεονεκτήματα • Ταχείες• Οικονομικές • Ευκολη διαδικασία• Φτηνός εξοπλισμός

Μειονεκτήματα Επηρεάζονται από:

Παρεκκλίσεις από διαδικασίες πρωτοκόλλου

Λανθασμένες τεχνικές εκτέλεσης

Λάθος χειρισμός δείγματος

Χρήζουν επιβεβαιωτικά τεστ

ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ

• Παρουσία τοξίνης C. diff A και B ή/και GDH στα κόπρανα

Ευαισθησία-ειδικότητα: Μεγάλες διακυμάνσεις

Ανίχνευση γλουταμινικής δευδρογενάσης (EIAs for GDH)

• Μεταβολικό ένζυμο• Παράγεται από την πλειοψηφία στελεχών C.

Difficile- τοξινογόνα και μη στελέχη• Ευαισθησία υψηλή ~88–90%

SCREENING SCREENING TEST TEST -1-1ΟΟ ΒΗΜΑ ΒΗΜΑ

ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ

Two-step or three-step testing algorithm Μη ικανοποιητική απόδοση των μεμονωμένων

δοκιμών Εισαγωγή εξεταστικών αλγόριθμων σε δύο ή

τρία στάδια Αρχική διαλογή με τεστ ανοσοχρωματογραφίας

ανίχνευση C. difficile GDH ή τοξίνες Α-Β (+) δείγματα: Επιβεβαιωτικά τεστ

Τοξινογόνο καλλιέργεια PCR Τεστ κυτταροτοξικότητας

Βήμα 1: Ανίχνευση GDH Ανίχνευση GDH

Βήμα 2: Κ-τοξινογόνος Καλλιέργεια Κ-τοξινογόνος Καλλιέργεια

+

- ΑΠΟΥΣΙΑ CD

-+

NON TOXIGENIC

STRAINTOXIGENIC CD STRAIN

Two-Step Test

CANCER Intratumoral injection CANCER Intratumoral injection of of Clostridium novyiClostridium novyi-NT spores -NT spores induces antitumor responsesinduces antitumor responses

The researchers first made sure they genetically modified the bacteria to make it less toxic, then used it to infect tumors (direct injection) that were growing in live patients: 16 pet dogs and one human. The human patient’s tumor that was treated with bacteria shrank, while other tumors in the patient’s body continued to grow. Three of the dogs were cured of cancer completely, and three others saw their tumors shrink by at least 30 percent.

C. novyi is that it only operates in oxygen-free (anerobic) environments. This held true when researchers found some of the tumors who supported oxygen didn’t show any sign of shrinking. 

The research suggests that bacteria, when engineered to reduce toxicity, can be a viable fighting tool against cancer, one with less destructive side effects than chemotherapy.

Ref: Nicholas J. Roberts, et al. Sci Transl Med 13 August 2014: Vol. 6, Issue 249, p. 249